Universitatea din CraiovaFacultatea de Matematic i tiine ale NaturiiDepartamentul de ChimieSpecializarea: Calitatea mediului

LUCRARE DE DISERTAIE

Coordonator tiinificLect. Dr. Simionescu Andreea AbsolventIovanescu Alexandru Mihai

Craiova2015

Universitatea din CraiovaFacultatea de Matematic i tiine ale NaturiiDepartamentul de ChimieSpecializarea Calitatea mediului

Materiale pe baz de silice mezoporoas utilizate pentru construcia de nanobiosenzori enzimatici

Coordonator tiinific lect. Dr. Andreea Simionescu

AbsolventIovanescu Alexandru Mihai

Craiova2015 CUPRINS

Introducere I Cromatografia pe strat subtire de inalta performanta (HPTLC) 1.1 Principii generale......................................... 1.2. Mecanismele de separare ale substantelor 1.3. Consideratii teoretice ....................................... 1.4 Faze stationare1.5 faze mobile1.6 Tehnici de developare

Capitolul II. Titlul Capitolului 2.1. Titlul subcapitolului........................................ 2.2. Titlul subcapitolului........................................ 2.3. Titlul subcapitolului.......................................Concluzii.........................................................................Bibliografie.......................................................................

Introducere Un obiectiv primordial in controlul calitatii produselor naturale sau sintetice il constituie separarea si identificarea corecta a principalilor constituenti . De aceea , este necesara o metoda simpla , rapida , exacta si necostisitoarea de studiu si aplicare practica . De peste 40 ani aceasta tehnica , impreuna cu varianta ei moderna , cromatografia pe strat subtire de inalta performanta (HPTLC ) , a fost utilizata la analiza alimentelor , a aditivilor , falsurilor , contaminatilor si produsilor de descompunere ,incluzand determinarea unor clase de compusi organici , ca : aminoacizi , lipide si acizi grasi , zaharuri , vitamine , acizi organici , pesticide ,etc. Prin utilizarea fotodensitometrelor de catre HPTLC , la determinarile cantitative s-au obtinut rezultate comparabile cu cromatografia de gaze (GC) si cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC). Cromatografia pe strat subtire a evoluat in ultima vreme ca urmare a optimizarilor teoretice si practice a tuturor aspectelor privin procesul cromatografic. Pentru a face diferenta intre practica moderna si cea conventionala , aceasta metoda se numeste cromatografie pe strat subtire de inalta performanta (HPTLC) sau cromatografie pe strat subtire instrumentala . Aceasta tehnica analitica se utilizeaza in separari si identificari de substante in diferite domenii, cum ar fi : aminoacizi din proteine alimentare , alcaloizi halucinogeni din plante , steroizi din urina ,morfina din sangele toxicomanilor ,micotoxine din alimente , pesticide din apa, sol si alimente , poluanti din atmosfera , etc. Multe din aceste analize se pot efectua in mai putin de o ora. Similar altor metode cromatografice denumite ,,de inalta performanta analistii inteleg prin aceasta o putere mai mare de separare cu un timp mai scurt de analiza .

I Cromatografia pe strat subtire de inalta performanta (HPTLC) 1.1 Principii generale Separarea substantelor din proba de analizat are loc prin repartitia diferita a componentilor acesteia, in urma unor procese fizico-chimice ce au loc la suprafata fazei stationare (solide) prin trecerea continua a unei faze mobile ( lichide) care poarta compusii respectivi . Fiecare solut (component) difera in comportarea fata de gramulele sorbentului fazei stationare si astfel este retinut mai mult sau mai putin la suprafata acestora , separandu-se de ceilalti componenti prezenti in amestecul initial . Separarea depinde de polaritatea moleculei. Un compus polar este retinut mai mult de faza stationara , in timp ce o substanta nepolara are tendinta de a migra in frontul developantului , fiind slab retinuta de sorbent . Acest tip de polaritate nu trebuie confundat cu notiunea de polaritate din chinia organica , care este exprimata in functie de dipol momentul moleculei . In sens cromatografic apar diferente in comportarea unor solventi fara dipol moment , astfel benzenul este mai ,,polar decat ciclohexanul si exemplele pot continua . In orice proces cromatografic , factorul principal al calitatii sale este dat de coeficientul de distributie ,,k care reprezinta raportul dintre cantitatea de solutie de analizat aflata in unitatea de faza stationara si cantitatea de solutie de analizat aflata in unitatea de faza mobila . Coeficientul de distributie ,,k este dependrent de temperatura si de concentratia solutului . La o temperatura data , relatia dintre cantitatea solutului continuta in fiecare faza poate fi redata grafic prin izotermele de adsorbtie . O izoterma de adsorbtie neliniara este apreciata prin forma spotului obtinut la separarea componentului pe cromatograma . Astfel , spotul poate fi concav, convex , poate avea forma alungita (coada), poate fi de forma circulara sau eliptic.

