Drojdiile.pdf

8/14/2019 Drojdiile.pdf

1/32

1. Drojdiile ca ageni biotehnologici

Introducere

Microorganismele incluznd bacteriile, drojdiile, fungii filamentoi i algele

unicelulare au fost folosite n culturi submerse pentru obinerea diferitelor produse printre

care i biomasa proteic. De la nceputurile produciei pe scar larg de penicilin,

streptomicin i de alte antibiotice i pn la conversia steroizilor de ctre o varietate de

microorganisme, s-au dezvoltat i o serie de ecipamente pentru culturile submerse dintre

care, mai utilizate sunt dou tipuri! bioreactorul cu agitare mecanic, cu diferite variante de

agitatoare i sisteme de spargere a spumei,fermentatorul airliftcare poate fi considerat un

ibrid ntre fermentatorul clasic cu agitare mecanic i tipul cu draft al fermentatorului airlift.

"actorii limitativi ai dezvoltrii celulare n astfel de ecipamente de fermentaie sunt

transferul de cldur i transferul de mas, ultimul influennd folosirea nutrienilor, n special

a o#igenului de ctre celule precum i cantitatea produilor de metabolism.$n jurul acestui subiect s-a dezvoltat o bogat literatur de specialitate, care descrie

efectul acestor factori asupra dezvoltrii culturilor submerse microbiene, cu punerea n

eviden a factorului limitativ pentru producia de mas celular i de metabolii primari sau

secundari. %&'

$n Figura 1sunt prezentate principalele aplicaii industriale tradiionale i moderne ale

drojdiilor bazate pe e#ploatarea dezvoltrii drojdiilor i pe procesele metabolice specifice

acestora la nivel industrial %('.

&&


2/32

Figura 1. )iotenologii tradiionale i moderne bazate pe drojdii.

*ccentul este pus pe relaia dintre fiziologia celulelor de drojdie i biotenologie pe de

o parte i *D+ recombinant i tenologiile de fermentaie pe de alt parte. rivitor la drojdiile

non Saccharomyces, creterea importanei lor industriale este n particular datorat produciei

masive de substane i preparate biofarmaceutice. De asemenea a fost evideniat importana

drojdiilor ca modele e#perimentale n studiile fundamentale ale tiinelor biomedicale %'.

1.1. Aspecte privind biologia drojdiilor

Drojdiile sunt benefice pentru omenire, deoarece n cea mai mare msur sunt utilizate

pentru producerea de alimente, vin, bere, substane bioterapeutice i produse farmaceutice. $n

prezent au fost recunoscute apro#imativ apte sute de specii de drojdie. Deoarece drojdiile

sunt adesea utilizate n biotenologia tradiional i modern, descoperirea de noi specii este

legat i de noile tenologii.

entru descrierea domeniului drojdiilor au fost utilizate mai multe definiii. $n

conformitate cu uilliermond /&0&(1 i 2odder /&0341 %&&' drojdiile sunt fungi unicelulari cu

reproducere prin nmugurire ori fisiune. $n acest sens, s-a recunoscut c drojdiile sunt fungi

unicelulari adevrai, dar n realitate, majoritatea speciilor de drojdii sunt dimorfice i produc

pseudoife i ife, pe lng dezvoltarea unicelular. 5imilar, majoritatea fungilor ifali sunt

dimorfici i, n mod uzual, acetia au fost denumii 6east 7 li8e.

9dentificarea, numirea i plasarea drojdiilor n propiul lor cadru evolutiv sunt

importante pentru multe domenii ale tiinei care includ agricultura, medicina, tiinele

biologice, biotenologia, industria alimentar.

9nvestigaii comparative care includ morfologia, fiziologia, genetica, biocimia,

ecologia i genetica molecular, au mbogit ta#onomia drojdiilor.

rima perioad n sistematica drojdiilor care se situeaz pn la nivelul anilor &0:4,

este caracterizat prin studii aprofundate de morfologie, fiziologie nutriional comparat igenetic convenional.

9niial pentru utilizri ta#onomice se foloseau teste care se refereau la numrul

atomilor de carbon asimilai i la folosirea compuilor azotului. ;ic8erman /&0


3/32

Drojdiile ca ageni biotehnologici

5tudiile genetice relev prezena diferitelor stadii se#uale. =iclul se#ual la ascomicete

poate fi aplontic, diplontic ori diploaplontic. 5peciile de drojdii pot fi omotalice,

eterotalice, sau o combinaie a acestora. %&4'

* doua perioad n sistematica drojdiilor este considerat de la &0:4 pn n prezent,

i este caracterizat printr-o aprofundare a studiului caracterelor morfologice datorit

introducerii microscopiei electronice, a aplicrii criteriilor biocimice i a introducerii

studiilor de genetic molecular. Microscopia cu transmisie de electroni a relevat diferene

ntre drojdiile ascomicete i bazidiomicete. Drojdiile ascomicete au pereii celulari

transpareni la electroni i conin n majoritate - glucani, ptura e#tern fiind format din -

manani. Drojdiile bazidiomicete au pereii celulari cu o structur lamelar netransparent la

electroni i formai n majoritate din - glucani. "ormarea mugurelui este de asemenea

diferit la cele dou grupuri de drojdii. Drojdiile ascomicete prezint o nmugurire

oloblastic, care const n participarea ntregului perete celular, la formarea noului perete, a

mugurelui pe cnd la drojdiile bazidiomicete care au o nmugurire enteroblastic, particip

numai stratul interior al peretelui celular.

>ltrastructura septului arat diferene importante ntre cele dou clase de drojdii.

