1 

 

Raport stiintific  

privind implementarea proiectului pe perioada 

 septembrie 2014‐decembrie 2015 

 Proiectului de cercetare PN-II-PT-PCCA-2013-4-0930, inceput la data 1/09/2014 cu titlul “Design-ul și testarea unei noi familii de medicamente inhibitori de HIV Integraza care nu interferă cu procesul recombinării V(D)J.”, Acronim HIVINVDJ

-Director de Proiect Ciubotaru Mihai.

Institutia Coordonatoare Spitalul Clinic Colentina, Centrul de Cercetare(CDPC).

Rezumatul proiectului 

Nou-născuții de la mame infectate cu HIV (Human Immunodeficiency Virus) trebuie să urmeze un tratament profilactic împotriva infecției virale. Integraza HIV(IN) mediază inglobarea genomului viral in cromozomii celulelor gazdă, si prevenirea acțiunii sale reprezintă o cale majoră de stopare a infecției. In ciuda avantajelor clinice majore (toxicitate redusă comparativ cu cel al analogilor de nucleotide, valori mult mai scazute de IC50, şi reacții adverse mai puțin pronunțate decât al inhibitorilor de proteaze) tratamentul cu inhibitori de Integraza (INi) la nou-născuţi induce o situație aproape paradoxală. Deoarece HIV-IN este asemănătoare atât structural cât și ca mecanism de reacție cu proteina Recombination Activating Gene RAG1 care asamblează receptorii antigenici limfocitari, INi prin interferența cu aceasta reduce abilitatea pacienților sub tratament de a dezvolta un răspuns imun normal. Agenții INi folosiți in prezent reducând activitatea RAG 1, induc iatrogen imunodepresie şi simulează debutul sindromului de imunodeficiență acută dobândită (SIDA). Această situație, la pacienții tratați poate duce la inițierea unei terapii mai agresive cu creșterea dozei administrate, ceea ce generează o accentuare a imunodeficienței. Propunem soluționarea acestei inconveniențe majore a tratamentului cu INi, care actual nu se poate adresa nou-născuților cu risc sporit de infecție.Obiectivul major al proiectului este acela de a descoperi agenți noi inhibitori specifici de Integrază HIV care nu afectează recombinarea somatică mediată de RAG. Elementul cheie de originalitate si creativitate al acestui proiect este conferit de expertiza noastră in domeniul cercetărilor de biofizică adresate activității RAG. Propunem o strategie nouă de screening a compușilor INi ce adresează fiecare din cele trei etape ale procesului de integrare: legarea IN de ADNul viral, tăierea de IN 3' monocatenară a ADNului viral şi reacția de transfer catenar. În prezent strategiile de descoperire de noi medicamente țintesc spre inhibiția doar a uneia din aceste activități enzimatice. Vom folosi rezultate din lucrările noastre asupra activității de legare și indoire a ADN-ului de către RAG(2,3) in recombinarea somatica. Be baza lor, propunem să dezvoltăm atât tehnologii cât și metode rapide, ieftine și eficiente de screening de compuși, bazate pe fenomenul de transfer energetic de rezonanță prin fluorescență (FRET), unele din ele in regim de "single molecule". Cu acestea vom efectua "high-throughput screening"-ul (HTS) unei librării de compuși derivatizați de inhibitori de HIV-IN al cărei design va fi elaborat de noi prin metode in silico. Screening-ul va fi dublu, țintind atât inhibiția HIV-IN cât si neafectarea activității RAG. Aceasta strategie este fără precedent in procesul de descoperire al acestei clase de medicamente. Compușii selectați FRET in vitro vor fi apoi testați ca efect asupra clivării ADN-ul substrat prin RAG. Compușii de aici selectați vor fi apoi testați pe linii celulare primare. Se va testa atât toxicitatea lor cât și efectul lor potențial de inhibiție a progresiei diferențierii celulare de la stadiul de pre B la acela de limfocit B imatur (care necesită recombinarea somatică). Aceasta va fi analizată prin factori de viabilitate si expresia la suprafața celulară a marker-ilor specifici preB/IgM (receptori pre B/ și imunoglobulinici M). Vom testa compușii optimi si pentru modul cum afectează răspunsul la stimularea antigenică nespecifică a celulelor B recoltate de la pacienți cu limfoame B imunodeprimați. Culturi celulare stimulate cu LPS(Lipopolizaharide) si Interleukina 4(IL4), vor testa efectul compușilor noștri evaluat prin teste de proliferare. Față de ceilalți compuși din aceeiași clasă cei

2 

 

de noi selectați nu vor afecta imunitatea celor tratați, motiv ce le va asigura perspective maxime de marketing după testarea pe animale și la nivel clinic pe pacienți.

In cele 15 luni si jumatate de la inceperea proiectului activitatea noastra s-a desfasurat inspre implinirea

completa a obiectivului 1 (subobiectivul 1.1C) ce propunea selectia de compusi chimici in vederea alcatuirii

unei librarii diversificate ulterior supusa selectiei (ce a fost comandata prin subcontractare in 2015 de la

chemdiv-vezi propunerea de proiect pg.24/38). Am reusit sa infaptuim si cele mai importante(Sarcina 4.2

livrabilele 3, 4 si 5) livrabile ale obiectivului 2(Ob1.3.2 pg.13/38 din propunerea de proiect) si anume

exprimarea cu succes a HIV-IN si infaptuirea assay-urilor de screening pentru inhibitia legarii IN de ADN-

ulLTR si respectiv a reactiei de crestare catalitica monocatenara FRET . Am testat assy-urile noastre chiar

cu Raltegravir si acid nigranoic.

