CURS 1

CURS 1

CITODIFERENIEREA reprezint ansamblul de mecanisme celuleare si moleculare, prin care un subset din setul de gene ale orictrei celule, este selectiv exprimat n fiecare tip de celul. Diferenierea celular este de regul ireversibil. Schimbarea strii de difereniere (ntlnit n special la plante) se numete dedifereniere.

Dezvoltarea embrionar urmrete pe de-o parte generarea diversitii celulare, n fiecare generaie, iar pe de alt parte, asigur continuitatea celular de la o generaie la alta prin intermediul celulelor germinale.

1. Imediat dup F! are loc segmentarea. Aceasta cuprinde o succesiune de diviziuni mitotice foarte rapide, n care volumul enorm de citoplasm al zigotului este divizat n celule mai mici numite blastomere. La sfritul procesului de segmentare rezult blastula.

2. Dup ce viteza diviziunilor celulare mitotice s-a redus, blastomerele sufer deplasri n cursul crora i chimb poziia. Ansamblul acestor rearanjri celulare poart denumirea de gastrulare i la sfritul ei se formeaz cele trei foie embrionare: ectoderm, endoderm i mezoderm.3. Dup formarea celor trei foie embrionare, celulele ncep s interacioneze ntre ele i s se organizeze pentru a forma esuturile i organele, proces numit organogenez.

4. O parte din citoplasma zigotului formaz celulele precursoare ale gameilor. Aceste celule se numesc celule germinale primordiale i se deosebesc de celelalte celule ale corpului numite celule somatice.

mprirea n celule somatice i celule germinale reprezint una din primele diferenieri care au loc n cursul embiogenezei. Datorit faptului c toate celulele unui organism provin din ovulul fecundat, ele sunt echivalente din punct de vedere genetic i au aceeai informaie genetic cu cea a zigotului.. Fenotipic, ns, ele sunt diferite i se caracterizeaz prin produi genetici distinci.. Cu alte cuvinte, celulele unui organism se deosebesc ntre ele nu pentru ca au informaie genetic diferite ci pentru c exprim gene diferite. Cele mai importante dovezi c genomul rmne constant n cursul diferenierii celulare provin de la exp. lui Gurdon (1975) prin care s-au transplantat nuclei de celule somatice in ovocite enuclate de amfibian. Confirmarea echivalenei genomice s-a realizat ns n 1997 odata cu clonarea oiei Dolly.

ZIGOT

BLASTUL

GASTRUL

ECTODERM

ENDODERM

Epiderm creier

intestin embrionar

i str. asociate i S.N. epit. tb. dig. epit. tr. resp

glande

MEZODERM

Notocord Somite

Muchi S. excret. Gonade Pleur

Pericard

Peritoneu

Mezenchim

Derm Sist. Circulator Sist. Osos

Ovocitul de amfibian este destul de voluminos pentru a permite injectarea cu o micropipet a unui nucleu izolat din alt celul (intestinal, tegumentar). S-a constatat c transplantarea nucleilor celulelor intestinale de mormoloc, n ovocite enucleate de Xenopus laevis, determin formarea de mormoloci viabili, unii din ei dezvoltndu-se pn la stadiul de adult. Acest experiment a demonstrat c nucleii endodermali sunt totipoteni. n cazul n care s-au folosit nuclei din celulele tegumentare adulte s-au obinut mormoloci, ns niciodat aduli. ncercrile cu nuclei ai altor celule adulte au condus la aceeai concluzie: nucleii celulelor difereniate sunt pluripoteni (au capacitatea de a produce toate tipurile celulare ale unui mormoloc) dar nu totipoteni.

Exist i excepii de la regula echivalenei genomice, cunoscute sub denumirea de diminuri cromozomale.