5eptul la majoritatea ascomicetelor are unul sau mai muli micropori. 5eptul simplu are un

singur por central, pe lng unii perei despritori de la unele bazidiomicete, care au o

structur de tip dolipor, la care porul central este flancat de o membran perforat numit

parentezom.

entru diferenieri ta#onomice au fost utilizate caracteristici biocimice, compoziia n

glucide a pereilor celulari i capsulelor, spectrul de rezisten magnetic a pereilor celulari,

numrul unitilor izoprenice din coenzima ?, citocromii, compoziia n acizi grai i paternul

izoenzimelor. %&('

9ntroducerea studiilor *D+, furnizeaz n principal, un parametru obiectiv n

estimarea distanelor evolutive din punct de vedere ta#onomic. Diferitele metode utilizate

ofer soluii la diferite niveluri ta#onomice. @aloarea ta#onomic a compoziiei n baze a

*D+ /molA B=1 este n special caracteristic ta#onomic de specie. Culpinile fenotipice

care difer au un procent mai mare de ( 7 A n compoziia bazelor, sunt considerate specii

diferite. 2imitele n compoziia de baze a *D+, difer pentru drojdiile ascomicete i

bazidiomicete. =ele mai multe drojdii ascomicete au procentul molar de guanin i citozin

/molA B=1 mai mic de


4/32

Tabelul 1. Distribuia molA B= la diferite ascomicete i bazidiomicete

Mol% G+ !rocentajul la drojdiile

asco"icete

!rocentajul la drojdiile

ba#idio"icete(< 7 (4

4 7

< 7 0

4 7

< 7 0


5/32


Figura . rocedeele de baz n ingineria genetic la drojdii.

+umeroi vectori plasmidiali au fost construii pentru transformarea genetic a

celulelor de drojdie /Tabelul 1. $n general pentru o transformare ct mai eficient a celulelor

de drojdie, vectorii trebuie s conin!

- secvene de plasmide bacteriene /! coli1, care servesc la producerea clonrii i

amplificrii i care permit ca *D+ s se insereze n celula gazdF

- secven /*G51 care se replic autonomF

- secven centromeric /=H+1 pentru stabilitatea segregrii mitoticeF

- mar8eri selectai corespunztor i avantajosF

- unul sau cteva situsuri pentru enzimele de restricie, care permit inserarea *D+

eterolog. %'

Tabelul . @ectori plasmidiali pentru transformarea celulelor de drojdie

&


6/32

Tipuri de vector &'e"ple aracteristici

lasmide deintegrare

lasmidintegrativ dedrojdie /Ilp1

"recvene sczute de integrare n loci cromozomali prinrecombinare omoloag. Ilps sunt integrate n copiisingulare, iar transformanii sunt stabili, ciar nabsena presiunii selective.

lasmide dereplicare

independent

lasmidreplicativ dedrojdie /IGp1

"recvene nalte de transformare /


7/32


separat din e#presia genei care controleaz disponibilitatea pentru anumii nutrieni

/galactaza n cazul *2&, fosfatul n cazul N&1 /Tabelul (1.

Tabelul (. Geglarea fiziologic a promotorilor transcripionali n drojdii

!ro"otor )eglare *i#iologic$*2&

N&

MH2&

MHC(GH1 i /591 sunt prionii lui >re(p i respectiv 5upGH1 face

ca celula s se prerepreseze pentru catabolismul azotului, n timp ce /591 ridic eficiena

supresorului *G+ts. *ceeai abordare a dus la identificarea elementului non 7 mendelian

/et-s1 al fungului filamentos #odospora anserina, ca prion al proteinei et 7 s. "orma

prionic a proteinei et-s este cerut pentru incompatibilitatea eterocarionului, o funcie

normal a fungului, ceea ce sugereaz c alte funcii celulare normale pot fi controlate de

prioni. />GH1 i /591 implic o autopropagare i agregarea >re(p i 5up


12/32

din cadrul industriei farmaceutice. Saccharomyces cerevisiaeeste un organism cu care se

lucreaz uor, deoarece este nepatogen, i datorit multitudinii de aplicaii aprute de-a lungul

timpului n obinerea de produse consumabile, ca etanolul sau drojdia, a fost clasificat ca

organism G*5 /generall6 regarded as seif S organism considerat sigur, neto#ic1. De

asemenea, fermentaia i procesele tenologice de producie la scar larg cu Saccharomyces

cerevisiae fac ca acest organism sa fie atractiv, la ndemn, pentru cteva scopuri

biotenologice, aa cum va fi ilustrat n continuare. >n alt motiv important pentru a justifica

utilizarea microorganismului Saccharomyces cerevisiaen cadrul biotenologiei l reprezint

susceptibilitile sale la modificrile genetice prin tenologia *D+ recombinant, care a fost

mai departe nlesnite de accesul la secvena genomic complet a Saccharomyces cerevisiae,

publicat n &00: %&:'.

$mbuntirea tulpinilor de drojdie de bere s-a bazat n mod tradiional prin

mutagenez la ntmplare i pe ncrucirile genetice a dou tulpini, urmate de screening, n

funcie de calitile de interes ale mutantelor. Dezvoltrile recente ale unor metode sofisticate

n domeniul tenologiei *D+ recombinant au permis s se manipuleze o anumit cale de

interes i de aici s se mbunteasc celula printr-o abordare mai direct. Cotui, acum este

posibil s se introduc anumite perturbri genetice n sensul de a modifica puterea de iniiere a

unei anumite gene, de a induce deleii asupra genelor sau de a introduce gene ntregi n celul %&E'.

$mbuntirile propietilor celulare obinute prin combinarea analizelor teoretice

bazate pe informaiile de biocimie i pe aplicaiile ingineriei genetice, au fost oferite de

ingineria metabolic %&


13/32


1.-.1. 0oi concepte asupra ingineriei "etabolice

Dup cum s-a menionat i n introducere, ingineria metabolic implic o abordare

direct asupra aplicaiei tenologiei *D+ recombinant pentru mbuntirea tulpinilor, i a

fost definit ca Tmbuntirea direct a formrii produsului sau a propietilor celulare prin

modificarea unor reacii biocimice specifice sau introducerea altora noi cu folosirea

tenologiei *D+ recombinantU %&E'. $n acest definiie termenul Treacii biocimiceU trebuie

interpretat n sensul lui mai larg. =eea ce distinge ingineria metabolic de aplicaiile clasice de

biologie molecular este folosirea unei abordri directe. *ceasta presupune cunotine bogate

despre sistemul folosit i, dup cum a fost menionat n introducere, ingineria metabolic

conine dou pri! partea analitic i partea sintetic. *ceast situaie este ilustrat n Figura

. $n anumite cazuri partea sintetic o precede pe cea analitic, dac natura substratului are

nevoie de o e#tindere prin e#presia unei enzime eterogene, dar n toate cazurile este

important ca prile analitic i sintetic s mearg mn n mn.

