0

Această lucrare reprezintă o traducere actualizată și îmbunătățită a lucrării “Reactive Oxygen Species, Oxidative Damage, and Antioxidative Defense Mechanism in plants under Stressful Conditions” ,Pallavi Sharma et al., Hindawi Publishing Corporation,

Jurnal of Botany, volume 2012, din care este folosită cu precădere

informația legată de antioxidanții enzimatici.

Efectele stresului biotic la plante asupra enzimelor antioxidante

Masterand: Neculai (Galani) Daniela

CuprinsIntroducere............................................................................................................................................2

Aspecte generale privind antioxidanții...................................................................................................3

2.1 Acidul ascorbic..............................................................................................................................3

2.2 Glutationul....................................................................................................................................4

2.3 Tocoferolii.....................................................................................................................................4

2.4 Carotenoizii..................................................................................................................................4

2.5 Compușii fenolici..........................................................................................................................4

Antioxidanți enzimatici...........................................................................................................................5

3.1 Superoxid dismutaza....................................................................................................................5

3.2 Catalaza........................................................................................................................................5

3.3 Guaiacol peroxidaza.....................................................................................................................5

3.4 Enzimele ciclului Acid ascorbic –Glutation....................................................................................6

3.4.1 Ascorbat peroxidaza..............................................................................................................6

3.4.2 Monodehidroascorbat reductaza..........................................................................................6

3.4.3 Dehidroascorbat Reductaza...................................................................................................6

3.4.4 Glutation Reductaza..............................................................................................................7

Activitatea enzimelor antioxidante în condiții de stres biotic.................................................................8

Bibliografie...........................................................................................................................................10

1

IntroducereFactorii de stres biotic determină la nivelul unei plante o cascadă de evenimente, care începe cu perceperea stresului de către recetorii specializați si sfârșește cu expresia unei baterii de gene țintă. Stresul biotic produce efecte asupra metabolismului primar și asupra metabolismului secundar, reflectându-se în modificarea activității unor enzime, având în vedere că toate procesele chimice sunt catalizate de enzime.

Răspunsul plantelor la stresul abiotic este determinat de mai mulţi factori, cum sunt genotipul şi stadiul lor de dezvoltare, ca şi durata, intensitatea, periodicitatea şi efectele aditive/sinergice  ale stresurilor multiple. La plante, stresul declanşează o gamă variată de răspunsuri, de la modificarea expresiei genelor şi a metabolismului celular la  schimbări ale ratei de creştere şi ale producţiei. Planta moare atunci când nu poate  face faţă stresurilor foarte severe1.

Speciile reactive de oxigen sunt un produs normal la metabolismului celular al plantelor. O varietate de stresuri din mediul înconjurător duc la producerea în exces a ROS, care cauzează daune oxidative și într-un final pot cauza moartea celulară. Pe lângă activitatea lor distructivă, ele sunt de asemenea descrise ca mesageri secundari în diverse procese celulare, inclusiv în creșterea toleranței plantelor la stresul biotic și abiotic. În funcție de echilibrul delicat dintre producerea și eliminarea de ROS, acestea pot servi ca molecule semnal sau pot cauza daune oxidative. Eliminarea eficientă a ROS produse datorită stresului plantei, necesită intervenția unor antioxidanți prezenți în țesuturi, atât nonenzimatici cât și enzimatici.

Cele mai comune specii reactive de oxigen sunt : ¹O2 , O2 ˙˙2, H2O2, ˙OH.

ROS sunt produse atât în celule supuse la stres cât și în cele care nu sunt supuse nici unui factor de stres, în câteva locații: în cloroplast, mitocondrii, plasmalema(plasma membranes), peroxizom, apoplast, reticulul endoplasmatic, și în pereții celulari. ROS se formează datorită unor scurgeri inveitabile de electroni către O2, din activitățile de transport ale cloroplastului, mitocondriei, și membranelor plasmatice sau ca un produs secundar a unor cai metabolice localizate în diferite compartimente celulare.

În continuare, lucrarea va detalia mecanismul de apărare din celule pentru eliminarea ROS produse în exces, cu ajutorul antioxidanților nonenzimatici, punând accentul însă, pe enzimele antioxidante.