- la Ascaris toate celulele somatice pierd 25% din ADN acesta fiind bogat n secvene repetitive. La alt specie Parascaris acre are doar doi cromozomi, se elimin 85% din ADN. Dup prima diviziune de segmentare, n blastomera din polul animal cromozomii se fragmenteaz i o parte din ADN este eliminat.. Procesul continu i n a doua diviziune de segmentare, astfel nct n final doar cteva celule conin genomul intact i ele dau natere liniei germinale.

Secvena de evenimente embrionare care conduce la formarea unui tip celular specializat cuprinde trei etape: specificare, determinare i difereniere celular.

O celul specificat este capabil s se diferenieze autonom ntr-un mediu neutru (mediu de cultur). Fiecare celul este specificat de tipul de citoplasm motenit n cursul segmentrii, astfel nct destinul celular este asumat fr intervenia celulelor vecine. Acest tip de specificare poart denumirea de specificare autonom, pentru c celula este specificat de proprii constituieni citoplasmatici.

O celul fondatoare este considerat prima celul specificat, care prin diviziuni succesive va forma o clon de celule, ce vor alctui un teritoiu embrionar.

Moleculele implicate n specificarea autonom poart denumirea de determinani morfogenetici, natura lor biochimic fiind diferit..

Un alt tip de specificare este specificarea condiionat sau inductiv deaorece destinul blastomerelor depinde de condiiile n care se gsesc. Ex. daca se indeprteaz o blastomer din embrionul timpuriu celulele rmase ii modific destinul.

Celulele determinate sunt angajate pe o anumit cale de dezvoltare. De exemplu, mezodermul somitic este determinat s formeze esut muscular, gonade, sistem excretor, etc. Celulele determinate s urmeze o anumit cale de dezvoltare sunt denumite cu sufixul blast (mioblast, neuroblast) i ele au capacitatea de a se divide, pentru a forma o clon celular, n care toi membrii sunt destinai s formeze acelai tip celular..

O celul determinat se poate diferenia autonom cnd este plasat n alt regiune embrionar. Dac n blastula de amfibian se grefeaz, ntr-o regiune ectopic, celule ectodermale, care dau natere ochiului, celulele transplantate se difereniaz n aceeai direcie cu celulele nconjurtoare, aspect care sugereaz c n momentul transplantului celulele nu erau determinate. Dac aceiai operaie este realizat mai trziu (gastrul), viitoarea regiune vizual va forma n embrionul gazd un ochi ectopic..

Determinarea celular implic selectarea genelor care se vor exprima n fiecare tip celular.

Fenomenul determinrii celulare ridic dou ntrebri moleculare:

1. Ce molecule definesc starea celular determinat?

2. Care este mecanismul prin care se menine aceast stare?

Diferenierea celular reprezint procesul prin care celulele embrionare devin diferite unele de altele, capt identiti distincte i funcii specializate. n cursul diferenierii au loc modificri ale exprimrii genetice, responsabile de sinteza produilor specifici unui tip celular.

Genele exprimate n celulele difereniate cuprind pe lng cele care codific proteine specifice i alte gene, care asigur buna funcionare a celulei. (house keeping genom). O celul difereniat este caracterizat de produii pe care i conine, astfel nct prezena anumitor proteine poate determina modificri structurale.

Celulele difereniate sunt foarte stabile i n mod normal nu se mai divid.

Exist dou cazuri n care diferenierea unui tip celular nu este ireversibil: transdiferenierea i dediferenierea.

Transdiferenierea a fost observat n esuturile regenerate, unde un tip celular se poate modifica n alt tip celular, nrudit. De exemplu, regenerarea cristalinului de triton se poate realiza prin recrutarea celulelor din regiunea dorsal a epiteliului pigmentat al irisului.

Dediferenierea reprezint pierderea caracteristicilor structurale i funcionale ale unei celule difereniate i diferenierea ulterioar n alt tip celular. Dup amputarea unui membru de triton celulele epidermale migreaz rapid la suprafaa rnii i formeaz un blastem alctuit din keratinocite, care i pierd caracterul difereniat i reintr n ciclul celular. Pe baza activitii blastemului are loc regenerarea tuturor tipurilor celulare caracteristice membrelor.

