1

Cod proiect: PN-II-RU-TE-2014-4-2093

ISTORIA EVOLUTIVĂ A UNUI GRUP DE SPECII DE COSAȘI

(ISOPHYA CAMPTOXYPHA) EXTRAPOLATĂ UTILIZÂND METODE

ACUSTICE, MOLECULARE ȘI DE MODELARE A NIȘEI

ECOLOGICE

Contract nr. 116 / 01.10.2015

Raport științific

privind implementarea proiectului în perioada octombrie-decembrie 2015 și

ianuarie-decembrie 2016

Etapa 1 (octombrie-decembrie 2015)

Grupul de specii “Isophya camptoxypha”: evaluarea cunoștințelor despre

distribuția, comunicarea acustică și genetica speciilor

Etapa 2 (ianuarie-decembrie 2016)

Studiul distribuției potențiale și a relațiilor filogenetice dintre speciile

grupului “Isophya camptoxypha”

Echipa proiectului

Dr. Ionuț Ștefan Iorgu, director de proiect

Dr. Elena Iulia Iorgu, cercetător postdoctoral

Dr. Tiberiu Constantin Sahlean, cercetător postdoctoral

Liviu Aurel Moscaliuc, student doctorand

Daniela Mirela Dragoș, student doctorand

Muzeul Național de Istorie Naturală "Grigore Antipa", București

2

Etapa 1: Grupul de specii “Isophya camptoxypha”: evaluarea cunoștințelor

despre distribuția, comunicarea acustică și genetica speciilor

I. Rezumatul Etapei

Descrierea și scopul proiectului

Cuprinzând aproximativ 90 de specii, Isophya Brunner von Wattenwyl (1878) este

unul dintre cele mai numeroase genuri palearctice din ordinul Orthoptera. Aceste specii sunt

insecte brahiptere, cu morfologie aproape uniformă; contrar acesteia, structura ritmică a

semnalelor acustice ale masculilor prezintă diferențe clare interspecifice. Pentru a forma

cuplul, masculul și femela formează un duet acustic, componentă semnificativă a sistemului

de recunoaștere al partenerului la acești cosași. Grupul de specii Isophya camptoxypha se

definește ca fiind un complex alcătuit din șapte specii (Isophya camptoxypha, I. ciucasi, I.

nagyi, I. sicula, I. posthumoidalis, I. dochia, I. fatrensis), cu putere de dispersie geografică

limitată și restricționate la câteva regiuni montane din Carpați. Scopul acestui proiect este

investigarea relațiilor filogenetice și filogeografice între speciile grupului I. camptoxypha,

clarificând taxonomia și istoria lor evolutivă, sintetizate din studiul bioacusticii, biologiei

moleculare și modelarea nișei ecologice.

Etapa 1 presupune evaluarea cunoștințelor despre distribuția, comunicarea acustică și

genetica speciilor din grupul Isophya camptoxypha. În cadrul acestei etape, studiile noastre s-

au canalizat pe trei direcții:

- alcătuirea unor baze de date cu informații privind structura oscilografică a sunetului și

distribuția speciilor din grupul Isophya camptoxypha.

- optimizarea unui protocol de amplificare markeri ADN nucleari și mitocondriali,

utilizabil pentru taxonii analizați.

- diseminarea rezultatelor pe scară largă prin comunicarea sau prin publicarea națională

/ internațională a rezultatelor. Acest obiectiv s-a realizat prin participarea la o manifestare

științifică internațională.

Obiectivele și activitățile etapei 1 (2015)

1. Evaluarea comunicării acustice la speciile din grupul Isophya camptoxypha.

1.1. Recenzia exhaustivă a literaturii pentru a extrage elementele de acustică din

lucrările publicate și crearea unei baze de date cu informații.

1.2. Analiza discriminantă a sunetelor: comparație oscilografică intra- și interspecifică

a speciilor din grupul Isophya camptoxypha.

2. Studiul relațiilor filogenetice dintre speciile grupului Isophya camptoxypha, folosind

markeri moleculari.

2.1. Extracție de ADN genomic din indivizi aparținând speciilor din grupul Isophya

camptoxypha.

2.2. Optimizarea reacțiilor PCR a unor markeri moleculari (gene mitocondriale sau

nucleare), necesari în analiza filogenetică.

3

3. Evaluarea distribuției potențiale (anvelopei bioclimatice) actuale și trecute pentru

speciile din grupul Isophya camptoxypha.

3.1. Recenzia exhaustivă a literaturii pentru a extrage punctele de ocurență din

lucrările publicate și crearea unei baze de date cu informații.

3.2. Georeferențierea punctelor de ocurență care nu au informație spațială, folosind un

sistem GIS și hărți de referință (aeriene, hărți topografice actuale și anterioare).

4. Diseminarea rezultatelor.

4.1. Crearea site-ului web al proiectului.

4.2. Participare la o manifestare științifică.

II. Descrierea științifică și tehnică a etapei

Tabel 1.1. Gradul de realizare a obiectivelor și activităților

Obiectiv / Activitate Grad de

realizare

1. Evaluarea comunicării acustice la speciile din grupul Isophya camptoxypha. 100%

1.1. Recenzia exhaustivă a literaturii pentru a extrage elementele de acustică din lucrările

publicate și crearea unei baze de date cu informații. 100%

1.2. Analiza discriminantă a sunetelor: comparație oscilografică intra- și interspecifică a

speciilor din grupul Isophya camptoxypha. 100%

2. Studiul relațiilor filogenetice dintre speciile grupului Isophya camptoxypha, folosind

markeri moleculari. 100%

2.1. Extracție de ADN genomic din indivizi aparținând speciilor din grupul Isophya

camptoxypha. 100%

2.2. Optimizarea reacțiilor PCR a unor markeri moleculari (gene mitocondriale sau nucleare),

necesari în analiza filogenetică. 100%

3. Evaluarea distribuției potențiale (anvelopei bioclimatice) actuale și trecute pentru

speciile din grupul Isophya camptoxypha. 100%

3.1. Recenzia exhaustivă a literaturii pentru a extrage punctele de ocurență din lucrările

publicate și crearea unei baze de date cu informații. 100%

3.2. Georeferențierea punctelor de ocurență care nu au informație spațială, folosind un sistem

GIS și hărți de referință (aeriene, hărți topografice actuale și anterioare). 100%

4. Diseminarea rezultatelor. 100%

4.1. Crearea site-ului web al proiectului. 100%

4.2. Participare la o manifestare științifică. 100%

4

Obiectivul 1. Evaluarea comunicării acustice la speciile din grupul Isophya

camptoxypha.

Activitatea 1.1. Recenzia exhaustivă a literaturii pentru a extrage elementele de acustică

din lucrările publicate și crearea unei baze de date cu informații.

Uniformitatea morfologică a genului Isophya face aproape imposibilă identificarea

speciilor cu distribuție simpatrică și ridică probleme asupra validității taxonomice a unor

specii alopatrice. Contrar morfologiei, structura ritmică a semnalelor acustice ale masculilor

prezintă diferențe clare, chiar și atunci când sunt comparate specii cu un înalt grad de

similaritate morfologică.

Crearea unei baze de date cu elementele caracteristice stridulației la speciile

aparținând complexului Isophya camptoxypha a fost făcută în două etape: în prima etapă a

fost efectuată o recenzie exhaustivă a literaturii științifice, iar toate articolele conținând

informații privind speciile vizate de proiect au fost descărcate. În continuare, din literatura

științifică au fost extrase elementele de acustică (număratul elementelor de bază și măsurarea

duratei acestora, de exemplu: numărul și durata silabelor, durata intervalului dintre silabele

succesive, numărul de impulsuri dintr-o silabă etc.) și au fost introduse într-o bază de date

MS Excel. Au fost folosite tab-uri separate pentru cele șapte specii, un total pentru toate

speciile și bibliografia folosită.

Fig. 1.1. Baza de date cu locațiile pentru speciile din complexul Isophya camptoxypha

Activitatea 1.2. Analiza discriminantă a sunetelor: comparație oscilografică intra- și

interspecifică a speciilor din grupul Isophya camptoxypha.

În general, funcția de bază a cântecului constă în transmiterea informației între

masculi și femele, în timpul comportamentului de împerechere: de regulă, masculii

stridulează spontan, iar femelele decid de care mascul să se apropie. Pentru a forma cuplul,

femela răspunde acustic într-o fereastră de oportunitate strict definită temporal în funcție de

stridulația masculului și formează un duet acustic cu acesta, componentă semnificativă a

sistemului de recunoaștere al partenerului la acești cosași. În contrast cu morfologia,

modularea amplitudinală a stridulației masculului și sincronizarea răspunsului femelei sunt

diferite și strict specifice pentru fiecare specie din acest gen.

5

Analiza comparativă a oscilogramelor sunetelor este un instrument necesar și eficient

pentru rezolvarea problemelor de taxonomie la nivel de specie, mai ales în cazul speciilor

criptice morfologic. Elementele acustice sunt procesate folosind programe pentru analiza

audio, un prim pas spre identificarea masculilor diferitelor specii. Deoarece sunetele emise de

ortoptere sunt semnale modulate amplitudinal, din analiza detaliată a oscilogramelor se extrag

acele caractere ale cântecului care pot fi folosite cu precizie la identificarea indivizilor și

pentru analiza comparativă care va revela relațiile dintre speciile studiate.

Fig. 1.2. Model de analiză oscilografică a semnalelor acustice intraspecifice la Isophya nagyi

Fig. 1.3. Model de analiză oscilografică a semnalelor acustice interspecifice la Isophya

camptoxypha și Isophya dochia

În cadrul bazei de date cu elementele caracteristice stridulației la speciile aparținând

complexului Isophya camptoxypha, fiecare tab dedicat speciilor prezintă sumarul

comparațiilor intraspecifice (minim, maxim, media aritmetică, cu menționarea deviației

standard, numărul de indivizi analizați), iar tab-ul "Total" însumează comparațiile

interspecifice în cadrul grupului studiat.

6

Obiectivul 2. Studiul relațiilor filogenetice dintre speciile grupului Isophya

camptoxypha, folosind markeri moleculari.