1 http://www.infoomg.ro/2013/04/speciile-reactive-de-oxigen-reactive-oxygen-species-ros

2

Aspecte generale privind antioxidan iițDeoarece aceste specii de oxigen sunt foarte reactive, afectând principalele componente celulare, plantele şi-au creat mecanisme de eliminare a lor. Rolul principal în apărarea de stresul oxidativ îl au enzimele antioxidante, superoxid dismutazele (SOD), apoi ascorbat peroxidazele (APX), peroxidazele (POD), catalazele şi moleculele antioxidante cu greutate moleculară mică (acidul ascorbic, glutationul şi compuşi fenolici).2

Plantele posedă un sistem complex de apărare împotriva stresului oxidativ, compus din componente enzimatice și nonenzimatice de detoxifiere a ROS. În celulele plantelor, sistemele de producere cât și de detoxifiere a ROS se găsesc în diferite organite celulare, cum sunt cloroplastul, mitocondria și peroxizomul. În condiții normale, metaboliți ai oxigenului potențial toxici sunt generați în cantități mici, și prin urmare există o echilibrare între producția și reducerea(quenching) ROS. Echilibrul dintre producția și reducerea de ROS poate fi perturbat de diverși factori, ducând la creșterea rapidă a nivelului ROS intracelular, ceea ce poate duce la daune oxidative lipidelor, proteinelor și acizilor nucleici. Pentru a evita daunele oxidative, plantele superioare își îmbunătățesc sistemul natural de apărare antioxidativă.

Antioxidanții neenzimatici

Antioxidanții nonenzimatici includ principalele 2 tampoane celulare reducătoare : ascorbat(AsA) și glutation(γ-glutamyl-cysteinyl-glycine ,GSH), dar și tocoferoli, carotenoizi și compuși polifenolici. Aceștia interacționează cu numeroase componente celulare, și pe lângă rolul lor de apărare și de cofactori enzimatici, acești antioxidanți influențează creșterea și dezvoltarea plantelor, prin modularea proceselor de la mitoză și alungirea celulei, până la îmbătrânire și moarte celulară.

2.1 Acidul ascorbic (AsA)– este cel mai frecvent antioxidant cu greutate moleculară mică, care are un rol cheie în apărarea împotriva stresului oxidativ cauzat de creșterea nivelului de ROS. AsA este considerat un antioxidant foarte puternic datorită capacității sale de a dona electroni în multe reacții enzimatice și neenzimatice. AsA a fost dovedit a juca un rol important în câteva procese fiziologice la plante, inclusiv în creștere, diferențiere și metabolism. Cea mai mare parte din acidul ascorbic, mai mult de 90%, este localizat în citoplasma, dar spre deosebire de alți antioxidanți solubili, o mare parte este exportat către apoplast, unde este prezent în concentrații milimolare. Acidul ascorbic apoplastic este considerat prima redută de apărare împotriva oxidanților externi potențial nocivi. Oferă

2 http://www.infoomg.ro/2013/04/speciile-reactive-de-oxigen-reactive-oxygen-species-ros

3

protecție membranei prin reacția directă cu O2˙˙2, H2O2 și prin regenerarea α-tocoferolului din radicalul tocoferoxil și protejarea activității enzimelor care conțim ioni metalici pentru tranziția protetică.

2.2 Glutationul – glutationul tripeptidic (γ-glutamyl-cysteinyl-glycine, GSH) – este una dintre nonproteinele cu greutate moleculară mică cele mai importante, jucând un rol important în apărarea intracelulară împotriva daunelor oxidative datorate ROS. A fost detectată în aproape toate componentele celulare cum ar fi citosolul, cloroplastul, reticulul endoplasmatic, vacuole, și mitocondrii. Echilibrul între GSH și forma sa oxidată GSSG este foarte important în menținerea stării redox a celulei. Datorită capacităților sale reducătoare, GSH joacă un rol important în diverse proceze biologice, inclusiv creștere/diviziunea celulară, reglementarea transportului sulfatului, transducția de semnal, conjugare de metaboliți, reglementare enzimatică, sinteza unor proteine și acizi nucleici, sinteza de fitochelatine pentru chelarea metalelor, detoxificare xenobioticelor, și expresia genelor care receptează stresul.

