HEMOGLOBINA: DOZARE, SPECTROSCOPIE, CRISTALE TEICHMANN. HEMATOCRITUL. INDICII ERITROCITARI.

HEMATOCRITUL=fractiunea din sange compusa din celulele sgv, in principal hematii

Barbati: ~45 %Femei: ~ 35 - 40 %Nou-nascuti: ~ 50%Centrifugare 3000rpm, 5-10 min

VARIATIILE HEMATOCRITULUICu nr de globule rosii: scade in anemie, creste in policitemieCu locul de recoltar: sg venos are HCT> sg arterial, dar mai putin decat sg splenicCu statusul de hidratare: hemodilutie vs hemoconcentratieCu raportul eritropoieza / eritrolizaImpreuna cu ceilalti parametri eritrocitari: HCT, Hb, Nr hematii se stabileste dgn de anemie.Tipul de anemie se stabileste in functie de indicii eritrocitari:MCV / VEM= Media volumului globulelor = 80-94 3MCH / HEM= Hemoglobina eritrocitara medie = 25-33 pgMCHC/ CHEM= Concentratia medie a hemoglobinei =32-36%

ANEMIILEIn functie de indici, anemiile se clasifica atfel;1. anemie normocroma, normocitara- hemoragie acuta-anemie aplastica/ hipoplatica-leucemie- boala renala/ hepatica2. anemie hipocroma, microcitara- deficit de fier- pierderi sgv cronice-anemie hemolitica- anemia din inflamatiile cronice3. anemie normocroma, megalocitara- deficit de vit B12- deficit de acid foliciIn functie de cant Hb:-Usoara: 8-11 g/dl-Moderata: 6-8 g/dl-Severa:

HEMOGLOBINA

TIPURILE DE HBConversia de la HbF la HbA apare in primele 3-6 luni de la nastere.65% din Hb este sintetizata in eritroblasti.35% din Hb este sintetizata in reticulocite.

METABOLISMUL FIERULUI

Cantitatea totala de Fier din organism : 4 +/- 0.5 gEste impartit in urmatoarele compartimente:-Hb 67%-Fier stocat ca feritina si hemosiderina 27%-Mioglobina 3,5 %-Enzime oxidative 0.2 %-PlasmaAbsorbtia fieruluiNecesar minim: -nou nascut 10 mg/24h- copii 5 mg/ 24 h-femei tinere: 20 mg/24 h- femei insarcinate: 30mg/24 h- barbati: 10 mg/ 24 h1 Fe2+ leaga 1 O2 => 1 Hb leaga 4 O2 => 1 g Hb leaga 1.34 ml O2La o concentratie a Hb in sg de 15 g/100 ml, sunt 20 ml O2 in 100 ml sg.

IDENTIFICAREA HEMOGLOBINEIMetoda colorimetrica Sahli:Aparatul folosit este hemometrul Sahli,format dintr-un support cu 3eprubete: doua laterale care contin standardul (solutie declorhemina) si una centrala, gradate in unitati Sahli(US), de la 10 la 140 US si uneori si in grame Hb/100ml sange.

In spatele eprubetelor se afla ungeam mat care usureaza compararea nuantelor solutiilor de clorhemina. Aparatul are anexata o pipeta capilara pentru recoltarea sangelui, asemanatoare cu pipeta Potain, dar care nuprezinta portiunea dilatata siare doar un reper la diviziunea 20 l (0,02 ml).Principiu:Se compara Solutia de clorhemina (hematina) obtinuta din sangele din care se face dozarea(Hb+HCl) cu clorhemina standard a aparatului. Metoda este subiectiva, depinde multdesensibilitatea vizuala a persoanei carelucreaza.

Tehnica:In eprubeta centrala se pune HCl pana la diviziunea 10US.

Se recolteaza sange capilar din pulpa degetului sau din calcai(la nou-nascut) direct cu pipeta capilara, aspirandu-se pana la reperul 20 l. Sepoate folosi si sange venos.

3. Se sterge varful pipetei deeventualele urme de sange.

4. Se introduce varful pipetei pana la fundul eprubetei si sesufla cu grija sangelein HCl, fara a se forma bule; se clateste de2-3 ori pipeta cu Solutia dineprubeta, apoi se agita usor pentru omogenizare.