REGLAREA ACTIVITII TRANSCRIPIONALE

Dezvoltarea unui organism pluricelular este realizat prin aciunea unor factori transcripionali specifici i a altor proteine reglatorii, care controleaz programele de determinare i difereniere celular.

Paradigma major a geneticii dezvoltrii este expresiei genic difereniat din acelai repertoriu nuclear. Diferite tipuri celulare au seturi diferite de proteine chiar dac genomul lor este identic. Aceast reglare a expresiei genice se poate realiza la mai multe nivele:

transcrierea genetic difereniat reglaj la nivelul transcrierii ARN

procesarea secelstiv a ARN nucl.

Translaia selectiv a ARNm

Modificarea diferit a proteinelor.

FACTORI TRANSCRIPIONALI

I. SUPRACLASA FACTORILOR TRANSCRIPIONALI CU MOTIVE DE ZINC

Clasa C2H2 (TFIIIA)

Clasa C4 (Receptori nucleari)

Factori transcripionali GATA

II. SUPRACLASA FACTORILOR TRANSCRIPIONALI CU DOMENII BAZICEClasa factorilor transcripionali leucin-zipper

Clasa factorilor transcripionali bazici helix-loop-helix

Clasa factorilor transcripionali HLH leucin zipper

III. SUPRA CLASA FATORILOR TRANSCRIPIONALI HELIX-TURN-HELIX

Clasa factorilor transcripionali cu homeodomeniu

Clasa factorilor transcripionali PAX

Clasa forkhead

Clasa ETS

Clasa TEA

IV ALI FACTORI DE TRANSCRIERE

Clasa REL

Clasa MADS-BOX

Clasa factorilor transcripionali cu domeniu COLD-SHOCK

Clasa RUNT

Clasa HMG

Clasa factorilor transcripionali T-BOX

Factorii transcripionali sunt reprezentai de proteine, care pot afecta transcrierea unei gene, prin activarea sau inhibarea ei. Acest efect poate fi exercitat direct, prin legarea de ADN sau indirect, prin interacii cu ali factori transcripionali.

Factorii transcripionali care interacioneaz cu regiunile de control ale genelor se mpart n dou grupuri:

factori de transcriere bazali care iniiaz transcripia de la nivelul secvenei promotoare TATA. Ei sunt necesari pentru transcrierea unei game largi de gene i sunt prezeni n majoritatea tipurilor celulare.

Factori transcripionali reglatori. Acestia se pot lega de secvene de ADN situate la distan de situsul de iniiere a transcripiei, au rolul de a modula activitatea transcripional i permit exprimarea genelor caracteristice unui tip celular.

Dei unele proteine reglatorii de la eucariote acioneaz individual, majoritatea lor fac parte dintr-un complex alctuit din mai multe polipeptide, fiecare cu o funcie distinct.

Studiile moleculare i compararea secvenelor de aminoacizi au evideniat existena mai multor motive structurale, care mediaz contactele specifice cu ADN. n multe cazuri, motivul de legare de ADN este conservat n cursul evoluiei, la o gam larg de specii. Existena acestor motive conservate de legare de ADN a condus la gruparea reglatorilor transcripionali n superclase, clase i familii

I. SUPRACLASA FACTORILOR TRANSCRIPIONALI CU MOTIVE DE ZINC

Clasa C2H2 (TFIIIA)

In motivele Zn finger ale acestor factori transcripionali, Zn joac un rol structural, pentru c el stabilizeaz aceste domenii scurte prin interacii ionice

Ex. TFIIIA - recunoaste specific o secven din regiunea de control a genei ARNr 5S.

Factorii transcriptionali care se nfoar n jurul acidului nucleic si au contacte multiple cu acesta, nu pot interaciona eficient cu ADN ncolcit n jurul miezului histonic. n acest sens s-a constatat c eficiena legrii TFIIIA depinde de tipul i stoichiometria histonelor asociate genei ARNr 5S.

