7) MECANISMELE MOLECULARE ALE EXPRESIEI GENICE

Expresia informaţiei genetice se realizează în toate celulele pe baza unui flux informaţional, unidirecţional şi universal, care se conformează dogmei centrale a geneticii: ADN → ARNm → polipeptid (proteină). Prima etapă a expresiei informaţiei ereditare este sinteza ARN (cu ajutorul unei ARN polimeraze ADN-dependente11), prin copierea informaţiei din ADN; această etapă are loc în nucleu şi mitocondrii şi se numeşte transcripţie. A doua etapă este sinteza unui polipetid, prin decodificarea ("traducerea") informaţiei ARNm într-o secvenţă caracteristică de aminoacizi; acest proces are loc în citoplasmă, pe ribosomi, şi este denumit translaţie. Realizarea acestor etape se bazează pe principiul coliniarităţii: o secvenţă liniară de nucleotide din ADN este copiată (complementar) într-o secvenţă liniară de nucleotide în ARN; apoi ea este decodificată (prin “citire” în grupe de trei nucleotide numite codoni) într-o secvenţă, de asemenea, liniară de aminoacizi ce formează un polipeptid.

Înainte de a descrie mecanismele moleculare ale expresiei genice sunt utile următoarele precizări:

Numai o mică proporţie din ADN al celulelor eucariote este exprimat şi determină o proteină. Este vorba de ADN genic codant (vezi capitolul 2.C.2.3.), iar din acesta diferite tipuri de celule diferenţiate transcriu numai anumite segmente de ADN (unităţi de transcripţie).

Întregul proces al exprimării informaţiei genetice este supus unui riguros control care reglează tipul de celulă în care se produce sinteza proteinei, precum şi momentul, cantitatea şi ritmul acestui proces.

Erorile mecanismelor moleculare ale exprimării informaţiei genetice vor genera, firesc, o serie de boli; descifrarea acestor mecanisme va creşte posibilităţile de diagnostic şi tratament.

1. TRANSCRIPŢIA

Transcripţia este procesul de copiere a informaţiei genetice a unei gene, sub formă codificată, complementară şi antiparalelă, într-o molecula de ARN. Acest proces are loc în nucleu.ARN este format din ribonucleotide, cu structura generală [P-R-N]n , în care P = acid fosforic, R = Riboza, iar N = baza azotată (Adenina, Guanina, Citozina şi Uracilul). Prin polimerizarea ribonucelotidelor (în sensul 5'–>3') rezultă o monocatenă, de obicei scurtă. Se deosebesc mai multe tipuri de ARN, cu funcţii diferite: ARNm sau mesager este codant deoarece prin translaţie va determina sinteza unui polipeptid; ARNr sau ribosomal (mai multe tipuri) va participa la formarea ribosomilor, iar ARNt sau de transfer intervine direct în transportul aminoacizilor la ribosomi; alte tipuri sunt ARNsn şi ARNsno(ce intervin în procesarea intronilor sau a ARNr). In cele ce urmează vom discuta mai ales transcripţia ARNm realizată de ARN polimeraza II ADN dependentă.

Pentru a se sintetiza in vivo un ARNm sunt necesare: ADN ca model sau matriţă,enzima ARN polimerază II, factori de transcripţie necesari pentru ghidarea şi activarea ARN polimerazei şi ribonucleotide activate. Numai una din cele două catene ale ADN (3'->5') este transcrisă şi serveşte ca "matriţă" pentru sinteza unei molecule complementare şi antiparalele (5'->3') de ARNm; dar aceasta nu este, la

diferite gene, aceiaşi catenă care este copiată în lungul moleculei ADN, la diferite gene. Alegerea catenei transcrise depinde în mare parte de localizarea şi orientarea promotorului, locul unde se fixează prin intermediul factorilor de transcripţie, ARN polimeraza.

Cele două catene ale ADN-ului, catena transcrisă (3’→5’) şi catena “de referinţă” (5’→3’), au o“nomenclatură” diferită. ARNm, care se formează prin transcripţie, va avea aceeaşi secvenţă de nucleotide (exceptând înlocuirea T cu U) şi acelaşi sens (5'3') ca şi catena ADN netranscrisă motiv pentru care aceasta se numeşte catenă sens iar catena transcrisă este numită adesea antisens. Raportul dintre secvenţa şi polaritatea ARNm pe de o parte şi cele două catene ale ADN pe de altă parte, precum şi unii termeni prin care se definesc aceste catene sunt prezentaţi mai jos:

5'...ATGTTACGACGT... 3' catena ADN "sens" (netranscrisă, de referinţă)3'...TACAATGCTGCA... 5' catena ADN "antisens" (transcrisă)

↓Transcripţie

↓5'...AUGUUACGACGU... 3' ARNm

Înainte de a descrie procesul de transcripţie este necesar să precizăm un element important. ADN este identic în toate celulele somatice (rezultate prin mitoze succesive din celula zigot); diferenţierea lor structurală şi funcţională implică expresia anumitor gene specifice de ţesut, care funcţionează împreună cu genele constitutive (“domestice sau menajere” de la “housekeeping genes” deoarece sunt active în toate celulele) ce controlează metabolismul cellular De aceea, expresia genelor specific tisulare implică activarea selectivă a acestor gene (prin intervenţia unor molecule specific tisulare), recunoaşterea lor de către ARN polimerază şi modularea expresiei lor ca moment, cantitate şi ritm. Fără a intra în detalii, vom preciza că aceste procese se realizează prin:(1) realizarea unei configuraţii “deschise” active a cromatinei în anumite teritorii prin relaxarea structurii sale (“decondensare”) şi acetilarea histonelor nucleosomale;(2) intervenţia secvenţelor sau elementelor cis-reglatoare din regiunea 5’ situată în amonte de zona centrală, transcrisă, a genei: promotorul (cu casetele TATA sau GC şi CAAT) reprezintă semnalul de start al transcripţiei, ce stabileşte localizarea şi direcţia de acţiune a ARN polimerazei; secvenţele specifice de ţesut; activatorii etc. Toate aceste elemente sunt ţinta unor proteine trans-reglatoare numite generic factori de transcripţie (TF); fixarea lor este determinantă atât pentru demarajul transcripţiei cât şi pentru intensitatea ei. Fiecare genă posedă o combinaţie particulară de elemente cisreglatoare.

