1

Cod proiect: PN-II-RU-TE-2014-4-2093

ISTORIA EVOLUTIVĂ A UNUI GRUP DE SPECII DE COSAȘI

(ISOPHYA CAMPTOXYPHA) EXTRAPOLATĂ UTILIZÂND METODE

ACUSTICE, MOLECULARE ȘI DE MODELARE A NIȘEI

ECOLOGICE

Contract nr. 116 / 01.10.2015

Raport științific

privind implementarea proiectului în perioada octombrie-decembrie 2015

Etapa 1

Grupul de specii “Isophya camptoxypha”: evaluarea cunoștințelor despre

distribuția, comunicarea acustică și genetica speciilor

Echipa proiectului

Dr. Ionuț Ștefan Iorgu, director de proiect

Dr. Elena Iulia Iorgu, cercetător postdoctoral

Dr. Tiberiu Constantin Sahlean, cercetător postdoctoral

Liviu Aurel Moscaliuc, student doctorand

Daniela Mirela Dragoș, student doctorand

Muzeul Național de Istorie Naturală "Grigore Antipa", București

2

Etapa 1: Grupul de specii “Isophya camptoxypha”: evaluarea cunoștințelor

despre distribuția, comunicarea acustică și genetica speciilor

I. Rezumatul Etapei

Descrierea și scopul proiectului

Cuprinzând aproximativ 90 de specii, Isophya Brunner von Wattenwyl (1878) este

unul dintre cele mai numeroase genuri palearctice din ordinul Orthoptera. Aceste specii sunt

insecte brahiptere, cu morfologie aproape uniformă; contrar acesteia, structura ritmică a

semnalelor acustice ale masculilor prezintă diferențe clare interspecifice. Pentru a forma

cuplul, masculul și femela formează un duet acustic, componentă semnificativă a sistemului

de recunoaștere al partenerului la acești cosași. Grupul de specii Isophya camptoxypha se

definește ca fiind un complex alcătuit din șapte specii (Isophya camptoxypha, I. ciucasi, I.

nagyi, I. sicula, I. posthumoidalis, I. dochia, I. fatrensis), cu putere de dispersie geografică

limitată și restricționate la câteva regiuni montane din Carpați. Scopul acestui proiect este

investigarea relațiilor filogenetice și filogeografice între speciile grupului I. camptoxypha,

clarificând taxonomia și istoria lor evolutivă, sintetizate din studiul bioacusticii, biologiei

moleculare și modelarea nișei ecologice.

Etapa 1 presupune evaluarea cunoștințelor despre distribuția, comunicarea acustică și

genetica speciilor din grupul Isophya camptoxypha. În cadrul acestei etape, studiile noastre s-

au canalizat pe trei direcții:

- alcătuirea unor baze de date cu informații privind structura oscilografică a sunetului și

distribuția speciilor din grupul Isophya camptoxypha.

- optimizarea unui protocol de amplificare markeri ADN nucleari și mitocondriali,

utilizabil pentru taxonii analizați.

- diseminarea rezultatelor pe scară largă prin comunicarea sau prin publicarea națională

/ internațională a rezultatelor. Acest obiectiv s-a realizat prin participarea la o manifestare

științifică internațională.

Obiectivele și activitățile etapei 1 (2015)

1. Evaluarea comunicării acustice la speciile din grupul Isophya camptoxypha.

1.1. Recenzia exhaustivă a literaturii pentru a extrage elementele de acustică din

lucrările publicate și crearea unei baze de date cu informații.

1.2. Analiza discriminantă a sunetelor: comparație oscilografică intra- și interspecifică

a speciilor din grupul Isophya camptoxypha.

2. Studiul relațiilor filogenetice dintre speciile grupului Isophya camptoxypha, folosind

markeri moleculari.

2.1. Extracție de ADN genomic din indivizi aparținând speciilor din grupul Isophya

camptoxypha.

2.2. Optimizarea reacțiilor PCR a unor markeri moleculari (gene mitocondriale sau

nucleare), necesari în analiza filogenetică.

3

3. Evaluarea distribuției potențiale (anvelopei bioclimatice) actuale și trecute pentru

speciile din grupul Isophya camptoxypha.