Clasa C4 (Receptori nucleari)

Receptorii nucleari particip la reglarea transcripional a proceselor embrionare, n meninerea homeostaziei sau n inducerea/inhibarea proliferrii celulare, a diferenierii i apoptozei

Factorii transcripionali GATA

Domeniul GATA se gsete n proteinele care se leag la o secven consens de ADN, bogat n Guanozin-Adenozin-ribozilTimin.Adenozin. Prezint 2 motive Znfinger.

Un aspect important al biologiei dezvoltrii este acela al nelegerii modului n care foiele embrionare genereaz diferite tipuri celulare. Date recente sugereaz c factorii transcripionali GATA i NHF3 (Hepatic Nuclear Factor) sunt eseniali pentru formarea endodermului la toate metazoarele. Aceti factori confer competen unei foie embrionare pluripotente, nainte ca aceasta s exprime genele specifice. Acest fenomen denumit potenare genetic se realizeaz prin legarea factorilor transcripionali GATA i HNF3 de genele int, naintea activrii lor. De exemplu, n endodermul intestinului anterior din care se va diferenia mugurele hepatic gena albuminei nu se exprim dei de regiunea enhancer sunt legati factorii GATA-4 i HNF3. Ulterior, n primordia ficatului (mugurele hepatic) gena este transcris datorit legrii de enhancer i a altor factori transcripionali

GATA-4 HNF3 ENDODERM

ENHANCERUL GENEI ALBUMINEI

MUGURELE HEPATICGATA-4 HNF3 Alti factori de transcriere

II. SUPRACLASA FACTORILOR TRANSCRIPIONALI CU DOMENII BAZICEClasa factorilor transcripionali leucin-zipper

In forma lor monomerica, proteinele leucin yipper contin un domeniu de dimerizare C-terminal si unul bazic N-terminal

La toate organismele factorii transcriptionali leucinzipper asigura controlul transcriptional al genelor implicate in formarea diferitelor strcuturi embrionare.

Clasa factorilor transcripionali bazici helix-loop-helix

Acesti factori contin un domeniu de 50-60 de aminoacizi format din 2 helixuri amfipatice unite printr-o regiune variabil ca lungime ce formaz o bucl

Din aceast categorie fac parte factori transcriptionali cu rol embrionar.

III. SUPRA CLASA FATORILOR TRANSCRIPIONALI HELIX-TURN-HELIX

Clasa factorilor transcripionali cu homeodomeniu

Homeodomeniul este codificat de o secven de ADN denumita homeobox alc din 60 aa ce formeaz 3 helixuri mpachetate intr-o strcutura globulara

Clasa PAX

Genele Pax codifica factori de transcriere ce controleaza diferite evenimente embrionare la vertebrate, artropode si nematode. Acesti fact de transcriere contin un domeniu de legare de ADN alctuit din 124-130 aa denumit paired-box deoarece este bipartit si alcatuit din 2 subdomenii N-terminal si C-terminal

Clasa MADS-BOX

Fact transcriptionali MADS alctuiesc o clasa distinct de proteine reglatoare embrionare care se gasesc in cantitate mare in muschii secheletici, cardiaci, netezi i neuroni

Proteinele MADS-BOX recunosc secvene bogate in AT

Structura miezului nucleozomal (dup Khorasanizadeh, 2004). 147 pb ADN (ilustrat n dou nuane de albastru) sunt infurate n jurul octamerului histonic compus din cte dou molecule H2A (rou), H2B (roz), H3 (verde) i H4 (galben) pentru a forma particula miez nucleozomal cu forma sa caracteristic de disc aplatizat.

DOMENIILE CROMATINICE

Goldman (1988) a introdus noiunile de gene competente transcripional, nelegnd prin acest termen setul de gene care sunt transcrise la un moment dat sau care vor fi transcrise ulterior, n dezvoltarea ontogenetic, atunci cnd vor apare stimuli corespunztori, i de gene incompetente transcripional- acele gene care nu pot fi transcrise n nici o situaie mezologic.