OBJECTIVUL 1 (identificat in propunerea de proiect la pg. 13 cu obiectivul 1.3.1 si apoi descris la

pg. 7, subcapitolul 1.1C.)

Enuntam obiectivul 1 asa cum era specificat in propunerea de proiect la pg.13:

Obiectivul 1.3.1 Vom construi un nou model structural de ansamblu al HIV-IN pornind de la structurile fragmentelor IN descrise si pe acesta vom suprapune şi ataşa prin docking compuşii chimici proiectaţi in punctele cheie ale configuratiei IN. Configuraţiile care se potrivesc cel mai bine vor fi ulterior folosite pentru sinteza librăriei de compuşi.

1.1C. Design-ul unei librarii derivatizate de inhibitori de HIV-Integrază HIV prin "in silico docking"

1.1C-1 Prefiltrarea librariei extinse de compusi

Deoarece libraria de compusi chimici a bazei de date chemdiv include compusi din toate domeniile farmaceutice am initiat un sistem de prefiltrare chimica pentru o preselectie numai a compusilor cu potential antiretroviral( ART).

Cautarea de substante organice, inhibitori ai integrazei virusului HIV, s-a

realizat pe baza similaritatii chimice cu raltegravir (Figura alaturata),

primul medicament antiviral din familia inhibitorilor de integraze HIV(7),

aprobat in 2007 de catre FDA pentru tratamentul pacientilor infectati cu

HIV, non-responsivi la tratamentul cu alti agenti retrovirali. Procesul de

dezvoltare a unei librarii de inhibitori

Raltegravir ai integrazei HIV a fost initiat pornind de la colectia de

compusi oferita de compania ChemDiv (http://www.chemdiv.com). ChemDiv este una din companiile cu o

traditie importanta in sinteza de medicamente (din 1991), lider mondial in domeniul dezvoltarii de compusi

chimici, avand in posesie cea mai larga (peste 1.500.000 molecule) si cea mai diversa colectie de compusi,

molecule mici relevante din punct de vedere farmacologic.

3 

 

Baza de date a ChemDiv contine un numar de 28638 compusi inhibitori ai integrazei HIV (analogi de

raltegravir, continand o zona beta-diketo). Aceasta librarie initiala a fost supusa unor etape ulterioare de

filtrare, pe baza unor criterii si algoritmi dezvoltati in cadrul laboratorului de Bioinformatica al Institutului

de Biochimie al Academiei Romane. Au fost aplicate succesiv urmatoarele etape de selectie:

Etapa a: compusi ce contin cel putin 3 atomi de oxigen care nu formeaza legaturi chimice cu doi

atomi de carbon diferiti, acestia fiind necesari coordinarii atomilor de Mg din situsul de legare a

raltegravirului. Acest filtru a redus libraria la 18108 compusi

Exemplu de compus selectat Exemplu de compus exclus

Etapa b: compusi ce contin 3 atomi de oxigen dublu legati de atomi de carbon, rezultand 14473 de

compusi

Exemplu de compus selectat Exemplu de compus exclus

Etapa c: compusi ce contin 3 cicluri, acestea fiind necesare fixarii stereochimice, rezultand 8196 de

compusi

Exemplu de compus selectat Exemplu de compus exclus

Etapa d: compusi ce au cel putin doua grupari cetonice vicinale, rezultand 308 compusi

4 

 

Fig.1 ‐ Domeniul catalitic de tip RNase H Fold 

Exemplu de compus selectat Exemplu de compus exclus

In etapele ulterioare ale proiectului, aceasta librarie de 308 compusi va fi supusa analizei prin docare

moleculara in modelul structural al situsului activ al integrazei HIV, apoi derivatizarii pentru obtinerea de

compusi cu afinitate mare pentru integraza HIV, insa cu afinitate mica pentru RAG-1.

1.1C-2 Elaborarea unui model structural molecular al HIV-IN pentru docarea compusilor selectati in cavitatea de interes.

1. Studiu comparativ al plierii "RNase H fold" la HIV-1 si HIV-2 Tipul de pliere "Rnase H Fold" este intalnit in domeniul catalitic al mai multor tipuri de transferaze: integraze (HIV-1, HIV-2, PFV, Visna virus), transpozaze (Mu, Tn5, Hermes), recombinaze (RAG1), etc. Aceasta pliere este una de tip sandwich alpha/beta/alpha si consta dintr-un mix de foi beta si helixuri alpha in ordinea: β1-β2-β3-α1-β4-α2/3-β5-α4-α5, in care β2 este antiparalela. In cadrul acestui tip de pliere se gaseste motivul catalitic DDE, care este implicat in coordonarea ionilor metalici divalenti (magneziu, mangan) ce sunt importanti pentru reactia catalitica. In figura 1 sunt reprezentate structurile 3D ale domeniului catalitic de tip Rnase H Fold intalnit in cadrul mai multor tipuri de enzime de la om (mai putin integraza de la virusul Visna de la oaie). Dupa cum se poate observa toate structurile selectate au acelasi tip de pliere schematizata in figura centrala colorata in gri. Aminoacizii din cadrul motivului DDE sunt colorati cu rosu si reprezinta centrul activ al situsului catalitic; cu albastru sunt colorati aminoacizii bazici, cu galben sunt colorati aminoacizii aromatici iar cu cyan sunt colorate histidinele din imediata apropierea a situsului catalitic. In toate cazurile schematizate in figura 1 observam o grupare a tipurilor de aminoacizi astfel:

- in zona nordica a Rnase H fold-ului si a motivului DDE sunt grupati aminoacizii aromatici. Acestia sunt preponderent intalniti pe zone de bucle flexibile si ar putea coordona la randul lor medicamente antivirale de tip Raltegravir, care contin in structura lor cicli aromatici, putand astfel interactiona prin interactie de tip stacking cu aminoacizii aromatici (Tyr, Phe, Trp).