1.2 Mecanismele de separare ale substantelor In timpul unei separari cromatografice moleculele solutului migreaza continuu din faza mobilca in cea stationara si invers. Pe baza interactiunilor ce au loc intre faza stationara si solut se disting urmatoarele mecanisme : adsorbtia, repartitia , schimbul ionic, excluziunea sterica si activitatea biospecifica. Modul particular al sorbtiei poate fi la suprafata unei faze (adsorbtie ) sau in interiorul sau (absorbtie). In funtie de natura fazei stationare se considera cromatografie pe strat subtire de adsorbtie (solid lichid ) sau de repartitie ( lichid-lichid) . In cazul in care faza fixata pe suport este apa sau un alt solvent polar iar faza mobila este un solvent cu polaritate mica tehnica se numeste ,,cromatografie cu faze directe iar cand faza fixata pe suport este un compus nepolar ( parafina ,C 2 ,C8 , C 18 , fenil , schimbator de ioni lichizi) iar faza mobila un solvent apos cu polaritate mare ( solutii de acizi , saruri, etc) tehnica se numeste ,,cromatografie de repartitie cu faze inversate. 1.3 Consideratii teoretice Principalul parametru ce caracterizeaza pozitia unui spot in cromatograme este factorul de retentie RF. Valoarea lui este data de raportul intre distanta Zs de la linia (punctul) de start pana in centrul petei (spotului) componentului separat si distanta ZF de la linia de start la frontul fazei mobile . Valoarea RF masurata in cromatogramele liniare , circulare si anticirculare pentru care conditiile de curgere sunt diferite este redata ecuatia : RF(L)=[ RF (C)]2=1-[1-RF(AC)]2 Unde : RF(L) valoarea RF pentru substantele developate liniar ; RF(C) valoarea RF pentru substantele developate circular ;RF(AC) valoarea RF pentru substantele develoapte anticircular ; Pentru developarea (eluarea) liniara cu curgere controlata ( migrare prin capilaritate) si neglijandu-se fluctuatiile fazei de vapori in contact cu stratu de eluent, viteza cu care eluentul migreaza pe placa cromatografica este data de relatia: (z)2=kt Unde : z- distanta de migrare a frontului eluentului, in centimetri ( cm), din pozitia de start, in t secunde ; k- constanta de viteza a fazei mobile (cm2/s) t- timpul in secunde Separarile performante pe straturi cu particule fine se caracterizeaza printr-o serie de spoturi compacte si simetrice , ce cresc uniform in diametru, odata cu cresterea distantei de migrare. Distributia probei in spot este de tip gaussian si eficienta sistemului cromatografic, reprezentata de numarul de talere teoretice este descrisa de ecuatia : N=16[Zs/Wb]2=16[RFZF/Wb]2Unde : N numarul de talere teoretice; Zs- distanta de migrare a substantei; ZF- distanta de migrare a fazei mobile; Wb- diametrul spotului . Gradul de separare a doi componenti se exprima prin notiunea de rezolutie , Rs si inglobeaza atat notiunea de eficienta de separare, cat si notiunea de selectivitate de separare, fiind definita prin ecuatia : Rs=2[(ZS1-ZS2)/(Wb1+Wb2)] Unde: ZS1 distanta de migrare a componentului 1, avand latimea picului Wb1; ZS2 distanta de migrare a componentului 2, avand latimea picului Wb2 ; Pentru doua spoturi cu valori RF apropiate Wb1=Wb2=Wb si considerand ZS=RFZF ecuatia devine : RS=ZF(RF1-RF2)/Wb=(ZF/Wb)RF

Prin urmare relatia dintre rezolutie si valoarea RF este complexa . Aceasta relatie este redata in figura sub forma unei curbe de tip clopot .