*cest lucru este foarte bine ilustrat prin ncercrile de a e#tinde natura substratului.

*ici, n mod clar, primii pai sunt de a introduce gene eteroloage care activeaz

metabolismul substratului de interes, iar n acest scop este important s lum n consideraie

dou strategii diferite!

a. introducerea unei gene ce codific o protein de legtur a membranei, care transport

un anumit substrat n celul n combinaie cu o gen ce codific o protein

responsabil pentru scindarea substratuluiF

b. introducerea unei gene ce codific o protein secretat n mediul e#tracelular, unde

substratul de interes este transformat sau scindat n substraturi care ar putea fi

asimilate direct de organismul gazd.

(


14/32

Figura . Aspecte variate ale ingineriei metabolice mprite n partea analitic i partea sintetic.

9ndiferent de strategia aleas, este important s se asigure c genele eterogene

sunt e#primate suficient n noul sistem gazd. *ceasta poate implica luarea n considerare a

unor posibile modificri postranslaionale, care pot diminua sau elimina activitatea enzimei de

interes, iar aceasta necesit analize atente ale tulpinii recombinante. Dup obinerea unuiorganism recombinant ce poate folosi un anumit substrat, deseori se obin rate sczute i

(


15/32


producii n general mici ale produsului din substratul respectiv. entru a identifica problema

cea mai important i a direciona urmtorul pas sintetic este necesar s se detvolte o analiz

detaliat a fiziologiei celulei. *ceasta poate fi ilustrat n mod clar n ncercarea de a

transforma #iloza la etanol prin fermentaii anaerobe cu Saccharomyces cerevisiae. *stfel,

ingineria metabolic aproape ntotdeauna va implica o strns interaciune ntre prile

analitic i sintetic, de obicei fiind necesare mai multe tipuri de construcii de tulpini, nainte

de obinerea unei tulpini recombinante optime.

$n ingineria metabolic la Saccharomyces cerevisiae, partea sintetic este relativ

devansat de partea analitic. *ceasta se datoreaz comple#itii metabolismului celular, ce

poate interaciona cu e#primarea genelor, ce poate determina niveluri metabolice prin

concentraia de enzime. $n multe cazuri sunt necesare multiple modificri, iar pentru fiecare

modificare, pot aprea scimbri neateptate ale metabolismului celular. artea analitic se

refer n mod clasic la fiziologie, n ultimii ani numeroase tenici avansate fiind utilizate

pentru o analiz mult mai elaborat a fiziologiei celulare. *ceasta include tenici ale *D+

pentru analiza transcriptoamelor /cuantificarea simultan a tuturor genelor transcrise ntr-o

celul1, gel bidimensional de electroforez pentru analiza proteoamelor /cuantificarea

simultan a unui numr mare de proteine ntr-o celul1, gaz cromatografie cu sprectrometria

de mas /= 7 M51 i licid cromatografie cu spectrometrie de mas /2= 7 M51, pentru

analiza nivelurilor metabolice intracelulare, e#perimente cu =& pentru analiza reelei

metabolice, studii avansate de fermentaie cu monitorizare on ( linea variabilelor de cultivare

mai importante i bioinformatica /modele matematice pentru analiza structurii cilor i

structurii flu#urilor1.

1.-.1.1. Anali#a transcriptoa"elor i proteoa"elor

*naliza metodologiei *D+ n domeniul transcriptoamelor este o tenic nc nou n

prezent nefiind e#emple despre modul cum a fost folosit tenica n ramurile inginerieimetabolice. Deoarece multe provocri n ingineria metabolic implic scimbri genetice

multiple, analiza transcriptoamelor va fi foarte important pentru ingineria metabolic n

viitor, deoarece aceast analiz permite studierea scemei e#primrii multor gene.

=a i analiza transcriptoamelor, analiza proteoamelor este important n ingineria

metabolic. Deseori cile de activitate sunt corelate direct cu concentraia proteinelor, i cnd

e#primarea genelor iJsau interaciunile protein 7 protein sunt supuse unei regularizri

metabolice, este important s se cuantifice concentraia proteinelor n diferite tulpinirecombinante. $n mod clar, o analiz detaliat a proteomului poate fi valoroas, deseori fiind

(


16/32

suficient stabilirea concentraiei de proteine implicate n cile studiate i uneori msurarea

unor proteine reglatorii ce afecteaz e#primarea genelor relevante.

1.-.1..$ile de anali#$

=ile de analiz sunt folosite deseori pentru a descrie aplicaia analizei flu#ului

metabolic /M"*1 i analiza controlului metabolic. =ile de analiz s-au dovedit a fi un

succes, ca instrument ajuttor pentru partea analitic a ingineriei metabolice. M"* este o

abordare global a celulei, unde se ia n calcul reeaua complet a reaciilor intracelulare, unde

sunt cuantificate flu#urile, prin ramurile individuale ale reelei. "lu#urile metabolice pot fi

estimate din balanele i msurtorile de metabolii ale ctorva ci, prin introducerea

substraturilor marcate cu =&, urmate de msurtorile distribuiei acestora n metaboliii

intracelulari. $n acest caz spectroscopia de rezonan magnetic nuclear sau = 7 M5 poate

fi folosit pentru a msura tiparul metaboliilor precursori marcai. *plicarea de substraturi

marcate permite determinri de flu# ale reaciilor reversibile i cuantificarea raiilor de flu#

ntre cile biosintetice ce duc la acelai metabolit. =ompararea distribuiilor flu#ului obinute

n diferite condiii fiziologice poate da informaii de pre despre interaciile dintre diferite ci

