102

CAPITOLUL 4

NOŢIUNI DE INGINERIE GENETICĂ

Moto:�E adevărat că misterul, nu este comod, te nelinişteşte.Dar dacă misterul ar fi absent, neliniştea metafizică acunoaşterii ar dispărea şi omul ar deveni mineral.�

Petre Ţuţea

Aprofundarea cunoştinţelor de genetică moleculară, cunoaştereastructurii fine a genelor şi a cromozomilor, a deschis noi posibilităţi de izolare şisinteză a genelor, de transfer de la o specie la alta, uneori chiar îndepărtatefilogenetic, de cultură �in vitro� a celulelor şi de hibridare a acestora.

Ingineria genetică poate fi definită ca un ansamblu de metode şi tehnicimoderne prin care este posibilă manipularea materialului genetic la nivel celularşi molecular.

La nivel celular, ingineria genetică a însemnat extinderea hibridărilorcelulare în afara graniţelor determinate de specie, obţinându-se hibrizi celulariîntre diferite specii de procariote şi eucariote, între celule vegetale şi animale.

La nivel molecular, ingineria genetică a însemnat izolarea genei, sintezaartificială a genei, realizarea ADN recombinat şi transferul de gene de la o speciela alta. În sens strict, ingineria genetică constă în crearea de ADN hibrid sau ADNrecombinat, derivat de la două specii diferite, integrarea şi clonarea acestuia într-ocelulă bacteriană, unde poate funcţiona normal, realizându-se în felul acestatransferul de gene, nu pe cale sexuată, ci pe baza ADN recombinat. În felul acestase deschide calea transformării dirijate a eredităţii organismelor la nivelmolecular, acţionându-se direct asupra bazei moleculare a eredităţii.

În sens mai larg, tot ingineriei genetice îi aparţin şi tehnicile demodificare a structurii şi numărului cromozomilor prin mutaţii, putându-setransfera fie cromozomi întregi de la o specie la alta, fie segmente de cromozomi,domeniu al ingineriei genetice denumit chirurgie cromozomică. În acestdomeniu, de remarcat sunt rezultatele obţinute de J. G. O'Mara (1940), care areuşit să combine caracterele a două specii prin transferul unuia sau a câtorvacromozomi de la diferite specii. S-a reuşit transferul unor cromozomi în cadrulunor hibridări intergenerice, grâu x secară sau grâu x pir, transferându-se gene ceconferă rezistenţa la rugina galbenă şi neagră de la secară şi respectiv pir, la grâu.

Primul transfer de gene a fost realizat în 1928 de către E. Griffith, prinexperienţele de transformare genetică, urmat de transferul de gene cu ajutorulunui ADN purificat, realizat în 1944 de O. T. Avery şi colaboratorii, cu o eficienţămult mai mare.

103

Din multitudinea de aspecte ale ingineriei genetice, vor fi prezentateaspecte privind sinteza artificială a genei, hibridarea celulară la animale şi plante,haploidia prin androgeneză, importanţa cercetărilor de inginerie genetică.

4.1. SINTEZA ARTIFICIALĂ A GENEI

Sinteza artificială a genelor a fost precedată de o altă mare realizare şianume sinteza artificială a ADN de la virusul ∅ x174 de către Arthur Kornberg,laureat al premiului Nobel (1959) fiind descrisă în capitolul anterior.

H. G. Khorana, genetician american de origine indiană, împreună cu oechipă de cercetători din Massachusetts, a realizat în 1970, prima sintezăartificială a unei gene şi anume gena ce determină sinteza unui ARNs cetransportă aminoacidul alanina la nivelul ribozomilor, la Saccharomycescerevisiae. Această genă este destul de mică, formată din 77 nucleotide, iartehnica folosită a fost următoarea: s-au sintetizat pe cale chimică, segmente deADN formate din 10-14 nucleotide. Cu ajutorul enzimei ligaza s-au asamblataceste segmente rezultând segmente bicatenare mai lungi. S-au obţinut 3segmente mai lungi cu ajutorul enzimei polinucleotid-kinaza, care au fost legateîntre ele rezultând segmentul de ADN, corespunzător genei ARNs ce transportăaminoacidul alanina la ribozomi. Această genă nu era funcţională biologic.

În anul 1973, geneticianul D. Agarwal, a sintetizat artificial o genă de labacteria E.coli, ce determină sinteza ARNs ce transportă aminoacidul tirozina laribozomi. Această genă s-a dovedit a fi funcţională biologic. În anul 1975geneticianul A. Efstradiatis şi echipa sa de la Universitatea Harvard, au sintetizatartificial genele ce intervin în sinteza hemoglobinei la iepure, fiind prima sintezăartificială a unei gene de la mamifere. În anul 1976 H. Köster, a sintetizat genapentru hormonul angiotensina, care reglează tensiunea arterială şi contracţiamusculară la om, fiind prima genă umană sintetizată artificial.