Faze stationare Studiat unitar, sistemul cromatografic pe strat subtire cuprinde trei componente de baza : faza stationara , faza mobila si amestecul de separat.Faza stationara este constituita din diferite tipuri de absorbanti similari celor utilizati in cromatografia de lichide pe coloana. Dupa provenienta lor sorbentii pot fi anorganici (alumina, silicagel, silicat de magneziu, etc) sau de natura organica ( celuloza, amidon, poliamida, etc) iar pentru a puteea fi folositi in HPTLC acestia trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii: sa fie o pulbere solida, de culoare alba, cu granulatie sub 40 m; sa nu reactioneze cu faza mobila sau cu substantele de separat; sa nu reactioneze cu reactivul de identificare; sa nu contina impuritati; sa reziste la temperaturi de 80o C si peste 80o C sa reprezinte o suprafata activa; sa aiba o suprafata specifica mare si un numar mare de poti de diametru mic.

Faze mobile Ca faza mobila se utilizeaza o multitudine de solventi sau amestecuri ale acestora . In mod uzual faza mobila este un amestec de 2 pana la 5 solventi diferiti, selectati pe baza urmatoarelor consideratii : solventii care compun faza mobila trebuie sa fie cat mai puri ; faza mobila nu trebuie sa afecteze chimic sau sa solubilizeze suportul cromatoplacii, absorbantul sau liantul; faza mobila nu trebuie sa produca transformari chimice componentilor separati, deoarece se poate modifica comportarea cromatografica a sistemului; faza mobila multicomponenta nu se va intrebuinta in mod repetat, deoarece raportul intre solventii volatili si cei mai putin volatili se modifica continuu; faza mobila recomandata trebuie sa asigure izoterme de adsorbtie liniare pe o faza stationara data. In acest fel se realizeaza o simetrie a spoturilor si se evita neregularitatile de margine ale acestor ( cozi, suprapuneri, dare , etc) faza mobila trebuie sa separe mai multi componenti dintr-un amestec necunoscut, realizand valori Rf in limitele 0,05-0,95 cu diferenta minima intre RF-urile a doua substante 0,03-0,05; conditiile si durata de pastrare a fazei mobile pot afecta in mare masura reproductibilitatea.

1.4 Tehnici de developare Timpul necesar developarilor este cuprins intre 3-60 min, depinzand de strat, de faza mobila si de tehnica aleasa pentru developare. In cromatografie pe strat subtire conventionala se folosesc urmatoarele tehnici : 1. Tehnica ascendenta: consta din ascensiunea fazei mobile datorita capilaritatii, printe granulele stratului subtire al unei placi cromatografice dispuse vertical, avand marginea inferioara imersata in eluent.2. Tehnica orizontala: placa cromatografica este asezata in pozitie orizontala, alimentarea cu faza mobila efectuandu-se prin intermediul unei benzi de hartie cromatografica imersate in rezervorul cu eluent.Se utilizeaza pentru separarea unor produsi cu mobilitate mica.3. Developarea continua: faza mobila parcurge pe strat o distanta prestabilita dupa care are loc evaporarea continua a acesteia. Evaporarea fazei mobile are loc de obicei la presiune ambianta, utilizand evaporarea naturala sau cea fortata. 4. Developarea multipla unidimensionala: placa cromatografica este eluata pe o anumita distanta, dupa care este scoasa din camera, repetandu-se procesul de developare.5. Developarea multipla automata: aceasta tehnica este o varianta a developarii multiple unidimensionale, care este complet automatizata.6. Developarea bidimensionala: consta din aplicarea probei la unul din colturile placii, urmata de o developare normala pana la distanta fixata.