sau poate ajuta la identificarea unor posibile reacii biocimice, care nu au fost descoperite n

prealabil ntr-un anumit microorganism %(4'. Cotui, M"* poate fi folosit n alegerea unei

strategii bune pentru ingineria metabolic, dar, poate fi folosit i ca un instrument pentru

caracterizarea fiziologic a unei tulpini, ce a fost manipulat n vederea introducerii unei

propieti noi sau modificate. >n domeniu n care M"* este interesat este mbuntirea

productivitii. *cest lucru este ilustrat n "igura (, n care se prezint o cale foarte simpl, n

care substratul * este convertit n produsul ), cu formarea produsului =. 5ubstratul * poate fi

glucoza, produsul ) poate fi etanolul i produsul = poate fi glicerolul. Depirea obinerii

produsului de substrat este determinat de raia flu#urilor V) i V*, unde productivitatea este

dat de flu#ul V). 9ntermediarul 9 nu se poate acumula n interiorul celulei, flu#ul acestuimetabolit va fi egal cu flu#ul ce iese din polul metabolitului. /Figura -1.

"lu#urile sunt descrise de ecuaia! V* S V) B V=, unul din aceti termeni poate fi

calculat, dac celelalte dou sunt msurate. *cesta este conceptul balanei metaboliilor. N

strategie clar pentru a mbunti obinerea total de V)este de a reduce sau de a elimina

flu#ul V=i astfel n mod direct va ajunge mai mult carbon la produsul V).

Nricum, formarea lui = joac de obicei un rol important n metabolismul celular, iar

eliminarea V= de o deleie a unei gene, va fi letal pentru celul sau va conduce spreau#otrofie. $n unele cazuri flu#urile pot fi determinate de constrngeri adiionale, dac

(:


17/32


anumii cofactori ca +*D/1 sunt implicai n diferite ramuri. Modularea distribuiei

flu#ului n jurul punctului metabolic 9, cere bineneles analiza complet a reelei metabolice

i de aceea conceptul de M"* este foarte important. M"* este n general cel mai folositor n

cazurile n care o fraciune relativ mrit a lui = este direcionat spre produs n vederea

obinerii de metabolii primari. +u n ultimul rnd, conceptul de M"* poate, de asemenea, s

contribuie la nelegerea modului n care producerea de metabolii secundari sau proteine

eteroloage este legat de metabolismul central al lui =, prin canalul metaboliilor precursori.

%(&'

M"*, de asemenea joac un rol important n clasificarea ramurilor metabolice. rin

analiza diferitelor mutante este posibil obinerea de informaii despre reglarea diferitelor

flu#uri, dac o anumit locaie a cii metabolice este fle#ibil sau nu. entru o locaie

metabolic rigid, enzimele din jurul punctului metabolic 9 din Figura pot fi reglate prin

regularizarea alosteric. *stfel, implicarea activitii uneia dintre enzime, n cascada de reacii

dintre intermediarul 9 spre produsul ), ar putea s se rezolve printr-o cretere a flu#ului V)i

implicit a randamentului n produs.

Figura -. "lu#ul metabolic V*, V)i V=prin intermediul 9 care este un precursor al metaboliilor ) i =.

*ceasta sugereaz un alt aspect important al cilor de analiz, i anume identificarea

enzimei, care e#ercit controlul flu#ului ntr-o cale metabolic dat. De fapt, problema cu

locul de intire al genomului, pentru a obine o cretere a flu#ului printr-o anume cale, estelegat de toate categoriile de inginerie metabolic menionate n introducere.

(3


18/32

Figura . =ile metabolice ale glucozei i #ilulozei.

*naliza controlului flu#ului este o e#aminare a bazelor celulare TlocaleU ce deseori

sunt implicate ntr-o singur cale metabolic, n contrast cu M"*, unde se considera ntreg

metabolismul celular. 5tudierea controlului flu#ului determin efectele perturbrilor n

activitile enzimatice, pentru a identifica cea mai bun int enzimatic pentru manipularea

genetic. 9nteresul general este de a suprae#prima genele specifice de codificare a enzimelor,

care e#ercit cel mai mare control asupra flu#ului dintr-o cale, deoarece suprae#primarea uneici ntregi poate fi foarte laborioas i deseori imposibil. entru e#aminarea controlului

flu#ului printr-o anume cale metabolic, cadrul analizelor de control metabolic poate servi ca

o unealt folositoare. H#ist o varietate de metode pentru determinarea aa 7 numiilor

Tcoeficieni de control al flu#uluiU, care determin un flu# relativ mrit datorit unei oarecare

creteri a activitii enzimelor individuale %&:'. 2a dezvoltarea analizei cilor metabolice este,

de asemenea important s se determine intermediarii ce ar lua parte ntr-un anumit mecanism

metabolic, care ar putea fi to#ici pentru celul n anumite condiii. $n plus, este important s

tim dac o anumit cale intermediar este implicat ntr-o cale de transducie 7 semnal, care

(E


19/32


regularizeaz flu#ul prin calea metabolic de interes, prin anumite interaciuni specifice

protein 7 protein sau prin influen la nivel transcripional %(('.

=ea mai bun strategie utilizat n studiile de inginerie metabolic la Saccharomyces

cerevisiaepentru consumul de #iloz a fost introducerea genelor KI2& i KI2( originale din

drojdii capabile s utilizeze #iloza /)andida shehatae, #ichia stipitis1. ena KI2& codific

#iloz-reductaza /KG1 care reduce #iloza la #ilitol cu consum de +*D/1. =onversia

#ilitolului n #iluloz este obinut de gena KI2( care codific #ilitol-deidrogenaza /KD1

/Figura 1.