În ultimii ani s-au sintetizat artificial genele ce determină sintezahormonului de creştere, somatostatina şi a insulinei.

În prezent tehnica de sinteză artificială a genei utilizează ARNm, care cuajutorul enzimei reverstranscriptaza, determină sinteza de ADN complementar şideci de gene.

Sinteza artificială a genelor prezintă o importanţă deosebită. Dacăgenele sunt inserate în virusuri sau plasmide, acestea le pot transfera în celulelebacteriene. Celulele bacteriene vor putea sintetiza o serie de enzime, hormoni,antibiotice şi, deoarece bacteriile se pot creşte uşor, va fi o cale foarte eficientă deproducere a acestor substanţe. Genele sintetizate artificial vor putea fi integrate încromozomii celulelor, în locul genelor cu defecte, combătându-se astfel, cauzaunor maladii ereditare şi nu efectul lor.

104

4.2. IZOLAREA GENEI

A fost efectuată pentru prima dată de J. Beckwith de la UniversitateaHarvard din SUA, în anul 1969. Izolarea primei gene s-a realizat la bacteriaE.coli, cu ajutorul fenomenelor de transducţie specializată şi sex-ducţie. Mai întâis-a izolat întregul operon lac. Genele care constituie acest operon sunt: genelestructurale (z, a şi y), gena reglatoare (i), promotorul (p) şi operatorul (o).

Prin cartarea acestui operon s-a stabilit că ordinea acestor gene înoperon este: a y z o p i.

Etapele mai importante ale izolării genei lac sunt redate în fig.4.1. Înprima etapă prin transducţie specializată fagul λ s-a detaşat de cromozomulbacteriei alături de gena gal, iar alături de acesta s-a ataşat un factor de fertilitateF ce conţinea gene ale operonului lac. În etapa a doua, operonul lac a fost inseratîn cromozomul bacteriei, în mijlocul genei gal, iar fagul λ într-o regiune alăturată,dar separată printr-un segment din cromozom. În cea de a treia etapă s-au separatbacteriile la care s-a pierdut segmentul dintre gena lac şi fagul λ astfel că fagul λeste plasat adiacent genei lac. Fagul λ capătă mai întâi o formă circulară, avândinclus şi operonul lac (etapa 5), iar în ultima etapă prin iradieri cu raze U.V. faguls-a eliberat de cromozomul bacterian, şi-a recăpătat forma lineară având inclus îninteriorul său operonul lac.

Fig.4.1. Etapele izolării operonului lac la bacteria Escherichia coli

105

Operaţiile descrise mai sus s-au efectuat şi cu un alt fag, ∅ 80, cerealizează transducţia specializată. ADN al fiecărui fag are o catenă cu o greutatemoleculară mai mare (catenă �grea�) şi o catenă cu o greutate moleculară maimică (catenă �uşoară�). Prin denaturare, catenele fagilor s-au izolat una de alta,iar prin ultracentrifugare s-au separat catenele �grele� de cele �uşoare�. Catenelegrele s-au pus împreună şi prin procesul de renaturare, între ele, se refac legăturilede hidrogen, dar numai în zona operonului lac, acolo unde cele două catene aunucleotide complementare, în rest catenele rămân distanţate. Cu ajutorulenzimelor ce hidrolizează ADN monocatenar, s-au eliminat catenele libere,rămânând doar operonul lac, bicatenar.

Izolarea genelor a avut o importanţă deosebită pentru că a deschis caleaspre studiul aprofundat al materialului genetic �in vitro�, dar mai ales spretransferul de gene de la un organism la altul.

4.3.TRANSFERUL DE GENE (TRANSGENEZA)

În natură se realizează pe mai multe căi: la organismele superioare, înprocesul de fecundare sau prin transducţie cu ajutorul virusurilor, iar laorganismele inferioare (procariote) transferul de gene se realizează prinintermediul fenomenelor de transformare, conjugare, sex-ducţie şi transducţie.

Transferul de gene între speciile îndepărtate filogenetic are la bazătehnica ADN recombinat, care constă în realizarea de hibrizi moleculari ADN,ce provin de la cele două specii.

Perfecţionarea tehnicii ADN recombinat nu a fost posibilă decât dupădescoperirea unor enzime care rup molecula de ADN în anumite puncte, denumiteendonucleaze de restricţie (restrictaze) şi a ADN-ligazelor care resudeazămolecula de ADN, în vederea realizării de ADN hibrid.

Enzimele de restricţie se găsesc în număr foarte mare, fiecare fiindspecifică unei anumite secvenţe de nucleotide, deci unei gene. Recunoscândsecvenţa specifică, restrictazele determină tăieturi la nivelul ambelor catene deADN, fragmentând molecula.