Procesul de transcripţie la eucariote se desfăsoară în două mari etape, determinate de structura "discontinuă" ("fragmentată") a genelor eucariote. Acestea sunt: formarea ARN mesager precursor (pre-ARNm) sau transcriptul primar14, prin transcripţia integrală a genei (exoni şi introni); maturarea pre-ARNm, printr-o serie de modificări din care rezultă ARNm matur, ce va trece în citoplasmă.1.2. FORMAREA ARNm PRECURSORFormarea pre-ARNm începe prin decondensarea zonei din ADN care conţine genasau genele ce vor fi transcrise. Acest proces implică intervenţia unor factori de transcripţie de clasă I (TF I), modificarea chimică a histonelor (acetilare,

deplasarea H1 etc) care va reduce gradul de compactare a filamentelor cu nucleosomi şi deplasarea (printr-un mechanism încă necunoscut) a nucleosomilor din zona de ADN transcrisă într-un anumit moment.Formarea pre-ARNm se realizează în trei etape.(1) Iniţierea transcripţiei. Prin convenţie primul nucleotid din ADN cu care se începe transcripţia reprezintă "situsul de iniţiere al transcripţiei" (SIT sau INR) şi este numit +1 iar nucleotidul care îl precede -1. Primul "pas" al transcripţiei este fixarea ARN polimerazei în regiunea promotor, situată spre capătul 5' al genei, în amonte de S.I.T. În această regiune, de circa 100 pb, se găsesc secvenţe nucleotidice speciale, identice la majoritatea genelor(secvenţe "consensus"), numite TATA box, CCAAT box şi GC box. Trebuie spus foarte clar că ARN polimeraza nu poate recunoaşte direct promotorul şi nici nu poate iniţia singură transcripţia. Pentru aceasta sunt necesari o serie de factori de transcripţie (TF II sau de clasă II) care se fixează pe secvenţele promotorului pentru a ghida şi activa ARN polimeraza. Enzima şi factorii de transcripţie formează un complex multiproteic de iniţializare. ARN polimeraza este poziţionată şi activată pentru a începe transcripţia la SIT, cu nucleotidul +1.(2) Transcripţia propriuzisă (elongaţia). După fixarea ARN polimerazei, cele două catene ale ADN sunt separate (prin acţiunea TF IIF, cu acţiune de helicază), eliberându-se catena transcrisă 3'5', care serveşte drept matriţă (tipar) pentru aşezarea secvenţială şi complementară a ribonucleotidelor activate; ele vor fi apoi polimerizate de către ARN polimerază, formându-se ARNm; Transcripţia se face numai în sensul 5'3' (deci ARNm este antiparalel faţă de catena transcrisă), fapt ce asigură marea fidelitate a “citirii” informaţiei genetice. ARNm se desprinde treptat de pe catena transcrisă (rămânâd fixattemporar numai la capătul 3’), iar cele două catene ale ADN se reunesc treptat, sub acţiunea unei topoisomeraze, şi refac dublul helix. Trebuie subliniat un fapt important: în molecula de ARNm precursor care se formează - numită şi transcriptul primar18 - sunt copiaţi atât exonii cât şi intronii.(3) Terminarea transcripţiei se face când ARN polimeraza întâlneşte situsul de terminare a transcripţiei; aici se află secvenţa AATAAA (citită pe catena netranscrisă) care semnalează clivarea 3' a transcriptului primar"; ea va corespunde în preARNm secvenţei AAUAAA. Secţionarea ARNm sintetizat are loc (sub acţiunea unei nucleaze) la 15-30 nucleotide în aval de secvenţa AAUAAA din ARN, în dreptul "situsului de poliadenilare". Transcripţia unei gene poate fi realizată de mai multe molecule de ARN polimerază, formându-se mai multe copii de ARNm ce conţin aceeaşi informaţie genetică (această "amplificare" va creşte considerabil în cursul translaţiei şi astfel o genă va determina mii de molecule proteice identice).1.3. MATURAREA ARNm PRECURSORMaturarea nucleară a pre-ARNm cuprinde două procese distincte, destinate să facă ARNm mai "disponibil şi mai util" translaţiei.a. Modificarea extremităţilor ARNm determină creşterea stabilităţii sale(protecţie la degradarea de către endonucleaze) si facilitează transportul în citoplasmă, recunoaşterea şi fixarea sa la subunitatea 40S ribosomală.

La capătul 5' se adaugă, la primul nucleotid al transcriptului primar, o moleculă de 7-metilguanozină,ce formează o structură specială, numită în l. engleză "cap" (bonetă);

La extremitatea 3' se adaugă19 o serie de 50-200 de nucleotide cu adenină, formând o“coadă” poliadenilică. Această operaţie de poliadenilare este caracteristică ARNm (există o singură excepţie: ARNm pentru histone nu este poliadenilat).

b. Procesarea ARN precursor. Aşa cum am precizat, transcriptul primar ARNconţine secvenţe complementare cu întreaga regiune transcrisă din genă (zona centrală sau cadrul de lectură) ce conţine exoni (regiuni exprimate, codante) şi introni (regiuni intercalare, necodante). După sinteză, transcriptul ARN primar suferă o procesare complex ce constă în decuparea precisă şi eliminarea ARN intronic urmată de reunirea/legarea "cap la cap" a ARN exonic, care va forma ARNm matur, alcătuit dintr-o serie continuă şi contiguă de exoni (cineva spunea foarte plastic că în această operaţie "se separă grâul de neghină"). Aceste fenomene sunt denumite "splicing" în limba engleză, "epissage" în limba franceză; termenii corespund cuvântului românesc "matisare", termen tehnic care se referă la "înădirea a doua capete". Excizia şi reunirea sunt operaţii foarte delicate care trebuie să fie deosebit de precise: o eroare de decupare cu un singur nucleotid modifică "cadrul de lectură" şi, după translaţie, va produce o proteină anormală.

