Disciplina Biologie celulară și moleculară-lucrări practice

L2

Mijloace tehnice de studiu în biologia celulară

Biologia celulară și moleculară este o disciplină relativ nouă și în continuu progres datorită perfecționării tehnicilor de studiu asupra celulei atât sub aspect morfologic, funcțional cât și molecular. De asemenea, studiile contemporane asupra complexității structurale la nivel celular și molecular au ca scop investigarea atât a celului normale cât și asupra celei patologice ori sub acțiunea substanțelor medicamentoase.

Tehnicile de investigare celulară sunt complexe și interdisciplinare. Dintre cele folosite în mod curent amintim tehnicile de microscopie fotonică, microscopie electronică, ultracentrifugare diferențiată, tehnici biofizice, biochimice, culturi de celule, fuziuni celulare, etc.

În vederea înțelegerii organizării ansamblurilor de molecule și conectarea lor în structuri, a proceselor legate de biosinteza acestora precum și funcțiile asociate lor, a proceselor patologice, deci pentru investigarea în domeniul ultrastructural este necesară coborârea treptată , cu ajutorul mijloacelor moderne de investigare de la celulă la atom.

Domeniul Dimensiunile elementelor structuraleCelular µm (µ) = 0,001mmMolecular nm (mµ) = 0,000001 mmAtomic Å(Angstrom) = 0,0000001mm

Prima etapă în studiul celular este reprezentată de analiza morfologică ceea ce implică mijloace ce au la bază microscopia fotonică.

Alcătuirea și funcționarea microscopului optic:

Microscopul fotonic este un aparat optic de mărit ( se pot examina structuri cu dimensiuni mult sub puterea de rezolutie a ochiului uman) care utilizează ca sursă de radiație fotonul (element din spectrul undelor electromagnetice).

Performanțele unui astfel de aparat constă în puterea de mărire și puterea de rezoluție. Puterea de mărire (PM) este produsul dintre puterea de mărire a obiectivului și cea a ocularului. Puterea maximă este de x1500 ori. Pentru preparate histologice se folosesc obiectivele x20, x40, iar pentru cele citologice x 60 și x100.

Puterea de rezoluție (PZ) a unui microscop este calitatea cea mai importanta în funcționarea unui astfel de aparat. PZ reprezintă cea mai mică distanță la care două puncte pot fi văzute distinct și se calculează după formula lui Abbé.

D= λ/n sin α

λ = lungimea de undă a radiației elecromagnetice . Aceasta este o constantă naturală care nu poate fi influențată și are valoarea 0,55.

1

Disciplina Biologie celulară și moleculară-lucrări practice

n = indicele de refracție al mediului dintre preparat și obiectiv (mediul dintre preparat și obiectiv este în general aerul , ca urmare valoarea lui n= 1). În cazul folosirii unui lichid cu indice de refracție diferit (uleiul de cedru, n=1,51) se va folosi obiectivul de imersie.

α =1/2 din apertura unghiulară a obiectivului. Apertura unghiulară maximă teoretică este de 1800, deci α = 90, limita teoretică maximă a sin α=1.

Rezoluția maximă a microscopului optic este 0,2µ. De PZ depinde claritatea și bogația în detalii a imaginii și depinde de lentila obiectivului.

Componentele microscopului optic: partea mecanica (talpa cu sursa de lumină, condensator, diafragma, masa, dispozitivul pentru fixarea preparatului, revolver, macroviza și microviza) și partea optică (sistemul ocular și cel obiectiv).

Tehnica de lucru- efectuarea de observații

Microscopia prin fluorescență

Pune în evidență o serie de fenomene luminoase care iau naștere în structurile biologice primare (naturale) sau în cele provocate de către substanțe numite fluorocromi. Metodele citologice de fluorescență prezintă o serie de avantaje, care le fac foarte utile în cercetarea histochimică cantitativă și a abiologiei celulare, atât pe celule vii cât și pe celule fixate.