Restrictazele constituie adevărate bisturie biologice, cu ajutorul cărorase poate desprinde din molecula de ADN, o genă ce urmează a fi transferată.Genele ce trebuiesc transferate pot fi sintetizate �in vitro�.

În realizarea transferului interspecific al genelor, prima problemă cetrebuie rezolvată este izolarea unei gene, prin una din tehnicile descrise şi găsireaunui vector sau vehicul. Rolul de vehicul îl poate avea atât ADN plasmidial, cât şiADN al unor virusuri cum ar fi, λ, SV40. În general vehiculele sunt molecule deADN circular.

În anul 1973, A. Chang şi S. Cohen, au reuşit să obţină plasmide hibridecare conţineau genele de la două bacterii şi anume gena pentru rezistenţa latetraciclină, de la E. coli şi gena pentru rezistenţa la penicilină de laStaphylococcus aureus.

106

O altă cale prin care se realizează transferul de gene este folosirea cavectori a virusurilor temperate, care la un moment dat se găsesc integrate încromozomul bacterian, sub formă de profagi. La un moment dat, profagii seeliberează din cromozomul bacterian şi produc liza bacteriei. În acest caz,bacteriofagii pot lua o genă din cromozomul bacteriei şi la o nouă infecţie o pottransfera într-o altă bacterie.

În anul 1971, geneticianul C. Merril a reuşit să transfere gena cerăspunde de metabolizarea galactozei de la bacteria E. coli în celulele umane.Pentru realizarea acestui transfer s-a procedat astfel: bacteriile E .coli au fostinfectate cu bacteriofagul λ, care se inseră adiacent genei gal din cromozomulbacterian. Se provoacă liza bacteriei şi se vor elibera fagi λ care posedă gena gal.Aceşti fagi recombinaţi au fost introduşi într-o cultură de celule umane, ceproveneau de la un individ ce prezenta maladia ereditară galactosemia (lipsagenei ce determină enzima necesară metabolizării galactozei, în glucoză). Dupăun timp s-a constatat că celulele umane au început să metabolizeze galactoza. Sepoate spune că bacteriofagii se comportă în mod similar cu plasmidele, putândîncorpora în cromozom gene străine, pe care le poate transfera în alte celule pecare le infectează.

Aceste transferuri de gene deschid mari perspective mai ales în cazultransferului de gene de la plante sau animale în celulele bacteriene, care ar puteasă producă pe medii relativ simple, mari cantităţi de enzime, hormoni, proteine, decare are nevoie omenirea.

În acest sens se poate menţiona transferul genei ce determină sintezaovalbuminei, proteină din oul de găină, la E. coli K12 (λ). S-a izolat mai întâiARNm ce codifică ovalbumina din ovocitul găinilor. Folosind fenomenul decomplementaritate s-a sintetizat ADN, respectiv gena ovalbuminei care a fostinclusă apoi într-un plasmid recombinat, care prin fenomenul de conjugare a fosttransferat în celula bacteriană. În urma acestui transfer, celulele bacteriene auînceput să producă între 30000-90000 molecule de ovalbumină, ceea ce reprezintăîn jur de 0,5-1% din cantitatea totală de proteine a bacteriei. A. Riggs (citat de P.Raicu, 1980) a reuşit să transfere gena ce determină sinteza insulinei umane înpancreas, la o bacterie care a început să sintetizeze insulina. Insulina umană esteformată din două catene polipeptidice alcătuite din 21 şi 30 de aminoacizi. Înexperienţa amintită A. Riggs a folosit o genă sintetizată artificial.

În anul 1977 s-a reuşit să se transfere gena ce determină sintezahormonului de creştere somatostatina, produs de hipotalamus, pancreas, stomac şiintestine, din celulele umane în celulele bacteriene care au început să sintetizezeacest hormon.

O altă realizare a ingineriei genetice este transferul genelor ce determinăsinteza interferonului din celulele umane în celula bacteriei E.coli.

Interferonul este o proteină cu rol antiviral şi este produs de leucociteleumane din sânge. Cercetările Institutului de Oncologie şi Imunogenetică dinVillejuif arată că interferonul este capabil să vindece şoarecii bolnavi de diferitetipuri de cancer, ce nu păreau induse de virusuri, că această substanţă stimulează

107

globulele albe, denumite NK (natural killers - celule ucigaşe), o linie de apărareîmpotriva celulelor canceroase.

Producerea interferonului prin infectarea leucocitelor cu virusuri, pentrua stimula fabricarea de interferon, era foarte scumpă şi se obţineau cantităţi infimede substanţă. La începutul anului 1980, Charles Weismann de la Institutul debiologie moleculară din Zurich, a realizat sinteza interferonului, cu ajutorulbacteriei E. coli.

