10. TIPURI DE CULTURI STARTERDin punct de vedere al stării în care se comercializează culturile starter,

acestea pot fi:• Culturi starter sub formă uscată

o Deshidratate o liofilizate

• Culturi starter congelateo Congelate la -40°Co Congelate în azot lichid la -l96°C

• Culturi starter imobilizateo Lactococcus lactis imobilizat pe perle de alginat de calciu - tip de fermentaţie

continuă.

10.1. CULTURI STARTER CONCENTRATE

Culturile starter concentrate de microorganisme sunt reprezentate de culturi (de bacterii, drojdii) obţinute în condiţii controlate, sau suspensii de spori de mucegai, concentrate într-un volum mic şi conservate prin congelare sau liofilizare.

Aplicaţii: culturile starter concentrate de bacterii se utilizează pentru obţinerea culturilor starter de producţie (maiele de producţie); obţinerea produselor fermentate prin utilizare directă în lapte, în pasta de carne etc.

Obţinerea culturilor starter concentrate se realizează prin două procedee:1. procedeul de cultivare periodică2. procedeul de cultivare continuă.

Etapele preparării culturilor starter concentrate sunt redate în figura de mai jos.

Tehnologia de obţinere a culturilor starter concentrate

Pentru însămânţarea culturii stoc trebuie selectat un mediu de cultură care să corespundă exigenţelor nutritive ale tulpinilor microbiene, să aibă un pH optim, iar incubarea să se efectueze în condiţii corespunzătoare tipului lor respirator şi la temperatura optimă de multiplicare.

CULTURA STOC

Inocularea mediului de cultură

incubare până la faza logaritmica de multiplicare

concentrare prin centrifugare si resuspendare

CONSERVAREcongelare - liofilizare

După obţinerea culturii la un nivel maxim de multiplicare, se concentrează cultura, prin centrifugare, iar sedimentul celular este resuspendat într-un lichid adecvat. Concentraţia de germeni a culturilor starter trebuie să se încadreze între anumite limite: 2,5x1010 şi 5,5x1010

celule vii, active/g sau ml.

Conservarea se realizează prin două metode: congelare şi liofilizare.Congelarea se poate efectua în stare lichidă sau în azot lichid.Congelarea în stare lichidă presupune resuspendarea bacteriilor într-un antigel

solubil în apă (alcooli polihidrici), care se utilizează în proporţie de 40-50% faţă de concentrat. Temperatura de congelare este minus 40°C. Avantajele acestui tip de congelare sunt:

• se elimină acţiunea negativă a gheţii asupra bacteriilor;• concentratul se poate încălzi la temperatura de utilizare, fară să afecteze viabilitatea

celulelor,• manipularea este mai facilă.

Congelarea în azot lichid (-196°C), implică combinarea concentratului cu un agent crioprotector. In cazul bacteriilor lactice, se utilizează cu bune rezultate următorul amestec: glicerol 10% şi lactoza 7,5%.

Conservarea prin liofilizare. Concentratul de bacterii se amestecă cu un suport adecvat (lapte praf degresat, lactoproteine pulbere, lactoza, zaharoză) şi apoi se liofilizează. In timpul desicării secundare, temperatura nu trebuie să depăşească 40- 45°C. După liofilizare se ambalează sub vid. Produsele liofilizate se conservă la -18°C.

10.2. Interacţiuni interspecifice în culturile starter mixte

Cultura starter mixtă, este o cultură de microorganisme aparţinând mai multor specii din cadrul unui gen, sau mai multor genuri microbiene. Relaţii ecologice între diferitele tulpini microbiene pot fi:

relaţii de tip cooperant: comensalismul, simbioza sau sinergismul;

relatii de tip antagonic: competitia, parazitismul, antagonismul propriu-zis.Relaţiile de tip cooperant (de tip beneficial), înseamnă că cel puţin unul dintre

partenerii microbieni, are un beneficiu.La prepararea iaurtului se utilizează o cultură mixtă alcătuită din Streptococcus

thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Cultura mixtă produce mai rapid acid lactic, decât fiecare specie bacteriană separat (acesta reprezintă un exemplu de sinergism). Intre cele două specii se realizează şi o relaţie de tip simbiotic, fiecare specie bacteriană oferă celeilalte un metabolit, care reprezintă un factor nutritiv pentru partener:

- Streptococcus thermophilus produce acid formic care favorizează dezvoltarea speciei Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus;

- Lactobacillus la rândul său produce aminoacizi liberi, în special histidină, care stimulează dezvoltarea şi producerea de acid lactic de către Streptococcus thermophilus.