Activitatea 2.1. Extracție de ADN genomic din indivizi aparținând speciilor din grupul

Isophya camptoxypha.

Colectarea probelor şi extracţia ADN-ului genomic.

Au fost colectate probe de țesut de la 212 exemplare aparținând speciilor din grupul

Isophya camptoxypha, din 49 de situri (Tabel 2). De la fiecare exemplar a fost prelevat un

picior posterior (stâng) și apoi fixat în alcool 96%. ADN-ul genomic total a fost extras din

ţesut muscular provenit de la fiecare individ în parte, urmând etapele kiturilor-ului ISOLATE

II Genomic DNA Kit (Bioline, London, UK) sau NucleoSpin® Tissue MACHEREY-

NAGEL GmbH & Co.

Principiul extracției ADN presupune 4 etape:

1. Prima etapă a extracției de ADN genomic presupune liza celulară prin incubarea probei

într-o soluţie de proteinază K şi SDS.

2. A doua etapă este legarea ADN genomic de membrana de dioxid de siliciu din coloniţele

furnizate de kituri. Această etapă este facilitată de adăugarea de săruri şi etanol. Procesul de

legare la membrană este reversibil şi specific acizilor nucleici.

3. Spălări succesive ale ADN-ului. Contaminările sunt înlăturate prin spălări succesive în

două soluţii tampon diferite.

4. Eluția ADN. ADN genomic pur este eluat la final într-o soluţie uşor alcalină sau în apă

distilată.

Concentraţia şi puritatea ADN genomic extras au fost măsurate utilizând

spectrofotometrul NanoDrop ND-1000.

Integritatea ADN genomic a fost testată ulterior prin electroforeza a 5µl în gel de

agaroză 1,5 % cu 0,5μg/ml EtBr

Tabel 1.2. Exemplarele aparținând grupului Isophya camptoxypha de la care s-a extras ADN

genomic

Nr. Crt. Taxon Sit colectare Numărul de exemplare și codul

probelor

1. I. camptoxypha Polonia 3 exemplare – ICPXPOL 1, 2, 3

2. I. camptoxypha M-rea. Agapia (NT) 4 exemplare – AG 1, 2, 3, 4

3. I. camptoxypha M-rea. Vatra Moldoviței (SV) 4 exemplare – VMO 1, 2, 3, 4

4. I. camptoxypha M-rea. Humor (SV) 4 exemplare – MHU 1, 2, 3, 4

5. I. camptoxypha M-ții. Parâng 2 exemplare – PG 1, 2

6. I. camptoxypha Cheile Râmețului 4 exemplare – CRM 1, 2, 3, 4

7. I. camptoxypha Sadova (SV) 3 exemplare – SAD 1, 2, 3

8. I. camptoxypha Vânători Neamț (NT) 1 exemplar – VNE

9. I. camptoxypha M-ții. Nemira 4 exemplare – NEM1, 2, 3, 4

10. I. camptoxypha M-ții. Țibles 2 exemplare – TIB 1, 2

11. I. camptoxypha Tg. Neamț (NT) 4 exemplare – TN 1, 2, 3, 4

12. I. camptoxypha Mărișel (M-ții. Apuseni) 3 – MAR 1, 2, 3

13. I. camptoxypha Căpâlna, 2009 8 exemplare – A 108, A 210, A 216, A

217, A 218, A 219, A 221, A 222

7

14. I. camptoxypha Căpâlna, 2011 2 exemplare – CAP 1, 2

15. I. camptoxypha M-ții. Penteleu 8 exemplare – P 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8

16. I. camptoxypha M-ții. Pietrosul Bistritei 7 exemplare – PB 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7

17. I. camptoxypha M-ții. Buila Vânturarița 5 exemplare – B 1, 2, 3, 4, 5

18. I. camptoxypha M-ții. Rarău 11 exemplare – R 1, 2, ,3, 4, 5, 6, 7, 8,

9, 10, 11

19. I. camptoxypha M-ții. Cozia 4 exemplare – COZ 4, 5, 6, 7

20. I. camptoxypha Ciuta (BZ) 1 exemplar – CIT

21. I. camptoxypha Pasul Mestecăniș (SV) 3 exemplare – ME 1, 2, 3

22. I. camptoxypha M-ții. Giumalău (SV) 2 exemplare – GIU 1, 2

23. I. camptoxypha M-ții. Piatra Craiului 4 exemplare – PIC 1, 2, 3, 4

24. I. camptoxypha Moeciu de Jos (BV) 2 exemplare – MJ 1, 2

25. I. camptoxypha M-ții. Bucegi 6 exemplare – BC 1, 2, 3, 4, 5, 6

26. I. camptoxypha M-ții. Postăvarul 4 exemplare – PTV 1, 2, 3

27. I. camptoxypha M-ții. Piatra Mare (BV) 3 exemplare – PMA 1, 2, 3

28. I. camptoxypha M-ții. Făgăraș, vf. Negoiu 3 exemplare – NEG 1, 2, 3

29. I. camptoxypha Sebeșul de Jos (SB) 3 exemplare – SBJ 1, 2, 3

30. I. camptoxypha M-ții. Cindrel 3 exemplare – CIN 1, 2, 3

31. I. camptoxypha M-ții. Ciucaș 13 exemplare – C1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

9, 10, 11, 12, 13

32. I. camptoxypha M-ții. Călimani 3 exemplare – CAL 1, 2, 3

33. I. posthumoidalis Teceu Mic (MM) 2 exemplare – POST 1, 2

34. I. ciucasi M-ții. Vrancei, vf. Goru 3 exemplare – GOR 1, 2, 3

35. I. ciucasi M-ții. Ciucaș 4 – ICIU 1, 2, 3, 4

36. I. dochia M-ții. Gurghiu 3 exemplare – GRG 1, 2

37. I. dochia M-ții. Ceahlău 2 exemplare – DU 1, 2

38. I. dochia M-ții. Ceahlău 33 exemplare – Ch 1-33

39. I. dochia M-ții. Bistritei, vf. Budacu 4 exemplare – BUD 1, 2, 3

40. I. fatrensis Slovacia 2 exemplare – IFRASL 9,10

41. I. nagyi M-ții. Suhard 3 exemplare – SUH 1, 2, 3

42. I. nagyi Neagra Șarului (SV) 4 exemplare – NSA 1, 2, 3, 4

43. I. posthumoidalis Polonia 2 exemplare – IPOSTPL 4, 5

44. I. sicula Băile Harghita (HR) 4 exemplare – HRB 1, 2, 3, 4

45. I. camptoxypha Valea Berii, Muntele Roșu 2 exemplare – MRO 1, 2

46. I. beybienkoi Slovacia, Slovenski Karst 3 exemplare – IBBYSL 6, 7, 8

47. I. harzi M-ții. Cozia 4 exemplare – COZ 1, 2, 3, 4

48. I. pienensis Baia Mare 1 exemplar – IPI 4

49. I. pienensis Pasul Borsec (HR) 3 exemplare – IPI 1, 2, 3

8

Activitatea 2.2. Optimizarea reacțiilor PCR a unor markeri moleculari (gene

mitocondriale sau nucleare), necesari în analiza filogenetică.

Markerii mitocondriali sunt preferaţi în anumite studii de filogenie și filogeografie la

anumite specii criptice datorită mai multor factori:

- degradarea acestora se produce mai lent decât a ADN nuclear.

- ADN mitocondrial evolueaza mai rapid decât ADN nuclear.

- ADN mitocondrial se transmite la descendenţi fără a suferi procesul de

recombinare.

Noi am ales și am optimizat reactiile de amplificare PCR la doi markeri mitocondrali

și a unui singur marker nuclear:

1. Gena COI - gena care codifică pentru subunitatea I a citocrom C oxidazei. Gena COI

este un marker molecular frecvent utilizat în studiile de filogenie, fiind o regiune înalt

conservată a genomului mitocondrial, utilizată pentru diferenţierea speciilor înrudite.

S-a amplificat fragment de ~750 pb din gena COI cu ajutorul unor primeri universali.

2. Gena 16 s - gena pentru subunitatea 16 S a ARN ribosomal. Aceasta genă este de

asemenea utilizată frecvent în studii de filogenie. S-a amplificat un fragment de

aproximativ 500 bp cu ajutorul unor primeri universali.

3. Gena pentru ITS 1 – gena pentru spacerul de transcriere intern. Este o genă nucleară

situată între gena pentru subunitatea mică 5.8 S a ADN ribozomal și gena pentru

subunitatea mare 18 S a ADN ribozomal. Acest fragment se întâlnește repetat în

andem în genom și este de asemenea folosit în studii de filogenie și filogeografie. S-a

amplificat un fragment de aproximativ 350bp cu ajutorul primerilor. Pentru reacţiile

PCR a fost utilizat T Professional Thermocycler basic (Biometra).

Componentele mixului reacţiei de amplificare pentru cei trei markeri moleculari sunt

redate în tabelul 3.

Tabel 1.3. Componentele reacţiei PCR pentru amplificarea fragmentelor de interes

Reactiv Volumul în reacţie

ADN 5

Tag Buffer (ROVALAB) 10X 5

MgCl2 (ROVALAB) 50 mM 2.5

dNTP1 mM 10

LCO1490 1μM1 μM 5

HCO2198 1μM1 μM 5

Taq DNA Polvmerase5 U/μl 1,5 U

mQsteril 17,2

Volum final 50 μl

Amplificarea s-a realizat utilizând programele PCR cu parametrii menţionaţi în

tabelul 4, 5 și 6.