Astăzi se ştie că interferonul are următoarele funcţii: inhibă creştereacelulelor în general, reglează activităţile imunitare, măreşte activitatea celuleloralbe (ce recunosc şi distrug celulele tumorale), stimulează celulele macrofage cedistrug virusurile, bacteriile şi alte particule.

Se poate spune că interferonul este un mediator celular, deoareceacţionează ca un activator al celulelor specializate în distrugerea virusurilor şi acelulelor canceroase şi nu un antibiotic antiviral.

Transgeneza, transferul de gene sau fragmente de ADN de la unorganism (donor) la altul (receptor) se poate realiza fie prin metoda directă(introducerea moleculei de ADN în celule receptor), fie prin metode indirecte(ADN este introdus în receptor printr-un vector).

Prin metoda directă, ADN exogen poate fi transferat în celule gazdăprin mai multe tehnici: endocitoză, electroporare, microinjecţie, macroinjecţie şibiolistic (Butnaru Gallia, 1999).

Endocitoza presupune obţinerea mai întâi a protoplaştilor, celulevegetale cărora li s-a îndepărtat peretele celular rigid, pectocelulozic, cu ajutorulenzimelor (pectinaza, celulaza) sau pe cale mecanică.

ADN transformant este adsorbit la suprafaţa celulelor receptoare, iarapoi este inclus în celule. Această metodă presupune protejarea moleculei deADN prin includerea sa în lipozomi, prin tratare cu polietilenglicol şi fosfat decalciu şi existenţa a mai multor molecule de ADN transformant pentru catransferul să se realizeze cu o frecvenţă cât mai mare.

Electroporarea constă în transferul moleculelor de ADN în protoplaşticu ajutorul unor impulsuri electrice de scurtă durată sau cu ajutorul razelor laser(porare laser). Se apreciază că eficienţa transformării genetice este destul de micăfiind dependentă de greutatea moleculară a ADN, concentraţiapolietilenglicolului, durata şi intensitatea impulsului electric, starea fiziologică acelulei receptor (Butnaru Gallia, 1999).

Microinjecţia este o metodă mult mai precisă, deoarece o moleculăcunoscută (ADN, ARN, proteine) se introduce cu o microseringă din sticlămontată pe un micromanipulator, într-un receptor (protoplast, celulă animală),fixat pe o lamă de sticlă, în gel de agaroză.

Metodele biolistice constau în introducerea unui ADN exogen într-unreceptor prin intermediul aşa numitului tun de particule sau cu ajutorul arculuielectric.

Cu ajutorul tunului de particule, microparticule de aur sau tungstenasociate cu molecule de ADN donor sunt direcţionate într-o celulă sau grup de

108

celule. Celulele sau ţesuturile bombardate cu aceste microparticule, crescute pe unmediu de cultură vor regenera plante, transformate genetic.

Transgeneza indirectă presupune izolarea unui segment de ADN (ogenă), clonarea genei respective şi transferul într-o celulă receptor prinintermediul unui vector (Butnaru Gallia, 1999).

Gena ce trebuie transferată a primit denumirea de pasager; de obiceipasagerul, pătruns într-o celulă receptor este degradat de sistemul enzimatic alacesteia. Pentru a evita această degradare, gena (pasagerul) se asociază cu unvector, iar împreună constituie o macromoleculă complexă, de ADN recombinant.

Izolarea ADN de la diferite organisme procariote sau eucariote serealizează prin diferite metode fizico-chimice (centrifugare, tratare cu diferiteenzime etc.). Deoarece fragmentul de ADN izolat poate conţine mai multe geneeste necesară fragmentarea acestuia, pentru izolarea genei (pasagerului) ce trebuietransferată. Pentru izolarea unei gene de interes se foloseşte ARNm al geneirespective, care în prezenţa reverstranscriptazei se va transforma într-o moleculăde ADN complementar (ADN-c) monocatenar. În prezenţa ADN-polimerazei I,ADN-c îşi va sintetiza catena complementară, devenind ADN bicatenar, care vaavea înscrisă informaţia nucleotidică din ARNm.

Genele ce urmează a fi transferate nu vor fi funcţionale dacă nu auataşate promotorul, intensificator sau atenuator ai transcripţiei informaţieigenetice, care intră în structura genelor şi reglează activitatea acestora.

În procesul de transgeneză sunt absolut necesare enzimele de restricţie(endonucleaze de restricţie), produse în mod natural de bacterii, cu rol imunitar,respectiv de a distruge moleculele de ADN exogen ce pătrund în acestea. Suntcunoscute în prezent peste 500 de tipuri de endonucleaze de restricţie careacţionează ca nişte �bisturie� moleculare, secţionând moleculele de ADN, însecvenţe scurte între două baze azotate adiacente cunoscute (�ţintă�).

Cele mai cunoscute endonucleaze de restricţie sunt: EcoR1 (izolată de laEscherichia coli), Hpa I (din Haemophilus parainfluenzae), Alu I (dinArthriobacter luteus) etc.

