CARTE Final

Roxana Lazăr Paul Corneliu Boişteanu

LUCRĂRI PRACTICE DE FIZIOLOGIE

Funcţii de nutriţie şi excreţie

ISBN: 978-973-147-104-4

© Editura ˝Ion Ionescu de la Brad˝ Iaşi

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României

LAZĂR, ROXANA Lucrări practice de fiziologie : funcţii de nutriţie şi excreţie / Roxana

Lazăr, Paul Corneliu Boişteanu - Iaşi : Editura. “Ion Ionescu de la Brad”, 2012 Bibliogr. ISBN: 978-973-147-104-4

I. Boişteanu, Paul Corneliu 619::612(075.8)(076.5)

Prefaţă

În perioada contemporană, fiziologia îşi consolidează prestigiul de disciplină de bază în medicină, fie ea umană sau veterinară.

Fiziologia folosind metodologii simple sau complexe explică toate funcţiile organismului viu, cunoştinţele obţinute fiind apoi utilizate în abordarea studiilor de patologie medicală şi în final în terapeutică şi prevenţie.

Materialul prezentat în actualul caiet de lucrări practice a fost elaborat şi completat cu datele actuale din literatura de specialitate şi în concordanţă cu programa analitică în vigoare. Sunt prezentate metode şi teste uzuale de explorare funcţională care pot fi realizate cu aparatura din dotarea laboratorului de Fiziologie, precum şi imagini originale ale fenomenelor fiziologice demonstrate experimental.

Manualul se adresează studenţilor facultăţii, putând fi folositor tuturor celor care studiază biologia.

Prof. univ. dr. Elena Marcu

1

Capitolul I

FIZIOLOGIA DIGESTIEI

3

Capitolul I Fiziologia digestiei

Cuprins

1. Fiziologia aparatului digestiv 1.1 Anatomia funcţională a aparatului digestiv 1.2 Fenomene mecanice ale digestiei bucale 1.2.1 Observarea mişcărilor cililor esofagieni la broască 1.3 Fenomenelechimice ale digestieibucale 1.3.1 Recoltarea salivei 1.3.2 Determinarea pH-ului salivar 1.3.3 Determinareacapacităţii tampon 1.3.4 Determinarea compoziţiei chimice a salivei 1.3.5 Rolul salivei în digestia chimică 1.4. Digestia şi absorbţia gastro-intestinală 1.4.1 Motricitatea gastro-intestinală 1.4.2 Digestia chimică gastrointestinală 1.4.3 Prepararea sucului gastric în laborator 1.4.4 Examenul macroscopic şi fizic al sucului gastric 1.4.5 Examenul microscopic al sucului gastric 1.4.6 Identificarea HCl liber 1.4.7 Determinarea acidităţii sucului gastric 1.4.8 Evidenţierea acţiunii proteolitice a pepsinei 1.4.9 Dozarea puterii peptice (experimentul lui Mett) 1.4.10 Acţiunea digestivă a labfermentului 1.4.11 Identificarea şi numărarea leucocitelor din sucul gastric 1.5 Teste privind explorarea funcţională a ficatului 1.5.1 Teste privind examenul bilei 1.6 Teste privind explorarea funcţională a pancreasului 1.6.1 Demonstrarea rolului vegetativ al pancreasului

Capitolul I Fiziologia digestiei 5

Fiziologia este ştiinţa care poate demonstra toate afirmaţiile făcute privind funcţionarea organismului animal viu, respectiv toate fenomenele fiziologice. Aparatul digestiv este un sistem anatomo-fiziologic complex care îndeplineşte în organism două funcţii esenţiale:

- funcţia fizică sau mecanică realizată de structurile mucoaselor (cili, vilozităţi), de musculatura striată (esofag) şi netedă (stomac şi intestine). Prin această activitate, alimentele după ce sunt ingerate şi masticate în cavitatea bucală sunt transportate prin mişcări ciliare şi mişcări esofagiene în stomac unde sunt depozitate şi prelucrate chimic, după care prin contracţii de segmentaţie şi peristaltice ajung în intestin unde se continuă digestia chimică şi apoi sunt transportate până în rect prin contracţii de segmentaţie ritmică, pendulare şi peristaltice, conţinutul intestinal rezultat fiind eliminat la exterior prin anus;

- funcţia chimică sau digestivă prin care alimentele sunt transformate în nutrimente care se absorb în sânge şi sunt transportate la nivelul organelor care le metabolizează pentru a deveni utile organismului. Procesul este realizat de componentele din salivă, suc gastric, bilă, suc intestinal şi pancreatic.

1. Fiziologia aparatului digestiv Digestia reprezintă totalitatea proceselor care asigură transformarea

alimentelor în substanţe asimilabile de către ţesuturile organismului. Digestia cuprinde ingerarea, prelucrarea şi dezintegrarea alimentelor complexe în nutriente, pentru a putea fi utilizate la nivelul ţesuturilor şi organelor în scop plastic, energetic şi funcţional. Pentru a înţelege procesul complex al digestiei trebuie să cunoaştem: fenomenele mecanice: modul de deplasare a alimentelor prin tractul

digestiv; Fenomenele chimice: - acţiunea sucurilor digestive;

- digestia alimentelor; - absorbţia produşilor de digestie, a apei şi a electroliţilor.

1.1 Anatomia funcţională a aparatului digestiv Aparatul digestiv este format din tubul digestiv şi glandele anexe,

reprezentate de glandele salivare, ficat, pancreas. Segmentele tubului digestiv sunt reprezentate de:

• cavitatea bucală; • faringe; • esofag;


• stomac; • intestin subţire; • intestin gros; • rect.