Tabel 1.4. Programul PCR pentru amplificarea fragmentului de interes din gena COI

Etapă Temperatură Durată Nr. Cicluri COI

Denaturare initial 95° 2 min 1×

Denaturare 94° 30 s

5× Aliniereprimeri 45° 1 min 30 s

Elongare 72° 1 min

Denaturare 94° 30 s 35×

9

Aliniereprimeri 52° 1 min 30 s

Elongare 72° 1 min

Elongarefinală 72° 5 min 1×

Tabel 1.5. Programul PCR pentru amplificarea fragmentului de interes din gena ITS 1

Etapă Temperatură Durată Nr. Cicluri ITS 1

Denaturare initial 95° 3 min 1×

Denaturare 94° 10 s

9× Aliniereprimeri 45° 30 s

Elongare 72° 50 s

Denaturare 94° 10 s

35× Aliniereprimeri 52° 30 s

Elongare 72° 1 min

Elongarefinală 72° 5 min 1×

Tabel 1.6. Programul PCR pentru amplificarea fragmentului de interes din gena 16S

Etapă Temperatură Durată Nr. Cicluri 16s

Denaturare initial 95° 3 min 1×

Denaturare 94° 30 s

35× Aliniereprimeri 52° 30 s

Elongare 72° 30 s

Elongarefinală 72° 5 min 1×

Rezultatele amplificării au fost verificate prin încărcarea şi migrarea produsului de

PCR în gel de agaroză 1.5% cu 0,5μg/ml EtBr (figurile 1.4-1.6).

Fig. 1.4. Amplificarea pe gel de agaroză 1.5% a produșilor de PCR obținuți în urma

amplificării genei COI

10

Fig. 1.5. Amplificarea pe gel de agaroză 1.5% a produșilor de PCR obtinuți în urma

amplificării genei 16s

Fig. 1.6. Amplificarea pe gel de agaroză 1.5% a produșilor de PCR obținuți în urma

amplificării genei ITS 1

11

3. Evaluarea distribuției potențiale (anvelopei bioclimatice) actuale și trecute pentru

speciile din grupul Isophya camptoxypha.

3.1. Recenzia exhaustivă a literaturii pentru a extrage punctele de ocurență din lucrările

publicate și crearea unei baze de date cu informații.

Pentru a construi baza de date cu puncte georeferențiate pentru speciile aparținând

complexului Isophya camptoxypha, în prima etapă a fost efectuată o recenzie exhaustivă a

literaturii științifice, iar toate articolele conținând informații privind speciile vizate au fost

descărcate și plasate într-un singur folder. În continuare, literatura științifică a fost organizată

folosind programul EndNote 7, în sensul că lucrările au fost introduse ca referințe într-o bază

de date EndNote (*.enl), iar articolele în format *.pdf au fost atașate acestei baze de date.

Fig. 1.7. Baza de date EndNote cu literatura științifică disponibilă pentru complexul Isophya

camptoxypha

În continuare, a fost creată o bază de date excel în care au fost introduse toate datele

de distribuție din literatura științifică, aceasta fiind apoi completată cu datele de distribuție

personale rezultate în urma deplasărilor în teren și cu datele disponibile on-line într-o locație

trasabilă (GBIF - http://www.gbif.org/). În cazul datelor din literatură pentru care lipseau

informațiile spațiale (latitudine și longitudine) au fost folosite ortofotoplanuri, harta militară

declasificată și informațiile autorului pentru a localiza spațial punctul de colectare. Dacă

autorul nu a oferit informații privind habitatul în locația de colectare, ci doar denumirea celei

mai apropiate localități, atunci punctul a fost amplasat într-un habitat favorabil speciei pentru

a fi util ulterior în procesul de modelare. În baza de date au fost incluse toate punctele din

literatura științifică, dar în procesul de modelare vor fi folosite doar punctele cu o rezoluție

mai mare de 1 km. Pentru locațiile prea generale (ex.: Munții Rarău, Munții Ciucaș)

georeferențierea nu a putut fi realizată, iar acele locații vor fi excluse din modelare.

12

Fig. 1.8. Baza de date cu locațiile pentru speciile din complexul Isophya camptoxypha

3.2. Georeferențierea punctelor de ocurență care nu au informație spațială, folosind un

sistem GIS și hărți de referință (aeriene, hărți topografice actuale și anterioare).

Din baza de date excel, locațiile au fost importate în ArcGIS 10.2.1 și apoi a fost

creată o bază de date de tip geodatabase (*.gdb), care va fi folosită ulterior pentru interogări

și pentru crearea sau editarea fișierelor necesare în procesul de modelare (rastere

bioclimatice, model digital al terenului etc.).

Fig. 1.9. Bază de date geospațială cu locațiile de distribuție pentru speciile din complexul

Isophya camptoxypha

13

4. Diseminarea rezultatelor.

Nr.

crt.

Rezultate

așteptate Rezultate livrate

1.

Crearea site-

ului web al

proiectului

Crearea site-ului web al proiectului, la adresa:

http://cercetare-antipa.ro/isophya/

2.

Participare la

o manifestare

științifică

Iorgu, I. Ş., Sahlean, T. C., Moscaliuc, L. A., Dragoș, M. & Iorgu, E. I.

- Mapping the general distribution of Isophya camptoxypha species

group (Insecta: Orthoptera) in the Romanian Carpathians and

application of IUCN Red List criteria for their future conservation.

International Zoological Congress of “Grigore Antipa” Museum,

București, 18-21 noiembrie 2015, p. 205-206

http://czga.ro/pozepagini/CZGA2015-

Book_of_abstracts(online_edition)_1.pdf

14

Etapa 2: Studiul distribuției potențiale și a relațiilor filogenetice dintre

speciile grupului “Isophya camptoxypha”

I. Rezumatul Etapei

În cadrul celei de-a doua etape, studiile noastre s-au canalizat pe următoarele direcții:

- activități de teren pentru a înregistra speciile de interes, pentru a colecta puncte de

distribuție pentru speciile țintă (și a investiga locațiile prezise de modele, dar unde specia nu a

fost găsită anterior) și pentru a colecta probe biologice. Stridulația insectelor colectate a fost

înregistrată în natură și în laborator pentru obținerea datelor privind sistemele de comunicare

acustică, înregistrarea masculilor care stridulează și a duetelor mascul-femelă.

- extracția ADN genomic de la probele colectate și amplificarea markerilor moleculari

necesari în analiza filogenetică și obținerea secvențelor ADN ale acestora. A fost realizată o

bază de date cu secvențe ADN provenind de la taxonii analizați.

- elaborarea unui model preliminar de distribuție potențială pentru speciile din

complexul “Isophya camptoxypha” folosind doi algoritmi de modelare: Maxent și Desktop

GARP. Modelele de distribuție potențială au fost recalibrate folosind date din teren, pentru a

crește acuratețea rezultatelor și transferarea modelelor pe climate din trecut. Au fost întocmite

hărți preliminare de distribuție a speciilor din grupul “Isophya camptoxypha”.

- diseminarea rezultatelor pe scară largă prin comunicarea sau prin publicarea

națională / internațională a rezultatelor. Acest obiectiv s-a realizat prin participarea la o

manifestare științifică internațională.

Obiectivele și activitățile etapei 2 (2016)

1. Evaluarea comunicării acustice la speciile din grupul “Isophya camptoxypha”.

1.1. Activități de teren pentru a înregistra speciile de interes și a colecta probe

biologice.

1.2. Înregistrarea cântecelor în natură/laborator pentru obținerea datelor privind

sistemele de comunicare acustică, înregistrarea masculilor care stridulează și a duetelor

mascul-femelă.

2. Studiul relațiilor filogenetice dintre speciile grupului “Isophya camptoxypha”, folosind

markeri moleculari.

2.1. Extracție de ADN genomic de la probele colectate.

2.2. Amplificarea markerilor moleculari necesari în analiza filogenetică și obținerea

secvențelor ADN ale acestora.

3. Evaluarea distribuției potențiale (anvelopei bioclimatice) actuale și trecute pentru

speciile din grupul “Isophya camptoxypha”.

3.1. Elaborarea unui model preliminar de distribuție potențială pentru speciile din

complexul “Isophya camptoxypha” folosind doi algoritmi de modelare: Maxent și Desktop

GARP.

15

3.2. Activități de teren pentru a colecta puncte de distribuție pentru speciile țintă și a

investiga locațiile prezise de modele, dar unde specia nu a fost găsită anterior și colectarea de

material biologic.

3.3. Recalibrarea modelelor de distribuție potențială folosind date din teren, pentru a

crește acuratețea rezultatelor și transferarea modelelor pe climate din trecut.

4. Rezultate așteptate:

4.1. Hărți preliminare de distribuție a speciilor din grupul “Isophya camptoxypha”.

4.2. Baza de date cu secvențe ADN provenind de la taxonii analizați.

4.3. Publicarea unui articol științific.

4.4. Participare la o manifestare științifică.

II. Descrierea științifică și tehnică a etapei

Tabel 2.1. Gradul de realizare a obiectivelor și activităților

Obiectiv / Activitate Grad de

realizare

1. Evaluarea comunicării acustice la speciile din grupul “Isophya camptoxypha”. 100%

1.1. Activități de teren pentru a înregistra speciile de interes și a colecta probe biologice. 100%

1.2. Înregistrarea cântecelor în natură/laborator pentru obținerea datelor privind sistemele de

comunicare acustică, înregistrarea masculilor care stridulează și a duetelor mascul-femelă. 100%

2. Studiul relațiilor filogenetice dintre speciile grupului “Isophya camptoxypha”, folosind

markeri moleculari. 100%

2.1. Extracție de ADN genomic de la probele colectate. 100%

2.2. Amplificarea markerilor moleculari necesari în analiza filogenetică și obținerea secvențelor

ADN ale acestora. 100%

3. Evaluarea distribuției potențiale (anvelopei bioclimatice) actuale și trecute pentru

speciile din grupul “Isophya camptoxypha”. 100%

3.1. Elaborarea unui model preliminar de distribuție potențială pentru speciile din complexul

“Isophya camptoxypha” folosind doi algoritmi de modelare: Maxent și Desktop GARP. 100%

3.2. Activități de teren pentru a colecta puncte de distribuție pentru speciile țintă și a investiga

locațiile prezise de modele, dar unde specia nu a fost găsită anterior și colectarea de

material biologic.