Aceste enzime acţionează asupra unor secvenţe de nucleotide constituitedin 4, 5 sau 6 nucleotide, fie pe axul de simetrie al acestora sau de o parte şi dealta a acestuia. Astfel, EcoR1 secţionează ADN în secvenţă hexanucleotidică 5�-GAATTC-3� între nucleotidele G şi A, pe ambele catene ale moleculei, în timp ceAlu I acţionează la nivelul tetranucleotidului 5�-AGCT-3� între nucleotidele A şiG (Cîrlan M., 1996).

Fiecare enzimă are un mod particular, unic, de acţiune, de aceia suntnelipsite în operaţiunile de fragmentare a moleculelor de ADN.

Transgeneza necesită folosirea unui alt grup de enzime şi anume ADN-ligazele, care leagă fragmentele de ADN ce trebuie transferat, de ADN al unuivector.

Trebuie avut în vedere şi receptorul în care trebuie transferat ADNexogen, care poate fi o bacterie, o celulă vegetală sau animală.

Între receptor şi vector trebuie să fie o compatibilitate perfectă, aşaîncât, un vector este funcţional numai la un anumit receptor.

109

4.3.1. Principalii vectori utilizaţi în transgeneză

Vectorii sunt molecule mici de ADN ce încorporează genele ce trebuietransferate (pasagerul). Vectorii trebuie să aibă capacitatea de a pătrunde într-ocelulă gazdă, iar gena ce trebuie transferată să fie marcată genetic cu un markerspecific, pentru a putea fi recunoscută.

Ingineria genetică foloseşte un număr mare de vectori, funcţie depasager şi de receptor.

Plasmidele bacteriene, cromozomi miniaturali, care pot include genestrăine sunt utilizate frecvent ca vectori: plasmida pBR322, plasmida pUC,plasmida Ti, plasmida Ri ş.a.

Ca vectori pentru celulele vegetale, în vederea obţinerii plantelortransgenice se folosesc plasmidele Ti (tumor inducing) de la Agrobacteriumtumefaciens şi Ri (root inducing) de la Agrobacterium rhizogenes.

Mărimea plasmidelor, exprimată în kilobaze (1000 de perechi de baze)este în jurul a 200 kb şi pot include şi transfera segmente de ADN de 8-10 kb.

Un alt grup de vectori îl reprezintă bacteriofagii.Fagul λ, care conţine 48500 pb poate transfera secvenţe de ADN mai

mari de 40 kb.Cosmidele sunt vectori hibrizi realizaţi între fagul λ şi plasmide,

combinând însuşirile plasmidelor şi a fagului, în sensul că sunt funcţionale,exprimându-se fenotipic, fără să se integreze în cromozomul celulelor gazdă. Sefolosesc frecvent pentru clonarea şi transferul fragmentelor de ADN de laeucariote, fragmente de aproximativ 45 kb, care în mod normal nu pot fi incluseîn fagul λ.

Fagii monocatenari au ca material genetic o singură catenă de ADNnotată convenţional cu (+). Această catenă pătrunde în celula gazdă, în momentulinfecţiei, constituind matricea pentru sinteza unei catene complementare, notatăcu (-). Împreună cu catena (+) va forma o moleculă bicatenară de ADN, carepoate fi izolată şi folosită pentru clonarea ADN.

Există şi alţi vectori, cum ar fi vectorii de expresie, a căror gene pot fitranscrise şi translate în proteine, virusul SV 40 (Simian Virus 40), vectorii YAC(Yeast Artificial Chromosome) � cromozomi artificiali ai drojdiei de bere,vectorii BAC (Bacterial Artificial Chromosome) etc.

4.3.2. Realizări ale transgenezei la plante

În ultimii ani s-au realizat plante transgenice, denumite şi plantemodificate genetic.

Aşa cum s-a specificat anterior, la plantele superioare se folosesc cavectori ai genelor �de interes� plasmidele Ti de la Agrobacterium tumefaciens,care în mod natural dau naştere la tumori şi plasmidele Ri de la Agrobacteriumrhizogenes, care dau naştere la rădăcini filiforme.

110

Plasmidele Ti, datorită regiunii denumite ADN-T funcţionează catranspozoni (elemente genetice mobile). Numai această regiune se integrează încromozomul celulei gazdă.

Bacteriile din genul Agrobacterium oferă singurul exemplu de ingineriegenetică naturală, deoarece în urma infecţiei, bacteria transferă în nucleul celuleivegetale o mică porţiune din ADN al plasmidei, care determină transformareacelulei infectate în celulă tumorală. Prin eliminarea genelor tumorale(oncogenelor) şi asocierea acestei plasmide �dezarmate� cu o plasmidă ce conţinegena �de interes�, clonată în bacteria Escherichia coli se obţine un vector detransformare foarte eficient pentru dicotiledonate (în condiţii naturaleAgrobacterium nu atacă monocotiledonatele).