Procesul este dependent de existenţa unor secvenţe nucleotidice-semnal situate la graniţa exoni-introni: 5’GT(GU în ARN) sau situs donor şi 3’AG sau situs acceptor; o altă secvenţă importantă este “branch site” (ce poate fi tradus ca situs de branşare, de legătură), ce conţine nucleotidul A, situat foarte aproape de capătul 3’ al intronului. Mecanismul de decupare se derulează în trei etape: (1) secţionare la joncţiunea 5’GU; (2) ataşarea nucleotidului terminal G la nucleotidul A al situsului de branşare şi formarea uneilasou/buclă; (3) secţionarea intronului la joncţiunea 3’AG, îndepărtarea lui şi unirea segmentelor de ARN exonic. Reacţiile sunt mediate de un complex ARN-proteine (“spliceosome”) ce cuprinde cinci tipuri dr ARNsn (“small nuclear”), numite U1-U6, dotate cu activitate enzimatică (ribozime) şi peste 50 de proteine

Ordinea exonilor în ADN şi transcriptul primar este păstrată în ARNm matur. Dar există o anumită flexibilitate în utilizarea exonilor, în sensul că (sub acţiunea unor factori încă necunoscuţi) în celule diferite, vor fi “reţinuţi” în ARNm matur numai o parte din exoni, alţii putând fi îndepărtaţi o dată cu intronii. Acest proces denumit matisarea alternativă a exonilorexplică producerea în ţesuturi diferite a unor mesageri şi deci a unor proteinediferite (asemănătoare dar nu identice) pe baza informaţiei unei singure gene,

2. TRANSLAŢIAA doua etapă a expresiei genice este translaţia20 - procesul de decodificare a

informaţiei genetice din mARN care permite aranjarea secvenţială specifică a amino acizilor şi polimerizarea lor într-o catenă polipeptidică.

Procesul de translaţie necesită, firesc, "un dicţionar" reprezentat de codul genetic şi un aparat de translaţie care trebuie să includă, printre alte componente, şi "traducătorul", reprezentat de moleculele de ARN de transfer (ARNt).

2.1. CODUL GENETIC.Informaţia din structura unei gene este “scrisă” sub forma unei anumite

secvenţe a celor patru tipuri de nucleotide: A,G,T,C. Ea este copiată (transcrisă) complementar (U,C,A,G) în ARNm şi apoi “tradusă” într-o anumită secvenţă de aminoacizi, care vor forma o catenă polipeptidică; această translaţie se face cu ajutorul unui fel de “dicţionar bilingv” care este codul genetic. Codul genetic reprezintă "un sistem de corespondenţe" între o anumită secvenţă de trei nucleotide numită codon şi un anumit aminoacid (tabelul 4.2). Cu cele patru “litere”ale alfabetului genetic” se pot scrie “cuvinte” alcătuite din trei litere; gena ar fi deci “o frază” formată dintr-o înşiruire de codoni, ce determină o anumită secvenţă a aminoacizilor într-un polipeptid.

Proprietăţile codului genetic.(1). Codul genetic este triplet pentru motivul logic că 3 este prima putere a lui 4 (cele patru tipuri de nucleotide) care formează 64 de combinaţii, suficiente pentru cei 20 de amino acizi care se găsesc în structura proteinelor.(2). Codul genetic are un codon iniţiator (AUG) şi trei codoni stop (UAA, UAG, UGA), veritabile semne de punctuaţie cu care se începe şi se termină sinteza polipeptidului. Codonii stop sunt numiţi şi "codoni nonsens" deoarece nu semnifică nici un aminoacid. Ceilalţi 61 de codoni sunt "codoni sens" ce semnifică 20 de amino acizi.

(3). Codul genetic este degenerat (redundant) deoarece mai mulţi codoni semnifică unacelaşi amino acid (de aceea ei se numesc "codoni sinonimi"). Exceptând metionina şi triptofanul, codificaţi de un singur codon, ceilalţi 18 amino acizi sunt codificaţi de 2-6 codoni (deseori deosebiţi prin al treilea nucleotid). Degenerescenţa nu s-a stabilit la întâmplare deoarece aminoacizii cei mai reprezentaţi în proteine sunt cei care posedă cei mai mulţi codoni. Cu toată conotaţia sa peiorativă, caracterul degenerat al codului genetic este unavantaj pentru celulă deoarece unele mutaţii genice ce produc codoni sinonimi nu modifică proteina codificată de genă (mutaţii silenţioase sau iso-semantice). Se poate afirma că degenerescenţa codului genetic este un veritabil sistem de protecţie contra efectelor mutaţiilor.(4). Codul genetic este nesuperpozabil (deoarece codonii vecini nu au un nucleotid comun) şifără virgule (întrucât codonii sunt adiacenţi, neseparaţi printr-un nucleotid cu rol de "virgulă"); codonii sunt definiţi prin simpla grupare de câte trei22. Dacă, printr-o mutaţie, într-unul dintre codon se suprimă (deleţie) sau se inseră (adiţie) 1-2 nucleotide (sau un alt număr care nu este un multiplu de trei) se produce o decalare a cadrului de lectură al genei, rezultând (printr-o nouă grupare câte trei, alţi codoni; în proteina sintetizată se modifică toţiaminoacizii începând cu locul în care s-a produs mutaţia (numită “frame-shift”).(5). Codul genetic este lipsit de ambiguitate întrucât un codon semnifică întotdeauna unanumit aminoacid, totdeauna acelaşi.(6). Codul genetic este universal , acelaşi la toate organismele, bacterie, plantă, animal sau om. Totuşi codul genetic mitocondrial are câteva mici diferenţe faţă de cel nuclear (codoni cu sensuri diferite); unele au fost găsite şi la levuri, paramecii şi la unele arheobacterii. Cu toate aceste foarte mici excepţii caracterul universal al codului genetic este evident. Acest lucru este foarte important în "ingineria genetică" deoarece bacteriile recombinante, în care s-a introdus o genă umană, fabrică proteina umană folosind codul genetic bacterian care, în fond, este acelaşi ca şi la om.

Înainte de a încheia, vom sublinia importanţa cunoaşterii codului genetic şi pentru înţelegerea mecanismului şi consecinţelor unor mutaţii genice (punctiforme) ce produc înlocuirea sau inserţia/adiţia unui nucleotide.