3.1. Recenzia exhaustivă a literaturii pentru a extrage punctele de ocurență din

lucrările publicate și crearea unei baze de date cu informații.

3.2. Georeferențierea punctelor de ocurență care nu au informație spațială, folosind un

sistem GIS și hărți de referință (aeriene, hărți topografice actuale și anterioare).

4. Diseminarea rezultatelor.

4.1. Crearea site-ului web al proiectului.

4.2. Participare la o manifestare științifică.

II. Descrierea științifică și tehnică a etapei

Tabel 1. Gradul de realizare a obiectivelor și activităților

Obiectiv / Activitate Grad de

realizare

1. Evaluarea comunicării acustice la speciile din grupul Isophya camptoxypha. 100%

1.1. Recenzia exhaustivă a literaturii pentru a extrage elementele de acustică din lucrările

publicate și crearea unei baze de date cu informații. 100%

1.2. Analiza discriminantă a sunetelor: comparație oscilografică intra- și interspecifică a

speciilor din grupul Isophya camptoxypha. 100%

2. Studiul relațiilor filogenetice dintre speciile grupului Isophya camptoxypha, folosind

markeri moleculari. 100%

2.1. Extracție de ADN genomic din indivizi aparținând speciilor din grupul Isophya

camptoxypha. 100%

2.2. Optimizarea reacțiilor PCR a unor markeri moleculari (gene mitocondriale sau nucleare),

necesari în analiza filogenetică. 100%

3. Evaluarea distribuției potențiale (anvelopei bioclimatice) actuale și trecute pentru

speciile din grupul Isophya camptoxypha. 100%

3.1. Recenzia exhaustivă a literaturii pentru a extrage punctele de ocurență din lucrările

publicate și crearea unei baze de date cu informații. 100%

3.2. Georeferențierea punctelor de ocurență care nu au informație spațială, folosind un sistem

GIS și hărți de referință (aeriene, hărți topografice actuale și anterioare). 100%

4. Diseminarea rezultatelor. 100%

4.1. Crearea site-ului web al proiectului. 100%

4.2. Participare la o manifestare științifică. 100%

4

Obiectivul 1. Evaluarea comunicării acustice la speciile din grupul Isophya

camptoxypha.

Activitatea 1.1. Recenzia exhaustivă a literaturii pentru a extrage elementele de acustică

din lucrările publicate și crearea unei baze de date cu informații.

Uniformitatea morfologică a genului Isophya face aproape imposibilă identificarea

speciilor cu distribuție simpatrică și ridică probleme asupra validității taxonomice a unor

specii alopatrice. Contrar morfologiei, structura ritmică a semnalelor acustice ale masculilor

prezintă diferențe clare, chiar și atunci când sunt comparate specii cu un înalt grad de

similaritate morfologică.

Crearea unei baze de date cu elementele caracteristice stridulației la speciile

aparținând complexului Isophya camptoxypha a fost făcută în două etape: în prima etapă a

fost efectuată o recenzie exhaustivă a literaturii științifice, iar toate articolele conținând

informații privind speciile vizate de proiect au fost descărcate. În continuare, din literatura

științifică au fost extrase elementele de acustică (număratul elementelor de bază și măsurarea

duratei acestora, de exemplu: numărul și durata silabelor, durata intervalului dintre silabele

succesive, numărul de impulsuri dintr-o silabă etc.) și au fost introduse într-o bază de date

MS Excel. Au fost folosite tab-uri separate pentru cele șapte specii, un total pentru toate

speciile și bibliografia folosită.

Fig 1. Baza de date cu locațiile pentru speciile din complexul Isophya camptoxypha

Activitatea 1.2. Analiza discriminantă a sunetelor: comparație oscilografică intra- și

interspecifică a speciilor din grupul Isophya camptoxypha.

În general, funcția de bază a cântecului constă în transmiterea informației între

masculi și femele, în timpul comportamentului de împerechere: de regulă, masculii

stridulează spontan, iar femelele decid de care mascul să se apropie. Pentru a forma cuplul,

femela răspunde acustic într-o fereastră de oportunitate strict definită temporal în funcție de

stridulația masculului și formează un duet acustic cu acesta, componentă semnificativă a

sistemului de recunoaștere al partenerului la acești cosași. În contrast cu morfologia,

modularea amplitudinală a stridulației masculului și sincronizarea răspunsului femelei sunt

diferite și strict specifice pentru fiecare specie din acest gen.