1.-.. reterea productivit$ii i produciei

*spectele variate ale ingineriei genetice asupra drojdiei de bere au fost revizuite acum

civa ani. Hste posibil s fie introduse propieti noi n drojdia de bere, printr-o puternic

cone#iune ntre calea analitic a ingineriei metabolice i manipularea genetic a celulei,

pentru a ajuta ca procesul s fie mai profitabil. >nul dintre principalele motive pentru cererea

unei lungi perioade de folosire a berii este conversia nonenzimatic i nceat a -

acetolactatului, la componentul nedorit i fr arom 7 diacetilul, care este convertit enzimatic

la aceton i subsecvenial la (, butan 7 diol. N cale de a evita pierderea aromei, cauzat de

diacetil, este introducerea unei metode alternative de dereglare a - acetolactatului, pentru a

se trece peste formarea acetilului.

Cotui, modificrile genetice asupra drojdiei de bere prin introducerea - acetolactat

decarbo#ilazei eterogen, determin tulpinile transformate s produc acetona direct din -

acetolactat, ceea ce accelereaz procesul de cretere prin diminuarea fazei de lag de la

sptmni la ore /Figura 21. - *cetolactat decarbo#ilaza a fost evideniat cu succes n

drojdii i provine de la "lebsiella terrigena,!nterobacter aerogenes i *cetobacter xilinum.

%(' *lte ncercri de a minimaliza formarea de diacetil n drojdiile de bere au fost ncununatede succes, prin screening pentru anumite mutante i suprae#primarea unor gene specifice, care

codific enzime implicate n procesul de biosintez a valinei.

(0


20/32

Figura 2. =ile biocimice ce conduc la glicerol, piruvat i etanol.

rin tenicile de screening pentru mutante rezistente la erbicidul sulfometuron metil i

e#punerea gradat n mediu deficient n valin i izoleucin /izoleucin - i valin-1, s-au

descoperit tulpini cu activitate de sintez a acetolactatului sczut, ce determin un flu# de

carbon sczut, direcionat spre formarea de - acetolactat. +umai jumtate din cantitatea de

diacetil a fost produs de unele din acele tulpini n comparaie cu tulpinile parentale.

N alt strategie de succes a fost cea de cretere a flu#ului, prin calea biosintetic a

valinei, n scopul de a trece peste formarea diacetilului.

Manipularea cii metabolice centrale la Saccharomyces cerevisiae a fost folosit

pentru a se crete productivitatea de etanol. =nd E enzime diferite ale glicolizei au fost

e#primate separat n multivectori, nici una dintre tulpinile transformate nu a determinat o

producere mai mare de etanol dect tulpina de tip slbatic. +ici ciar suprae#primarea

enzimelor ce catalizeaz reaciile ireversibile, ca e#ocinaza, fosfofructocinaza i

4


21/32


piruvatcinaza, nu au avut efect asupra producerii de alcool. *ceste rezultate ilustreaz

rigiditatea controlului flu#ului prin metabolismul central al Saccharomyces cerevisiae.

Nricum, alte studii au raportat c folosirea fosfofructazei a mbuntit productivitatea de

etanol n cazul resturilor celulare imobilizate care cresc doar aerob.

N problem major n legtur cu producerea de etanol prin fermentaia anaerob la

Saccharomyces cerevisiae este formarea substanial de glicerol, ca produs secundar. $n

condiiile de cretere aerob, +*D citosolic format din biomasa poate fi reconvertit la

+*DBprin formarea de glicerol, n concordan cu deidrogenazele +*D mitocondrial

e#tern, codificate de genele +DH& i +DH( i alternativ printr-un sistem necunoscut.

*naerob, o#idarea +*D citosolic se poate produce doar prin formarea de glicerol, deoarece

fosforilarea o#idativ nu funcioneaz n astfel de condiii.

H#ist dou gene, D& i D(, amndou codificnd glicerol - - fosfat

deidrogenaza, care regenereaz +*DBdin +*D, n timp ce convertete diidro#iaceton 7

fosfatul la glicerol - - fosfat, dar izoenzima codificat de gena D( s-a demonstrat ca fiind

cea mai important dintre cele dou, n condiii de anaerobioz. =onversia total a glucozei la

etanol este redo# neutr, deoarece +*D este format de gliceraldeida - - fosfat

-deidrogenaza i deoarece conversia acetaldeidei la etanol include regenerarea +*D- din

+*D /Figura 21 de ctre alcool deidrogenaza 9 /codificat de *D&1 %('. *stfel,

formarea glicerolului este important pentru meninerea ecilibrului redo# din citosol, pentru

a reo#ida +*D format. N posibil strategie pentru a optimiza producia de etanol poate fi

deducerea formrii glicerolului, prin redirecionarea flu#ului de carbon, prin manipularea

metabolismului redo#. =nd o mutant gpd( a fost crescut n condiii de anaerobioz a fost

obinut o producie mai mare de etanol cu EA n concordan cu reducerea de 4A a formrii

glicerolului, dar creterea specific ma#im a fost redus cu


22/32

Figura 3. *similarea +Bn Saccharomyces cerevisiae, unde ( - o#oglutaratul i +Bsunt transformate n

glutamat prin dou ci diferite.

$ntr-o alt abordare asupra implicrii ingineriei metabolice n mrirea produciei de

etanol la Saccharomyces cerevisiaes-a intervenit n metabolismul energetic care a fost condus

n sensul scimbrii cerinelor cofactorilor, n asociaie cu asimilarea de amoniac. *similarea

de amoniac la Saccharomyces cerevisiae este descris n Figura 3. *moniacul i ( 7

o#oglutaratul pot fi convertii n glutamat, de diferite izoenzime ale glutamat deidrogenazei,

folosind +*D /d&1 sau +*D/d(1 drept cofactori %(('. *moniacul poate fi asimilat

i de glutamin 7 sintetaza /lu&1, cu formarea de glutamin, care este convertit n glutamat

prin aciunea glutamat 7 sintetazei /lt&1F suma celor dou reacii ale lu& i lt& este artat

n "igura


23/32


D, ma#imul ratei specifice de cretere a fost n principal egal cu cel al unei tulpini de tip

slbatic. Nricum scderea observat n formaiunile de glicerol a rezultat nu dintr-o cretere

considerabil a produciei de etanol, ci, mai degrab dintr-o cretere a producerii de biomas.