- in zona sudica/vestica, de cealalta parte a motivului DDE, intalnim cel mai des aminoacizi bazici. Acestia ar putea fi implicati in interactia cu acizi nucleici, coordonand astfel moleculele de ADN ale caror catene sunt taiate de catre motivul DDE prin atac nucleofil. Tot in zona sudica mai pot fi intalniti aminoacizi aromatici in imediata apropiere a situsului catalitic format de DDE. Aceste informatii denota faptul ca enzimele prezentate aici cu Rnase H Fold sunt foarte similare intre ele iar situsul activ al fiecareia poate recunoaste medicamente antivirale care au structuri similare.

2-Studiu comparativ al secventelor din cadrul Rnase H fold Pentru o analiza mai in detaliu a domeniului catalitic a fost efectuata o aliniere multipla intre secventele proteinelor ale

5 

 

caror structuri au fost reprezentate in figura 1. Astfel, au fost folosite urmatoarele secvente: - integraza HIV-1 cu aminoacizi din regiunea Rnase H fold-ului de la P58 la R187 (cod PDB: 4OVL); - integraza HIV-2 cu aminoacizii de la L58 la R187 (cod PDB: 3F9K); - integraza de la Visna Virus cu aminoacizii de la I60 la R189 (cod PDB: 3HPG); - integraza de la Prototype Foamy Virus (PFV) cu aminoacizii de la F122 la T256 (cod PDB: 3OYA); - transpozaza Hermes cu aminoacizii de la G174-N264 la S567-N606 cu mentiunea ca intre N264 si S567 dispune de un insertion domain (ID) (cod PDB: 4D1Q); - metnaza SETMAR cu aminoacizii de la E473 la S644 (cod PDB: 3K9K); - recombinaza RAG1 cu aminoacizii de la P590-L729 la G951-T995 cu mentiunea ca, la fel ca si in cazul transpozazei Hermes, intre cele doua intervale se gaseste un domeniu de insertie (colorat cu cenusiu in alinierea multipla de secvente de mai jos)(1,2,3,4). In aliniere sunt reprezentati subliniat culoare verde - aminoacizii din motivul DDE, subliniat culoare mov - aminoacizii acizi, cu subliniat albastru cyan - aminoacizii bazici iar culoare gri - aminoacizii hidrofobi. Sub secvente sunt reprezentate structurile secundare corespunzatoare fiecarei secvente. Se observa ca in toate cele 7 proteine, motivul DDE este conservat, exceptie facand metnaza SETMAR in care glutamatul E din motiv nu este prezent, acesta fiind inlocuit cu o asparagina. Dupa cum se poate observa, desi secventele intre ele difera destul de mult, este pastrata similaritatea de structura secundara sustinuta intr-un fel de faptul ca caracterul aminoacizilor care intra in componenta Rnase H Fold-ului este pastrat (ex. in cazul foii beta β2, secventele tuturor proteinelor aliniate sunt preponderent hidrofobe). Principalele diferente care apar se gasesc in zona dintre al doilea D si E-ul din motivul DDE. In cazul transpozazei Hermes si al recombinazei RAG1 aici se gaseste un domeniu de insertie (al carui rol nu se stie insa e posibil sa coordoneze moleculele de ADN de care aceste enzime se leaga), domeniu ce lipseste in cazul integrazelor(1,6). Se observa ca in aceste zone structurile secundare sunt un pic diferite, observandu-se o delimitare intre transpozaze/recombinaze si integraze. Este posibil ca domeniul de insertie sa afecteze si docarea unor medicamente (ex. Raltegravir) in situsul activ, datorita dimensiunii mari pe care aceste domenii le au (~200-250AA). O alta trasatura distincta este data de prezenta insertiilor mari de AA, intre zonele de structura secundara, in transpozaze si recombinaze, comparativ cu integrazele.

3. Pozitionarea Raltegravir in integraza PFV In figura 3 poate fi observat in detaliu modul de legare al moleculei de Raltegravir in situsul activ al integrazei PFV. Dupa cum se observa oxigenii diketo din molecula de Raltegravir (colorata dupa tipul de atomi) coordoneaza legarea ionilor de Magneziu (culoare mov). Se observa o interactie de tip stacking intre capetele aromatice ale Raltegravirului cu Y212 din proteina si una zin bazele ADN (colorat cu verde) din imediata apropiere a ciclului aromatic ce contine Fluor. E posibil ca atomul de Fluor sa destabilizeze la randul sau legaturile de hidrogen de tip Watson-Crick din imediata sa apropiere. Ionii de Mg sunt coordonati in acelasi timp de catre motivul DDE (colorat cu rosu).