2.2. APARATUL DE TRANSLAŢIE.Aparatul de translaţie este alcătuit din numeroase componente: ARNm, ribosomii, ARNt, aminoacizi, factori de iniţiere, factori de elongaţie, enzime, surse de energie etc. În sinteză, ARNm furnizează informaţia (secvenţa de codoni) care va fi translată într-o secvenţă de aminoacizi în proteină; el se fixează pe ribosom (o particulă alcătuită din ARNr şi proteine) şi care reprezintă platforma de sinteză a polipeptidului. ARNt fixează un aminoacidspecific şi apoi amplasează acest aminoacid în polipeptid, folosind informaţia din ARNma) Ribosomii sunt organite citoplasmatice veritabile "platforme de asamblare a aminoacizilor în proteine" pe baza instrucţiunilor ARNm. Ribosomii eucariotelor sunt alcătuiţi din două subunităţi inegale, [deosebite prin constanta de sedimentare (S): 40S şi 60S], care sunt de obicei disociate şi libere în citoplasmă; ele se reunesc la începutul translaţiei pentru a forma ribosomul activ. Fiecare subunitate este alcătuită din ARN ribosomal şi proteine23, care au rol structural şi funcţional/catalitic (facilitează: fixarea moleculelor de ARNm şi ARNt la ribosom; deplasarea ribosomului, ş.a.). Ribosomii prezintă patru situsuri funcţionale: pe subunitatea mică se află situsul de fixare al extremităţii 5’ a ARNm iar pe subunitatea mare: situsul P (peptidil) şi A (aminoacil) unde se fixează moleculele de ARNt cuplate cu aminoacizii lor specifici, precum şi situsul de fixare al peptidil-transferazei, enzima ce polimerizează aminoacizii într-un polipeptid. În procesul de translaţie, ribosomii se deplasează în lungul moleculei de ARNm, spre capătul 3’. Pe măsura deplasării, alţi ribosomi pot începe translaţia aceleiaşi molecule de ARNm, alcătuind împreună un poliribosom.b) ARN de transfer (ARNt) transportă aminoacizii din citoplasmă la ribosomi,locul sintezei proteice. Aici ARNt recunoaşte codonul din ARNm corespunzătoraminoacidului respectiv, pe care îl poziţionează în dreptul acestui codon; deci ARNt are rolul de "translator". ARNt este un micropolimer de ribonucleotide (75-100 nucleotide), monocatenar, cu o structură secundară şi terţiară "în treflă", relativ identică la toate tipurile de ARNt. El posedă două situsuri importante extremitatea 3'OH este terminată prin nucleotidele CCA, iar la poziţia 3’ a

ribozei adenine se fixează aminoacidul transportat, cu ajutorul unei enzime aminoacil-ARNt-sintetaza;anticodonul, un grup de trei nucleotide situat în bucla opusă extremităţii 3'OH; el recunoaşte, prin complementaritate, codonul din ARNm corespunzător aminoacidului.c)Enzimele şi cofactorii proteici ai translaţiei sunt, deasemeeai elementeimportante. În procesul de translaţie sunt implicate amino-acil-ARNt sintetazele şi peptidiltransferaza. Aminoacil-ARNt-sintetazele sunt 20 de enzime cu o dublă specificitate: recunosc fiecare un anumit aminoacid (foarte probabil pe baza configuraţiei sale spaţiale) precum şi ARNt corespunzător. În acest proces de “încărcare”, mecanismul de recunoaştere între o anumită enzimă şi ARNt specific a fost recent descifrat: enzima recunoaşte specific fie anticodonul unor molecule de ARNt fie o pereche de nucleotide (de exemplu, UG pentruE+alanină) situate spre extremităţile terminale 5' şi 3' ale ARNt; ele formeazăun veritabil al doilea cod genetic. Peptidil-transferaza catalizează formarea legăturiipeptidice între doi aminoacizi. Cofactorii proteici intervin în diferite etape ale translaţiei. Ei sunt reprezentaţi de factorii de iniţiere (IF 1-6), factorii de elongaţie (EF 1-2) şi un factor de terminare (RF). Inactivarea lor (prin diferite toxine microbiene) blochează procesul de translaţie şi produce moartea celulară.

Translaţia se realizează în trei etape succesive: iniţierea, elongaţia şi terminarea translaţiei; fiecare etapă implică molecule diferite şi necesită energie (furnizată de ATP sau GTP).

Iniţierea translaţiei este o etapă complexă care, în esenţă, va plasa primul aminoacid (AA) al proteinei (de la extremitatea sa NH2-terminală) în dreptul codonului iniţiator AUG din ARNm, ce corespunde metioninei, şi va asambla în această poziţie cele două subunităţi ce vor forma ribosomul activ.

Într-un prim timp, ARNm se fixează (cu Cap şi secvenţa 5’.CCACCAUGC-3’) pe subunitatea mică a ribosomului; apoi, se formează un complex de iniţiere între ARNm, ARNt-1 "Încărcat" cu AA-1 (metionină) şi diferiţi factori de iniţiere ai translaţiei (IF2, IF3) cu rol catalizator; anticodonul ARNt-iniţiator este în contact cu codonul AUG al ARNm. Apoi, prin acţiunea unui alt IF, se fixează subunitatea mare 60S şi ribosomul devine activ, deci capabil de a participa la sinteza polipeptidică. ARNt-iniţiator se va palsa direct în situsul P al subunităţii mari a ribosomului.

Elongaţia este o etapă relativ simplă şi repetată succesiv în cursul cărie se formează legături peptidice între AA aşezaţi secvenţial pe baza ordinii codonilor din ARNm.

După plasarea ARNt1 în poziţia P a ribosomului în situsul A (amino-acil) liber vine şi se plasează ARNt-2 încărcat cu AA-2, codificat de al doilea codon din ARNm. In acest momen, sub acţiunea enzimei peptidil-transferaza se realizează legătura peptidică între primii doi aminoacizi, formându-se un dipeptid (legat la ARNt2). După formarea dipeptidului, sub influenţa factorului de elongaţie EF2, GTP şi a unei translocaze, ribosomul se deplasează cu trei nucleotide în lungul ARNm, în direcţia 5'3'. Astfel ARNt-1 este scos din situsul P care va fi ocupat de ARNt-2,

care poartă dipeptidul27. În situsul A eliberat se fixează ARNt-3 cu AA-3 şi, printr-o nouă legătură peptidică, AA-3 este fixat la la dipeptid. Ciclul celor trei faze (acroşarea AA~ARNt la ribosom, formarea legăturii peptidice, translocarea ribosomului) se repetă şi astfel catena polipeptidică creşte la fiecare ciclu cu un aminoacid. De subliniat că pe măsură ce un ribosom avansează în lungul catenei de mARN alţi ribosomi pot începe "lectura" acestei catene formându-se astfel sute sau mii de molecule proteice identice ("amplificare"). Desigur în procesul de sinteză a polipeptidului se pot produce erori dar ele sunt corectate prin diferite mecanisme, ce implică diferite enzime şi factori de elongaţie.