5

Analiza comparativă a oscilogramelor sunetelor este un instrument necesar și eficient

pentru rezolvarea problemelor de taxonomie la nivel de specie, mai ales în cazul speciilor

criptice morfologic. Elementele acustice sunt procesate folosind programe pentru analiza

audio, un prim pas spre identificarea masculilor diferitelor specii. Deoarece sunetele emise de

ortoptere sunt semnale modulate amplitudinal, din analiza detaliată a oscilogramelor se extrag

acele caractere ale cântecului care pot fi folosite cu precizie la identificarea indivizilor și

pentru analiza comparativă care va revela relațiile dintre speciile studiate.

Fig 2. Model de analiză oscilografică a semnalelor acustice intraspecifice la Isophya nagyi

Fig 3. Model de analiză oscilografică a semnalelor acustice interspecifice la Isophya camptoxypha și Isophya

dochia

În cadrul bazei de date cu elementele caracteristice stridulației la speciile aparținând

complexului Isophya camptoxypha, fiecare tab dedicat speciilor prezintă sumarul

comparațiilor intraspecifice (minim, maxim, media aritmetică, cu menționarea deviației

standard, numărul de indivizi analizați), iar tab-ul "Total" însumează comparațiile

interspecifice în cadrul grupului studiat.

6

Obiectivul 2. Studiul relațiilor filogenetice dintre speciile grupului Isophya

camptoxypha, folosind markeri moleculari.

Activitatea 2.1. Extracție de ADN genomic din indivizi aparținând speciilor din grupul

Isophya camptoxypha.

Colectarea probelor şi extracţia ADN-ului genomic.

Au fost colectate probe de țesut de la 212 exemplare aparținând speciilor din grupul

Isophya camptoxypha, din 49 de situri (Tabel 2). De la fiecare exemplar a fost prelevat un

picior posterior (stâng) și apoi fixat în alcool 96%. ADN-ul genomic total a fost extras din

ţesut muscular provenit de la fiecare individ în parte, urmând etapele kiturilor-ului ISOLATE

II Genomic DNA Kit (Bioline, London, UK) sau NucleoSpin® Tissue MACHEREY-

NAGEL GmbH & Co.

Principiul extracției ADN presupune 4 etape:

1. Prima etapă a extracției de ADN genomic presupune liza celulară prin incubarea probei

într-o soluţie de proteinază K şi SDS.

2. A doua etapă este legarea ADN genomic de membrana de dioxid de siliciu din coloniţele

furnizate de kituri. Această etapă este facilitată de adăugarea de săruri şi etanol. Procesul de

legare la membrană este reversibil şi specific acizilor nucleici.

3. Spălări succesive ale ADN-ului. Contaminările sunt înlăturate prin spălări succesive în

două soluţii tampon diferite.

4. Eluția ADN. ADN genomic pur este eluat la final într-o soluţie uşor alcalină sau în apă

distilată.

Concentraţia şi puritatea ADN genomic extras au fost măsurate utilizând

spectrofotometrul NanoDrop ND-1000.

Integritatea ADN genomic a fost testată ulterior prin electroforeza a 5µl în gel de

agaroză 1,5 % cu 0,5μg/ml EtBr

Tabel 2. Exemplarele aparținând grupului Isophya camptoxypha de la care s-a extras ADN genomic