5. Se asteapta 10 minute formarea clorheminei de culoare maron-brun.6.Cu o pipeta Pasteur se adauga putin cate putin apa distilata sise omogenizeaza cu o bagheta subtire de sticla, pana candculoarea solutiei de clorhemina dineprubeta centrala devine identica cu cea a clorheminei standard a aparatului.

Citirea si transformarea US in Grame%:Citirea se face la nivelulinferior al meniscului solutiei declorhemina, direct in unitati sahli(US).Aparatul este astfel realizat incat la 100 US corespund 16 gHB/100 ml sange.De exemplu, se citesc 80 US =>100 US.16 g%80 US..x%=>x=(80x16)/100=12,8%HbValori normale:-nou-nascut: 110-135 US sau 17-20 g%-barbati:90-110USsau15-17g%-femei:80-100USsau13,5-15,5g%

OBSERVAREA CRISTALELOR TEICHMAN= cristale de hematina (clorhemina) - obtinute printratarea Hb cu HCl - rezulta din reactia NaCl cu acid acetic glacial

Tehnica:1.Se face un frotiu, prinpunerea unei picaturi de sange pe lama si intinderea eiin strat subtire cu ajutorul unei lame inclinate la 45.

2. Se usuca frotiul la temperature camerei sau la flacara, maxim 40-45C

3. Se adauga pe frotiu o picatura de amestec acid acetic glacial siNaCl 1% si se acopera cu o lamella.

4. Se incalzeste la flacara pana la fierbere-pana apar bule. Culoarea preparatului devine maron => s-a format clorhemina: hematiile lizeaza, eliberand Hb, iarHCl in stare nascanda descompune Hb in hem+globina siapoi HCl+hem=>clorhemina.

5. Se raceste lent, la temperature camerei si seobserva la MO (obiectivul 10x sau 40x)prezenta unor cristale rombice, brune, numite cristale Teichman

Interpretare: Prezenta cristalelor Teichman arata ca in reactive s-a folosit sange. Este o metoda de identificare a petelor desange, folosita in medicina legala. Nu permite insa precizarea specie de la care provine sangele, pentru ca hemul esteacelasi la toate vertebratele, numai globina difera.

Evidentierea spectroscopica a HbNormal, hematiile contin oxi-Hb, carb-Hb si eventual mici cantitati de met-Hb sicarboxi-Hb. Este importanta cunoasterea spectrelor de absorbtie caracteristice fiecaruia din acesti compusi deoarece pe baza lor se identifica prezenta acestora in sange.

Principiul spectroscopiei: Razele de luminacare trec prin lentilelespectroscopului sunt descompuse in cele 7culori care compun lumina alba: rosu, orange, galben, verde, albastru,indigo, violet.

Hb si derivatii eiau spectre de absorbtie diferite, adica absorb razele luminoase cu o anumita lungime de unda (). Astfel, una sau mai multeculori vor fi acoperite de benzi intunecate, negre, care corespund lungimii de undain care acea substanta absoarbe razele luminoase.

Tehnica: se prepara solutii cu derivati de Hb,se pun in eprubete si eprubetele se analizeaza la spectroscop.

1.Oxi-hemoglobinaSolutia de oxi-Hb (HbO2) se obtine din 20 mlapa si 3 picaturi de sange. La contactul cu aerul solutia capata o culoare rosu-deschis, pentru ca Hb se satureaza cu oxigen.Spectroscopic, se observa 2 benzi de absorbtie:una mai lata care acopera partial culoarea galbena (577 nm) si una mai ingusta peste culoarea verde(536-556 nm).

2.Hemoglobina redusaPentru prepararea solutiei de Hb redusa (HbH+) se folosesc 10 ml din solutia deoxi-Hb la care se adauga cateva cristale de hidrosulfit de sodium.

Culoarea solutiei este rosu-violaceu.

Analiza spectroscopica arata osingura banda de absorbtie care acopera culorilegalben si verde, numita banda Stokes.

Scaderea oxi-Hb si cresterea proportiei de HbH+ peste 1/3 din Hb totala, adica peste 5g%,duce la coloratia albastruie ategumentelor si mucoaselor, numita cianoza.Concentratiile normale ale Hb redusesunt:-0.75 g% in sg arterial-2.4 g% in sg capilar-4.5 g% in sg venosDe exemplu, ininsuficienta cardiaca, insuficienta respiratorie, desaturarea Hb de oxigen creste la nivel tisular, creste concentratie Hb reduse si aparecianoza.