Cotui ingineria metabolic care diminueaz formarea de glicerol prin solicitarea unei cantiti

mrite de +*D reo#idat n celul, nu conduce neaprat la o mrire a produciei de etanol.

entru a servi acestui scop, o reducere a surplusului de +*D ar trebui combinat cu un

consum mai mare de *C n formarea biomasei, unde celula compenseaz pentru cererea

energetic mrit, prin creterea flu#ului spre etanol. *cest e#emplu ilustreaz cum un flu#

mbuntit pe una din ci poate fi obinut prin ingineria unei ci complet diferite i arat c

este important ca ntreaga reea metabolic s fie luat n consideraie. $n completarea

e#emplului mai sus amintit, mrirea ratei de conversie a *C la *D poate fi obinut prin

introducerea activitii unei *C-aze unei anumite celule, unde producia unui anumit

component poate fi mbuntit. Gecent, au fost descrise numeroase aplicaii ale acestei

abordri %(:'.

$n contrast cu drojdiile folosite n industria buturilor alcoolice, este de dorit s

direcionm flu#ul de carbon spre glicerol n timpul formrii de etanol la drojdiile

productoare de vin, deoarece glicerolul poate mbuntii calitatea vinului, oferindu-i

consisten.

1.-.(. I"bun$t$irea per*or"anelor procesului

entru a mbunti producia la nivelul produilor biotenologici, este foarte

important s se utilizeze disciplinele de inginerie genetic, care se ocup de designul

bioreactorului i optimizarea tenologiilor fermentative, care poate duce la o mbuntire a

performanelor procesului biotenologic, obinndu-se supraproducii.

roblematica dezvoltrii unor metode optime, pentru mbuntirea anumitor operaii

ale procesului tenic este legat de capacitatea tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae dembuntii performanele procesului.

Saccharomyces cerevisiae care poate suferi o cretere pseudoifal, poate forma

asociaii floculare, proprietate ce este de obicei atribuit drojdiilor de fermentaie %(3'.

N tulpin de drojdie de bere potrivit ar trebui s fie n stare de a produce floculare,

deoarece aceast proprietate este cea mai convenabil de a limpezi berea n comparaie cu

celelalte metode convenionale, cum ar fi filtrarea i centrifugarea %(E'.

+umeroase studii privind flocularea au generat o baz mare de date, dar din nefericire,compararea acestor date este restricionat, datorit diferenelor privitoare la condiiile de


24/32

testare i de cretere. Dou mecanisme de floculare complet diferite au fost observate pn

acum! fenotipul +eW"lo, gsit n numeroase tulpini de drojdii de bere, i fenotipul "lo&, gsit

n cele mai multe tulpini floculare de laborator.=ele dou fenotipuri difer remarcabil ciar

prin felul de a flocula. "enotipul "lo& d natere la floculaie n timpul creterii, neinnd

seama de semnalele pe care le primete din mediu, cum ar fi limitarea nutrienilor, n timp ce

flocularea fenotipului +eW"lo se pare a fi lansat la sfritul creterii e#poneniale, cnd i

face apariia lipsa de glucoz. >ltima apariie a floculrii la fenotipul +eW"lo este un avantaj

evident pentru industria buturilor, ajutnd la separarea drojdiilor de butur, dar genetica

fenotipului +eW"lo rmne a fi descoperit. Cotui o continuare a muncii este necesar pentru

a da o imagine complet asupra genelor implicate n fenotipul "lo&, deoarece sunt necesare

mai multe cunotiine genetice, dect pentru fenotipul +eW"lo. "enotipul "lo&, conine una

sau mai multe din genele dominante floculare, din care a fost studiat gena "2N&. *ceasta

codific o protein a suprafeei celulare, care joac rolul principal n procesul de floculare.

roteina "lo& este ancorat n peretele celular unde partea + -terminal este e#pus mediului,

iar n timpul floculrii acest fragment +-terminal se poate ataa de manoproteinele din

peretele celular vecin. ena "2N& a fost integrat cu succes n genomul unei tulpini de

drojdie de bere monoflocular, obinndu-se o tulpin flocular stabil. "locularea prin

fermentare cauzeaz o micorare a numrului de celule, mrind timpul general de fermentaie.

ena "2N& din tulpinile cu fenotipul "lo&, pare a fi legat la nivel transcripional de o

cretere n transcrierea "2N&, corelat cu o cretere a floculrii. "locularea constitutiv a fost

observat n toate stadiile de cretere, dar a fost intensificat n fazele de declin i n faza

staionar a creterii. entru a introduce flocularea ntr-o gazd nefloculant ar fi necesar s se

stabileasc un sistem genetic care s e#prime gena pentru floculare doar spre sfritul

fermentaiei. *stfel, ingineria metabolic ar trebui s se concentreze pentru a determina un

anumit sistem genetic, care conine una sau mai multe gene floculare dominante. 5ubiectul

mecanismului de control care este responsabil pentru apariia floculrii la limitareanutrienilor la tulpinile fenotipului +eW"lo este nc necunoscut %(E, (0'.

Dei, introducerea floculrii la drojdiile de bere este o metod convenabil de separare

a drojdiei din mediu se utilizeaz nc filtrarea berii care este o etap tenic important n

industria de buturi. rezena - glucanilor n orz, mpiedic filtrarea datorit vscozitii

mrite, /Saccharomyces cerevisiaenu poate idroliza legturile &, ale - glucanilor1 i de

aceea este necesar adugarea unor enzime comerciale. *lternativ, poate fi introdus in

drojdia de bere o gen eteroloag care codific - gluconaza de +acillus subtilis i


25/32


Crichoderma yeesei. >ltima opiune servete ca sarcina pentru ingineria metabolic, deoarece

substratul este mrit pentru a include i - glucanul i n consecin procesul de obinere a

berii poate fi mbuntit. %4'