La un moment dat, totuşi se instalează şi o formă de antagonism bacterian, bazată pe competiţia dintre cele două specii, în sensul că:

- Streptococcus thermophilus se dezvoltă mai rapid şi consumă substanţele nutritive necesare şi dezvoltării speciei Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, care din acest motiv se dezvoltă mai slab.

Alt exemplu de relaţii de tip benefic, este reprezentat de cultura mixtă alcătuită din bacterii lactice şi propionice.

Bacteriile lactice favorizează dezvoltarea bacteriilor propionice, prin:- transformarea lactozei în lactaţi,- scăderea potenţialului de oxidoreducere,- hidroliza proteinelor, reglarea pH-ului.

Si in acest caz, poate sa apară şi o forma de antagonism bacterian, atunci când:- bacteriile lactice, produc H2O2 şi nu sintetizează catalază.- Lactobacilii care produc H2O2, dar sunt catalază negativi, sunt mai puţin sensibili

decât streptococii catalazo negativi şi care nu produc nici H2O2.

10.3. Culturi starter concentrate de spori de mucegaiAceste culturi se pot utiliza în industria laptelui (obţinerea unor sortimente de

brânzeturi) sau în industria cărnii pentru prepararea unor sortimente de cârnaţi sau salamuri în stare crudă.

Pentru obţinerea unei culturi starter de spori de mucegai se procedează după cum urmează:

• se însămânţează mediul de cultură adecvat, repartizat în eprubete şi solidificat în pantă, cu spori de mucegai şi se incubează în condiţii corespunzătoare speciei de cultivat (de regulă la 20-25°C).

• Se urmăreşte dezvoltarea culturii, până la atingerea gradului de maturitate al miceliului, cu formarea corpilor fructificanţi şi a sporilor.

• In acest moment se recoltează sporii prin spălarea culturii cu soluţie fiziologică sterilă şi se însămânţează mediul Czapek repartizat în plăci Roux. Se incubează mai multe zile la 20-25°C.

• După dezvoltarea culturilor şi formarea sporilor se recoltează sporii într-un volum mic de soluţie fiziologică sterilă, astfel să se asigure o concentraţie de 109-1010 spori/ml.

• Suspensia astfel obţinută se conservă la frigider (0-4°C) sau poate fi liofilizată, în acest caz se utilizează ca emulgator, polietilsorbitanul.

10.4. CULTURI STARTER CU CELULE IMOBILIZATE

Tehnologia celulelor imobilizate (IC), în ultimul timp, a câştigat teren şi în industria alimentară. Avantajele oferite de tehnologia IC:

• asigură o densitate mai mare de celule microbiene;• oferă productivitate ridicată;• asigură stabilitatea fizică şi biologică a celulelor microbiene pe parcursul fermentaţiei,

superioară faţă de tehnologia FC (cu celule libere);

• împiedică transferul de plasmide între celule;

• limitează posibilitatea de contaminare;

• stimulează sinteza şi secreţia de metaboliţi.Scopul principal al acestei noi tehnologii este acela de a menţine o concentraţie ridicată

de germeni în bioreactor şi de a proteja celulele de acţiunea factorilor nefavorabili. Tehnici de imobilizare a celulelor microbiene:

> includere într-o reţea de polimeri; > adsorbtia la suprafaţa unui purtător;> includere în membrane;

> microîncapsularea.Dintre aceste procedee de imobilizare, de o largă aplicabilitate se bucură metoda de

includere a celulelor într-o matrice poroasă de polimeri şi metoda microîncapsulării.

Tehnica includerii într-o matrice de polimeri este o metodă relativ simplă şi constă în obţinerea unor sfere de gel (0,3-3,0 mm Ø), cu o concentraţie mare de celule.

Polimerii utilizaţi trebuie să nu fie toxici, să asigure viabilitatea celulelor, să prezinte o bună stabilitate mecanică pe parcursul fermentării şi să poată fi obţinuţi în condiţii aseptice. In industria alimentară şi cu precădere în industria laptelui au fost acceptaţi ca aditivi sau ingrediente, următorii polimeri: K-carrageenan, gellan, agaroză, gelatină, alginat, chitosan etc.

Aplicaţiile bacteriilor lactice imobilizate sunt, în industria laptelui, la obţinerea unor produse lactate fermentate (iaurt, unele brânzeturi etc).

In industria laptelui, se mai utilizează celule bacteriene aparţinând speciilor Streptococcus thermophilus şi Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus imobilizate în perle sferice de alginat de calciu, într-un sistem continuu de inoculare-prefermentare a laptelui, pentru obţinerea iaurtului. pH-ul este permanent monitorizat şi controlează rata de alimentare a fermentatorului. La pH 5,7, timpul de remanentă a laptelui în bioreactor este foarte scurt (8-9 minute), iar producerea de acid lactic este superioară (de cca. 3,3 ori mai mare) faţă de tehnologia care utilizează cultură mixtă cu celule libere (FC). Raportul coci/bacili în laptele prefermentat, se menţine stabil, la valoarea 1, proporţie ideală pentru fabricarea iaurtului.