Terminarea. Elongaţia polipeptidului se opreşte când ribosomul ajunge la un codon stop, situsul de terminare a translaţiei. În acest moment se produce dezasamblarea complexului ribosom-ARNm-polipeptid (prin intervenţia unui factor proteic, RF) şi polipeptidul este eliberat din ribosom. Ribosomul poate fi reciclat pentru o nouă sinteză iar polipeptidul suferă o serie de modificări posttranslaţionaleşi capătă forma tridimensională specifica.3. LOCALIZAREA PROTEINELOR

Fiecare proteină, sintetizată pe baza informaţiilor unei gene, funcţionează într-un anumit compartiment celular; de ex., tubulina-în citosol; histonele-în nucleu; succinat coenzima A reductaza-în mitocondrii; glicozil-transferazele-în aparatul Golgi; receptorii hormonilor peptidici-pe membrana celulară; colagenul-în spaţiul extracelular etc. Orice proteină cu o localizare specială posedă în structura ei una sau mai multe “secvenţe-semnal” care vor determina, ca un veritabil “cod poştal”, adresa sa de destinaţie.

O primă sortare a polipeptidelor nou sintetizate separă proteinele care vor ramâne în interiorul celulei de cele care vor fi “exportate”/excretate la exteriorul celulei. Această decizie iniţială este determinată de prezenţa unei secvenţe de 15-30 aminoacizi (hidrofobi), situată la capătul N terminal al proteinelor care vor fi excretate; ea se numeşte peptid signal (semnal peptidic) şi lipseşte la proteinele cu destinaţie intracitoplasmatică. După ce s-au încorporat circa 70 de AA dintr-o proteină excretată, secvenţa semnal devine “vizibilă” din canalul ribosomic şi pe ea se fixează o particulă numită SRP (Signal Recognition Particule), care opreşte translaţia. Complexul SRP-semnal peptidic recunoaşte şi se fixează pe un receptor (“docking protein”) situat pe suprafaţa citosolică a reticulului endoplasmic (RE). După fixare, semnalul peptidic traversează membrana RE iar ribosomii ce efectuează translaţia se fixează la RE; apoi particula SRP este eliberată şi translaţia se reia darpolipeptidul sintetizat este dirijat în lumenul RE (unde secvenţa peptidică care "şi-a făcut datoria" a fost deja clivată), fiind apoi transportat la exteriorul celulei.Printr-un mecanism asemănător se realizează transportul proteinelor nucleare sau mitocondriale sau celor destinate aparatului Golgi. În cazul proteinelor lizozomale şi membranare mecanismele sunt diferite. Proteinele (proteazele) destinate lizozomilor au o secvenţă de aminoacizi care determină adiţia posttranslaţională a manozei-6-fosfat; această modificare determină dirijarea

acestor glicoproteine din RE sau aparatul Golgi în interiorul lizozomilor. Dacă accidental modificare nu se produce transportul proteazele lizozomale neprocesate va fi anormal (în mucolipidoze şi boala celulei I). Proteinele ataşate la membranăse fixează prin secvenţe peptidice şi SRP la un receptor din vecinătatea unui por membranar; ele încep să traverseze membrana prin acest por până când se ajunge la o secvenţă ce opreşte transferul şi determină inserţia proteinei în pătura lipidică a mebranei.

4. MODIFICĂRILE POST-TRANSLAŢIONALE ALE PROTEINELOR.Pe măsură ce un polipeptid se sintetizează, în anumite zone se

formează prin repliere structuri secundare (-elice în proteinele fibrilare sau β-pliere, în proteinele globulare) prin interacţiuni (punţi de hidrogen, punţi disulfidice) între diferiţi aminoacizi învecinaţi sau situaţi mai la distanţă; în felul acesta, la sfârşitul sintezei, polipeptidul ia configuraţia spaţială, tridimensională, specifică, care îi determină activitatea.

În afara modificărilor conformaţionale, polipeptidele pot suferi şi alte modificări calitative, permanente sau reversibile care, în esenţă, fac ca o proteină să devină activă.

Modificările reversibile ale proteinelor sunt reprezentate în special de acetilarea Lys (în cazul histonelor) sau fosforilarea Ser (în cazul kinazelor); aceste modificări pot influenţa, uneori decisiv, activitatea proteinei.

Modificările permanente pot fi de asemenea numeroase şi importante. Clivarea proteolitică a catenei peptidice. După sinteza catenelor polipeptidice are

loc cel mai adesea clivarea metioninei iniţiale şi, la unele proteine, a mai multor aciziaminaţi de la extremitatea NH2 (secvenţa "peptid signal"). Numeroase proteine sunt sintetizate sub forma unui precursor inactiv (pro-hormon, proferment) care nu poate acţiona asupra substratului;

după sinteză, precursorul este clivat proteolitic şi rezultă o proteină matură, activă funcţional. Un exemplu sugestiv este reprezentat de sinteza insulinei. Alteori dintr-un singur precursor proteic (de exemplu., proopiomelanocortina) se pot produce mai multe polipeptide cu funcţie diferită

Hidroxilarea unor aminoacizi, de exemplu prolina şi lizina în cazul colagenului, asigură stabilitatea unor complexe proteice (tripla elice de colagen).

Glicozilarea este un proces întâlnit în cazul glicoproteinelor, care sunt de regula fie secretate, fie localizate la suprafata celulelor. Glicozilarea poate fi inţiată

la nivelul RE (Nglicozilarea unei asparagine prin adăugarea unui oligozaharid comun alcătuit din 14 reziduuri glucidice care va fi procesat ulterior) sau în interiorul aparatului Golgi (Oglicozilarea unei serine prin ataşarea unui rest de N-acetilglucozamină sau a unei treonine).

Adăugarea de lipide este caracteristică proteinelor care vor fi ancorate în membrane plasmatică. În cazul proteinelor care se vor localiza la faţa internă a membranei plasmatice pot fi întâlnite trei tipuri principale de adiţii lipidice: N-miristoilarea (la nivelul glicinei situate la extremitatea amino a proteinelor), prenilarea (la nivelul lanţurilor laterale ale aminoacizilor ramificaţi: cisteina, serina si treonina) şi palmitoilarea (la

nivelul atomului de sulf al cisteinei). În cazul proteinelor care se localizează la faţa externă a membrane plasmatice sunt ataşate grupări glicolipidice, de regulă la capătul C-terminal al lanţului peptidic.