1.-.. 4"bun$t$irea propiet$ilor celulare

>n efort mrit s-a depus pentru a mbunti propietile e#istente ale Saccharomyces

cerevisiae, legate de e#ploatarea industrial a acestui organism. 9nteresante n acest sens sunt

cercetrile legate de a obine o reducere a represiei glucozei, folosit n consumul de sucroz

i maltoz, care sunt prezente n amestecurile de zar din industrie i care sunt metabolizate

n mod natural de Saccharomyces cerevisiae. Drojdia de bere este produs aerobic din melase,

care conin 4A pn la


26/32

fenomen descris ca fiind sub controlul glucozei. *cest mecanism reglator poate avea un efect

costisitor asupra proceselor menionate mai sus, datorit timpului destinat procesului de

control al glucozei. 5istemul reglator care asigur consumarea glucozei naintea altor zaaruri

a fost studiat mai ales la nivel transcripional, la nivelul represiei glucozei. Gepresia glucozei,

nlesnit de proteina Mig&, controleaz e#primarea ambelor gene 5>=( i M*2. Mecanismul

molecular al represiei glucozei cu ajutorul Mig&, este o cascad reglatorie care poate implica

un comple# de proteine ce conine 5sn:, Cup& i Mig&, unde Mig& dirijeaz comple#ul spre

un consens specific, spre promotorii genelor int. enele int ale Mig& sunt limitate nu

numai de genele ce codific proteinele implicate n funciile periferice ale celulei, cum ar fi

gena 5>=(, gena M*2 i gena *2 /ce codific proteinele responsabile de utilizarea

galactozei1 i de genele metabolismului central al carbonului %(, '.

entru a depi represia glucozei e#ercitat de gena 5>=(, deleia M9& ntr-o tulpin

de laborator aploid /;4 7 &a1 s-a dovedit a fi un succes, deoarece s-a observat o cretere

a e#primrii genei 5>=(, ce a fost obinut atunci cnd celulele au crescut pe glucoz. $n

plus, micorarea controlului de glucoz a fost observat la creterea a ( mutante mig& derivate

dintr-o alt tulpin de laborator aploid i o tulpin poliploid industrial, respectiv pe

amestecurile sucroz 7 glucoz. N alt protein recent descoperit, Mig(, contribuie de

asemenea la controlarea e#primrii genei 5>=(. Deleia adiional a M9( ntr-o tulpin

mutant mig& a artat o depreciere continu a e#primrii genei 5>=(. 5tudiile fiziologice ale

deleiilor tulpinilor mig&mig( au indicat c frmiarea lui M9( a condus la o continuare a

micorrii controlului glucozei i o mrire a activitii respiratoriiF mai mult, s-a obinut o

cretere de &(A a ratei specifice de cretere pe glucoz n comparaie cu tipul slbatic. rin

urmare, deleia concomitent a lui M9& i M9( s-a dovedit a fi un succes n producia

drojdiilor de panificaie, deoarece controlul glucozei este micorat cu succes n metabolismul

sucrozei %'.

Gata de consumare a glucozei folosit n procesul industrial poate fi mrit fr aaprea efectul =rabtree, iar rata specific de cretere, care servete ca un important parametru

n producia drojdiilor de panificaie, este mrit prin aceast abordare.

5trategiile de succes pentru metabolismul energetic al genelor M*2 pentru diminuarea

e#tinderii controlului glucozei e#ercitat asupra acestor gene este diferit de strategiile mai

sus amintite. Cransferul genei M9& n tulpina aploid de tip slbatic )(( a micorat ncet

controlul glucozei e#ercitat asupra genelor M*2. Nricum, acest efect nu s-ar fi putut obine

cu mutante mig& derivate din aploida =H+. L&& 7 3D i tulpina poliploid industrialD&(.%


27/32


nceput s consume maltoza la niveluri mai sczute de glucoz, cnd au fost cultivate n medii

comple#e cu glucoz 7 maltoz, n comparaie cu tipurile parentale. 5-a concluzionat c

aceasta se datoreaz unei inactivri mai puternice a metaboliilor permeazei maltozei. 5cindri

adiionale ale genei M9( n mutante derivate din tipul slbatic =H+. L&& 7 3D au artat

un fenotip uor mai represat dect mutanta mig&. Desfacerea lui M9& /i M9(1 poate

derepresa anumite proteine implicate n semnalizarea glucozei, iar aceste proteine mediaz

inactivarea permeazei maltozei. Mai multe raporturi arat c inactivarea catabolic a

permeazei maltozei, are un impact major asupra metabolismului maltozei, iar analizele de

control metabolic indic de asemenea, c permeazele maltozei limiteaz metabolismul

maltozei %:'.

$n loc de a inti gene reglatoare ca M9& i M9(, mbuntirea consumului de

maltoz din amestecurile glucoz 7 maltoz au fost obinute prin e#primarea constitutiv a

genelor structurale M*2. H#primarea constitutiv a M*2C i M*25 n mutanta mig&

derivat din tipul slbatic )((, a artat o utilizare simultan a glucozei i maltozei. =nd

M*2C i M*25 au fost suprae#primate n tulpina de tip slbatic, maltoza a fost utilizat n

defavoarea glucozei. Dup ct se poate presupune, suprae#primarea genei M*2C

contracareaz complet efectul de inactivare a catabolismului carbonului n transportorul

maltozei. $n sprijinul micorrii controlului glucozei, suprae#primarea celor dou gene

strcturale M*2 a crescut rata specific de cretere cu 4,4 -& i la glucoz i la maltoz,

comparativ cu cea a tipului slbatic %3'.

Deci, aceast strategie pare s fie atractiv pentru micorarea controlului glucozei n

metabolismul maltozei n cazul drojdiilor de fermentaie, ceea ce reduce timpul de producere

a etanolului. =ontrolul redus al glucozei arat, de asemenea, un timp redus al procesului de

producere a pinii, care este mai departe micorat deoarece aluatul poate crete i mai repede,

ca rezultat al mririi ratei specifice de cretere.