Principiul metodei: anumite substanțe radiate cu un fascicol luminos cu o lungime de undă mică și cu o frecvență înaltă ( cum este cazul celor ultraviolete de 300-400 milimicroni) emit radiații cu o lungime de undă mare și o frecvență mai joasă, deci de culoare diferită. Aceste substanțe se numesc fluorescente. Fluorescența este condiționată de prezența unor grupări fluorofore. Se folosesc 2 categorii de filtre pentru aceste microscoape: filtrele de excitație și cele de baraj. Filtrele de excitație sunt filtre colorate de la albastru la violet închis. Ele rețin o parte din radiațiile emise de sursă lăsând să treacă radiațiile cu lungimea de undă care excită fluorocromul. Filtrele de baraj opresc lumina primară ce vine de la sursă, lăsând să treacă lumina emisă de fluorocrom. Alegerea filtrelor trebuie făcută astfel încât, transparența lor să fie maximă în domeniul de absorbție a fluorocromului.

Fluorescența este de 2 categorii:

1- fluorescența primară, naturală sau autofluorescența produsă de substanțe care se află în mod natural în celule. O serie de substanțe iluminate în ultraviolet, emit în mod natural la o lungime de undă mai mare (legea Stoke) , adică în vizibil. Exp: vitamina A –fluorescență verde, vitamina B2 cu fluorescență albăstruie, derivații de oxidare ai lipidelor cu o fluorescență galben –brună, porfirinele- roșie, proteinele- albă datorită prezenței aminoacizilor aromatici (tirozina, triptofanul, fenilalanina).

2- Fluorescența secundară sau indusă prin tratarea secțiunilor de țesut cu fluorocromi sau prin tratament chimic adecvat ce facilitează formarea unor grupări

2

Disciplina Biologie celulară și moleculară-lucrări practice

fluorocrome ( metodă prin care sunt detectați acizii nucleici, fibrele de colagen, reticulina). Astfel, tratamentul cu acid sulfuric concentrat determină o fluorescență a testosteronului, coriofosfina O provoacă fluorescența ADN (în verde) și a ARN citoplasmatic în roșu (Radu Meșter, 1976).

Cu ajutorul fluorescenței primare pot fi identificați:

- Pigmenții : porfirinele (fluorescența roșie), lipocromii sau pigmenții carotenoizi (fluorescența verde), cromolipidele (fluorescența galben-verde), lipofuscina (fluorescența roșu- brun).

- Acizii aminați : fenilalanina, tirozina, triptofan (fluorescența albastră).- Virusuri și bacilul Koch emit fluorescența verde.- Aminele biogene: adrenalina, noradrenalina, serotonina (fluorescența verde).

Cu ajutorul fluorocromării cu acridin orange se pot identifica:- Acizi nucleici ARN- fluorescența roșie, ADN- fluorescența verde.- Fibrele de colagen, elastice și de reticulină- fluorescența verde.- Nucleii leucocitelor au o fluorescența verde, iar citoplasma lor și eritrocitele rămân

opace.- Mucinele – fluorescența verde.

Colorația cu acridin orange se mai utilizează în citodiagnosticul precoce al cancerului. Cea mai importantă aplicație este imunofluorescența care se bazează pe cuplarea unui acid cu un fluorocrom și poate fi identificată localizarea antigenelor în celule.

Microscopia în contrast de fază

Metoda utilizează un tip special de microscop fotonic ce realizează contrastul unor obiecte de examinat, permițând astfel studiul celulelor în stare vie, nefixate și necolorate. Aparatul propriu-zis este un microscop obișnuit cu unele particularități: condensatorul are un diafragm inelar, iar în obeictiv se găsește o placă sau inel de fază care are rol de a modifica transmisia unei părți din razele luminoase care formează imaginea câmpului microscopic (este un proces de defazare între razele luminoase care sunt transmise direct și cele care sunt difractate de preparat).