Nr. Crt. Taxon Sit colectare Numărul de exemplare și codul

probelor

1. I. camptoxypha Polonia 3 exemplare – ICPXPOL 1, 2, 3

2. I. camptoxypha M-rea. Agapia (NT) 4 exemplare – AG 1, 2, 3, 4

3. I. camptoxypha M-rea. Vatra Moldoviței (SV) 4 exemplare – VMO 1, 2, 3, 4

4. I. camptoxypha M-rea. Humor (SV) 4 exemplare – MHU 1, 2, 3, 4

5. I. camptoxypha M-ții. Parâng 2 exemplare – PG 1, 2

6. I. camptoxypha Cheile Râmețului 4 exemplare – CRM 1, 2, 3, 4

7. I. camptoxypha Sadova (SV) 3 exemplare – SAD 1, 2, 3

8. I. camptoxypha Vânători Neamț (NT) 1 exemplar – VNE

9. I. camptoxypha M-ții. Nemira 4 exemplare – NEM1, 2, 3, 4

10. I. camptoxypha M-ții. Țibles 2 exemplare – TIB 1, 2

11. I. camptoxypha Tg. Neamț (NT) 4 exemplare – TN 1, 2, 3, 4

12. I. camptoxypha Mărișel (M-ții. Apuseni) 3 – MAR 1, 2, 3

13. I. camptoxypha Căpâlna, 2009 8 exemplare – A 108, A 210, A 216, A

217, A 218, A 219, A 221, A 222

14. I. camptoxypha Căpâlna, 2011 2 exemplare – CAP 1, 2

7

15. I. camptoxypha M-ții. Penteleu 8 exemplare – P 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8

16. I. camptoxypha M-ții. Pietrosul Bistritei 7 exemplare – PB 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7

17. I. camptoxypha M-ții. Buila Vânturarița 5 exemplare – B 1, 2, 3, 4, 5

18. I. camptoxypha M-ții. Rarău 11 exemplare – R 1, 2, ,3, 4, 5, 6, 7, 8,

9, 10, 11

19. I. camptoxypha M-ții. Cozia 4 exemplare – COZ 4, 5, 6, 7

20. I. camptoxypha Ciuta (BZ) 1 exemplar – CIT

21. I. camptoxypha Pasul Mestecăniș (SV) 3 exemplare – ME 1, 2, 3

22. I. camptoxypha M-ții. Giumalău (SV) 2 exemplare – GIU 1, 2

23. I. camptoxypha M-ții. Piatra Craiului 4 exemplare – PIC 1, 2, 3, 4

24. I. camptoxypha Moeciu de Jos (BV) 2 exemplare – MJ 1, 2

25. I. camptoxypha M-ții. Bucegi 6 exemplare – BC 1, 2, 3, 4, 5, 6

26. I. camptoxypha M-ții. Postăvarul 4 exemplare – PTV 1, 2, 3

27. I. camptoxypha M-ții. Piatra Mare (BV) 3 exemplare – PMA 1, 2, 3

28. I. camptoxypha M-ții. Făgăraș, vf. Negoiu 3 exemplare – NEG 1, 2, 3

29. I. camptoxypha Sebeșul de Jos (SB) 3 exemplare – SBJ 1, 2, 3

30. I. camptoxypha M-ții. Cindrel 3 exemplare – CIN 1, 2, 3

31. I. camptoxypha M-ții. Ciucaș 13 exemplare – C1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

9, 10, 11, 12, 13

32. I. camptoxypha M-ții. Călimani 3 exemplare – CAL 1, 2, 3

33. I. posthumoidalis Teceu Mic (MM) 2 exemplare – POST 1, 2

34. I. ciucasi M-ții. Vrancei, vf. Goru 3 exemplare – GOR 1, 2, 3

35. I. ciucasi M-ții. Ciucaș 4 – ICIU 1, 2, 3, 4

36. I. dochia M-ții. Gurghiu 3 exemplare – GRG 1, 2

37. I. dochia M-ții. Ceahlău 2 exemplare – DU 1, 2

38. I. dochia M-ții. Ceahlău 33 exemplare – Ch 1-33

39. I. dochia M-ții. Bistritei, vf. Budacu 4 exemplare – BUD 1, 2, 3

40. I. fatrensis Slovacia 2 exemplare – IFRASL 9,10

41. I. nagyi M-ții. Suhard 3 exemplare – SUH 1, 2, 3

42. I. nagyi Neagra Șarului (SV) 4 exemplare – NSA 1, 2, 3, 4

43. I. posthumoidalis Polonia 2 exemplare – IPOSTPL 4, 5

44. I. sicula Băile Harghita (HR) 4 exemplare – HRB 1, 2, 3, 4

45. I. camptoxypha Valea Berii, Muntele Roșu 2 exemplare – MRO 1, 2

46. I. beybienkoi Slovacia, Slovenski Karst 3 exemplare – IBBYSL 6, 7, 8

47. I. harzi M-ții. Cozia 4 exemplare – COZ 1, 2, 3, 4

48. I. pienensis Baia Mare 1 exemplar – IPI 4

49. I. pienensis Pasul Borsec (HR) 3 exemplare – IPI 1, 2, 3

8

Activitatea 2.2. Optimizarea reacțiilor PCR a unor markeri moleculari (gene

mitocondriale sau nucleare), necesari în analiza filogenetică.