6 

 

Fig.2 ‐ Aliniere multipla de secvente in zona RNase H Fold 

Fig.3 ‐ Detaliu legare Raltegravir in situsul activ al integrazei PFV 

Prin analogie Raltegravir-ul va fi la inceput docat in modelul construit de noi pentru HIV-IN si ulterior va trebui sa elaboram un algoritm de marcare prin scor a diferitelor conflicte sterice si de potential electrostatic(penalty score), pe baza caruia sa clasificam compusii librariei noastre potrivit unui scor de fitting. 

4.Purificarea proteineinelor active Necesare Experimentelor de Selectie InVitro

4a. RAG1, RAG2 si HMGB1.

In vederea inceperii reactiilor de selectare a librariei avem nevoie de reactivi proteici puri HIV-IN, RAG1, RAG2. In cazul HIV-IN santem in proces de clonare al enzimei cu codoni opimizati pentru expresia in E. coli

---------β1-------------------------------------β2-------------β3-------------------------HIV-1_int. ----PGIWQLDCTHL---------------------------EGKVILVAVHV-----ASGYIEAEVIP------------------AE- HIV-2_int. ----LGTWQMDCTHL---------------------------EGKIIIVAVHV-----ASGFIEAEVIP------------------QE- VISNA_vir_int. ----IDHWQVDYTHY---------------------------EDKIILVWVET-----NSGLIYAERVK------------------GE- PFV_int ----FDKFFIDYIGPLPPSQGYL----------------------YVLVVVDG-----MTGFTWLYPTK--------------------A HERMES_transp. ----GASATIDLWTDNYIK------------------------RNFLGVTLHYHENNELRDLILGLKSL-----------------DFER METNASE_transp. EPFLDRIVTCDEKWILYDNRRRSAQWLDQEEAPKHFPKPILHPKKVMVTIWWS-----AAGLIHYSFLN-----------------PGET RAG1_reco. PFTVVVKESCDGMGDVSEKH-------------GSGPAVPEKAVRFSFTVMRITIE-HGSQNVKVFEEPKPNSELCCKPLCLMLADESDH ss_HIV-1_int. ----TTEEEEEEEEE---------------------------TTEEEEEEEET-----TTCCEEEEEES------------------SC- ss_HIV-2_int. ----TTEEEEEEEEE---------------------------TTEEEEEEEET-----TTTEEEEEEES------------------SC- ss_VISNA_vir_int. ----SSEEEEEEEEC---------------------------SSCEEEEEEET-----TTCCEEEEEES------------------CC- ss_PFV_int ----TSEEEEEEECCCSCBTTBC----------------------EEEEEEET-----TTCCEEEEEES--------------------S ss_HERMES_transp. ----CCEEEEEEEEETTTT------------------------EEEEEEEEEEEETTEEEEEEEEEEEE-----------------CGGG ss_METNASE_transp. SCCGGGEEEEEEEEEESBCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCEEEEEEEEE-----TTEEEEEEEEC-----------------TTCC ss_RAG1_reco. CEEEEEEECCCCCCCCCCCC-------------CCCCCCCCCCEEEEEEEEEEEEE-CCCCCEEEEECCCCCCCCCCCCHHHEECCCCCH ---------α1----------------------β4-----------------α2----------β5------------------α3---- HIV-1_int. TGQETAYFLLKLA-GRW-------------PVKTVHT-----DN-GSNFTSTTVKAACWWAGIKQEF---GIPYNPQSQGVIESMNKELK HIV-2_int. SGRQTALFLLKLA-SRW-------------PITHLHT-----DN-GANFTSQEVKMVAWWIGIEQSF---GVPYNPQSQGVVEAMNHHLK VISNA_vir_int. TGQEFRVQTMKWY-AMF-------------APKSLQS-----DN-GPAFVAESTQLLMKYLGIEHTT---GIPWNPQSQALVERTHQTLK PFV_int PSTSATVKSLNVLTSIA-------------IPKVIHS-----DQ-GAAFTSSTFAEWAKERGIHLEF---STPYHPQSSGKVERKNSDIK HERMES_transp. STAENIYKKLKAIFSQFNVEDLS--------SIKFVT-----DR-GANVVKS-------LANNIRINCSLSLLSIPASSAASERTFSLAG METNASE_transp. ITSEKYAQEIDEMNQKLQRLQLALVRR---KRPILLH-----DNARPHVA-QPTLQKLNELGYEVLP---HPPYSP-DLLPTNYHVFKHL RAG1_reco. ETLTAILSPLIAEREAMKSSELTLEMGGIPRTFKFIFRGTGYDE-KLVREVE----GLEASGSVYICTLGSIGAWASE--GNESGNKLFR ss_HIV-1_int. CHHHHHHHHHHHH-HHS-------------CCCEEEC-----SS-HHHHHCHHHHHHHHHHTCEEEC---CCCSSTHHHHHHHHHHHHHH ss_HIV-2_int. CHHHHHHHHHHHH-TTS-------------CCSEEEE-----CC-CTTTSSHHHHHHHHHHTCEEEE---SSCCCTTCTTHHHHHHHHHH ss_VISNA_vir_int. CHHHHHHHHHHHH-HHS-------------CCSEEEE-----CS-CHHHHCHHHHHHHHHHTCEEEE---SSCCCTTHHHHHHHHHHHHH ss_PFV_int SCHHHHHHHHHHHTTTC-------------CCSEEEE-----CS-CHHHHSHHHHHHHHTTTCEEEE---CCTTCGGGGHHHHHHHHHHH ss_HERMES_transp. CSHHHHHHHHHHHHHTTTCCCCT--------TCEEEE-----CC-CHHHHHH-------TTTSEEEECHHHHHTSCSCTTTTHHHHHHTH ss_METNASE_transp. CCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHTTSSCC---CCCEEEC-----CTTSSSCS-HHHHHHHHHTTCEECC---CCSSCG-GGCHHHHTHHHHH ss_RAG1_reco. HHHHHHHHHHHHHHHHHHCCHEEEHCCCCCCEEEEEEECCCCCH-HHHHHHH----CCCCCCCEEEEEECCCEEECCC--CCCCHHHHHH ----α3-------------α4------- HIV-1_int. KIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFKR HIV-2_int. NQISRIREQANTIETIVLMAIHCMNFKR VISNA_vir_int. NTLEKLIPMFNAFESALAGTLITLNIKR PFV_int RLLTKLLVGRPTKWYDLLPVVQLALNNT HERMES_transp. NIITEKRNRI-GQQTVDSLLFLNSFYKN METNASE_transp. NNFLQGK-RFHNQQDAENAFQEFVESQS RAG1_reco. RFRKMNARQS--KCYEMEDVLKHHWLYT ss_HIV-1_int. HHHHHHGGGCSSHHHHHHHHHHHHHHCB ss_HIV-2_int. HHHHHTGGGCSSHHHHHHHHHHHHHHSC ss_VISNA_vir_int. HHHHHHGGGCSSHHHHHHHHHHHHHTTC ss_PFV_int HHHHHHHTTSCCCCTTTHHHHHHHHHTC ss_HERMES_transp. HHHHCTTTCC-CHHHHHHHHHHHHHHHH ss_METNASE_transp. HHHHTTC-BCSSHHHHHHHHHHHHHTCC ss_RAG1_reco. HHHHHCCHCC--CCHHHHHHHHHHHHHC