Proteinele pot fi compuse din unul sau mai multe polipeptide (formând o protein multimerică; de exemplu, hemoglobina, fibrele de colagen etc), fiecare fiind supuse unor modificări posttranslaţionale. Astfel, ele pot intracţiona cu o serie de cofactori specifici (de exemplu, cationi bivalenţi Ca+2, Fe+2, Cu+2, Zn+2 sau molecule mici necesare activităţii enzimatice, cum ar fi NAD+) sau liganzi. Toate acestea vor influenţa puternic conformaţia şi deci activitatea proteinei.

5. SINTEZA PROTEINELOR , ORIGINEA ŞI EVOLUŢIA VIEŢII .Originea acizilor nucleici şi a proteinelor, a codului genetic, a aparatului

şi mecanismului de translaţie sunt probleme interesante şi actuale, deoarece ele reprezintă, în esenţă, substratul biochimic al originii vieţii. Faptele certe sunt puţine iar ipotezele numeroase şi divergente. Dogma centrală a geneticii: ADN ARN proteine implică existenţa unor molecule informaţionale dar şi a unor proteine catalitice care să realizeze diferitele etape ale transferului informaţiei genetice. Se pune firesc întrebarea: cine a apărut mai întâi pe Pământ, proteinele sau acizii nucleici; dacă se acordă prioritate acizilor nucleici atunci nimeni nu poate răspunde la întrebarea: cum a fost posibilă replicarea, transcripţia sau translaţia acizilornucleici în absenţa unor proteine catalitice. Astfel, la nivel molecular, clasica dilemă "oul sau găina" se traduce printr-o nouă dilemă "acizii nucleici sau proteinele".

ADN nu poate fi "molecula originară" deoarece este lipsită de activităţi catalitice. Recent s-au descoperit însă ribozimele, molecule de ARN dotate cu activitate catalitică şi s-a presupus că ARN ar putea fi în acelaşi timp o moleculă informaţională şi enzimatică, putând să realizeze singură stocarea, conservarea şi expresia informaţiei ereditare. S-ar putea deci prezuma că viaţa a început "în supa prebiotică" prin formarea spontană a moleculelor deARN, amino acizi şi polipeptide care, acţionând în simbioză, ar fi realizat complexe ribonucleoproteice capabile de "proliferare şi perenizare". Foarte probabil, ARN a apărut înaintea ADN. Caracterul chimio-reactiv al sistemului determină însă instabilitatea sa şi riscul de auto-distrugere. Pentru a evita acest lucru s-a trecut la o etapă superioară "acizi nucleici bicatenari", prin asocierea a două molecule complementare de ARN. Această structură mult mai complexă pierde activitatea enzimatică (preluată de alte molecule polipeptidice) dar asigură stabilitate precum şi perpetuarea informaţiei, prin replicare.

Caracterul universal al codului genetic permite ipoteza logică că toate organismele vii au avut un strămoş comun. El avea un cod genetic deja “elaborat”, identic cu cel actual; în cursul evoluţiei acest cod genetic a rămas “îngheţat”, nu a suferit modificări. Se poate concluziona că apariţia codului genetic şi a aparatului său traducător s-a făcut deci în etapa

prebiotică. Acizii nucleici, primul “pas” al evoluţiei biologice, au apărut pe cale abiogenă şi apoi s-au specializat, unii jucând rol de matriţă, alţii pe cel de translatori. Astfel, acizii nucleici au dobândit capacitatea de a dirija asamblarea aminoacizilor (apăruţi prin acelaşi mecanism abiogen). Iniţial ei realizau acest proces ambiguu şi bidirecţional; ulterior, selecţiaşi evoluţia au exclus ambiguitatea şi au stabilit un sens unidirecţional de lectură a informaţiei din ADN. Evident, în absenţa unor “molecule fosile”, toate acestea rămân la nivel de ipoteze.

O problemă, corelată cu evoluţia iniţială a lumii vii, este absenţa intronilor la bacteriile actuale şi prezenţa lor la eucariote sau ...la bacteriile fosile de tip arheobacterii. Până nu de mult se considera că organismele eucariote provin dintr-o bacterie. Ori, această idee paregreşită: procariotele şi eucariotele actuale provin probabil dintr-un strămoş comun asemănător arheobacteriilor, care posedă un genom cu introni. Probabil că şi codul genetic avea mici diferenţe faţă de cel actual, fiind foarte asemănător cu cel al mitocondriilor. Evoluţia s-a făcut prin pierderea intronilor, totală la procariotele actuale parţială la eucariote. Deci bacteriile actuale, lipsite de introni ar fi ...punctul maxim al evoluţiei (!!) deoarece utilizarea ADN este mai performantă decât la eucariote. Explicaţia s-ar putea baza pe timpul de înmulţire foarte scurt (minute) ce face posibilă succesiunea în timp a unui număr aproape infinit de generaţii, oricum mult mai mare ca al eucariotelor superioare. Această schemă seducătoare nu explică însă amplificarea taliei genomului odată cu "păşirea" pe treptele superioare ale evoluţiei eucariotelor.O altă problemă vizează însăşi originea genelor actuale cu o structură "în mozaic". Compararea (cu ajutorul ordinatoarelor) a secvenţei de aminoacizi a diferitelor proteine relevă la unele proteine existenţa unor domenii comune cu ale altor proteine. Spre exemplu, în structura receptorilor pentru lipoproteinele LDL există un domeniu care se găseşte în structura proteinei C9 a complementului sau alte domenii care există în receptorul EGF(epidermal growth factor) în factorul IX a coagulării sau proteinei C. Deoarece fiecaredomeniu este codificat de un anumit exon, se poate conchide că genele care determină proteinele respective au exoni comuni. Pentru a explica acest fenomen s-a presupus că "...genele pentru proteinele actuale s-au format ca jocul de Lego" adică, prin asamblareaunor exoni (ce ar putea fi nişte "gene mai mici") ce codifică anumite unităţi funcţionale, într-ostructură mai complexă, deci o genă "mai mare" ce determină o proteină mai complexă, cu proprietăţi specifice; mai clar, aceeaşi exoni ar fi fost folosiţi în asamblarea unor gene diferite. Intronii prezenţi încă de la primele bacterii ancestrale ar fi, în această concepţie, “fragmente de gene nefuncţionale”.