100%

3.3. Recalibrarea modelelor de distribuție potențială folosind date din teren, pentru a crește

acuratețea rezultatelor și transferarea modelelor pe climate din trecut. 100%

4. Diseminarea rezultatelor. 100%

4.1. Hărți preliminare de distribuție a speciilor din grupul “Isophya camptoxypha”. 100%

4.2. Baza de date cu secvențe ADN provenind de la taxonii analizați. 100%

4.3. Publicarea unui articol științific. 100%

4.4. Participare la o manifestare științifică. 100%

16

Obiectivul 1. Evaluarea comunicării acustice la speciile din grupul Isophya camptoxypha

Activități de teren pentru a înregistra speciile de interes și a colecta probe biologice

Speciile din grupul studiat au o distribuție Central Europeană: partea de Est a Alpilor

și în bazinul Carpatic. În anul 2016 au fost întreprinse mai multe deplasări în teren în

următoarele zone din România: Lipova, Săvârșin (jud. Arad), Blaj (jud. Alba), Sovata (jud.

Mureș), Făgăraș, Agnita (jud. Sibiu), Munții Ciucaș (jud. Prahova), Gura Humorului, Cacica,

Putna, Munții Rarău, Munții Călimani, Vatra Dornei (jud. Suceava), Munții Maramureșului,

Munții Rodnei, Poienile de sub Munte (jud. Maramureș), Piatra Neamț, Poiana Largului,

Durău, Munții Ceahlău (jud. Neamț), pentru colectarea acestor insecte.

Înregistrările acustice ale diverselor specii studiate au fost efectuate în teren cu

ajutorul următorului echipament: reportofon digital Edirol R-09HR (frecvența de răspuns a

microfonului: 20–40000 Hz, fișiere .wav 96000 Hz, 24-bit) și un microfon extern Sennheiser

“shotgun” ME65 (Fig. 2.1). Amplitudinea perfectă pentru analiza oscilografică a cîntecului se

obține la intensitatea de -12 – -6 dB, respectiv prin poziționarea microfonului la aproximativ

30-50 cm de insectă. Perioada optimă a zilei pentru acest studiu este la apusul soarelui și în

primele ore ale nopții, când cosașii Isophya devin activi și încep să striduleze.

Fig. 2.1. Expediție în Carpați (stânga) pentru înregistrarea stridulațiilor (centru) speciilor din

complexul “Isophya camptoxypha” (dreapta)

Înregistrarea cântecelor în natură/laborator pentru obținerea datelor privind sistemele

de comunicare acustică, înregistrarea masculilor care stridulează și a duetelor mascul-

femelă

Introducere.

În general, funcția de bază a cântecului constă în transmiterea informației între

masculi și femele, în timpul comportamentului de împerechere: de regulă, masculii

stridulează spontan, iar femelele decid de care mascul să se apropie. Pentru a forma cuplul,

femela răspunde acustic într-o fereastră de oportunitate strict definită temporal în funcție de

stridulația masculului și formează un duet acustic cu acesta, componentă semnificativă a

sistemului de recunoaștere al partenerului la acești cosași. Modularea amplitudinală a

17

stridulației masculului și sincronizarea răspunsului femelei sunt diferite și strict specifice

pentru fiecare specie din acest gen.

Metode.

Înregistrările au fost efectuate cu un reportofon digital EDIROL R-09HR, sunetul

fiind captat la o frecvență de sampling de 96 kHz și rezoluție amplitudinală de 24-bit.

Temperatura ambientală a fost măsurată în timpul fiecărei înregistrări, deoarece densitatea

repetiției diferitelor elemente structurale ale stridulației sunt foarte dependente de temperatură

la animalele poikiloterme. Înregistrările audio și video s-au desfășurat în natură, dar și în

laborator (fig. 2.2).

Fig. 2.2. Frame-uri din înregistrări video ale mișcărilor aripilor în timpul stridulației la

speciile din complexul “Isophya camptoxypha”, în teren (stânga) și în laborator (dreapta)

Corelarea frame-urilor din înregistrările video cu semnalele acustice permit

vizualizarea comportamentului în timpul stridulației și mai ales a mișcărilor aripilor în timpul

producerii sunetelor. În laborator, insectele au fost înregistrate în terarii cu pereții din burete

(pentru prevenirea reverberațiilor), microfonul fiind așezat la o anumită distanța de aripile

insectei, în funcție de intensitatea sunetului emis de aceasta (fig. 2.3).

Fig. 2.3. Producerea sunetului prin mișcarea aripilor la o specie studiată: corelarea frame-

urilor dintr-o înregistrare video cu oscilograma sunetului (stânga) și poziționarea

microfonului față de aripile insectei în timpul înregistrărilor din laborator (dreapta)

Răspunsul femelei a fost obținut prin aducerea unei femele în terariul unui mascul

care stridulează și formarea spontană a unui duet acustic între cei doi parteneri. Înregistrarea

s-a realizat cu același echipament (Edirol R-09HR), dar folosind microfoanele stereo ale

18

reportofonului, poziționat la mijlocul distanței dintre cele două insecte, astfel incât fiecare

partener a fost înregistrat cu amplitudine mai mare pe canalul ipsilateral față de cel

contralateral (oscilograma din fig. 2.4).

Fig. 2.4. Reprezentarea oscilografică a semnalelor acustice în timpul unui duet mascul -

femelă la Isophya dochia. Femela răspunde imediat după fiecare grup de silabe a masculului

(masculul – mov, femela – roșu, temporizarea răspunsului femelei – roz)

Toate măsurătorile oscilografice și spectrografice au fost făcute cu software-ul

Audacity 2.1.2.

A fost folosită o terminologie specială pentru descrierea elementelor stridulației,

adaptată după Ragge & Reynolds (1998) și Heller et al. (2004): silabă – sunetul produs în

timpul mișcării de deschidere și închidere a aripilor; impuls – sunetul produs de impactul unui

dinte a carenei stridulante; clic – un impuls izolat, produs de regulă după o silabă. Pentru

caracterizarea cantitativă a modelului oscilografic și pentru comparații inter- și intraspecifice

au fost folosite următoarele elemente definitorii (Orci et al., 2001; Orci et al., 2010a): durata

unei silabe (DS), perioada de repetiție a silabei (SRP), durata unui grup de silabe (DG),

perioada de repetiție a grupului (GRP), numărul de silabe dintr-un grup (NS) și numărul de

impulsuri dintr-o silabă (NI). De asemenea, a fost măsurată și perioada necesară unei femele

să răspundă stridulației masculului (Dfr) (Fig. 2.5).

Fig. 2.5. Caracterele oscilografice studiate la Isophya fatrensis (abrevierile se regăsesc în

text; după Iorgu et al., in press).

Rezultate. Discuții.

Au fost analizate stridulațiile și duetele mascul-femelă la toate speciile din grupul

studiat: Isophya camptoxypha, I. ciucasi, I. nagyi, I. sicula, I. posthumoidalis, I. dochia, I.

fatrensis. Cântecul masculului este produs prin stridulația aripilor și de regulă constă în suite

de silabe izolate. Luând în calcul structura silabelor, aceste specii se împart în 3 sub-grupuri:

1. specii care produc un singur tip de silabă, cu structură simplă (I. camptoxypha, I.

ciucasi, I. sicula) sau complexă (I. nagyi). Femela poate să răspundă după fiecare silabă.

2. specii care au două tipuri de silabe (A și B), iar una dintre ele funcționând ca

element declanșator pentru răspunsul femelei (silaba B într-o suită “AA…AB”) (I. dochia, I.

posthumoidalis).

19

3. specii care stridulează silabele în grupuri, fără un element special structural care să

declanșeze răspunsul femelei (I. fatrensis) (după Iorgu et al., in press).

La această ultimă specie, declanșarea răspunsului femelei în funcție de stimulii

acustici din stridulația masculului a făcut obiectul unui studiu recent (Iorgu et al., in press):

elementul funcțional din cântecul masculului este ultima silabă a unui grup, răspunsul femelei

fiind temporizat la un interval de 228–335 ms, unul dintre cele mai lungi de acest gen din

cadrul grupului [125–186 ms la I. harzi (Orci et al., 2010a), 40–70 ms la I. sicula (Orci et al.,

2010b), 13–34 ms la I. dochia (Iorgu, 2012), 70–130 ms la I. nagyi (Szövényi et al., 2012)].

Elementul declanșator se află în ultima silabă a unui grup, dar în acest caz există două

posibilități: începutul silabei sau finalul acesteia? Au fost examinate cele două cazuri, iar

efectul duratei ultimei silabe asupra femelei a fost negativ: timpul de reacție al femelelor nu

se modifică odată cu modificarea duratei ultimei silabe a masculului. Așadar, răspunsul

femelei ar depinde de începutul acestei silabe.

Rezultatul studiului arată unicitatea duetului dintre masculii și femelele acestei specii

și imposibilitatea formării unui cuplu acustic intraspecific. Pe viitor, studii asupra elementelor

spectrale ale sunetelor produse de speciile din acest complex vor completa cunoștințele

prezente despre datele oscilografice (după Iorgu et al., in press).

20

Obiectivul 2. Studiul relațiilor filogenetice dintre speciile grupului Isophya

camptoxypha, folosind markeri moleculari

Extracție de ADN genomic de la probele colectate

Colectarea probelor de la indivizi din genul Isophya

A fost constituită o colecție cu exemplare din genul Isophya din România și nu numai,

cu peste 600 de exemplare colectate. Toate exemplarele au fost fixate în alcool 96% și

etichetate. Etichetele conțin următoarele informații: Locul colectării, data colectării,

coordonatele GPS, colectorul.

Fig. 2.6. Exemple din colecția de indivizi de Isophya sp. Exemplarele sunt ținute individual în

recipiente în alcool etilic de 96%

Extracția ADN de la indivizi din grupul Isophya camptoxypha

Au fost colectate probe de țesut de la 307 exemplare aparținând speciilor din grupul

“Isophya camptoxypha”, din 78 de situri (Fig. 2.6, 2.7, 2.8). De la fiecare exemplar a fost

prelevat piciorul posterior stâng, fixat în alcool 96%. ADN-ul genomic total a fost extras din

ţesut muscular provenit de la fiecare individ în parte, urmând etapele kiturilor-ului ISOLATE

II Genomic DNA Kit (Bioline, London, UK).