2.3 Tocoferolii (α,β,γ și δ) reprezintă un grup de antioxidanți lipofilici implicați în detoxifierea radicalilor liberi de oxigen, radicalilor peroxil lipidici și a ¹O2 . α- tocoferolul cu cei trei metil substituenți ai săi, are cea mai mare activitate antioxidantă dintre tocoferoli. Tocoferolii sunt sintetizați doar de organisme fotosintetice și sunt prezenți doar în părțile verzi ale plantei. Tocoferolii protejează lipidele și alte componente ale membranei prin bariera fizică dar și reacționând chimic cu O2 în cloroplast, în acest fel protejând structura și funcționarea PSII. Tocoferolii previn propagarea în lanț din autooxidarea lipidelor fiind astfel o capcană eficientă pentru radicalii liberi. Acumularea de tocoferoli s-a dovedit a induce toleranță la frig, la deficit de apă și la salinitate la diferite specii de plante.

2.4 Carotenoizii – aparțin de asemenea grupului de antioxidanți lipofilici și sunt în stare să detoxifice diferite forme de ROS. Sunt pigmenți organici ce se găsesc în cloroplastul și cromoplastul plantelor ,dar și în alte organisme fotosintetizatoare ca algele, unele bacterii și unele ciuperci. La plante, carotenoizii absorb lumina în regiunea dintre 400-550 nm din spectrul vizibil și trec energia capturată către Chl. Ca antioxidant, ei neutralizează ¹O2 pentru a preveni daunele oxidative și pentru a proteja aparatul fotosintetic. Carotenoizii pot fi și precursori ai moleculelor semnal care influențează dezvoltarea plantelor și răspunsul la stresul biotic și abiotic.

2.5 Compu ii fenoliciș – sunt diverși metaboliți secundari (flavonoizi, tanini, lignina etc) care posedă proprietăți antioxidante. Sunt găsiți în abundență în țesuturile plantelor. S-au dovedit a depăși antioxidanți cunoscuți ca acidul ascorbic și α-tocoferolul în anumite teste în vitro datorită capacității foarte mari de a dona electroni sau atomi de hidrogen. Există de asemnea dovezi ale inducerii metabolice de fenoli de către plante ca răspuns la stresuri multiple.

4

Antioxidan i enzimaticițComponentele enzimatice ale sistemului de apărare antioxidativă sunt superoxid dismutaza(SOD), catalaza(CAT), guaiacol peroxidaza(GPX), și enzime ale ciclului acid ascorbic-glutation(AsA- GSH), ca: ascorbat peroxidaza(APX), monodehidroascorbat reductaza(MDHAR), dehidroascorbat reductaza(DHAR) și glutation reductaza(GR). Aceste enzime funcționează în diferite compartimente subcelulare și răspund corespunzător atunci când celulele sunt expuse la stres oxidativ.

3.1 Superoxid dismutaza.

Superoxid dismutaza joacă un rol important în apărarea împotriva stresului oxidativ la toate organismele aerobe. Enzima SOD aparține grupului de metaloenzime și catalizează dismutarea O2̇ 2 în O2 și H2O2. Este prezent în majoritatea compartimentelor celulare care generează oxigen activat . La plante s-au găsit 3 izoenzime ale SOD : Cu/Zn-SOD, Mn-SOD, şi Fe-SOD.(176,177). MnSOD se găseşte în mitocondrie, în timp ce FeSOD este localizat în cloroplast. Cu/Zn-SOD este prezent în trei izoforme, care pot fi găsite în citosol, cloroplast, peroxizom şi mitocondrie. Activitatea SOD s-a observat a fi în creştere în plantele expuse la diferite forme de stres, incluzând seceta şi toxicitate metalică. De asemenea creşterea activităţii SOD poate fi corelată cu creşterea toleranţei plantelor la stresul biotic şi abiotic.