Markerii mitocondriali sunt preferaţi în anumite studii de filogenie și filogeografie la

anumite specii criptice datorită mai multor factori:

- degradarea acestora se produce mai lent decât a ADN nuclear.

- ADN mitocondrial evolueaza mai rapid decât ADN nuclear.

- ADN mitocondrial se transmite la descendenţi fără a suferi procesul de

recombinare.

Noi am ales și am optimizat reactiile de amplificare PCR la doi markeri mitocondrali

și a unui singur marker nuclear:

1. Gena COI - gena care codifică pentru subunitatea I a citocrom C oxidazei. Gena COI

este un marker molecular frecvent utilizat în studiile de filogenie, fiind o regiune înalt

conservată a genomului mitocondrial, utilizată pentru diferenţierea speciilor înrudite.

S-a amplificat fragment de ~750 pb din gena COI cu ajutorul unor primeri universali.

2. Gena 16 s - gena pentru subunitatea 16 S a ARN ribosomal. Aceasta genă este de

asemenea utilizată frecvent în studii de filogenie. S-a amplificat un fragment de

aproximativ 500 bp cu ajutorul unor primeri universali.

3. Gena pentru ITS 1 – gena pentru spacerul de transcriere intern. Este o genă nucleară

situată între gena pentru subunitatea mică 5.8 S a ADN ribozomal și gena pentru

subunitatea mare 18 S a ADN ribozomal. Acest fragment se întâlnește repetat în

andem în genom și este de asemenea folosit în studii de filogenie și filogeografie. S-a

amplificat un fragment de aproximativ 350bp cu ajutorul primerilor. Pentru reacţiile

PCR a fost utilizat T Professional Thermocycler basic (Biometra).

Componentele mixului reacţiei de amplificare pentru cei trei markeri moleculari sunt

redate în tabelul 3.

Tabel 3. Componentele reacţiei PCR pentru amplificarea fragmentelor de interes

Reactiv Volumul în reacţie

ADN 5

Tag Buffer (ROVALAB) 10X 5

MgCl2 (ROVALAB) 50 mM 2.5

dNTP1 mM 10

LCO1490 1μM1 μM 5

HCO2198 1μM1 μM 5

Taq DNA Polvmerase5 U/μl 1,5 U

mQsteril 17,2

Volum final 50 μl

Amplificarea s-a realizat utilizând programele PCR cu parametrii menţionaţi în

tabelul 4, 5 și 6.

Tabel 4. Programul PCR pentru amplificarea fragmentului de interes din gena COI

Etapă Temperatură Durată Nr. Cicluri COI

Denaturare initial 95° 2 min 1×

Denaturare 94° 30 s

5× Aliniereprimeri 45° 1 min 30 s

Elongare 72° 1 min

Denaturare 94° 30 s 35×

9

Aliniereprimeri 52° 1 min 30 s

Elongare 72° 1 min

Elongarefinală 72° 5 min 1×

Tabel 5. Programul PCR pentru amplificarea fragmentului de interes din gena ITS 1

Etapă Temperatură Durată Nr. Cicluri ITS 1

Denaturare initial 95° 3 min 1×

Denaturare 94° 10 s

9× Aliniereprimeri 45° 30 s

Elongare 72° 50 s

Denaturare 94° 10 s

35× Aliniereprimeri 52° 30 s

Elongare 72° 1 min

Elongarefinală 72° 5 min 1×

Tabel 6. Programul PCR pentru amplificarea fragmentului de interes din gena 16S

Etapă Temperatură Durată Nr. Cicluri 16s

Denaturare initial 95° 3 min 1×

Denaturare 94° 30 s

35× Aliniereprimeri 52° 30 s

Elongare 72° 30 s

Elongarefinală 72° 5 min 1×

Rezultatele amplificării au fost verificate prin încărcarea şi migrarea produsului de

PCR în gel de agaroză 1.5% cu 0,5μg/ml EtBr (figurile 4-6).