2Cromatografia in faza gazoasa cuplata cu spectometria de masa (CG-MS)Principii generale Atat cromatograful de gaze cat si spectometrul de masa sunt aparate relativ simple conceptual iar datele analitice pe care le furnizeaza sunt usor de inteles si utilizat. Cand aceste doua instrumente sunt combinate intr-un sistem CG-MS, posibilitatile acestui sistem reprezinta nu numai suma celor doua aparate, dar cresterea facilitatilor pe care le ofera este exponentiala. Pentru folosirea potentialului conferit de cantitatile mari de date generate de sistemul CG-MS este necesar un calculator cu un program specializat. Elementele de baza ale unui sistem CG-MS sunt indicate in figura urmatoare :

Cromatografia este o metoda foarte buna de separare a componentilor unui amestec.Are insa dezavantajul ca nu permite identificarea directa a compusilor separati. Spectrometria de masa este in schimb o foarte buna metoda de identificare a unor compusi si necesita cantitati foarte mici de proba ( 10-9-10-10 g) in vederea analizelor. Cuplarea celor doua metode de analiza este deci avantajoasa . Se poate face mai intai o separare cromatografica a componentilor unui amestec, iar apoi acestia sa fie analizati pe rand, cu ajutorul unui spectometru de masa.

Interfete pentru cuplarea CG-MS Pentru cuplarea cromatografului de gaze la spectrometrul de masa este necesara o interfata deoarece gazul purtator , impreuna cu compusii, la iesirea din coloana se gasesc la presiunea atmosferica iar in camera de ionizare a spectrometrului de masa presiunea trebuie sa fie foarte mica (10-5 torr). Pentru aceasta cuplare au fost confectionate mai multe tipuri de interfete. Interfataa Watson-Biemann utilizeaza principiul separarii gazului purtator de moleculele probei pe baza diferentelor de masa. Gazul purtator cu proba trec intr-un tub de sticla poroasa aflat in vid. Gazul purtator ( Heliu ) , va trece preferential prin frita de sticla in zona cu vid si este pompat in afara . Capacitatea unei molecule de a trece printr-un por mic din frita este invers proportionala cu masa sa. Ca urmare, se vor pierde putine molecule de proba pentru compusii cu masa moleculara mare . Acesta este unul dintre factorii limitativi ai acestei interfete care a redus aplicarea ei in practica. Interfata cu jet (Ryhage) . Interfata cu jet se bazeaza pe principiul trecerii probei si a gazului purtator de la iesirea din coloana CG printr-o duza pentru un jet mic. Trecand sub forma unui jet, moleculele isi maresc viteza si intra in prima camera cu vid; apoi, printr-o alta duza asezata pe aceeasi directie cu prima intra in a doua camera cu vid si apoi la sursa de ioni a SM. Eficienta unei interfete cu jet este dependenta de debitul de gaz purtator si trebuie sa fie construita pentru debite optime. Interfata cu membrana permeabila. Interfata cu membrana permeabila se bazeaza pe principiul trecerii probei si a gazului purtator din cromatograful de gaze pe suprafata unei membrane de cauciuc siliconic avand in partea opusa camera de vid a sursei de ioni. Interfata cu membrana permeabila este usor de folosit, ieftina si nu produce multe probleme de functionare. Interfata cu membrana permeabila este preferata pentru analizele organice de tip general si in cazul utilizarii coloanelor umplute. Prelucrarea datelor Desi, in anumite limite se pot obtine date corespunzatoare daca se utilizeaza un cromatograf de gaze fara ajutorul calculatorului, acest lucru nu mai este valabil in cazul sistemelor CG-MS. Cantitatea de date este atat de mare incat nu este practic posibil sa se obtina rezultatele dorite prin metode standard. Inainte de a se efectua analiza CG-SM este necesara calibrarea analizorului de masa. Acesta se realizeaza prin scanarea unui compus de calibrare (de exemplu, perfluorokerosen) pentru care picaturile sunt bine cunoscute. Se obtine un tabel de calibrare care este memorat in calculator astfel ca se vor putea determina valori individuale de m/z pe perioada de scanare a analizorului. Dupa introducerea probei, calculatorul supravegheaza buna functionare a intregului sistem urmarind respectarea parametrilor impusi: temperatura cuptorului CG, initierea si respectarea intervalelor de scanare a maselor, conversia datelor de la detector in valori de masa, etc. Datele sunt culese si inregistrate automat prin scanari la intervale suficient de reduse pentru a se sesiza corespunzator picaturile ( aprox. 0,5- 2s in cazul coloanelor capilare WCOT ).