Indiferent de metoda de transfer, frecvenţa de integrare a genelor îngenomul celulei vegetale este destul de redusă. Din această cauză, genei �deinteres� îi este asociată o genă marker, care permite selecţia celulelortransformate. Se folosesc frecvent ca gene marker, genele care conferă rezistenţăla un antibiotic sau la un erbicid, care-i va permite celulei transformate săsupravieţuiască pe un mediu de cultură ce posedă antibioticul sau erbicidul.

Cele mai importante plante transgenice aflate deja în cultură sunt soiaRoundup Ready, tolerantă la erbicidul total Roundup (care are ca principiu activglifosat) şi porumbul Bt, rezistent la atacul sfredelitorului (Ostrinia nubilalis),urmând a se obţine plante tolerante la doi sau mai mulţi factori (rezistenţă la unerbicid asociată cu rezistenţa la o insectă, androsterilitate asociată cu rezistenţa laun erbicid etc.).

O altă realizare a ingineriei genetice o constituie tomatele, la care s-amodificat procesul de coacere a fructelor, denumite Flavr Savr, fructelemenţinându-şi prospeţimea timp îndelungat. În acest caz, s-a folosit tehnologiaARN antisens, blocându-se sinteza uneia din enzimele ce degradează pereţiicelulari ai fructului sau a hormonului etilenă (cel care accelerează procesul decoacere, aceasta fiind întârziată).

O altă direcţie a ingineriei genetice este transferul genelor nif de laplantele leguminoase la plantele cerealiere.

4.3.3. Transferul genelor fixatoare de azot

Plantele din familia Leguminoase (mazărea, fasolea, bobul, soia etc.) aucapacitatea să fixeze N atmosferic cu ajutorul unor bacterii cu care trăiesc însimbioză. Bacteriile fixatoare de azot pătrund în ţesuturile rădăcinilor, formândaşa numitele nodozităţi, iar din această simbioză beneficiază ambele specii:plantele obţin azotul atmosferic iar bacteriile obţin de la plante compuşii organicide care au nevoie. Există şi alte plante, în afară de cele leguminoase, care trăiescîn simbioză cu bacterii fixatoare de azot: unele graminee (Digitaria), chiar uniiarbori cum ar fi aninul (Alnus).

111

Azotul atmosferic poate fi fixat de unele bacterii din genurile:Rhizobium, Azotobacter, Desulfovibrio, Hydrogenomonas etc. sau de unele algeverzi-albastre.

Mecanismul fixării azotului atmosferic a fost descifrat în 1960, înlaboratoarele Du Pont de Nemours (SUA). La bacteria Clostridium pasteurianums-a izolat enzima nitrogenaza, care catalizează fixarea azotului atmosferic.Această enzimă este formată din două molecule proteice, una cu greutatemoleculară mare (220.000 daltoni) şi cealaltă cu greutate moleculară mică (55.000daltoni). Molecula mare conţine atomi de fier, sulf şi molibden, iar molecula micădoar fier şi sulf. Cele două molecule sunt active împreună şi numai în absenţaoxigenului atmosferic. Protejarea moleculei de nitrogenază împotriva oxigenuluiatmosferic este asigurată de un pigment denumit leghemoglobină care se combinăcu oxigenul şi protejează astfel enzima.

Sinteza enzimei nitrogenaza este determinată de un grup de gene notatecu nif care sunt localizate pe cromozom alăturat de gena his, ce determinămetabolismul histidinei. Se pare că este vorba de două gene nif: una ce determinăsinteza moleculei mari a nitrogenazei şi alta ce determină sinteza moleculei mici.

Transferul genelor nif de la bacteriile fixatoare de azot la altelenefixatoare se poate realiza pe căile cunoscute de recombinare la bacterii:transformare, conjugare, sex-ducţie şi transducţie. Geneticianul R. Dixon de laUniversitatea din Sussex (Anglia) a transferat genele nif şi his de la bacteria F+de Klebsiella pneumoniae, la bacteria F- de E. coli.

Tot Dixon în 1974 a obţinut un factor de fertilitate recombinat careincludea în el şi genele nif, denumite FN 68. Acest factor de fertilitate, introdus înmediul de cultură a unor bacterii incapabile să fixeze azotul atmosferic (ex.E.coli), a produs transformarea acestora în bacterii fixatoare de azot.

Pentru transferul genelor nif se pot folosi ca vectori şi bacteriofagii înprocesul de transducţie. S. Stroicher a folosit fagul P1 pentru transferul genelornif.

Transferul genelor nif de la o bacterie la alta a creat premisele realizăriiunor simbioze a acestor bacterii nu numai cu leguminoasele, ci şi cu alte plantecare nu au capacitatea de a fixa azotul atmosferic.