7 

 

a) HMGB1 exprimat in E. coli fuzionat la capatul C terminal cu o terminatie poli 6xHis, purificat prin coloana de afinitate pe Nichel ( Figura alaturata godeurile 1 si 2, 29KDa).

MBP-RAG1(384-1040) si MBP-RAG2 (1-387) coexprimate in fibroblaste umane HEK 293T in urma cotransfectiei cu vectori de tip pcDNA(Fig. 4.RAG1 120kDa si RAG2 87kDa). Acest amestec de RAG1 si RAG2 este optim pentru testarea catalitica a recombinazei RAG(5). In Fig. 4 este ilustrat intreg profilul cromatografic de copurificare pe amiloza al celor doua enzime pornind de la extractul celular, si cele 3 fractii(F1, F2, F3), necesare activitatii de selectie.

4b. Expresia si purificarea Integrazei HIV fuzionate cu Domeniul de legare ADN de tip Zinc Finger E2C(HIV-INE2C)

Un aspect important al intregului proiect il presupune exprimarea si purificarea Integrazei HIV(HIV-IN), enzima cheie necesara desfasurarii tuturor experimentelor de screening in vitro ale compusilor medicamentosi. Pentru a directiona actiunea HIV-IN spre o secventa ADN de recunoastere specifica plasmidul de expresie in E. Coli(BL21-DE3) pHAT2 a fost construit in asa fel incat secventa HIV-IN (codificand 288 aminoacizi) sa fie flancata la capatul sau N terminal de 6 codoni pentru His iar la capatul C terminal fuzionat cu o secventa ce codifica cei 184 aminoacizi ai domeniului de legare specifica a ADN ai proteinei Zinc Finger E2C (vezi Propunerea de Proiect pg. 9 si referinta (8) Tan W et al. 2004). In Fig. 5 sunt prezentate imaginile obtinute de la analizele de electroforeza SDS-PAGE ce caracterizeaza diferitele etape din cursul purificarii HIV-INE2C. Aceasta integraza fuzionata HIV-INE2C a fost exprimata cu inductie in E. Coli( Fig.5A) (8)iar pentru purificarea sa din extractul solubilizat s-au folosit consecutiv trei metode cromatografice: a) de afinitate pentru Ni2+(Fig.5B) b) de schimb ionic – monoQ (Fig.5C) c) de gel filtrare, Superdex 200(Fig.5D). In urma purificarilor se obtine de la 4litri mediu de cultura LB in jur de 0.5mg proteina de puritate 90% asa dupa cum reiese in Fig. 5E, unde este evidentiata proteina obtinuta in

proba finala dupa concentrarea sa prin filtrare selectiva cu centrifugare la o concentratie functionala de 0.5mg/ml necesara folosirii in assay-urile noastre in vitro de selectie.