3.2 CatalazaDintre enzimele antioxidante, catalaza (CAT), a fost prima enzimă descoperită şi caracterizată. Este o enzimă conţinătoare de Fe omniprezentă, care catalizează dismutarea a două molecule de H2O2 în H2O şi O2. Are o mare specificitate pentru H2O2, dar activitate scăzută în ceea ce priveşte peroxizii organici. Plantele conţin mai multe tipuri de enzime reducătoare de H2O2 , dar catalazele sunt unice deoarece nu au nevoie de echivalenți reducători celulari. Peroxizomii sunt componentele celulare unde se produce cel mai mult H2O2. Catalaza elimină H2O2 produsă în aceste organite în timpul oxidării fotorespiratorii, β-oxidării acizilor graşi, şi a altor enzime ca XOD cuplat cu SOD. Deşi se poate întâlni catalază şi în citosol, cloroplast, şi mitocondrii, prezenţa acesteia aici este mai puţin probabilă.

De exemplu, în plantele transgenice de tutun, având 10% din genotipul sălbatic, activitatea catalazei ne arată acumulare de GSSG(glutation oxidat) şi o descreştere de 4 ori a AsA, indicând faptul că enzima CAT este vitală pentru menţinerea echilibrului redox în timpul stresului oxidativ.

3.3 Guaiacol peroxidazaGuaiacol peroxidaza (GPX), o proteină ce conţine gruparea hem, oxidează donori aromatici de electroni, ca guaiacolul şi piragalolul, cu consum de H2O2. Este foarte des întâlnită la animale, plante şi microbi. GPX este asociată cu multe procese biosintetice, ca lignificarea

5

pereţilor celulari, degradarea IAA, biosinteza etilenei, vindecarea rănilor, şi apărarea împotriva stresului biotic şi abiotic. GPX au fost asimilate ca „enzime de stres” .

3.4 Enzimele ciclului Acid ascorbic –Glutation Shimbarea raporturilor Acid ascorbic la DHA şi GSH(glutation) la GSSG(glutation oxidat) este vital pentru ca celulele să perceapă stresul oxidativ şi să răspundă corespunzător. Ciclul Acid ascorbic –Glutation implică oxidări şi reduceri succesive ale AsA, GSH şi NADPH catalizat de enzimele APX, MDHAR, DHAR şi GR. Acest ciclu este prezent în cel puţin patru locaţii subcelulare, incluzând citosolul, cloroplastul, mitocondria şi peroxizomul. Ciclul AsA -– GSH joacă un rol important în combaterea stresului oxidativ indus de stresul biotic şi abiotic.

3.4.1 Ascorbat peroxidaza (APX) este o componentă importantă a ciclului AsA -– GSH, şi joacă un rol esenţial în ţinerea sub control a nivelului intracelular a ROS. APX folosește două molecule de Acid ascorbic pentru a transforma H2O2 în apă, generând în același timp două molecule de MDHA. La plantele superioare au fost găsite cinci izoforme de APX în diferite localizări subcelulare: în citosol, stroma, tilacoid, mitocondrie și peroxizom. APX găsit în organitele celulare reduce H2O2 produs în organite, în timp ce APX din citosol elimină H2O2 din citosol, apoplast şi care difuzează din organite.

3.4.2 Monodehidroascorbat reductaza. Radicalul MDHA rezultat în urma reacției de catalizare a APX are o durată de viață foarte scurtă, și dacă nu este rapid redus, se descompune în Acid ascorbic și DHA. Monodehidroascorbat reductaza(MDHAR) este o enzimă ce catalizează regenerarea Acidului ascorbic din radicalul MDHA, folosind NAD(P)H ca donor de electroni. Este singura enzimă cunoscută care folosește un radical organic(MDA) ca bază/substrat, și este de asemenea în stare să reducă radicali de fenoxil, care sunt generați de peroxidaza din hrean, cu H2O2. Izoenzimele MDHAR s-au găsit în câteva componente celulare cum ar fi cloroplastul, citosolul și mitocondria și peroxizomii. În clorplast, MDHAR ar putea avea două funcții fiziologice: regenerarea Acidului ascorbic din MDHA și medierea fotoreducerii dioxigenului în O2 ˙˙2 atunci când este absent MDHA ca substrat. Caracterizarea polipeptidelor membranare din peroxizomii frunzelor de mazăre, a arătat că MDHAR poate fi implicat și în generarea de O2˙˙2.

