Cultivarea virusurilor

Structură foarte simplăAgenţi acelulari:

Segmente de acizi nucleiciÎnveliş proteic protector

sunt adaptate la un parazitism obligatoriu intracelular (nu există medii acelulare pe care putem cultiva virusuri) → se pot dezvolta doar în celule vii

Schema de diagnostic în bolile virale

I. Diagnostic virusologic

II. Diagnostic serologic

Diagnostic virusologic1. Recoltarea produselor

patologice

preparate microscopice (ME)

se pot detecta Ag virale – IF, metode imunoenzimatice, alte procedee

2. Izolarea virusului

inocularea pe unul din sistemele celulare vii

urmărim dezvoltarea virusului

identificarea virusului

Diagnostic serologic se recoltează două probe de ser prima probă odată cu produsul patologic A doua probă la 7 -14 zile interval Se urmăreşte creşterea în dinamicăa titrului

anticorpilor specifici

Sisteme celulare care asigură dezvoltarea şi cultivarea virusurilor:

animale de experienţă

oul de găină embrionat

culturi de celule

Animale de experienţă apariţia semnelor de boală leziunile care apar în ţesuturile afectate:

preparate colorate incluzii virale = formaţiuni rotunde-ovalare

situate în nucleul celulelor parazitate de virus sau al citoplasmei

uneori au importanţă diagnostică→ incluziile Babeş-Negri în citoplasma neuronilor infectaţi cu virusul rabic

detectarea anticorpilor specifici

Inocularea pe animale a permis izolarea:

virusului poliomielitei → maimuţă virusurilor gripale → inoculare intranazală la

şoarece nou-născut virusul Coxsackie A → şoarece nou-născut virusul rabic, arbovirusuri → intracranian la

şoarece nou-născut

Virusul Coxsackie A,B → virus cu ARN (fam. Picornaviridae)

inoculare subcutanată în regiunea cefei la şoarece nou-născut a unei mici cantităţi mici de produs patologic (LCR)

v.coxsackie A → şoarecele moare într-o săptămână → paralizie flască → leziuni în musculatura striată (degenerarea musculaturii, fenomene de miozită) Pe secţiuni din musculatură, colorate HE → alterarea

structurii normale a musculaturii striate v.coxsackie B → leziuni în principal la nivelul SN;

şoarecii mor cu paralizie spastică → leziuni şi în pancreas, ficat

Oul embrionat

= sistem celular închis, steril; sunt celule tinere în dezvoltare, nu gpsim dezvoltate mecanismele de apărare umorală şi celulară

inoculare din anii 1930 v. gripale (metodă de elecţie) v. urlian

Dezvoltarea virusurilor pe oul embrionat

- urmărim viabilitatea embrionului- v. variolei → se urmărea apariţia pe

membrana corioalantoidiană a unor mici leziuni de culoare alburie

- v. gripale: nu omoară embrionul incubare 48 ore → la frigider 18 ore se taie un căpăcel în dreptul camerei de aer se absorb lichidul alantoidian şi lichidul amniotic în acele lichidese căută prezenţa virusului gripal

prin reacţia de hemaglutinare (HA)

Reacţia de hemaglutinare

diluţii din lichidele embrionare (1/4, 1/8, 1/16, 1/32, ... )

suspensii de hematii de cocoş 1 oră la temperatura camerei (TC) dacă există v. gripal → aglutinarea

hematiilor

identificarea virusului hemaglutinant prin reacţia de hemaglutinoinhibare (HI)

Se folosesc anticorpi antigripali cunoscuţi

dacă agentul hemaglutinant este virusul gripal, anticorpii s-au fixat pe suprafaţa virusului, deci virusul nu mai aglutinează hematiile (se depun ca un buton)

Culturi de celule

= sisteme celulare vii care permit izolarea virusurilor în laborator

introduse în practica de laborator în 1949 Tipuri de celule:

culturi primare culturi de celule diploide linii celulare

culturi de celule – dezvoltarea virusurilor 1. ECP (efect citopatic) citocid (cu moartea celuleor infectate de virus) →

picornavirusuri sinciţial (celulele fuzionează → apar mase gigante

multinucleate) → paramyxovirusuri, virus respirator sinciţial

agregare (celulele formează palcarde) → adenovirusuri

transformarea tumorală a celulelor → virusurile oncogene, retrovirusuri

minim → detecatrea virusului prin IF, HA, HAI fără modificări → v. rubeolei

2.Incluzii nucleu → v. herpetice, adenovirusurile citoplasmă → v. turbării, poxvirusurile nucleu şi citoplasmă → v. rujeolei, v.

citomegalic

3. Hemaglutinare

4. Hemadsorbţie: adsorbţia hematiilor pe suprafaţa celulelor în care se multiplică virusul

5. Imunofluorescenţa

6. Interferenţa → prin acest fenomen se pune în evidenţă virusul rubeolei

se adaugă un virus despre care ştim exact ECP → dacă al 2-lea virus nu mai produce efect citocid înseamnă că în celulele respective s-a multiplicat v. rubeolei

Identificarea virusurilor

1. Reacţia de hemaglutinare (HA), hemaglutinoinhibare (HI)

HI → confirmă şi identifică varianta de virus izolat

Reacţia HI →şi în diagnosticul serologic (pentru depistarea Ac specifici)

dg. serologic, totdeauna lucrăm probe perechi de seruri: o probă cât mai aproape de debutul bolii, serul se congelează până la recoltarea celei de-a 2-a probe la 7 zile de la prima probă

ambele probe se lucrează în aceeaşi zi, cu aceleşi materiale

2. RFC

pentru identificarea virusului mai ales pentru dg. serologic tehnica Bradstreet-Taylor (pe plăci cu godeuri) →

tehnică la rece: După ce se pun în contact diluţii de ser de bolnav +

Ag + C' (prin titrarea C' în tablă se şah se titrează concomitent C' şi hemolizina) → 18 ore / 4 ºC

+ sistem hemolitic (hematii de oaie + hemolizină) = sistem Ag-Ac cu rol de indicator

3. Seroneutralizarea (SN) reacţie laborioasă (rar în laborator) pentru unele picornavirusuri (v. poliomielitei)

= neutralizarea infectivităţii virale de către Ac specifici antivirali astfel încât aceste complexe Ag-Ac nu mai permit:

producerea infecţiei la animale infectarea oului embrionat infectarea culturilor de celule

4. IF pentru detectarea Ag din culturi de celule sau produs patologic şi pentru detectarea Ac din ser

5. Metode imunoenzimatice – pentru depistarea infecţiei HIV → confirmarea infeţiei HIV prin alte procedee (Western blot)

6. Imunodifuzia în gel (CIEF) – HBV