Fig 4. Amplificarea pe gel de agaroză 1.5% a produșilor de PCR obținuți în urma amplificării genei COI

10

Fig 5. Amplificarea pe gel de agaroză 1.5% a produșilor de PCR obtinuți în urma amplificării genei 16s

Fig 6. Amplificarea pe gel de agaroză 1.5% a produșilor de PCR obținuți în urma amplificării genei ITS 1

11

3. Evaluarea distribuției potențiale (anvelopei bioclimatice) actuale și trecute pentru

speciile din grupul Isophya camptoxypha.

3.1. Recenzia exhaustivă a literaturii pentru a extrage punctele de ocurență din lucrările

publicate și crearea unei baze de date cu informații.

Pentru a construi baza de date cu puncte georeferențiate pentru speciile aparținând

complexului Isophya camptoxypha, în prima etapă a fost efectuată o recenzie exhaustivă a

literaturii științifice, iar toate articolele conținând informații privind speciile vizate au fost

descărcate și plasate într-un singur folder. În continuare, literatura științifică a fost organizată

folosind programul EndNote 7, în sensul că lucrările au fost introduse ca referințe într-o bază

de date EndNote (*.enl), iar articolele în format *.pdf au fost atașate acestei baze de date.

Fig 7. Baza de date EndNote cu literatura științifică disponibilă pentru complexul Isophya camptoxypha

În continuare, a fost creată o bază de date excel în care au fost introduse toate datele

de distribuție din literatura științifică, aceasta fiind apoi completată cu datele de distribuție

personale rezultate în urma deplasărilor în teren și cu datele disponibile on-line într-o locație

trasabilă (GBIF - http://www.gbif.org/). În cazul datelor din literatură pentru care lipseau

informațiile spațiale (latitudine și longitudine) au fost folosite ortofotoplanuri, harta militară

declasificată și informațiile autorului pentru a localiza spațial punctul de colectare. Dacă

autorul nu a oferit informații privind habitatul în locația de colectare, ci doar denumirea celei

mai apropiate localități, atunci punctul a fost amplasat într-un habitat favorabil speciei pentru

a fi util ulterior în procesul de modelare. În baza de date au fost incluse toate punctele din

literatura științifică, dar în procesul de modelare vor fi folosite doar punctele cu o rezoluție

mai mare de 1 km. Pentru locațiile prea generale (ex.: Munții Rarău, Munții Ciucaș)

georeferențierea nu a putut fi realizată, iar acele locații vor fi excluse din modelare.

12

Fig 8. Baza de date cu locațiile pentru speciile din complexul Isophya camptoxypha

3.2. Georeferențierea punctelor de ocurență care nu au informație spațială, folosind un

sistem GIS și hărți de referință (aeriene, hărți topografice actuale și anterioare).

Din baza de date excel, locațiile au fost importate în ArcGIS 10.2.1 și apoi a fost

creată o bază de date de tip geodatabase (*.gdb), care va fi folosită ulterior pentru interogări

și pentru crearea sau editarea fișierelor necesare în procesul de modelare (rastere

bioclimatice, model digital al terenului etc.).

Fig 9. Bază de date geospațială cu locațiile de distribuție pentru speciile din complexul Isophya camptoxypha

13

4. Diseminarea rezultatelor.

Nr.

crt.

Rezultate

așteptate Rezultate livrate

1.

Crearea site-

ului web al

proiectului

Crearea site-ului web al proiectului, la adresa:

http://cercetare-antipa.ro/isophya/

2.

Participare la

o manifestare

științifică

Iorgu, I. Ş., Sahlean, T. C., Moscaliuc, L. A., Dragoș, M. & Iorgu, E. I.

- Mapping the general distribution of Isophya camptoxypha species

group (Insecta: Orthoptera) in the Romanian Carpathians and

application of IUCN Red List criteria for their future conservation.

International Zoological Congress of “Grigore Antipa” Museum,

București, 18-21 noiembrie 2015, p. 205-206

http://czga.ro/pozepagini/CZGA2015-

Book_of_abstracts(online_edition)_1.pdf

Data, Director de proiect,

04 Decembrie 2015 Dr. Ionuț Ștefan Iorgu