S-a propus aplicarea acestei tehnologii şi pentru obţinerea acidului lactic. Pentru aceasta se utilizează celule aparţinând speciei Lactobacillus helveticus imobilizate în perle de k-carrageenan/LGB, utilizând un reactor suplimentar IC.

De asemenea, această metodă a avut succes şi în tehnologia de obţinere a exopolizaharidelor produse de bacteriile lactice. Se utilizează celule imobilizate de Lactobacillus rhamnosus prin adsorbţie pe suport solid poros (ImmobaSil®).

Exopolizaharidele sintetizate de bacteriile lactice se utilizează ca ingrediente alimentare pentru îmbunătăţirea texturii, aromei şi stabilităţii produsului finit. De asemenea, se pot utiliza ca prebiotice având un rol benefic asupra organismului uman, datorat efectului antitumoral, antiulceros, imunomodulator şi hipocolesterolemiant.

Celule de Lactococcus lactis subsp. lactis var. diacetilactis imobilizate în perle de gel K-carrageenan/LBG se utilizează pentru obţinerea unei cantităţi sporite de nizină Z. Tot în scopul producerii de bacteriocine (pediocina) se utilizează tehnologia cu celule imobilizate de Pediococcus acidilactici .

Microîncapsularea. Microcapsulele sunt sfere de câţiva microni până la 1 mm, cu o membrană subţire, semipermeabilă, care conţin în interior cultură de bacterii lactice sau microorganisme probiotice sau particule de cultură liofilizată. In majoritatea cazurilor se utilizează pentru încapsulare biopolimeri naturali ca alginatul de calciu, k-carrageenan sau guma gellan.

Există semnalări în literatura de specialitate privind creşterea rezistenţei la congelare sau liofilizare a celulelor microbiene probiotice prin încapsulare. O stabilitate la congelare îmbunătăţită în mod semnificativ, s-a constatat la Lactobacillus acidophilus şi Bifidobacterium longum imobilizate în alginat, comparativ cu tehnica FC (celule libere). In cazul speciei Bifidobacterium longum au fost utilizaţi agenţi crioprotectori (glicerol sau manitol) în soluţia de alginat, care a crescut efectul protector faţă de celulele imobilizate şi a determinat o rată de viabilitate de 90%, comparativ cu doar 40% prin metoda FC. Pentru

industria alimentară se recomandă ca dimensiunea microcapsulelor să se încadreze între 30 şi 100 µ, deoarece s-a observat că microcapsulele cu dimensiuni mai mici au un efect protector diminuat faţă de celulele imobilizate, iar cele cu dimensiuni mai mari, conduc la apariţia unor defecte organoleptice ale produselor respective.

Metoda încapsulării asigură viabilitatea microorganismelor probiotice şi în produsele lactate fermentate. Imobilizarea bacteriilor din specia Bifidobacterium longum în k-carrageenan, Bifidobacterium bifidum şi B. infantis în perle de gellan-xantan a condus la menţinerea unei concentraţii crescute de celule în iaurt, în timpul conservării pe o perioadă de 5 săptămâni, fară instalarea unor modificări organoleptice.

In tabelul de mai jos sunt prezentate speciile bacteriene care pot fi încapsulate.Microcapsule cu celule bacteriene imobilizate destinate

industriei laptelui

Au fost efectuate teste in vitro, privind efectul protector al microîncapsulării asupra viabilităţii celulelor, simulând digestia gastrică sau intestinală. Astfel, expunerea timp de 30 minute la acţiunea sucului gastric artificial, cu pH 2,5, a determinat scăderea dramatică a numărului de celule viabile prin metoda FC, de la l,2xl09UFC ml'1, la un nivel nedetectabil, în timp ce prin imobilizarea celulelor, numărul a scăzut cu doar 0,67 log. De asemenea, dimensiunea microcapsulelor influenţează rolul protector asupra celulelor. Aşadar, microcapsulele foarte mari (peste 2 mm) asigură o mai bună protecţie a bacteriilor de B. longum, faţă de acţiunea sucului gastric sau a sărurilor biliare.

Suport Specie microbianăAlginat Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricusAlginat Lactobacillus plantarumAlginat Lactobacillus acidophilusAlginat Bifidobacterium bifidumAlginat Bi/idobacterium infantisAlginat Bifidobacterium longumAlginat Bifidobacterium lactis

k-carrageenan Bifidobacterium bifidumk-carrageenan Bifidobacterium longumacetat-ftalat- Bifidobacterium pseudolongum

celuloză