Mai multe studii au demonstrat creșterea activității MDHAR în plantele supuse stresului biotic și abiotic. Supraexpresia genei MDHAR din Arabidopsis thaliana la tutun, arată o creștere a toleranței la stresul provocat de mediul sărat și glicol polietilenă. Supraexpresia MDHAR cloroplastic de la Solanum lycopersicum în Arabidopsis i-a crescut toleranța la stresuri de tipul temperaturii extreme și cel mediat de metil viologen.

3.4.3 Dehidroascorbat Reductaza. DHAR catalizează reducerea DHA în Acid ascorbic folosind GSH ca substrat de reducere și astfel joacă un rol important în menținerea Acidului ascorbic în forma sa redusă. Deși există posibilitatea regenerării enzimatice și neenzimatice a Ascorbatului direct din MDHA, întotdeauna oxidarea Ascorbatului în frunze și alte țesuturi produce ceva DHA. Acesta, o substanță chimică cu viață scurtă, poate fi

6

hidrolizat ireversibil în 2,3-acid diketogulonic sau reciclat în Acid ascorbic de către DHAR. Supraexpresia DHAR în frunzele de tutun, porumb și cartof s-a dovedit a crește conținutul de Acid ascorbic, sugerând că DHAR joacă un rol important în determinarea cantității de Acid ascorbic. DHAR este o enzimă ce se găsește în abundență în semințele uscate, rădăcini și mugurii verzi precum și în cei etiolați. Stresurile abiotice ca seceta, toxicitatea metalică și înghețul, au crescut cantitatea de DHAR în plante.

3.4.4 Glutation Reductaza(GR). Atunci când se comportă ca un antioxidant participând la ciclurile de oxidare-reducere enzimatice și neenzimatice, GSH este oxidat în GSSG. În ciclul Ascorbat-Glutation, GSH este oxidat într-o reacție catalizată de DHAR. GR, fiind o enzimă dependentă de NAD(P)H, catazilează reducerea GSSG în GSH, și prin aceasta menține un raport celular mare al GSH/GSSG. Deși se gasește atât în cloroplast, cât și în citosol, mitocondrii și peroxizomi, cea mai mare parte a activității GR în țesuturile fotosintetice se datorează izoformelor specifice cloroplastului. În cloroplast, GSH și GR sunt implicate în detoxifierea H2O2 generate de reacția Mehler.

Mai mulți autori au observat creșterea activității GR în condiții de stres de mediu. Pastori și Trippi au observat o corelație între rezistența la stresul oidativ cauzat de ierbicidul paraquat sau de H2O2 ar putea stimula sinteza de novo a GR. Supraexpresia GR în N. Tabacum și plante Populus a dus la creșterea nivelului de Acid ascorbic foliar, și a mărit toleranța la stresul oxidativ.

Mai multe studii au demonstrat că supraexpresia unei combinații de enzime antioxidante în plantele transgenice are efecte sinergice asupra toleranței la stres oxidativ a plantelor.

7

Activitatea enzimelor antioxidante în condi ii de stres bioticțUnul dintre primele răspunsuri celulare ce urmează după recunoașterea cu succes a patogenilor este arderea oxidativă cu producere de ROS. Recunoașterea unei varietăți de patogeni duce la generarea de O2̇ 2, sau produsul de dismutație al acestuia H2O2 în apoplast.

Reglementarea diferită a enzimelor antioxidante, în parte mediată de SA(acidul salicilic), poate contribui la creșterea producerii ROS și activarea apărării împotriva infecției.

De exemplu:

La plantele de tutun hiper receptive la patogeni, s-a observat o reducere a activității CAT și APX.

Creșteri semnificative ale CAT și POD(peroxidaza) au fost observate la rândurile de in afectat de făinare. Creșterea activității POD a fost mult mai pronunțată la plantele tolerante decât la cele susceptibile.