Deleia genelor ce codific proteinele represoare de transcripie sau suprae#primareagenelor ce codific activatorii transcripionali pozitivi, poate fi o strategie de succes pentru

ingineria metabolic, n anumite sisteme metabolice. *ceast strategie poate rezulta din

suprae#primarea mai multor gene, care sunt subiectul controlului transcripional implicnd

proteina represoare de deleie sau proteina represoare.

$n anumite cazuri aceast abordare va fi favorabil n comparaie cu suprae#primarea

genelor ce codific unele sau toate enzimele unei anumite ci metabolice %(('.

1.. !roducerea de proteine heteroloage3


28/32

De-a lungul studiilor efectuate asupra comportamentului Saccharomyces cerevisiae, ca

i a importantei capacitii acestei drojdii de a e#prima gene strine n combinaie cu aparatul

ei secretor, face din Saccharomyces cerevisiaeun organism-gazd atractiv pentru producerea

de anumite proteine eterogene.

+umeroase proteine eterogene care au fost folosite n scopul de a diagnostica sau ca

ageni terapeutici umani i vaccinuri au fost produse cu succes de Saccharomyces cerevisiae.

9nterferonul uman a fost prima protein recombinant produs de Saccharomyces

cerevisiaen &0E&, iar n anul urmtor a fost produs primul vaccin obinut prin intermediul

ingineriei genetice %E'. roducia industrial de insulin de ctre Saccharomyces cerevisiae,

acoper aproape jumtate din nevoia de insulin a &


29/32


mediaz translocarea cotranslaional /Figura 161 a fuziunii proteinei n eucariote %3'.

reregiunea secvenei leader este separat de o peptidaz 7 semnal, iar n aparatul olgi

endoproteaza Le#( separ preregiune n partea =-terminal a maturrii dibazice Le#(. $nainte

de secreie, peptida spaiatoare a maturrii Le#( de la e#tremitatea =-terminal este nlturat

prin aciunea dipeptidil 7 aminopeptidazei, codificat de gena 5CH& i proteina eterogen

este eliberat n mediul e#tracelular %'.

De-a lungul timpului au fost efectuate studii pentru a mbunti secreia de insulin

prin folosirea factorului prepro 7 leader al Saccharomyces cerevisiaeF ntregul - factor

prepro 7 leader al Saccharomyces cerevisiaea fost folosit pentru studiile iniiale n secreia de

insulin cu o peptid spaiatoare avnd o secven lu 7 *la 7 lu 7 *la, care rezult prin

fuziunea proteinelor artate n "igura &4 %'.

Figura 16. 9lustrarea unui factor prepro-leader fuzionat cu un precursor al insulinei.

$n acest studiu, peptida spaiatoare a fost ndeprtat cu greu de dipeptidil 7 aminopeptidaza,

obinndu-se n principal un precursor al insulinei lu 7 *la 7 lu 7 *la, deci spaiatorul a fost

ndeprtat prin mutageneza direct asupra locului. *ceast modificare a factorului al secvenei

leader a relevat cu succes e#primarea i secreia a numeroi precursori insulinici. *lte studii au

artat avantajul unui spaiator, deoarece poate fi atins o mbuntire a procesrii Le#(p, ceea ce n

cazul insulinei este de preferat deoarece procesarea insuficient a Le#(, poate cauza o

iperglicozilare i o depreciere a produciei de insulin.

=nd spaiatorii potrivii i creai n aa fel nct s poat fi ndeprtai de tripsin sau

de*chromobacter lyticusce cu o proteaz specific 26s&, au fost introdui ntre Le#( dibazic

i precursorul insulinic, producia de precursor al insulinei a fost mbuntit. rezena unui

spaiator nu numai c s-a dovedit a fi un succes pentru secreia secvenei leader a factorului

fuzionat cu precursorul insulinei, dar i glicozilaza + 7 lincat a celor dou pri a -

factorului propeptidglicozilat, localizate aproape de precursorul insulinei, joac un rol de

0


30/32

pivot n procesul de secreie, deoarece lipsa acestor dou glicozilaze micoreaz semnificativ

secreia precursorului insulinei %


31/32


leader pot activa e#primarea i secreia proteinelor eterogene, ceea ce nu este posibil cu

factorul - prepro 7 leader folosit n mod tradiional.

=onceptele descrise mai sus relateaz cteva e#emple de obinere de tulpini de

Saccharomyces cerevisiae cu propieti noi sau mbuntite prin inginerie genetic imetabolic. 9deea de baz n utilizrile tulpinilor de Saccharomyces cerevisiaeeste aceea de a

satisface din ce n ce mai multe scopuri biotenologice. Deoarece secvena complet

genomic a drojdiei este cunoscut, scimbrile genetice int sunt mai uor de obinut prin

tenologia *D+ recombinant, ceea ce faciliteaz i accelereaz studiile de inginerie

metabolic.. Cotui, rigiditatea Saccharomyces cerevisiae privind alterarea funciilor ei

metabolice poate limita anumite abordri ale metabolismului ingineresc, acest microorganism

are cu siguran un potenial mrit pentru cile energetice. >n numr de noi aplicaii bazate pe

Saccharomyces cerevisiae vor aprea n viitor, iar acestea, mpreun cu e#emplele

menionate, vor ilustra clar potenialul tulpinii Saccharomyces cerevisiae, ca fabric celular

n procesele biotenologice.

7ibliogra*ie1. 5pencer, 9., 5pencer, D., easts -echnology, 5pringer @erlag, )erlin eidelberg +eW

Ior8, -:nWin,

2ondon, /&0E31.. innen, *., )u#ton, "., =anduri, )., ein, 9., ottinger, C., Me6ac8, )., olig, .,

.ene expression in recombinant micro/organism, *. 5mit, Marcel De88er 9nc., +eWIor8, &(&-&0, /&00L, &3-&E0, /&00&1.

. "aber, L. +., order, ;., *b. ., @ecnuis, M., east, 11, &&-&, /&00


32/32

12. offeau, *., )arell, . )., )uss6, )., 2ife 3ith 6000 genes, 5cience, 2,

Drojdiile.pdf

Documents

Transcript of Drojdiile.pdf