REGLAREA EXPRESIEI GENELOR.

Celulele corpului uman, indiferent de structura şi funcţia lor, posedă aceeaşi informaţie genetică, deoarece rezultă prin mitoze succesive din zigot. Expresia genică este însă diferită. Unele gene (constitutive / domestice, de la housekeeping genes) sunt exprimate continuu, în toate tipurile celulare, fiindcă produşii lor proteici sunt necesari permanent celulei (sinteze proteice, producere de energie etc); multe alte gene au o expresie limitată la anumite ţesuturi specifice iar altele sunt complet şi permanent inactivate. În plus, expresia genelor „autorizate” să se exprime prezintă o limitare spaţială (pentru anumite organe, ţesuturi, celule, componente celulare) şi temporală (stadii diferite ale dezvoltării, diferenţierii, ciclului celular), fiind adaptată la natura şi intensitatea stimulilor extracelulari (factori inductibili). Toate aceste fenomene presupun intervenţia unor mecanisme complexe de control a expresiei genice.

Mecanismul molecular comun pentru majoritatea formelor de reglare a expresieigenice este reprezentat de fixarea şi interacţiunea unor factori proteici la secvenţele de reglare ale acizilor nucleici, situate în vecinătatea genei (pe ADN) sau pe ARN transcris. Factorii proteici reglatori sunt codificaţi de gene situate la distanţă; deoarece ei trebuie să “migreze” la situsul de acţiune sunt numiţi generic factori trans-reglatori (sau trans-activi). Secvenţele de reglare la care se fixează aceşti factori se găsesc în aceiaşi regiune ADN sau moleculă de ARN ca şi gena sau transcriptul ARN ce trebuie reglat; de aceea aceste secvenţe se numesc generic elemente cis-reglatoare (sau cis-active). In afară de factorii genetici, controlul expresiei genice poate fi influenţat si de factori negenetici (care nu interesează secvenţa de nucleotide a ADN), cu alte cuvinte informaţia genetică ramâne nemodificată şi, de aceea, au fost denumite modificari epigenetice (epi – peste).1. REGLAREA PRETRANSCRIPTIONALĂ (EPIGENETICĂ)A EXPRESIEIE GENICE

Reglarea pretranscripţională a expresiei genice vizează manifestarea lor “spaţială” în anumite organe, ţesuturi, linii sau tipuri celulare şi chiar celule individuale. După cum se ştie, conţinutul în ADN al tuturor celulelor umane nucleate (provenite prim mitoze succesive din zigot) este virtual identic dar, exceptând genele “domestice/constituţionale” care se exprimăîn toate celulele (deoarece codifică proteine esenţiale pentru viaţa celulei), toate celelalte gene au o expresie specific tisualară sau celulară. Aceasta presupune selecţia anumitor gene în celulele embrionare diferenţiate şi menţinerea acestei expresii diferenţiate în descendenţa lor.Ambele fenomene sunt realizate prin intervenţia unor mecanisme epigenetice şi a unormecanisme de control la distanţă prin structura cromatinei.1.1 MECANISMELE EPIGENETICE

În nucleul celulelor, moleculele de ADN formează cu histonele structuri compacte sub forma fibrelor de cromatină. Pentru ca să se iniţieze transcripţia unei gene trebuie ca factorii proteici de reglare să aibe acces la promotorul genei. Aceasta implică o modificare a structuriicromatinei, mai ales în regiunile de eucromatină, active transcripţional. In general este vorba de o serie de modificari ale histonelor sau de metilarea ADN (mecanism general de menţinere a represiei transcripţiei). Toate aceste

modificari epigenetice au două trăsături esenţiale: caracterul reversibil (care le fac extrem de utile în reglarea expresiei genice) si potenţialul lor ereditar (se pot transmite in succesiunea generaţiilor, precum şi în cursul diviziunilor celulare).a). Modificari ale histonelorModificările histonelor (metilare, acetilare, fosforilare şi ubiquitinare) au rol important în reglarea expresiei genice şi reprezintă un marker epigenetic esenţial. Aceste modificări interesează “cozile aminoterminale” ale histonelor, bogate în aminoacizi precum lizina, arginina şi serina, care sunt “ţinta” modificărilor epigenetice. Fiecare dintre modificările menţionate mai sus interesează specific anumiţi aminoacizi.(1). Metilarea histonelor poate avea loc la nivelul mai multor reziduuri de lizină sau arginină ale acestor histone, dar cele mai importante sunt: metilarea la nivelul reziduului Lys4 al histonei H3 (H3-K4) care este asociată cu expresia activă a genelor, respectiv metilarea reziduului Lys9 al histonei H3 (H3-K9) care este asociată cu atenuarea trasncriptiei. Aceste modificari sunt rezultatul activităţii unor histon-metiltransferaze.(2). Acetilarea histonelor se afla sub controlul unor histon-acetiltransferaze (HAT) caredetermina o relaxare a structurii cromatinei ce favorizează transcripţia si, respectiv a unor histon-deacetilaze (HDAC) care produc o compactarea a structurii cromatinei şi suprimarea transcriptiei. Modificările histonelor se asociază cu modificări ale structurii cromatinei. Cromatina inactivă transcripţional se află într-o conformaţie puternic condensată şi asociată cu fixarea strânsă a histonei H1. In schimb cromatina activă adoptă o conformaţie "mai deschisă"produsă de acetilarea histonelor nucleosomale şi, probabil, de hipometilarea citozinei. In sfârşit, exista o serie de modificări ale cromatinei induse componenta SWI/SNF a complexului transcripţional care, în prezenţa ATP, desface structura nucleosomilor şi favorizează transcripţia.b). Metilarea ADN. Metilarea ADN este al doilea marker epigenetic esenţial. La om, metilarea AND are loc aproape exclusiv în poziţia 5' a citozinei din cadrul dinucleotidelor CpG31, concentrate în anumite regiuni denumite insule CpG, localizate foarte adesea la nivelul regiunilor promotor a numeroase gene, precum şi în interiorul unor gene amprentate . Metilarea ADN este guvernată de acţiunea unor ADN-metiltransferaze şi, probabil, a unor ADN-demetilaze.Au fost identificate două clase importante de ADN-metiltransferaze: DNMT1 este metiltransferaza de menţinere, care metilează dinucleotidele CpG din catenele ADN nascente în cursul procesului de replicare a ADN; funcţia sa este esenţiala în menţinerea modelului de metilare a ADN în succesiunea generaţiilor de cellule. DNMT3A si DNMT3B sunt metiltransferaze de novo, implicate în stabilirea modelului nou de metilare a ADN în diversele etape ale dezvoltarii. DNMT1 si DNMT3A interacţioneaza cu histon-deacetilazele (HDAC) şi ca urmare pot represa transcripţia. Ca urmare, între metilarea ADN şi deacetilarea histonelorexista o stransă interdependenţă.