8 

 

9 

 

5. Testarea activitatii de legare specifica a HIV-INE2C de ADN LTR, si determinarea parametrilor optimi necesari formarii complexului ADN-IN

Prima reactie din propunerea noastra de proiect(Ob1.1D) pe care urma sa o supunem la inhibitie cu agenti medicamentosi antiretrovirali INin era descrisa a fi reactia de legare a HIV-IN la ADN-ul viral si anume la secventele sale de recunoastere LTR marcat fluorescent(Obj 1.1D, pg7). Pentru a dezvolta aceasta reactie este insa necesar atat sa studiem in amanunt reactia de legare a integrazei virale in conditiile propuse in propunerea noastra de proiect cat si sa optimizam aceasta reactie la conditiile de lucru favorabile selectiei in vitro de tip “highthroughput” pe placi cu 96 de godeuri. Reactia de detectie a formarii complexului ADN LTR-HIV-INE2C a fost descrisa in amanuntime in propunerea de proiect (pg7-8). Folosind aceasta schema de principiu in care intr-o prima etapa proteina purificata HIV-INE2C este adsorbita de peretii placii de screening (prin fluorescent) iar in a doua ADN-ul LTR fluorescent marcat este adaugat in placa si incubat cu proteina fixata, doua tipuri de reactii de optimizare au fost intreprinse. In primul tip de reactii am testat efectul concentratiei saline (NaCl) la prima etapa cea de adsorbtie nespecifica a HIV-INE2C de peretii godeurilor placii (high, adsorbent) ce se face la 4oC pe timp de 16 ore in solutie de fosfat salin PBS. In literatura fiind descris efectul sarii asupra specificitatii si eficientei de legare ADN-Integraza am investigat doua solutii de adsorbtie, solutie de fosfat de sodiu conventional PBS (150mM NaCl) pH 7.5 si o solutie de fosfat de sodiu PBS suplimentat la o concentratie finala 300mM NaCl pH 7.5.

Rezultatele acestui experiment sunt prezentate in Fig. 6, pentru o reactie standard cu cele 2 conditii de adsorbtie a proteinei pe peretii placii folosind in conditia de legare o solutie tampon optimala(LB+150mMNaCl,+5%PEG+10%DMSO-LBPD) specificata la punctul 2. in josul figurii(vezi conditii de legare in josul pg 9 si pg10. Toate reactiile din Fig. 6 au fost intreprinse in 3 duplicate in conditii de high throughput HT in placi cu 96 godeuri. Deoarece nu se poate preciza cu exactitate starea de oligomerizare a integrazei in solutie (orice stare intre dimer si tetramer este compatibila cu functia activa) am folosit pentru fitting o reactie Hill cu coeficient parametru n variabil. Spre surprinderea noastra prezenta in exces a sarii (300mM) la adsorbtie faciliteaza retentia unei specii/oligomer mai active de IN ceea ce se

reflecta in constanta aparenta de legare Ka=36.73+/-3.97nM mult mai buna decat cea de Ka=133.14+/-17.52nM obtinuta la salinitatea de 150mM a solutiei de Baza PBS.

Pentru al doilea tip de conditii testate am investigat diferite versiuni de solutii tampon de legare LB toate continand (HEPES 20 mM, MgCl2 7.5 mM, DTT 5 mM, pH 7.5), si la care s-a adaugat fie NaCl

10 

 

50(Fig.7B-LB50) sau 150 mM(Fig.7A) (LB150), sau + 10% DMSO (LBD), sau + 5% PEG (LBP). Si la nivelul reactiilor de ligare sporirea salinitatii la 150mM duce la o constanta aparenta de legare

Ka=129.32+/-7.84nM LB 150 usor mai buna decat cea obtinuta la doar 50mM NaCl, Ka=182.60+/-13.09nM LB50. Efectul PEG, (Polietilenglicol) este acela de a limita interactiunile hidrofobe ale Integrazei

si in acest fel de a stabiliza ordinul de oligomerizare al enzimei aproape de acela de dimer, desi in literatura frecvent acest aspect este controversat, IN fiind raportata in solutii purificata intre dimer-tetramer si chiar la un ordin superior. DMSO(dimetilsulfoniloxid) este un solvent organic folosit pentru solubilizarea compusilor chimici medicamentosi, agent ce va insoti compusii ce urmeaza sa-i testam in screening-ul nostru. Efectul acestor aditivi asupra interactiunii de legare a ADN-ului LTR de catre HIV-IN este ilustrat separat in Fig.8 si cuulativ in Fig.6.

Din pacate  in ciuda  faptului ca experientele din Fig.8 au fost repetate de sase ori rezultatele  legarii sunt modeste, dupa cum reflecta si valorile de confidenta statistica ale fit-urilor obtinute. Din acest motiv

11 

 

consideram faptul ca efectul ambilor compusi PEG si DMSO este cumulativ stabilizand reactia de legare a integrazei exprimate recobinant in vitro, ceea ce explica calitatea superioara a semnalului obtinut in experientele din Fig.6.

6. Testarea activitatii de cataliza monocatenara a HIV-INE2C pe ADN LTR

Folosind conditiile optimizate de la reactia de legare am testat mai apoi activitatea enzimatica a HIV-

IN incepand cu reactia de crestare monocatenara a ADN-ului la capatul 3’, ceea ce indeparteaza un

dinucleotid 5’GT3’ al fiecarui capat liber LTR al cromozomului duplicat viral, lasand in urma cate o grupare

libera 3’ OH initiatoare a etapei ulterioare de transfer catenar. Aceasta prima etapa de cataliza monocatenara

in vitro este generata numai de enzima HIV-IN in stare tetramerica si nu necesita prezenta intregului

complex de preinitiere asa cum decurg evenimentele

intracelular. Prima testare am efectuat-o prin reactii de

biochimie clasica conventionala in vitro folosind HIV-

INE2C purificata si un oligonucleotid dublu catenar ADN

LTR 27-mer marcat la capatul 3’terminal al catenei

inferioare cu Alexa-594(diagrama cutiei din josul Fig.9) .