Aplicații:- Studiul celulelor în stare vie;- Scoate în evidență unele detalii de structură și funcționare celulara (endocitoza,

diviziunea celulară);- Studiul reacțiilor celulare la diferiți agenți chimici și fizici;- Studiază benzile cromosomiale.

Microscopia în lumină polarizată

Prin această tehnică se obțin imagini ale unor constituiențiîn care structurile analizate sunt anizotropei acestea făcând ca viteza de propagare a luminii polarizate să varieze cu direcția de propagare . Mediile respective se numesc birefringente.

3

Disciplina Biologie celulară și moleculară-lucrări practice

Birefringența pozitivă este atunci când indicele de refracție este mai ridicat în lungime decât în plan perpendicular (caracterizează mediile reprezentate de structurile fibrilare: colagen, mielină, fibrele musculare striate) , iar negativă în caz contrar (fibrele nuceoproteice).

Microscopul are două dispozitive speciale numite polarizor și analizor . Polarizorul se găsește sub condensator, iar analizorul se află deasupra obiectivului. Dacă planul de polarizare al analizorului este perpendicular pe cel al polarizorului, lumina va fi transmisă. Punând pe platina microscopului un preparat birefringent, planul de polarizare va devia datorită întârzierii provocate de întreruperea probei de examinat.

Aplicații practice:

- Se studiază structuri a căror compoziție chimică macromoleculară au un aspect liniar ca de exemplu fibrele de colagen, mielina, fibrele musculare striate;

- Se utilizează pentru studiul membranelor biologice;- Se evidențiază structurile cu simetrie radiară: granule proteice, lipide, colesterol.

Microscopia electronică

Microscopul electronic reprezintă un instrument de vizualizare directă a ultrastructurilor celulare, cu o putere de rezoluție mult mai mare decât al microscopului fotonic.

Microscopul electronic se bazează pe proprietatea electronilor de a fi deviați de un câmp elecrostatic sau electromagnetică. Dacă se plasează un filament (catodul) într-un tub cu vid, după care filamentul se încălzește, el emite electroni ce pot fi accelerați, prin intermediul unei diferențe de potențial.

Fluxul de electroni astfel realizat are proprietăți similare luminii, prezintă caracteristici corpusculare și vibratorii, însă lungimea de undă este mult mai mică în comparație cu lumina albă. Acest flux trece printr-o bobină electromagnetică (cu rol asemănător unui condensator) prin care electronii se concentrează în direcția obiectivului. Instrumentul mai prezintă o bobină electromagnetică cu funcții similare lentilei obiectivului prin care se obține o imagine mărită a obiectului, iar una care funcționează ca și ocular sau lentilă de proiecție. Aceasta permite o mărire suplimentară a imaginii.

Limitele de rezoluție calculate pentru microscopul electronic sunt cuprinse între 3-5Å. În cercetarea biologică această limită de rezoluție este de 10Å. Un microscop electronic ce prezintă o mărire inițială a obiectului de 100x, poate mări imaginea de 200x, cu ajutorul bobinei proiectoare, ceea ce echivalează cu o mărire totală de 20.000x. Instrumentele perfecționate pot realiza măriri suplimentare de 160.000, iar imaginea poate fi fotografiată la 1.000.000x mărire.

Microscopul electronic este un instrument ideal pentru studiul structurilor submicroscopice celulare, al unor constituienți chimici celulari sau macromolecule purificate. Se poate urmări structura în relief a moleculelor ceea ce oferă o serie de avantaje privind înțelegerea acestora.

Există și dezavantaje prin faptul că preparatele biologice trebuiesc fixate, deshidratate și colorate, procedee ce produc o serie de alterări ale structurilor celulare.de asemenea, bombardamentul cu electroni induce alterări de ordin structural sau chimic.

4

Disciplina Biologie celulară și moleculară-lucrări practice

5

i Anizotrop = 1. proprietate a unui corp de a prezenta caracteristici mecanice, optice, electrice, magnetice, variate; eolotropie. 2. (biol.) însuşire a unui organ de a reacţiona diferit la excitaţii externe. (fr. anisotropie)