Liza celulară începe prin incubarea probei într-o soluţie de proteinază K şi SDS.

Condiţiile necesare legării ADN la membrana de dioxid de siliciu din coloniţe sunt realizate

prin adăugarea de săruri şi etanol. Procesul de legare la membrană este reversibil şi specific

acizilor nucleici. Contaminările sunt înlăturate prin spălări succesive în două soluţii tampon

diferite. ADN genomic pur este eluat la final într-o soluţie uşor alcalină sau în apă distilată.

Eluția AND s-a realizat într-un volum final de 60-100 µl, în funcție de starea indivizilor.

ADN genomic extras a fost verificat atât din punct de vedere calitativ, cât şi cantitativ,

utilizând spectrofotometrul NanoDrop ND-1000. Concentrațiile DNA variază de la 6 ng/µl la

500 ng/µl.

21

Fig. 2.7. Exemple de cutii cu tuburi cu ADN genomic de la indivizi din grupul “Isophya

camptoxypha”. Tuburile cu ADN genomic sunt depozitate în congelatoare, la -20°C.

Datele privind concentrația ADN genomic și rapoartele A260/A280 și A260/A230 au

fost completate într-o bază de date cu probe ADN de la Isophya camptoxypha. De asemenea,

au fost completate în baza de date și următoarele aspecte: Id-ul probei, Specia probabilă,

Locul de colectare, Țara/județul, Data calendaristică, secvențele obținute de la markerii

moleculari amplificați, concentrația ADN genomic, Rapoartele de puritate ale ADN genomic

față de proteine și ARN. Această bază de date are atașate și fișiere fasta cu secvențe

amplificate de la fragmente din genele COI mitocondrial, 16s mitocondial, ITS1 și ITS2

nucleare.

22

Fig. 2.8. Exemplu de bază de date alcătuită pentru probele de ADN provenit de la specii din

grupul “I. camptoxypha”.

Amplificarea markerilor moleculari necesari în analiza filogenetică și obținerea

secvențelor ADN ale acestora

Diversitatea genetică a speciei Isophya camptoxypha în Carpați

Introducere.

Specia Isophya camptoxypha (Fieber, 1853) (fig. 2.9) are o distribuție Central

Europeană, fiind prezentă în Estul Alpilor și în Lanțul Carpatic. Ea a fost citată din

următoarele țări: Austria, Ungaria, Polonia, Slovacia, Ucraina și Romania. Specia are o

distribuție disjunctă pe întreg arealul ei. Isophya camptoxypha este un cosaș de dimensiuni

medii, brachipter, cu o capacitate de dispersie limitată. Specia preferă habitate de pajiști din

zona subalpină sau colinară, de tip mezofil sau higro-mezofil cu specii de plante

dicotiledonate cu frunze late. Ea se hrănește cu frunzele speciilor: Veratrum sp., Rubus sp.,

Rumex sp., Vaccinium sp. etc.

23

Fig. 2.9. Mascul și femelă de Isophya camptoxypha (Foto: I.Ș. Iorgu)

Din punct de vedere morfologic, specia aparține unui supra-grup numit “Isophya

pyrenaea”, care este format din 16 specii de cosași (Warchałowska–Śliwa et al., 2008).

Datorită similarităților morfologice foarte mari și a lipsei unor piese genitale sclerotizate la

masculi, cel mai bun criteriu de discriminare pentru acest gen de cosași este stridulația.

Pentru o bună diferențiere a speciilor se analizează elementele structurale ale cântecului

masculilor, care sunt specific fiecărei specii, precum și duetele formate între masculi și

femele (Heller et al., 2004).

Scopul studiului nostru a fost să analizăm diversitatea genetică a speciei cu ajutorul

secvențelor a două fragmente de gene mitocondriale (16s și COI) și de a testa ipoteza

corelării grupurilor filogenetice descoperite la acestă specie cu distribuția lor geografică.

Materiale și metode.

Prelevarea probelor

Am colectat 83 de exemplare adulte de I. camptoxypha din 37 de populații de pe

întreg arealul acestei specii. Colectarea s-a realizat manual sau prin cosire cu fileul

entomologic. Fiecare individ a fost prins viu, înregistrat acustic pentru a se determina clar

dacă aparține acestei specii și apoi a fost fixat în alcool etilic 96% pentru analize genetice

ulterioare. Ca outgroup s-au folosit 3 exemplare din grupul “Isophya modesta” (după

Grzywacz-Gibala et al., 2010): 2 exemplare de Isophya modesta și un exemplar de Isophya

longicaudata (fig. 2.10).

24

Fig. 2.10. Harta distribuției populațiilor de I. camptoxypha luate în analiză (roșu). Albastru –

specii din outgroup (Isophya modesta)

Extracția DNA și amplificarea markerilor genetici

ADN genomic a fost extras din țesut muscular provenit din piciorul posterior de la

fiecare individ în parte, cu ajutorul uni kit de izolare ADN de la Bioline Genomic II DNA kit,

conform instrucțiunilor producătorului.

S-au amplificat două fragmente genice din ADN mitocondrial, cu ajutorul unor

primeri specifici universali:

1. un fragment de 662 perechi de baze, provenind de la subunitatea I a genei Citocrom

C oxidaza mitocondrială (coi) - cu ajutorul primerilor: (LCO1490 – LCO2198) (Folmer,

1994);

2. un fragment de 494 perechi de baze, din gena ARN ribozomal, subunitatea 16s

(16s) – cu ajutorul primerilor (16sSa – 16sSb) (Simon et al., 1994).

Reacţia PCR pentru genotipare a fost realizată într-un volum total de 50 μl cu

următoarele componente: 100-200 ng ADN matriță, 10 μl buffer de reactie 5X Green

GoTaq® Reaction Buffer Promega, 1.5-2.5 mM MgCl2, fiecare dNTP la o concentraţie de 0.1

mM, 0.1 μM din fiecare primer (unul dintre ei marcat cu o “coadă” M13), 1.5 U de ADN

polimerază GoTaq® DNA Polymerase, și apă distilată sterilă până la volumul final.

Amplificarea PCR s-a realizat într-un thermal cycler de tip BioRad PTC 200 PCR

engine după următoarele protocoale:

COI - o etapă de denaturare iniţială la 95°C pentru 2 min, urmată de 5 cicluri cu

denaturare la 95°C pentru 30 s, alinierea primerilor la 45°C pentru 1 min 30 s şi elongare la

72°C pentru 1 min, urmate de 30 cicluri cu denaturare la 95°C pentru 30 s, alinierea la 52 °C

pentru 1 min 30 s şi elongare la 72°C pentru 1 min, urmate de o etapă finală de elongare la

72°C pentru 5 min.

25

16s - o etapă de denaturare iniţială la 95°C pentru 3 min urmată de 35 cicluri cu

denaturare la 95°C pentru 30 s, alinierea primerilor la 48°C pentru 45 s şi etapa de elongare la

72°C pentru 45 s, urmate de o etapă finală de elongare la 72°C pentru 5 min.

După reacția de amplificare, produșii de PCR sau fost încarcați, migrați și vizualizați

pe un gel de agaroză de concentrație 1.5 %, colorat cu bromură de etidiu. Fragmentele de

interes au fost excizate din gel și purificate utilizând un kit specific FavorPrep™ GEL/PCR

Purification Kit de la Favorgen Corp., conform instrucțiunilor fabricantului.

Secvențierea produșilor de PCR s-a realizat unidirecțional apelând la serviciile

Macrogen.com.

Analize moleculare

Secvențele obținute au fost curățate și aliniate cu ajutorul programelor Codon Code

Aligner (codonCode Corp.) și Mega 7 v. 7.0.14 (Tamura, Stecher & Kumar, 2016).

Modelul de substituție a nucleotidelor cu cea mai mare probabilitate a fost calculat cu

ajutorul programului jModelTest 2.1.5 (Darriba et al., 2012; Guindon & Gascuel, 2003),

ordonate după algoritmul Akaike Information Criterion (AIC).

Pe baza secvențelor concatenate de 16s și COI și acestor analize preliminarii au fost

reconstruiți arbori filogenetici după următoarele metode: Maximum Likehood (ML),

Maximum Parsimony (MP), Neighbour Joining (NJ) și Bayesian Inference (BI). Programul

Mega 7 v7.0.14 a fost utilizat pentru reconstrucția arborilor cu ajutorul metodelor Maximum

Likehood (1000 de iterații de tip Bootstrap, deleția completă a gapurilor), Maximum

Parsimony (1000 de iterații de tip Bootstrap, deleția completă a gapurilor), Neighbour Joining

(1000 de iterații de tip Bootstrap, deleția completă a gapurilor). Reconstrucția filogenetică

prin metoda Bayesian Inference a fost realizată prin programul MrBayes v3.2.2 (Ronquist &

Huelsenbeck 2003; Ronquist et al., 2005) cu 1.000.000 de generații simulate și cu o rată de

extracție de 100 de generații).

Diversitatea genetică, numărul de haplotipuri și divergențele genetice au fost calculate

folosind programul DnaSP v5.10.1 (Librado & Rozas, 2009). Ca parametri de variație

genetică au fost calculate numărul de situri polimorfice/segregative (S), numărul de

haplotipuri (H), diversitatea haplotipică și diversitatea nucleotidelor (π), pentru totalul

secvențelor, pentru fiecare clad în parte și pentru fiecare subclad în parte.

Estimarea timpului de divergență a cladelor filogenetice a fost realizată cu ajutorul

programului Beast v1.8.1 (Drummond et al., 2012), folosind un model de ceas molecular

strict și rate de substituție cunoscute pentru cei doi markeri (0.0177 substituții/sit/Mya pentru

COI și 0.0054 substituții/sit/Mya pentru 16s) determinate după alte specii de Isophya

(Chobanov et al., 2016 și Papadopoulou et al., 2010). Mărimea populației în timp a fost

estimată după un model de speciație de tip Yule, lungimea lanțului Markov-Chain-Monte-

Carlo (MCMC) a fost setat la 10×106 cu un burn in de 106, în timp ce ceilați parametrii au

rămas în ”default”.