Creșterea activității POD, CAT, APX și SOD a fost observată în frunzele de Vicia faba infectate cu virusul mozaicul galben al fasolei, indicând faptul că sistemele de eliminare a ROS, au un rol important în a ține sub control ROS generate ca răspuns la patogeni.

Activitatea peroxidazei a crescut pe parcursul evoluției bolii cauzate de Erwinia Amylovora, constatându-se producerea unor substanțe implicate în răspunsul defensiv(flavonoizi, lignine) (Keck și al, 2002)3;

Graskova și al.(2004) au constatat la cartof două mecanisme ale activării peroxidazei în timpul patogenezei. Unul l-a constituit sinteza de novo a enzimei(caracteristic soiului susceptibil la patogen), iar cel de-al doilea, caracteristic soiului rezistent, a indus nu doar sinteza enzimei ci și activarea moleculelor enzimatice preexistente. Totodată, infecția bacteriană și exoplizaharidele secretate de patogen au indus modificarea POD intra și extracelulare la soiul susceptibil, fără însă a se constata modificări la soiul rezistent4.

S-a înregistrat de asemenea o creștere seminficativă a activității peroxidazei, ascorbat peroxidazei, catalazei și superoxid dismutazei, ca răspuns la infecția orezul cu ciuperca Rhizoctonia solani (Parandhiharan și al., 2003). Peroxidazele solubile din frunze(POX), folosesc peroxidul de hidrogen pentru a oxida fenolii și alte substraturi, contribuind la răspunsul de apărare (Ostengard și al., 2000)5.

3 Fiziologia Stresului biotic la plante, Elena Delian, Ed. Cartea Universitară, 2006, p.179

4 Idem 1.

5 Idem 1.8

Sunowar și al. (2005) studiind rolul ascorbat peroxidazei pe tutunul transgenic folosind gena CAPOA1 de la Capsicum anuum au constatat nivele ridicate ale expresiei genei în planteletransgenice, cu o dublare a activității totale a peroxidazei6.

Bayal și Zeller (2004) precizează că intensificarea activității peroxidazei și chitinazei s-a corelat cu restricția colonizării cu bacteria Erwinia amylovora la portaltoiul de măr M267.

Patykovski și Urbanek (2005), comparând conținutul de H2O2 și acid ascorbic, precum și activitățile peroxidazei și catalazei în frunzele mai puțin susceptibile( cv. Perkoz)și mai susceptibile (cv. Corindo), după infecția cu B. Cinerea, au înregistrat o creștere în fracția citosolică a activității peroxidazei, după 48 de ore de la infecție în ambele cultivaruri, dar mai evidentă la soiul Perkoz. Activitatea peroxidazei la nivelul fracției apoplastice a înregistrat o creștere mai timpurie la cv. Perkoz decât la cv. Corindo. Prin aceste studii s-a demonstrat că fortificarea peretelui celular mediată de peroxidaza apoplastică reprezintă un factor cheie responsabil pentru rezistența acestor soiuri de tomate, la infecția cu B. cinerea8.

Activitatea enzimelor antioxidante este în creștere în condiții de stres biotic conform cercetărilor menționate mai sus, acest fapt arătând importanța detectării și cuantificării activității acestor enzime pentru pentru cunoașterea mai aprofundată a fiziopatologiei plantelor și crearea soluțiilor și tehnicilor de protecție a plantelor în condiții de cultură.

6 Fiziologia Stresului biotic la plante, Elena Delian, Ed. Cartea Universitară, 2006, p.180

7 Idem 4

8 Idem 4.9

Bibliografie

1. Fiziologia Stresului biotic la plante, Elena Delian, Ed. Cartea Universitară, 2006;

2. http://www.infoomg.ro/2013/04/speciile-reactive-de-oxigen-reactive-oxygen-species- ros/

3. Reactive Oxygen Species, Oxidative Damage, and Antioxidative Defense Mechanism in plants under Stressful Conditions ,Pallavi Sharma et al., Hindawi Publishing Corporation, Jurnal of Botany, volume 2012, Article ID 217037;

10