Metilarea ADN asociată cu deacetilarea histonelor (care creşte gradul de condensare al cromatinei) reprezintă mecanismul principal de represie al transcripţiei la vertebrate şi poate fi considerată ca “o poziţie standard”.

Toate secvenţele care sunt transcrise activ trebuie să fie nemetilate (cel putin în regiunea promotor). Pentru aceasta pledează modificările în metilarecare au loc în timpul gametogenezei şi dezvoltării embrionare.Dezvoltarea embrionară precoce necesită capacitatea de a activa numeroase gene, urmată de inactivarea selectivă a unora dintre acestea, pe măsură ce are loc diferenţierea celulară. Aceasta reprogramare a întregului genom a fost demonstrată a apare imediat după fertilizare şi este consecinţa, cel puţin în parte, a unei demetilări rapide a ambelor genomuri parentale asociată cu decondensarea cromatinei şi activarea genelor esenţiale dezvoltării precoce. Demetilarea apare iniţial la nivelul pronucleului masculin şi se pare că prin mecanisme active (intervenţia unor ADN-demetilaze), pentru ca după formarea zigotului să continue pasiv, la nivelul întregului genom nou constituit. Până în stadiul de blastocist majoritatea genomului este demetilat, excepţie facând genele amprentate. După implantarea embrionului au loc fenomene de metilare de novo care sunt asociate cu stabilirea diferitelor linii celulare şi, deci, cu diferenţierea celulară. Metilarea apare iniţial la nivelul celulelor interne ale blastocistului care vor forma ulterior viitorul embrion, în timp ce celulele care formeaza trofoblastul (din care deriva placenta, sacul galben etc.) ramân hipometilate.

Metilarea ADN poate interveni în represia expresiei genice prin câteva mecanismedistincte. În primul rând, prezenţa grupărilor metil ataşate ADN poate inhiba legarea unor factori de transcripţie la secvenţele lor ţintă. În al doilea rând, represarea expresiei genice poate fi mediată de către o serie de proteine (MECP2, MBD1, MBD2, etc) etc care au capacitatea de a recunoaşte şi a se lega specific la grupările metil ataşate citozinei.

Cunoaşterea acestor fenomene este departe de a fi încheiată dar consecinţele practice încep să se întrevadă. Vom meţiona două aspecte:O serie de proteine implicate în reglarea metilării ADN sau a reglării metil-dependente a expresiei genice au fost identificate recent a fi ţinta mutaţiilor care produc cateva boli genetice. Astfel, mutatiile MECP2 sunt responsabile de producerea sindromului Rett (OMIM 312750) boală genetică dominantă legată de X, letală la sexul masculin, caracterizată prin dezvoltare neurologică normală până la vârsta de 7-18 luni urmată de o deteriorare rapidă a funcţiilor neurologice cu demenţă, autism, mişcări caracteristice ale mâinilor, ataxie şi microcefalie dobandită. Mutaţiile DNMT3B sunt associate sindromului ICF (OMIM 242860), boală autosomal recesivă caracterizată prin anomalii faciale, imunodeficienţă si hipometilarea regiunilor cu ADN satelit ale cromosomilor 1, 9 si 16, cu instabilitatea cromosomilor respectivi. O caracteristică a modificărilor epigenetice amintite (modificari ale

histonelor si metilarea ADN) este potenţialul lor reversibil, ceea ce a condus la posibilitatea dezvoltarii unor noi ţinte terapeutice în diverse boli în care aceste mecanime de reglare sunt perturbate. Aşa sunt azacitidina si decitabina, inhibitori ai metilării ADN sau acidul hidroxamic, inhibitor al histon-deacetilazelor (HDAC).

c) Variaţii în configuraţia ADN

Aşa cum am precizat în capitolul 2.B.2, structura ADN nu este fixă, rigidă. Ea poate suferi o serie de modificări conformaţionale care influenţează interacţiunea dintre anumite secvenţe ale ADN şi diferite molecule exogene reglatoare. Supraînrularea ADN (controlată de topoisomeraze) ar face bazele din regiune promotor a genelor mai accesibile proteinelor reglatoare. Mutaţiile genelor pentru topoisomeraze sau inhibitorii acestor enzime produc o diminuare importantă a transcripţiei unor gene.

Trecerea de la forma B a ADN unor gene la forma Z a ADN ar putea fi vitală pentru reglarea activităţii genice. Astfel, la nivelul unei gene care codifică o componentă a sistemului imun s-a dovedit că secvenţa reglatorie din regiunea promotor este mai întâi convertită în forma de ADN-Z şi abia apoi este activată. Spre deosebire de concepţia clasică se consider că trecerea tranzitorie în configuraţia Z ar face secvenţele ADN mult mai accesibile la factorii de transcripţie.Au fost identificate şi alte variaţii de la forma elicoidală clasică a ADN. Astfel, porţiunea monocatenară a ADN, cu care se termină telomerele fiecărui cromsomom, formează o buclă care se plicaturează şi determină un aspect de quadruplex (quadruplex G). Asemenea structuri au fost însă identificate şi în alte regiuni ale ADN bogate în G; de exemplu, în imediata vecinătate a genei c-MYC, implicată în producerea multor cancere. Mutaţiile care determină abolirea acestei structuri au drept consecinţă activarea acestei oncogene.

In sfârşit, există situaţii în care expresia unor gene este asociată cu o adevarată reconfigurare a genomului produsă prin recombinari somatice. Aşa este cazul genelor implicate în sinteza imunoglobulinelor sau a receptorilor TCR.