3PARTEA EXPERIMENTALA Separarea si identificarea eugenolului din plante prin HPTLC si CG-MS Probe de cuisoara , nucsoara si scortisoara au fost extrase prin macerare cu etanol timp de 24 ore si cu solutie apoasa de etanol timp de 48 de ore . Rizomii de cuisoara ( Geum urbanum ) , obligeana (Aconum calamus ) sii radacinile de valeriana (Valeriana officinallis ) au fost hidrolizate iar apoi extrase cu diclormetan . Principiile active din probe au fost separate pe placi HPTLC din silicagel , cu eugenol pur (standard ) sau farmaceutic folosind ca faza mobila n-heptan-acetat de etil (60+40 , v/v ). Dupa developare , componentii au fost vizualizati in lumina UV la = 254 nm . Prezenta eugenolului a fost confirmata prin CG-MS [129] .Eugenolul este prezent in multe uleiuri esentiale fiind constituentul principal in uleiul de cuisoare [130] . A fost separate si identificat in coaja plantelor de scortisoara [131] , in seminte de nucsoara [132,133] sii in radacinile de valeriana [134].Pyka si colaboratorii[136] au separate eugenolul si alti compusi (timol , vanilina , guaiacol ) din valerian ape placi de silicagel 60 si alumina 60 (Merck ) folosind amestecurile benzen -cloroform, benzene acetona , tetraclorura de carbon acetona , cloroform acetona , clorbenzen acetona in diferite proportii ca faze mobile . Cele mai bune separari au fost obtinute folosind amestecul tetraclorura de carbon acetona (98+2 , v/v ) , ca faza mobile pentru alcooli si amestecul tetraclorura de carbon acetona (18+15 , v/v ) pentru fenoli . Acidul valerianic din valeriana a fost de asemenea analizat pe placi HPTLC de silicagel 60 F 254 cu hexan - acetat de etil acid acetic ( 80 +20 +0,5 , v/v ) ca faza mobila . Compusii au fost identificati densitometric dupa derivatizarea cu anisaldehida-acid sulfuric [137] . Eugenolul a fost separat din borneol , nopinol si mirtenol prin TLC pe silicagel cu pentan acetat de etil ( 3 + 1, v/v ) si diclorpentan acetat de etil (9+1 , v/v ) ca faze mobile. Detectia a fost realizata in UV dupa pulverizarea cu vanilina-acid sulfuric si incalzire la 120 C timp de 10 minute [138]. Pentru a determina originea botanica a scortisoarei comerciala , nucsoara si cuisare au fost macerate timp de 24h in etanol p.a. respectiv 48 ore in etanol-apa (1:1, v/v). Probele (20g) din rizmi de cuisoare , obligeana si radacini de valeriana au fost mojarate si macerate in apa distilata timp de 48 ore. Dupa filtrare , eugenolul si alti constituent au fost extrasi cu 25 mL diclorometan. Fiecare extract a fost concentrat prin evaporare iar rezidiul a fost dizolvat in 15 mL diclorometan. Probele din extractele plantei (3L) si eugenol standard si farmaceutic au fost aplicate pe placi de silicagel 60F254 (Merck) folosind micropipete Brand. Placile au fost developate in camere cromatografice normale , nesaturate cu heptan-acetat de etil (60+40, v/v) ca faza mobila. Dupa vizualizarea in UV la =254 nm, fiecare spot din extractele din planta, corespunzand eugenlului, a fost preluat de pe placi si extras ci diclorometan. Extractele au fst analizate CG-MS folosind un gaz-cromatograf Hewlett-Packard 5890 si un detector spectrometru de masa MS-5972. Compusii au fost separate pe o coloana capilara 30mx0,25mm pe care a fost depus un film cu grosimea de 0,25m de 5% fenil-polidimetil-siloxan. Gazul purtator a fost heliu iar temperatura coloanei a fost programata la 50 C cu 5C/min. Temperatura liniei de transfer a fost de 280C . Rezultatele obtinute dupa separarea extractelor prin TLC sunt prezente in figura 1 pentru eugenol din maceratul cu alcool al scortisoarei si analiza prin CG-MS. Figura 1 .

Timpul de retentive, tR, al eugenolului a fost 21,9 min iar identificarea compusului ca eugenol a fost confirmata prin compararea spectrului de masa obtinut din toate extractele cu spectrul eugenolului din fisierul computerului (Wiley Library 275). In concluzie, cromatografia pe strat subtire, permite separarea si identificarea eugenolului din extractele din plante mult mai rapid si mai simplu decat CG-MS .