În viitor se preconizează transferul acestor gene nif în cromozomulplantelor sau în cromozomul cloroplastelor, situaţie în care plantele nu ar maiavea nevoie de simbioze cu bacteriile, plantele fixându-şi direct azotul atmosferic.

4.4. HIBRIDAREA CELULARĂ LA ANIMALE

Hibridarea celulară �in vitro� a fost realizată pentru prima dată în 1960de cercetătorul francez G. Barski. A cultivat pe un mediu artificial celule ceproveneau de la două specii de şoareci şi a observat că unele celule au fuzionatrezultând celule hibride, care însumează cromozomii de la celulele iniţiale şi auînsuşiri morfologice, fiziologice şi biochimice diferite de ale celulelor iniţiale.

112

Fuzionarea spontană a celulelor se realizează cu o frecvenţă foarte mică.Pentru a mări frecvenţa celulelor hibride s-au căutat o serie de agenţi inductoricare să favorizeze hibridarea celulară. Virusul Sendai inactivat s-a dovedit a fi unbun inductor, capabil să mărească foarte mult frecvenţa celulelor hibride. S-auidentificat o serie de substanţe chimice care stimulează hibridarea celulară: unanalog al isoleucinei, polietilenglicolul etc.

O altă problemă ce a condiţionat hibridarea celulară a fost modul deseparare sau selectare a celulelor hibride de restul celulelor din mediul de creştere.S-au elaborat aşa numitele medii selective, în care celulele hibride se înmulţesc întimp ce celulele parentale sunt eliminate.

Folosind tehnicile prezentate mai sus, s-au reuşit hibridări celulare întrecelule de la specii foarte diferite: celule de hamster chinezesc x celule de şoarece,celule umane x celule de şoarece, celule umane x celule de ţânţar, celule deşoarece x celule de găină.

Celulele hibride nu pot regenera organisme hibride complet dezvoltate,dar se înmulţesc până la un anumit moment, rezultând clone celulare hibride.Obţinerea acestor clone celulare hibride are un rol foarte important în cercetărilede genetică.

Dacă ne referim la hibridările dintre celulele umane x celule de şoarece(fig.4.2.), s-a constatat că celulele hibride conţin iniţial toţi cromozomii (46 de laom + 40 de la şoarece). În momentul când încep să se dividă, celulele hibridepierd câte un cromozom ce aparţine unei specii. În cazul hibridării celule umane xcelule de şoarece se pierd o parte din cromozomii umani.

Fig.4.2. Hibridarea celulară la animale

113

Această particularitate a celulelor hibride, a fost folosită în alcătuireahărţilor cromozomice, deoarece eliminarea a câte unui cromozom se manifestăprin lipsa sau prezenţa în plus a uneia sau a mai multor enzime, putându-selocaliza unele gene pe cromozomi. Pentru localizarea mai precisă a genelor îndiferite regiuni ale cromozomului se folosesc pentru hibridare celule umane ceprovin de la indivizi ce prezintă anumite restructurări cromozomice. S-au realizathibrizi celulari între leucocitele ce produc interferon şi celulele tumorale,rezultând celule de tip hibridoma, ce produc o cantitate mult mai mare deinterferon.

4.5. HIBRIDAREA CELULARĂ LA PLANTE

Hibridarea celulară la plante s-a putut realiza numai după ce s-au obţinutaşa numiţii protoplaşti, care sunt celule vegetale cărora li s-a îndepărtatmembrana rigidă pecto-celulozică. Îndepărtarea membranei pecto-celulozice s-arealizat la început pe cale mecanică iar mai târziu, după anul 1960, prin metodechimice, folosind o serie de enzime cum ar fi: celulaza, pectinaza, macerozima. Înanul 1971, francezul J. P. Nitsch a obţinut o plantă complet dezvoltată, prinregenerarea protoplaştilor (fig. 4.3.). În ultimii ani s-au izolat protoplaşti şi s-auregenerat plante întregi la: soia, morcov, petunia, bob, mazăre, grâu etc. (Raicu P.,1980).

Fig. 4. 3. Obţinerea enzimatică a protoplaştilor

114

Fuzionarea protoplaştilor ridică aceleaşi probleme ca şi fuzionareacelulelor animale: mărirea frecvenţei celulelor hibride şi selectarea acestora.Pentru a mări frecvenţa de fuzionare a protoplaştilor se folosesc:polietilenglicolul, nitratul de sodiu, ionii de Ca la un pH ridicat, ser proaspăt deiepure etc.

Selectarea celulelor fuzionate se realizează prin folosirea de mediiselective, care elimină celulele nefuzionate păstrându-le pe cele hibride. La plantes-a constatat că mediile de cultură ce nu posedă substanţe de creştere (citochininăşi auxină) elimină celulele parentale, în timp ce celulele hibride se pot dispensa deaceste substanţe.