De asemenea, am folosit algoritmul Median-Joining implementat în programul

NETWORK Software v4.6.1.0 (http://www.fluxus-engineering.com) pentru a ilustra pattern-

urile filogenetice și geografice în diversitatea haplotipurilor.

Rezultate.

Caracteristicile secvențelor, diversitatea haplotipică și distanțele genetice între

principalele clade

În cei 86 de indivizi (incluzând outgroup-ul), secvențele concatenate au însumat 1156

perechi de baze. În aceste secvențe au fost detectate 52 de haplotipuri de I. camptoxypha și 3

haplotipuri în outgroup (2 de I. modesta și 1 de I. longicaudata). În total, 186 de situri s-au

26

dovedit variabile, iar dintre acestea, 153 au fost informative parsimonial, fără să fie detectată

vreo diferență semnificativă între cei doi loci.

În cadrul secvențelor din specia I. camptoxypha (83 de indivizi) au fost descoperite 52

de haplotipuri. Secvențele conțin 1028 situri invariabile și 128 situri polimorfice dintre care

114 informative parsimonial. S-a observat o diversitate haplotipică foarte ridicată (0.986)

(vezi tabelul 2).

Tabelul 2.2. Parametrii de variație genetică în cadrul speciei I. camptoxypha. Abrevieri:

mărimea probei (N), nr. de situri polimorfice (S), numărul de haplotipuri (H), diversitatea

haplotipica (h) și diversitatea nucleotidica (π)

Grup N S H h π

Total 83 128 52 0.986 0.03122

Subclad I Carpathians 41 74 26 0.974 0.01277

Clad II Carpathians 37 49 23 0.964 0.00757

Subclad Eastern Alps 5 3 3 0.7 0.00104

Media distanței genetice între grupuri este prezentată în tabelul 2.3:

CLAD II CLAD I CLAD III OUTGROUP

CLAD_II Carpathians

0.006 0.006 0.009

SUBCLAD_I Carpathians 0.053

0.005 0.010

SUBCLAD_Eastern Alps 0.037 0.036

0.010

OUTGROUP 0.098 0.106 0.099

Analizele filogenetice

Conform algoritmului BIC, modelul evolutiv de substituție a nucleotidelor cu cea mai

mare probabilitate s-a dovedit a fi Hasegawa-Kishino-Yano (HKY, nst=2) cu o distribuție de

tip Gamma a ratei de variație pe situri și și o proporție de situri invariabile (HKY+G+I).

Analizele filogenetice de tip ML, MP, NJ și BI au generat arbori foarte asemănători și

înalt congruenți din punct de vedere al ordinii cladelor și poziția nodurilor majore. Fiecare

metodă a generat câte un arbore care prezenta 2 clade majore pentru specia I. camptoxypha.

Nu s-a dovedit o corelație între cele două clade filogenetice și distribuția geografică, fiecare

clad ocupând același areal în Carpați, având astfel o distribuție simpatrică. De asemenea, se

distinge prezența unui clad separat, format din probe provenind din Alpii de est, Munții

Kozseg din Ungaria (fig. 2.11, 2.12).

Cu toate acestea, privind distribuția în Carpați a celor două clade (fig. 2.13) putem

vedea că deși acestea sunt simpatrice, haplotipurille din Cladul I din Carpați nu ocupă

aceleași masive muntoase ca haplotipurile din Cladul II. Există o singură excepție: în Masivul

Postăvarul au fost descoperite haplotipuri unice aparținând la cele două claduri.

De asemenea, din cele 52 de haplotipuri identificate, 50 s-au dovedit a fi private

pentru masivele muntoase analizate (populațiile analizate), doar două haplotipuri găsindu-se

în 2, respectiv 3 populații foarte apropiate. Aceste două haplotipuri sunt: Hap4 – prezent în

27

populația din Bucegi și cea din Masivul Piatra Mare și Hap18 – prezent în populațiile din

Rarău, Giumalău și de la M-rea. Moldovița.

Fig. 2.11. Arbore filogenetic obținut prin metoda Bayesian Inference cu probabilitățile

posterioare în fața nodurilor principale

28

Fig. 2.12. Arbori filogenetici obținut prin metoda Mahimum Likehood (A) și Maximum

Parsimony (B) cu procentele de bootstrap ale ML/MP în fața nodurilor principale

29

Distribuția geografică a diversității genetice și estimarea timpului de divergența a

cladelor

O rețea a fost construită cu algoritmul de tip ”median joining” pe fiecare marker în

parte, precum și cea pe secvențele concatenate are aproximativ aceași structură cu trei linii

filogenetice distincte (Fig. 2.14).

Fig. 2.13. Distribuția celor două clade filogenetice în aria studiată. În buline roșii (roz) –

Cladul II Carpatic; bleu – subcladul din Alpii de Est, iar în albastru intens – subcladul I

Carpatic

30

Fig. 2.14. Rețeaua de haplotipuri pe secvențe ale genei COI mitocondriale, realizată prin

algoritmul Median-Joining. Cercurile galbene reprezintă haplotipurile, mărimea cercurilor

arată numărul de secvențe prezent în fiecare haplotip.

În urma analizei secvențelor în programul BEAST v1.8.1, prin metoda de inferență

colescentă de tip Bayesian Markov Chain Monte Carlo s-a aproximat momentul de

divergență a cladelor principale la 1.96 milioane de ani. Acestă vechime a cladelor ne indică

faptul că cele două clade majore din cadrul I. camptoxypha s-au format cu mult înainte de

ultima perioadă glaciară. De asemenea, subcladul identificat in Munții Koszeg din Ungaria s-

a desprins de subcladul Carpatic aproximativ acum 1.3 milioane de ani. În cadrul Carpaților,

Cladul II și Subcladul I au avut linii filogenetice divergente care au aproximativ aceeași

vârstă (1 milion de ani).

De asemenea, separarea dintre grupurile I. camptoxypha și I. modesta s-a realizat

înainte de separarea speciilor I. modesta și I. longicauda (4.42 milioane de ani).

31

Fig. 2.15. Cronogramă realizată în BEAST a genelor COI și 16s. Valorile medii de timp

pentru nodurile principale sunt menționate în dreapta lor.

Discuții.

Munții Carpați adăpostesc o biodiversitate ridicată precum și foarte multe habitate

bine conservate. De asemenea, o mare parte din arealul carpatic nu a avut ghețari în perioada

de maximum a ultimei glaciațiuni (Last Glacial Maximum) și a furnizat condiții propice

pentru supraviețuirea faunei și florei, jucând astfel un rol de refugiu glacial și interglacial

pentru acestea (Mraz & Ronikier, 2016). De asemenea, lanțul Carpatic formează un sistem de

insule de habitat separate unele de celelalte, ceea ce favorizează evoluția și dezvoltarea unei

faune proprii cu un procent destul de ridicat de endemisme (Mraz & Ronikier, 2016).

Această ipoteză este susținută și de datele noastre, diversitatea haplotipică a speciei I.

camptoxypha în Carpați fiind foarte ridicată, la fel ca și proporția de haplotipuri private

pentru diferite lanțuri muntoase (96%). Fiecare masiv montan are populațiile lui proprii din

această specie, cu haplotipuri unice, izolate geografic de populații din alte masive. Astfel,

aceste populații se încadrează în definiția de unități evolutive semnificative ESU

(evolutionary significant units) care presupun izolare geografică față de alte populații, izolare

genetică și trasături fenotipice diferite (Moritz, 1994). Acest fapt are o importanță deosebită

în protejarea și conservarea acestei specii, fiind necesare protecția acestor ESU pentru

păstrarea variabilității genetice a speciei.

32

Fig. 2.16. Lanțul Carpatic și principalele bariere fizico-geografice ce au influențat de-a lungul

timpului distribuția diversității genetice la diverse specii (după Mraz & Ronikier, 2016)

Speciile cu dispersie redusă tind să prezinte pattern-uri de diferențiere foarte

pronunțate datorită lipsei de geneflow (Kuo & Avise, 2005). Mai multe studii asupra unor

specii cu capacitate de dispersie redusă au descoperit divergențe genetice profunde de-a

lungul populațiilor din Carpați, precum și persistența “in situ” a liniilor evolutive pe o

perioadă foarte mare de timp. Acestea au fost corelate cu diferite bariere fizico-geografice

(Babick et al., 2005, Mraz et al., 2006, Theissinger et al., 2013, Homburg et al., 2013 etc.).

În cazul speciei I. camptoxypha, am identificat două linii filogenetice diferite, cu o

divergență genetică foarte mare, dar care nu s-au corelat cu nicio barieră geografică din lanțul

carpatic.

Concluzii.

- Specia I. camptoxypha este o specie cu abilitate de dispersie redusă, cu o diferențiere

genetică puternică și prezintă numeroase populații izolate, cu haplotipuri private în diferite

masive montane care pot fi considerate ca potențiale ESU.

- Datele noastre sugerează că cele două clade principale prezente în Carpați au fost izolate

unul de celălalt pentru o perioadă lungă de timp. Se presupune că în timpul perioadelor dintre

glaciațiuni s-au petrecut evenimente de colonizare multiple, care au avut loc din mai multe

refugii.

- Pentru un tablou mai complet al istoriei evolutive a acestei specii este necesară realizarea

mai multor analize, care presupun un efort de sampling mai mare, precum și analiza unor

markeri genetici nucleari independenți.

33

3. Evaluarea distribuției potențiale (anvelopei bioclimatice) actuale și trecute pentru

speciile din grupul “Isophya camptoxypha”

Activități de teren pentru a colecta puncte de distribuție pentru speciile țintă și a

investiga locațiile prezise de modele, dar unde specia nu a fost găsită anterior și

colectarea de material biologic.

Punctele de ocurență au fost colectate în teren folosind o unitate GPS Garmin Oregon

450t, în format GPX și folosind proiecția WGS84. Pentru colectarea datelor s-au efectuat

deplasări în zonele unde distribuția speciilor nu era cunoscută, dar modelul preliminar

construit pe baza datelor anterioare indica o favorabilitate ridicată pentru specii. Datele

colectate au fost stocate într-o bază de date geospațială compatibilă cu principalele programe

GIS (QuantumGIS, DivaGIS, ArcGIS).