3.Carboxi-hemoglobinaObtinerea solutiei de carboxi-Hb (HbCO) se realizeaza prin barbotarea timp de o ora inSolutiade oxi-Hb, a CO provenit din arderea incompleta a carbunilor.

Solutia are culoare visinie sise gaseste gata-preparata in laborator.La spectroscop, se observa 2 benzi de absorbtie asemanatoare cu ale oxi-Hb: in galben siverde,deplasate putin spre violet.

Pentru a deosebi oxi-Hb de carboxi-Hb, se adauga solutiei cateva cristale de hidrosulfit desodium si seanalizeaza din nou spectroscopic:-Daca este oxi-Hb, se reduce si apare banda Stokes;-Daca este carboxi-Hb, nu se reduce si spectrul nu se modifica.

HbCO este un compus patologia al Hb, format rapid la expunerea sangelui la monoxide decarbon, afinitatea Hb pentru CO fiind de 200 ori mai maredecat penntru oxigen. O concentratie a CO in aerul atmosferic de 0.1% este suficienta pentru ca 50% dinHb sa se combine cu CO.Intoxicatia este letala atunci cand 70% din Hb totala este sub forma de HbCO.

4. Met-hemoglobina

Se adauga 5 picaturi de fericianura de potasiu K3[Fe(CN)6] la 10ml de solutie oxi-Hb sise obtine Solutia de met-Hb, de culoare maron.

Analizata spectroscopic, met-Hb are 4 spectre deabsorbtie: in rosu, galben, verde si albastru. Met-Hb este Hb ce contine Fe3+, care nu fixeaza O2, ci radicalii OH. Astfel, Hb transporta numai jumatate din cantitatea de oxigen (hipoxemie).

Legatura Fe3+OH este mai stabila ca legatura Fe3+O2.

Ca si HbCO, met-Hb deviaza la stanga curba de disociere aoxi-Hb, cedarea O2 la tesuturi facandu-se mai greu. Ca urmare, apare hypoxemia si hipoxia tisulara, semnele clinice aparand la concentratii de peste 50% ale met-Hb din Hb totala. La concentratii peste 60% se instaleaza coma.Sangele in car peste 15% din Hb totala este met-Hb (2g%) are culoare bruna si apare cianoza albastra-cenusie a mucoaselor si tegumentelor.Mici cantitati de met-Hb se formeaza tot timpul, dar Fe3+ este transformat in Fe2+ de o enzima sintetizata in ficat: methemoglobin-reductaza, precum si pecale neenzimatica, de glutationul redus si acidul ascorbic (vitamina C).

Concentratia sanguine normal maxima a met-Hb este 1% la adulti si1.5% la copii, care au mecanismele de reducere sufficient dezvoltate.

Indici eritrocitari

VEM - volum eritrocitar mediu - VEM = Ht x 10/ E Ht hematocrit E nr. Eritrocite / mm3 N = 80-94 3 VEM scazut = microcitoza anemii feriprive VEM crescut = macrocitoza anemii megaloblastice - deficit de vit B 12/acid folic

VOLUM CRITIC ERITROCITAR peste 134 3 hematia se sparge

HEM Hemoglobina eritrocitara medie = cantitatea medie de hemoglobina din eritrocit

HEM = Hb x 10/E

N: 25-33 pg eritrocit normocrom HEM scazut E hipocrom HEM crescut E hipercrom

CHEM - concentratia de hemoglobina medie eritrocitaraProcentul de hemoglobina din eritrocit

CHEM = Hb x 100/HtN : 32-36% scazut : hipocrom , crescut : hipercrom

Indice de sfericitateDiametrul hematiei raportat la grosimea eritrocitului

N : 3 - 3.4

Indicele de sfericitate scade in sferocitoza

Largirea distributiei eritrocitare RDW/RBC distribution weight

Cuantifica heterogenitatea volumului eritrocitarRDW peste 17% in anemiile feriprive ( anemia microcitara talasemii)Valori crescute in stadiile initiale ale carentei nutritionale de Fe

Nu se modifica in anemiile cronice simple