Tot in Fig.9 (central sus) este ilustrat scan-ul prin

fluorescenta la 620nm al unui gel denaturant de 8M uree

10% acrilamida pe care au fost izolati electroforetic diferitii produsi rezultati la interval de fiecare 20 min

(0’-godeul 1 inceputul reactiei 20’-godeul 2, 40’-3, 60’-4, 80’-5, 120’-6, godeul 7 LTR netratat cu HIV-IN)

in cursul reactiei de crestare monocatenara (la o conc. 800nM, 200nM LTRAlx594bt, HEPES 20 mM,

NaCl 150 mM, MgCl2 7.5 mM, DTT 5 mM, 10%DMSO, 5%PEG, 37o C). In josul gelului se observa

acumularea in timp a produsului de mobilitate crescuta dinucleotid-ul marcat fluorescent rezultat al actiunii

enzimatice specifice. Din pacate aceasta procedura in ciuda evidentierii specificitatii acestei reactii sufera

din cauza sensibilitatii scazute de detectie observabila daca estimam vizual raportul intensitatilor de

fluorescenta a ADN-ului LTR neclivat (LTR_Alexa594, 27mer) fata de cea a produsului de reactie

(Dinucleotid GT_Alexa594). Asa cum descriam in propunerea noastra de proiect(1.1D pg. 7&8/38) am

dezvoltat un assay nou bazat pe fenomenul de transfer rezonant de fluorescenta (FRET) ce foloseste drept

substrat acelasi oligonucleotid ADN LTR marcat la capatul 5’catena de sus cu fluorofor donor D(Alexa 488)

iar la capatul 3’ catena de jos cu fluorofor Acceptor A(Alexa 594) testati in exact aceleasi conditii de reactie

ca si cele prezentate in Fig. 9. Proximitatea celor doi fluorofori in ADN-ul LTR intact (localizati diametral

opus pe ADN-ul dublu elicoidal ≈ 20Å ) permite fenomenul de FRET (Fig.10) evidentiat in spectrele de

emisie fluorescenta (ex = 490nm specifica donorului) atat prin scaderea emisiei donorului D (Fig.10,

comparam spectrul D negru punctat fata de D_A cel albastru la 520nm) cat si prin cresterea fluorescentei

acceptorului (aceleasi spectre in jurul regiunii 620nm). Adaugarea enzimei HIV-INE2C la ADN-ul marcat

12 

 

unic cu donor duce la scaderea prin ecranare nespecifica a fluorescentei donorului D de pe ADN (Fig.10,

comparam intensitatea spectrului D negru punctat fata de cel D+IN violet punctat catre 520nm).

Remarcabil insa este efectul produs de prezenta enzimei HIV-IN la amestecul de reactie ce contine LTR

ADN dublu marcat cu ambii fluorofori (Fig.10, comparam spectrul continuu albastru D_A cu cel trasat

continuu in rosu D_A+IN), efect compatibil cu diminuarea substantiala a fenomenului de FRET ca urmare a

indepartarii acceptorului A de la capatul 3’ terminal al catenei inferioare consecinta desfasurarii catalizei.

Acest clivaj este observabil si cuantificabil prin ambele efecte atat cel de recuperare partiala a fluorescentei

donorului (zona 520 nm) cat si cea de scadere a

emisiei induse FRET a acceptorului (zona 620 nm).

Folosind teoria dezvoltata de Förster am cuantificat

prin ambele procedee(donor quenching & acceptor

sensitisation ) procentul diferenta de FRET inainte si

dupa cataliza enzimatica a HIV-IN ΔE in diferite

solutii tampon similare cu cele testate la reactia de

legare (Fig.11A). Imbucurator, observam din

Fig.11A (histograma verde) faptul ca o solutie

tampon continand PEG si DMSO, ca si-n cazul

reactiei de legare ADN-LTR, sustine optimal si

reactia de crestare monocatenara enzimatica (ΔE=17-

18%). Deasemenea am investigat daca variatia

detectabila de FRET se datoreaza specific reactiei

catalitice. Precum toate enzimele din clasa sa si HIV-

IN (1) si (5) necesita pentru cataliza la nivelul sit-

ului activ DDE prezenta unui cofactor cation

divalent, iar Mg2+ este considerat fiziologic activ in

nucleele limfocitelor. In Fig.11B histogramele din

stanga jos arata fara echivoc faptul ca variatia de

energie FRET detectabila in reactie este strict

dependenta de prezenta unui cation divalent (absenta lui creste fenomenul FRET probabil prin modificarea

quantum yield al fluoroforilor polar incarcati-histograma cea mai din stanga cu ΔE < 0), cat si faptul ca

ionul de Mg2+ este preferential folosit de Integraza purificata de noi (histograma MgCl2 corespunzatoare

incubarii cu Mg2+ conduce la variatia maxiala ΔE testata). Aceasta ultima observatie este o confirmare a

semnificatiei biologice a testarilor in vitro folosind Integraza recombinata folosita de noi. In panelul din

dreapta jos in Fig.11B sunt experiente de FRET ce folosesc diferite concentratii de HIV-IN in assay

13 

 

relevand conditia optimala obtinuta la o concentratie de 800nM enzima compatibila cu saturatia in reactiile

de legare ADN-LTR (Fig.6 si 7).