Fig. 2.17. Harta de distribuție a unei specii din complexul studiat: Isophya dochia

34

Elaborarea unui model preliminar de distribuție potențială pentru speciile din

complexul “Isophya camptoxypha” folosind doi algoritmi de modelare: Maxent și

Desktop GARP. Recalibrarea modelelor de distribuție potențială folosind date din

teren, pentru a crește acuratețea rezultatelor și transferarea modelelor pe climate din

trecut.

Materiale și metode.

Puncte de distribuție

Pentru crearea modelelor de distribuție au fost folosite atât datele existente în

literatură cât și datele colectate de membrii echipei în timpul activităților de teren. Baza de

date a fost rarefiată la o rezoluție de ~1 km folosind funcția “Trimm duplicate occurrences”

din ENMTools 1.4.4 (Warren et al., 2010), pentru a elimina punctele duplicate (i.e. prezența a

mai mult de 1 punct în fiecare celulă a rasterului).

Gruparea datelor de distribuție

Deoarece complexul “Isophya camptoxypha” cuprinde numeroase specii cu un areal

de distribuție limitat, adesea reprezentat doar de câte un singur masiv muntos izolat, datele de

prezență au fost grupate pentru modelare, rezultând o bază de date cu 86 de puncte de

distribuție după rarefierea spațială. Gruparea este susținută și de datele morfologice care nu

prezintă diferențe între specii, ceea ce indică o evoluție recentă a grupului.

Variabile climatice

Datele climatice utilizate pentru modelare au fost reprezentate de setul de 19 variabile

bioclimatice disponibile gratuit pe site-ul Worldclim (http://www.worldclim.org/, Hijmans et

al., 2005) și prezentate în continuare (Tabel 4). Pentru proiecțiile pe paleoclimate a fost

folosit același set de 19 variabile bioclimatice, acestea fiind calculate din simulări cu Modele

Globale de Climat (GCM) și disponibile pe site-ul Worldclim. Perioadele temporale de

referință au fost reprezentate de ultima perioadă interglaciară (LIG) (~120.000 – 140.000

î.e.n.), ultimul maxim glaciar (LGM) (~22.000 î.e.n.) și Holocenul Mijlociu (MH) (~6.000

î.e.n.). Datele pentru ultima perioadă interglaciară sunt furnizate de Otto-Bliesner et al.

(2008), iar datele pentru ultimul maxim glaciar și holocenul mijlociu sunt obținute din

Modelul Comunitar de Climat (CCSM4). Datele pentru ultima perioadă interglaciară și

pentru holocenul mijlociu au o rezoluție de ~1 km, iar datele pentru ultimul maxim glaciar au

o rezoluție de 2.5 minute de arc.

Tabel 2.4. Setul de 19 variabile bioclimatice utilizate pentru modelare, descărcate de pe site-

ul Worldclim

Cod Denumire

Bio1 Temperatura medie anuală

Bio2 Variația diurnă (media lunară(temp max – temp min)

Bio3 Izotermalitate (bio2/bio7)(*100)

Bio4 Sezonalitatea temperaturii (SD*100)

Bio5 Temperatura maximă a celei mai calde luni

Bio6 Temperatura minimă a celei mai reci luni

Bio7 Variația anuală a temperaturii (bio5-bio6)

Bio8 Temperatura medie a celui mai ploios sfert

Bio9 Temperatura medie a celui mai uscat sfert

Bio10 Temperatura medie a celui mai cald sfert

Bio11 Temperatura medie a celui mai rece sfert

35

Bio12 Precipitații anuale

Bio13 Precipitații în cea mai ploioasă lună

Bio14 Precipitații în cea mai uscată lună

Bio15 Sezonalitatea precipitațiilor (coeficient de variație)

Bio16 Precipitații în cel mai ploios sfert

Bio17 Precipitații în cel mai uscat sfert

Bio18 Precipitații în cel mai cald sfert

Bio19 Precipitații în cel mai rece sfert

Algoritmi de modelare

Inițial s-a dorit folosirea a doi algoritmi de modelare (Maxent și GARP) pentru a

obține modele de ansamblu, dar algoritmul GARP, implementat în programul Desktop GARP

nu a putut fi utilizat ca urmare a instabilității extensiei Dataset Manager care are rol de a crea

o bază de date cu variabilele utilizate în modelare și care trebuie să furnizeze informații

despre variabile către Desktop GARP.

În consecință am folosit programul Maxent 3.3.3k (Phillips et al., 2006) care

implementează algoritmul de entropie maximă – o versiune a modelelor liniare generalizate

(Renner & Warton, 2013). Avantajul programului constă în capabilitatea de a genera automat

pseudoabsențe folosind datele de background, producerea unor modele robuste chiar și

folosind un set redus de date, acceptarea unei game largi de date în format ASCII sau SWD

și disponibilitatea gratuită.

Modelele au fost antrenate pe o zonă care reprezintă arealul actual cunoscut al speciei

și apoi au fost transferate pe o scală spațială mai largă sau pe paleoclimate. Zona de antrenare

a fost determinată folosind funcția “Minimum bounding geometry” din ArcGIS 10.2.1 și

argumentul “Convex hull” pentru a genera o anvelopa care cuprinde toate punctele

cunoscute, la care a fost adăugat apoi un buffer generic de 10 km.

Setul de date de distribuție a fost împărțit în două seturi, 75% din puncte fiind folosite

pentru antrenare și 25% pentru testarea modelului generat. Pentru împărțirea setului de date a

fost folosită extensia SDMToolbox v1.1c (Brown, 2014) pentru ArcGIS disponibilă gratuit

(http://sdmtoolbox.org/).

Modelul a fost rulat folosind “Auto features”, 104 puncte de background și a fost

activată funcția de jackknife pentru a determina contribuția variabilelor în producerea

modelului. Algoritmul a fost lăsat să ruleze până la convergență sau pentru 1000 de iterații.

Ulterior variabilele cu o contribuție mai mică de 5% în generarea modelului au fost eliminate

și modelul a fost generat din nou și inspectat rapid pentru acuratețe folosind AUC și opinia

expertului.

Evaluarea modelelor

Modelele au fost evaluate în fază inițială pe bază de AUC și opinia expertului, iar

modelele finale au fost evaluate statistic folosind AUC parțial implementat în Partial ROC

(Narayani, 2008) și inspecția vizuală de către expert. În cazul AUC parțial s-a folosit raportul

dintre AUC la un nivel de confidență de 95% și AUC generat randomic (50%), precum și

testul z pentru a verifica semnificația statistică a modelelor obținute comparativ cu modele

generate randomic.

Rezultate.

Acuratețea modelelor

Modelele generate au avut un raport AUC0.05/AUC0.5 cuprins între 1.033 și 1.0342

(Fig. 2.18): prezent 1.033251±0.01294; LIG 1.033373±0.01281; LGM 1.034091±0.013057;

MH 1.034245±0.013442. Toate modelele au dovedit predicții semnificativ mai bune față de

36

modelele generate randomic: prezent – z=3.95; p=7.75*10-5; LIG – z=3.99; p=6.43*10-5;

LGM – z=4.052766545; p=5.06*10-5; MH – z=3.982004711; p=6.83*10-5. Inspecția vizuală a

expertului a confirmat validitatea modelelor generate.

Fig. 2.18. Raportul AUC0.05/AUC0.5 pentru modelele generate de Maxent

Modelele de distribuție

Modelul de ditribuție antrenat folosind locațiile cunoscute din literatură și colectate de

autori din teren interpretează foarte bine arealul de distribuție al complexului, așa cum este el

cunoscut în momentul de față.

37

Fig. 2.19. Modelul de distribuție antrenat folosind ocurențele cunoscute pentru complexul

Isophya camptoxypha

Fig. 2.20. Modelul actual de distribuție pentru complexul Isophya camptoxypha

38

Fig. 2.21. Modelul de distribuție pentru complexul Isophya camptoxypha în ultima perioadă

interglaciară (LIG)

Fig. 2.22. Modelul de distribuție pentru complexul Isophya camptoxypha în timpul ultimului

maxim glaciar (LGM)

39

Fig. 2.23. Modelul de distribuție pentru complexul Isophya camptoxypha în timpul

Holocenului Mijlociu

Modelul general actual de distribuție al speciei (fig. 2.20) evidențiază foarte bine

spațiul geografic ocupat de acest complex și chiar suprinde zone noi dinspre Alpi unde

existența complexului este cunoscută dar punctele nu au fost folosite pentru antrenare cu

scopul de a testa performanța modelului.

Transferând modelele pe paleoclimate se observă că nișa ecologică a speciei acoperea

o mare parte din zona de studiu în perioada interglaciară (LIG), cuprinzând atât zone de

altitudine mai joasă, cât și zonele muntoase. Odată cu răcirea climei și instalarea perioadei

glaciare dimensiunea nișei se reduce iar complexul Isophya camptoxypha s-a refugiază către

zonele cu altitudini mai joase și climat mai blând. În Holocenul Mijlociu, când climatul era

mai blând decât astăzi speciile complexului au început să se retragă din nou către altitudini

mai mari, dar se observă că nișa climatică era mult mai mare față de cea actuală.

40

Bibliografie

Babik W, Branicki W, Crnobrnja-Isailovic J, Cogalniceanu D, Sas I, Olgun K, Poyarkov NA,

Garcia-Paris M, Arntzen JW (2005) Phylogeography of two European newt species:

discordance between mtDNA and morphology. Molecular Ecology 14: 2475-2491.

Brown JL (2014) SDMtoolbox: a python-based GIS toolkit for landscape genetic,

biogeographic, and species distribution model analyses. Methods in Ecology and Evolution

DOI: 10.1111/2041-210X.12200.

Chobanov DP, Kaya S, Grzywacz B, Warchałowska‐Śliwa E, Çıplak B (2016). The

Anatolio‐Balkan phylogeographic fault: a snapshot from the genus Isophya (Orthoptera,

Tettigoniidae). Zoologica Scripta (online first).