De exemplu, gene incompetente transcripional n fibroblaste sunt genele pentru hemoglobin sau genele specifice ficatului. Autorul consider c dobndirea potenialului de transcriere ce apare n cursul dezvoltrii nu este o proprietate a nsi unitii de transcriere, ci mai degrab a domeniului cromatinic care poate fi de cteva ori mai mare dect gena.

Prin domeniu cromatinic se nelege o bucl de ADN superspiralizat independent, ce poate fi asamblat n cursul replicrii ntr-o conformaie deschis (transcriptibil) sau nchis (netranscriptibil), depinznd de disponibilitatea unei cantiti corespunztoare a unui factor proteic specific (posibil un factor de transcriere), n cursul replicrii.

- Domeniile cromatinice se replic fiecare ca o unitate singular sub controlul unei singure origini a replicrii. Dac acea origine a replicrii iniiaz replicarea n cursul primei jumti a fazei S, domeniul este asamblat ntr-o configuraie activ. n consecin, replicarea timpurie este o condiie esenial ca un domeniu cromatinic s fie asamblat ntr-o stare activ. Domeniile cromatinice ale organismelor eucariote apar ca bucle ale unor regiuni discrete ale cromozomilor, avnd lungimea de 30-300Kb, fiind ancorate ntr-un matrix nuclear bogat n proteine

- Fiecare domeniu cromatinic este o unitate funcional, n sensul c, bucla n intregul ei poate fi n stare potenial activ sau n stare represat transcripional.Reglarea transcripiei genice implic dou etape de baz:

1. Stabilirea unei conformaii a cromatinei compatibil cu transcripia;

2. Introducerea factorilor transactivatori care interacionaeaz cu promotorul, spre a iniia transcripia.Conceptul domeniului cromatinic ca unitate de reglare a activitii genice n cursul dezvoltrii are implicaii importante. Una dintre ele este aceea c elementele de secven aflate imediat n amonte de gene, alturi de factorii transactivatori ce se leag la ele, au fost obiectul multor studii de biologie molecular, cu rezultate importante. S-a conchis c expresia genic este sensibil la starea domeniilor cromatinei n care gena considerat se afl localizat.

ncorporarea variantelor histonice cum ar fi H2A-X, CENP-A, macroH2A i H2A.Z ar putea fi de o importan major n anumite domenii din genom. n acest context, o variant a histonei H3 este asociat cu regiunile centromerice sileniate sau macroH2A este asociat cu cromozomul X inactiv la femelele mamiferelor. H2A.X este implicat n formarea unor foci ce conin factori de reparare ADN n regiunile rupturilor dublu catenare. H2A.Z are rol n modificarea structurii cromatinei n vederea reglrii transcrierii.

n timpul etapei de maturare, ncorporarea histonelor linker, a proteinelor non-histonice asociate cromatinei denumite HMG (High Mobility Group) i a altor factori specifici cu legare la ADN, ajut la spaierea i plierea nucleofilamentului. De aceea, primii pai n asamblarea cromatinei pot avea un impact major n caracteristicile finale ale cromatinei din domeniile nucleare spacifice

Proteinele HMG (High Mobility Group)

Proteinele HMG (High Mobility Group) sunt proteine nucleare ubiquitare ce regleaz i faciliteaz diferite activiti n care este implicat ADN, cum ar fi transcriere, replicare, recombinare i reparare. Aceste proteine se leag la ADN i la cromatin i acioneaz ca elemente arhitecturale, inducnd modificri pe distane scurte sau lungi n structura situsurilor la care se leag. Proteinele HMG influeneaz activitatea diferitelor molecule reglatoare cum ar fi: receptori hormonali, p53, proteinele RAG implicate n recombinarea V(D)J, proteinele homeotice HOXD9 i a ctorva factori de transcriere. Domeniile funcionale ale proteinelor HMG sunt foarte rspndite, ele fiind componente i ale diferitelor proteine reglatoare cu domenii de legare la ADN.