7. Efectul unor compusi medicamentosi asupra activitatii de cataliza monocatenara a HIV-INE2C evidentiat prin reactia de FRET

Deoarece finantarea proiectului nostru a permis achizitia prin suma alocata din buget a librariei de compusi

chimici medicamentosi abia in luna noiembrie 2015(factura DEX7293, 9 noiembrie 2015 echipa

coordonatoare) am putut testa assay-ul nostru de FRET pe crestarea monocatenara doar pe compusi

medicamentosi

izolati precum

Raltegravir-ul

(Isentress Merk)

Fig.12 A sau

Acidul Nigranoic

Fig.12 B. In

Fig.12 A sunt ilustrate prin histograme efectele a 2 concentratii de Raltegravir(0.5 si respectiv 1M ) sau

DMSO( 2% si 10%+/-PEG) . Efectul de inhibitie al reactiei de crestare monocatenara LTR(Scaderea ΔE

FRET de la valori 18-22% in absenta Raltegravir la ΔE 16-14%) este evidenta la ambele concentratii de

agent chimic si indiferent de concentratia de DMSO. Un efect similar a fost obtinut si in prezenta acidului

Nigranoic(histogramele din Fig.12 B)

In prezent(luna decembrie) folosind iterativ aceleasi proceduri descrise in acest raport am trecut la

screening-ul la scara larga (HT) a librariei de 500 compusi chemdiv prezenti in libraria noastra.

 

 

CONCLUZII

In aceste 15 luni si jumatate de activitate am reusit:

a) Sa prefiltram din libraria de compusi chimici ai chemdiv, un numar fezabil de compusi cu potential

inhibitori de HIV-IN ce urmeaza a fi in silico docati in modelul HIV-IN RNAase H fold.

b) Sa elaboram un model molecular structural al HIV-IN RNAase H fold, pe baza similitudinii de functie cu

alte enzime din familia de transpozaze-integraze. Acest model va fi cel pe care se va face docarea

compusilor ce urmeaza a fi selectati si testarea lor structural inaintea sintezei

c) Sa exprimam si sa purificam in regim constant si de rutina proteine active RAG1, RAG2 and HMGB1/2

din diverse surse reactivi extrem de pretiosi pentru toate studiile recombinarii RAG in vitro.Deasemenea am

14 

 

definitizat obtinerea unui construct plasmid pentru expresia HIV-IN recombinat in E. coli.

d) Am reusit cu succes sa exprimam in E coli si sa purificam o proteina himerica HIV-INE2C la aproape 90%

puritate.

e)Am testat activitatea enzimei HIV-INE2C prin doua assay-uri fluorescente in regim HTde selectie si am

reusit sa identificam parametrii biochimici optimi ceruti de aceste reactii. Prima din reactii este cea de legare

a HIV-INE2C de ADN- LTR fluorescent ce decurge optim in prezenta DMSO si PEG. Al doilea assay

testat si dezvoltat pentru prima data de noi este cel de FRET fata de reactia de cataliza monocatenara

3’terminala a LTR prin HIV-IN. Si-n acest caz am optimizat reactia pentru a o putea implementa in conditii

de HT.

f) Am aplicat cu succes reactia de FRET fata de reactia de cataliza monocatenara si caracterizat cu ea gradul

de inhibitie enzimatica realizat de 2 compusi medicamentosi, Raltegravir si Ac Nigranoic.

References

1) Hickman, A. B., Chandler, M. & Dyda, F. Integrating prokaryotes and eukaryotes: DNA transposases in light of

structure. Crit Rev Biochem Mol Biol 45, 50-69, (2010).

2)Chen, J. C. et al. Crystal structure of the HIV‐1 integrase catalytic core and C‐terminal domains: a model for viral DNA binding. Proc Natl Acad Sci U S A 97, (2000).   3) Goldgur, Y. et al. Structure of the HIV‐1 integrase catalytic domain complexed with an inhibitor: a platform for antiviral drug design. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 13040‐13043 (1999).   4) Maignan, S., Guilloteau, J. P., Zhou‐Liu, Q., Clement‐Mella, C. & Mikol, V. Crystal structures of the catalytic domain of HIV‐1 integrase free and complexed with its metal cofactor: high level of similarity of the active site with other viral integrases. J Mol Biol 282, 359‐368, (1998). 33 Wang, J. Y., Ling, H., Yang, W.  5)Maertens, G. N., Hare, S. & Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X‐ray structures of its key intermediates. Nature 468, 326‐329, (2010).  6)Ciubotaru M., Surleac M.D., Musat G. M., Rusu A. M., Ionita E., Albu C. C. Paul " DNA bending in the synaptic 

complex in V(D)J recombination: turning an ancestral transpososome upside down”", Discoveries, 2(1):e13:1‐15, 

2359–7232(2014). 

7)Temesgen Z, Siraj DS. Raltegravir: first in class HIV integrase inhibitor. Therapeutics and Clinical Risk Management 2008;4(2):493-500.  

8) Wenjie Tan, Kai Zhu, David J. Segal, Carlos F. Barbas III, and Samson A. Chow"Fusion Proteins Consisting of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Integrase and the Designed Polydactyl Zinc Finger Protein E2C Direct Integration of Viral DNA into Specific Sites", Journal Of Virology,78, pp1301‐1313(2004) .

15