P. S. Carlson (1972) a obţinut plante hibride întregi, prin fuzionareaprotoplaştilor de la speciile de tutun, Nicotiana glauca (2n=24) şi N. langsdorffii(2n=18). Plantele rezultate erau amfiploizi ce aveau 2n=42 cromozomi, identicicu hibrizii obţinuţi pe cale sexuată (fig.4.4.)

Această metodă de obţinere a hibrizilor a permis însă obţinerea dehibrizi celulari între speciile îndepărtate filogenetic care în mod obişnuit nu se pothibrida sexuat: morcov x tutun, porumb x ovăz, porumb x soia, morcov x petunia.

Fig. 4.4. Hibridarea celulară la plante

115

Un aspect foarte important este acela că protoplaştii pot includemolecule de ADN străine, existente în mediu, particule străine(virusuri) şi altemolecule. Fenomenul a fost numit transgenoză, iar pe această cale se pottransfera gene sau chiar organite citoplasmatice de la un organism la altul.

Din punct de vedere genetic, protoplaştii prezintă o serie de avantaje:- permit înmulţirea rapidă a unor genotipuri valoroase;- se pot obţine hibrizi celulari între două specii îndepărtate din punct de

vedere filogenetic, care nu se pot încrucişa sexuat;- se pot obţine forme cu grade diferite de poliploidie;- se pot induce mutaţii la nivelul protoplaştilor haploizi sau diploizi;- se pot transfera gene, cromozomi sau cloroplaste;- protoplaştii pot regenera plante libere de viroze.În ultimii ani cercetările privind hibridarea celulară a luat o mare

amploare, reuşindu-se hibridarea unor celule animale cu celule vegetale. În anul1976 A. Lima de Faria (Suedia) a reuşit fuzionarea unor celule tumorale umane detip HeLa cu protoplaşti de morcov, folosind polietilenglicolul ca agent inductor.

Aceste hibridări urmăresc combinarea unor genotipuri extrem dediferite, depăşindu-se limitele impuse de reproducerea sexuată.

4.6. HAPLOIDIA PRIN ANDROGENEZĂ LA PLANTE

Dezvoltarea partenogenetică a unui embrion sau a unei plante dintr-unmicrospor haploid poartă numele de androgeneză iar dezvoltarea unui organismhaploid dintr-o oosferă sau un nucleu secundar al sacului embrionar se numeşteginogeneză.

În anul 1964 cercetătorii indieni S. Guha şi S. C. Maheswari au cultivatpe un mediu artificial, antere de Datura innoxia şi au obţinut numeroşi embrioizi.Cu doi ani mai târziu s-au obţinut plante haploide complet dezvoltate la tutun(Nicotiana tabacum) (Raicu P., 1980).

Androgeneza este de două tipuri: directă şi indirectă (fig.4.5.).Androgeneza directă constă în faptul că programul normal al microsporului estedeviat sub influenţa unor stimuli externi, având loc o evoluţie particulară anucleului haploid, care prin diviziuni mitotice devine embrioid şi apoi plantămatură. În cazul androgenezei indirecte, se formează mai întâi un ţesutnediferenţiat denumit calus, din care se pot diferenţia apoi plante haploide cudiferite grade de poliploidie.

Obţinerea unor plante haploide prin androgeneză este condiţionată denumeroşi factori, cum ar fi vârsta anterelor, temperatura, lumina, compoziţiamediului de cultură, fapt ce a făcut ca numai la unele specii să se poată obţinehaploizi pe această cale.

Pentru genetică, haploizii obţinuţi prin androgeneză prezintă o mareimportanţă. În primul rând se demonstrează că în nucleul celulelor vegetale existătoată informaţia ereditară a organismului, inclusiv programul embriogenezei,deoarece dintr-o singură celulă se regenerează un organism întreg.

116

Plantele haploide sunt pure din puncte de vedere genetic, deoarece sunthemizigote, existând o corespondenţă completă între genotip şi fenotip.

Prin dublarea numărului de cromozomi se obţin plante diploide, complethomozigote, aşa numitele linii izogene, într-un timp foarte scurt, de o importanţădeosebită pentru ameliorare. Dacă prin metodele clasice liniile homozigote laplantele alogame se obţin în 8-9 generaţii de consangvinizare, prin haploidieliniile homozigote se obţin într-o singură generaţie.

La plantele haploide se manifestă toate genele recesive iar mutaţiile sepot detecta foarte uşor.

Haploizii s-au dovedit utili în studiile de embriogeneză experimentală,de citologie, citogenetică, de mutageneză, de fiziologie şi biochimie, decitodiferenţiere, datorită faptului că expresivitatea genelor la plantele haploide,care sunt hemizigote, este totală, într-o singură generaţie.

Fig. 4.5. Haploidia prin androgeneză directă şi indirectă