Darriba D, Taboada GL, Doallo R, Posada, D (2012) jModelTest 2: more models, new

heuristics and parallel computing. Nature Methods 9: 772.

Drummond AJ, Suchard MA, Xie D, Rambaut A (2012) Bayesian phylogenetics with

BEAUti and the BEAST 1.7. Molecular Biology and Evolution 29: 1969-1973.

Folmer O, Black M, Hoeh W, Lutz R, Vrijenhoek R (1994) DNA primers for amplification of

mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan

invertebrates. Molecular marine biology and biotechnology 3(5): 294-299.

Grzywacz-Gibała B, Chobanov DP, Warchałowska-Sliwa E (2010) Preliminary phylogenetic

analysis of the genus Isophya (Orthoptera: Phaneropteridae) based on molecular data.

Zootaxa 2621: 27-44.

Guindon S, Gascuel O (2003) A simple, fast and accurate method to estimate large

phylogenies by maximum-likelihood. Systematic Biology 52: 696-704.

Heller K-G, Orci KM, Grein G, Ingrisch S (2004) The Isophya species of Central and

Western Europe (Orthoptera: Tettigonioidea: Phaneropteridae). Tijdschrift voor Entomologie

147: 237-258.

Hijmans RJ, Cameron SE, Parra JL, Jones PG, Jarvis A (2005) Very high resolution

interpolated climate surfaces for global land areas. International Journal of Climatology 25:

1965-1978.

Homburg K, Drees C, Gossner MM, Rakosy L, Vrezec A, Assmann T (2013) Multiple

glacial refugia of the low-dispersal ground beetle Carabus irregularis: molecular data

support predictions of species distribution models. PLoS ONE 8: e61185.

Iorgu IŞ (2012) Acoustic analysis reveals a new cryptic bush-cricket in the Carpathian

Mountains (Orthoptera, Phaneropteridae). ZooKeys 254: 1-22.

Iorgu IȘ, Kristin A, Szovenyi G, Kanuch P, Jarcuska B, Sahlean TC, Iorgu EI, Orci KM (in

press) Distinctive male-female acoustic duetting support the specific status of Isophya

fatrensis, a West-Carpathian endemic bush-cricket (Insecta: Orthoptera: Tettigoniidae:

Phaneropterinae). Bioacoustics. The International Journal of Animal Sound and its

41

Recording.

Librado P, Rozas J (2009) DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA

polymorphism data. Bioinformatics 25: 1451-1452.

Kuo CH, Avise JC (2005) Phylogeographic breaks in low-dispersal species: the emergence of

concordance across gene trees. Genetica 124(2-3): 179-186.

Moritz C (1994) Defining ’Evolutionarily Significant Units’ for conservation. Trends in

Ecology & Evolution 9: 373-375.

Mraz P, Gaudeul M, Rioux D, Gielly L, Choler P, Taberlet P, Intrabiodiv. Consortium (2007)

Genetic structure of Hypochaeris uniflora (Asteraceae) suggests vicariance in the Carpathians

and rapid post-glacial colonization of the Alps from an eastern Alpine refugium. Journal of

Biogeography 34: 2100-2114.

Mráz P, Ronikier M (2016) Biogeography of the Carpathians: evolutionary and spatial facets

of biodiversity. Biological Journal of the Linnean Society 119(3): 528-559.

Narayani B (2008) Tool for Partial-ROC (Biodiversity Institute, Lawrence, KS), ver 1.0.

Orci KM, Szövényi G, Nagy B (2001) A description of the song of Isophya beybienkoi

Mařan 1958 (Orthoptera: Tettigoniidae). Biologia (Bratislava) 56(5):489–495.

Orci KM, Szövényi G, Nagy B (2010a) A characterization of the pair forming acoustic

signals of Isophya harzi (Orthoptera, Tettigonioidea, Phaneropteridae). Acta Zoologica Acad.

Sci. Hung. 56(1): 43-53.

Orci KM, Szövényi G, Nagy B (2010b) Isophya sicula sp. n. (Orthoptera: Tettigonioidea), a

new, morphologically cryptic bush-cricket species from the Eastern Carpathians (Romania)

recognized from its peculiar male calling song. Zootaxa 2627: 57-68.

Otto-Bliesner BL, Marshall SJ, Overpeck JT, Miller GH, Hu A (2006) Simulating Arctic

climate warmth and icefield retreat in the last interglaciation. Science 311(5768): 1751-1753.

Papadopoulou A, Anastasiou I, Vogler AP (2010) Revisiting the insect molecular clock: the

Mid-Aegean Trench calibration. Molecular Biology and Evolution 27: 1659-1672.

Phillips S, Anderson R, Schapire R (2006) Maximum entropy modeling of species

geographic distributions. Ecological Modelling 190: 231-259.

Ragge DR, Reynolds WJ. 1998. The songs of the grasshoppers and crickets of Western

Europe. Colchester: Harley Books, 591 pp.

Renner IW, Warton DI (2013) Equivalence of MAXENT and Poisson Point Process Models

for Species Distribution Modeling in Ecology. Biometrics 69: 274-281.

Ronquist F, Huelsenbeck JP (2003) MrBayes version 3.0: Bayesian phylogenetic inference

under mixed models. Bioinformatics 19: 1572-1574.

42

Ronquist F, Huelsenbeck JP, van der Mark P (2005) MrBayes. Ver. 3.1. [Computer software

and manual. Draft 5/26/2005]. Available via http://mrbayes.csit.fsu.edu/manual.php.

Simon C, Frati F, Beckenbach A, Crespi B, Liu H et al. (1994) Evolution, Weighting, and

phylogenetic utility of mitochondrial gene-sequences and a compilation of conserved

polymerase chain-reaction primers. Annals of the Entomological Society of America 87: 651-

701.

Szövényi G, Puskás G, Orci KM (2012) Isophya nagyi, a new phaneropterid bush-–cricket

(Orthoptera: Tettigonioidea) from the Eastern Carpathians (Căliman Mountains, North

Romania). Zootaxa 3521: 67-79.

Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S (2013) MEGA6: Molecular

Evolutionary Genetics Analysis version 6. Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729.

Theissinger K, Balint M, Feldheim KA, Haase P, Johannesen J, Laube I, Pauls SU (2013)

Glacial survival and postglacial recolonization of an arctic-alpine freshwater insect

(Arcynopteryx dichroa, Plecoptera, Perlodidae) in Europe. Journal of Biogeography 40: 236-

248.

Warchałowska-Śliwa E, Chobanov DP, Grzywacz B, Maryańska-Nadachowska A (2008)

Taxonomy of the genus Isophya (Orthoptera, Phaneropteridae, Barbitistinae): comparison of

karyological and morphological data. Folia biologica (Kraków) 56(3-411): 227-241.

Warren DL, Glor RE, Turelli M (2010) ENMTools: a toolbox for comparative studies of

environmental niche models. Ecography 33: 607-611.

4. Diseminarea rezultatelor

Nr.

crt.

Rezultate

așteptate Rezultate livrate

1.

Hărți

preliminare

de distribuție

a speciilor

din grupul

Isophya

camptoxypha

Au fost realizate hărți de distribuție pentru fiecare dintre speciile

complexului “Isophya camptoxypha”, folosind software-ul ArcGIS

10.2.1. De asemenea, datele au fost introduse într-o bază de date

geospațială folosită pentru modelare.

2.

Baza de date

cu secvențe

ADN

provenind de

la taxonii

analizați

A fost generată o bază de date cu secvențe ADN provenind de la

taxonii analizați (Id-ul probei, Specia probabilă, Locul de colectare,

Țara/județul, Data calendaristică, secvențele obținute de la markerii

moleculari amplificați, concentrația ADN genomic, Rapoartele de

puritate ale ADN genomic față de proteine și ARN). Această bază de

date are atașate și fișiere fasta cu secvențe amplificate de la fragmente

din genele COI mitocondrial, 16s mitocondial, ITS1 și ITS2 nucleare.

43

3.

Publicarea

unui articol

științific

Iorgu I.Ș., Kristin A., Szovenyi G., Kanuch P., Jarcuska B., Sahlean

T.C., Iorgu E.I., Orci K.M. - Distinctive male-female acoustic

duetting support the specific status of Isophya fatrensis, a West-

Carpathian endemic bush-cricket (Insecta: Orthoptera: Tettigoniidae:

Phaneropterinae). Bioacoustics. The International Journal of Animal

Sound and its Recording [IF 1.369] (accepted on 11.11.2016)

http://www.tandfonline.com/toc/tbio20/current

4.

Participare la

o manifestare

științifică

Iorgu I.Ș., Kristin A., Szovenyi G., Kanuch P., Jarcuska B., Sahlean

T.C., Iorgu E.I., Orci K.M. - Acoustic behaviour of Isophya fatrensis,

the last phaneropterine species with unknown acoustic signal pattern

from Central Europe. First European Congress on Orthoptera

Conservation, Trier, Germany, 18-20 March 2016, p. 21.

https://www.uni-

trier.de/fileadmin/fb6/prof/BIO/Claudes_Datenbank_sortiert/08Heusc

hrecken_Tagung/Programm/Abstractband_Heuschreckentagung_Trier

_Homepage_11.03.16.pdf

Iorgu I.Ș. - The hunt for peculiar Plump Bush-crickets in the largest

European volcanic caldera (Insecta: Orthoptera: Tettigoniidae).

International Zoological Congress of Grigore Antipa Museum,

Bucharest, Romania, 16-19 November 2016, p. 50.

http://czga.ro/pozepagini/CZGA2016_Book_of_abstracts_on_line_edi

tion_.pdf

Iorgu E.I., Iorgu I.Ș., Vadana M.I., Krapal A.M., Popa A.F., Popa

O.P., Popa L.O. - Preliminary data on the genetic diversity of Isophya

camptoxypha in the Carpathians. International Zoological Congress of

Grigore Antipa Museum, Bucharest, Romania, 16-19 November 2016,

p. 80.

http://czga.ro/pozepagini/CZGA2016_Book_of_abstracts_on_line_edi

tion_.pdf

Data, Director de proiect,

05 Decembrie 2016 Dr. Ionuț Ștefan Iorgu