Proteinele HMG prezint un rol important n maladiile umane. Mutaii sau rearanjamente n genele ce codific pentru unele din proteinele aparinnd grupului HMG sunt asociate cu etiologia unor tumori benigne des ntlnite cum ar fi: leiomioame uterine, polipi endometriali, lipoame. HMG-1 i HMG-2 sunt implicate n mecanismul de aciune al citostaticului cisplatin. La pacienii ce sufer de maladii autoimune au fost detectati anticorpi pentru proteinele HMG.

Prin modificarea arhitecturii ADN i a cromatinei, proteinele HMG pot contribui la reglarea diferitelor procese care, n ultim instan, afecteaz fenotipul celular. Studiul asupra structurii i funciei acestor proteine ar putea aduce noi informaii asupra mecanismelor moleculare implicate n etiologia diferitelor maladii.

Nomenclatura

Proteinele High Mobility Group (HMG) au fost iniial izolate din cellule mamaliene i, arbitrar clasate ca un grup specific de proteine non-histonice, pe baza observaiaei c sunt asociate cu cromatina izolat.

Au fost divizate n 3 grupe: HMG-1/-2, HMG-14/-17 i HMG-I/Y. Acestea sunt considerate proteine HMG clasice. Studii mai amnunite au evideniat c motivele funcionale caracteristice fiecrui grup de proteine HMG sunt prezente i la alte proteine nucleare. Proteinele care conin oricare din motivele funcionale ale proteinelor HMG clasice sunt denumite proteine cu motiv HMG. Acestea sunt divizate n 3 suoerfamilii denumite:

1. HMGB (denumirea anterioar HMG-1/-2)

2. HMGN (denumirea anterioar HMG-14/-17)

3. HMGA (denumirea anterioar HMG-I/Y).

Fiecare familie HMG posed o secven funcional caracteristic. Domeniul funcional al familiei HMGB este denumit HMG-box, cel al familiei HMGN se numete Nucleosomal binding domain, iar cel al HMGA este denumit AT-hook.

Inter-relaia dintre diferitele proteine HMG este ilustrat n diagrama urmtoare :

4. HMGB (denumirea anterioar HMG-1/-2)

5. HMGN (denumirea anterioar HMG-14/-17)

6. HMGA (denumirea anterioar HMG-I/Y).

PROTEINE HMG

Proteine cu motiv Proteine clasice

HMG HMG

MOTIVUL FUNCIONAL

Fibra de 30 nm

1. Depunerea la nivelul ADN a unui nou tetramer sintetizat (H3-H4)2 pentru a forma o particul sub-nucleozomal, urmnd a fi adugai 2 dimeri H2A-H2B o particul miez nucleozomal ce cont din 146 pb ADN ce nconjoar octamerul histonic. Aceast particul miez i ADN linker formeaz un nucleozom. Histonele nou sintetizate sunt modificate specific. Cea mai conservat modificare este acetilarea histonei H4 la nivelul Lys 5 i 12 (Sobel, 1995).

2. Eveniment de maturare ce necesit ATP pentru a stabili spaierea regulat a nucleozomilor pentru a forma nucleofilamentul. n timpul acestei etape histonele ncorporate sunt deacetilate

3. are loc ncorporarea histonelor linker nsoit de plierea nucleofilamentului ntr-o fibr de 30nm, structur care rmne a fi elucidat. Exist 2 modele de baz: modelul solenoidului i modelele zig-. n final, plierile succesive conduc ctre un nivel nalt de organizare i la apariia domeniilor specifice n nuclei.

Proteine HMG-box

Proteine NBD

Proteine AT-hook

Denumire nou HMGB

Denumire veche HMG 1/2

Denumire nou HMGN

Denumire veche HMG 14/17

Denumire nou HMGA

Denumire veche HMG I/Y

HMG-box

HMGB

Nucleosome binding

HMGN

AT-hook

HMGA