Materiale necesare: animal de experienţă (iepure, cobai, broască), cloroform, trusă de disecţie, planşetă.

Metodă de lucru şi interpretare Pentru evidenţierea aparatului digestiv, animalul de experienţă se

paralizează prin spinalizare sau se anesteziază cu cloroform prin inhalare, după care se fixează pe o placă de plută sau plastic cu faţa ventrală în sus cu ajutorul acelor cu gămălie, fixate în cele patru membre. Pe linia mediană se secţionează pielea şi stratul muscular după care secţiunea se prelungeşte la nivelul membrelor. În plan profund apare tubul digestiv şi anexele sale.

Figura 1-1 Disecţia şi evidenţierea aparatului digestiv la cobai A- secţionarea pielii; B- secţionarea peretelui muscular; C- evidenţierea

organelor din cavitatea toracică şi abdominală: 1- cord, 2- ficat, 3- vezică biliară, 4- stomac, 5- intestin subţire, 6- intestin gros, 7- splină, 8- rinichi.

Figura 1-2 Disecţia şi evidenţierea organelor interne la iepure 1- cord, 2- pulmon, 3- ficat, 4-stomac, 5-intestin subţire,

6-intestin gros, 7- vezica urinară


1.2 Fenomene mecanice ale digestiei bucale 1.2.1 Observarea mişcărilor cililor esofagieni la broască

Deplasarea alimentelor începe din cavitatea bucală. La broască, plafonul cavităţii bucale este acoperit cu un epiteliu ciliat. Se pune în evidenţă deplasarea particulelor fine de plută sau negru de fum spre regiunea stomacală datorită mişcărilor cililor din regiunea palatinului şi esofagului.

Figura 1-3 Cavitatea buco-faringiană la broască: 1-dinţi de pe maxilar; 2-dinţi vomerieni; 3-narina internă; 4-deschiderea

spre trompa lui Eustache; 5-glota; 6-deschiderea spre sacul vocal (la masculi); 7-limba; 8-maxilarul superior; 9-maxilarul inferior

Materiale necesare: broască, plăcuţă de disecţie, ace cu gămălie,

instrumentar pentru disecţie, bucăţele fine de plută, praf de cărbune, ser fiziologic, microscop, lamă de sticlă.

Metodă de lucru şi interpretare O broască spinală se fixează pe o placă de disecţie cu partea ventrală în

sus. Se incizează tegumentul şi planşeul muscular abdominal, descoperind esofagul şi stomacul. Se secţionează şi se îndepărtează maxilarul inferior, se descoperă deschiderea esofagului şi se incizează îndepărtând porţiunea lui ventrală pe o distanţă de 1-2 cm. Pe regiunea posterioară a palatinului şi la începutul esofagului se presară câteva bucăţele de plută şi se urmăreşte deplasarea acestora spre stomac. Pentru a menţine funcţia fiziologică a esofagului acesta trebuie umectat cu ser fiziologic pe toată perioada experimentului.

Se excizează o porţiune de esofag din partea sa dorsală, se pune pe o lamă de microscop şi se presară cu praf de negru de fum. Se observă la microscop deplasarea acestuia spre capătul stomacal al esofagului.


1.3 Fenomenele chimice ale digestiei bucale

În cavitatea bucală digestia chimică este realizată de salivă. Saliva este un lichid transparent, cu excepţia omnivorelor şi ierbivorelor la care aceasta este opalescentă, fiind produsul de secreţie al glandelor salivare.

Glandele salivare sunt glande perechi exocrine cu secreţie seroasă, mucoasă sau mixtă. Acestea sunt: - glandele parotide, cu celule de tip seros; - glandele submandibulare, conţin celule de tip mixt şi seros; - glandele sublinguale, formate din celule de tip mixt.

1.3.1 Recoltarea salivei

Pentru efectuarea determinărilor privind compoziţia şi rolul salivei în digestie, aceasta se recoltează diferit în funcţie de specie şi de cantitatea necesară în laborator prin metode mecanice, chimice (medicamentoase), chirurgicale (fistule).

Materiale necesare: burete, pilocarpină, cateter, eprubete Metodă de lucru şi interpretare La animalele de laborator, saliva se poate recolta prin deschiderea cavităţii

bucale şi palparea mucoasei vălului palatin, a părţii dorsale a limbii şi a părţilor molare. La rumegătoare se foloseşte introducerea unui burete în cavitatea bucală

determinându-se reflexul de masticaţie, care va îmbiba buretele cu salivă. De asemenea se pot utiliza substanţe parasimpaticomimetice (pilocarpină) sau metoda fistulelor salivare care constă în introducerea unui cateter în canalul excretor al unei glande salivare.

Imediat după recoltare, saliva are aspect spumos datorită conţinutului de bule gazoase, iar în timp apare un sediment datorită carbonaţilor din salivă.

1.3.2 Determinarea pH-ului salivar

Determinarea pH-ului (pH-ul reprezintă logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentraţiei ionilor de hidrogen) unei soluţii se poate realiza prin metoda colorimetrică, bazată pe modificarea în funcţie de pH a culorii unui indicator de pH, sau prin metodă electrometrică cu ajutorul unui aranjament de doi electrozi: un electrod de lucru (indicator) şi un electrod de referinţă, sau un electrod combinat ce poate indeplini ambele funcţii. pH este prescurtarea de la "pondus hydrogenii".

Materiale necesare: salivă, hârtie indicator, pH-metru. Metodă de lucru şi interpretare pH-metrul digital realizează o citire automată a pH-ului şi a temperaturii

la care se realizează citirea, în funcţie de temperatură aplicându-se corecţii pentru o determinare exactă a pH-ului.


Figura 1-4 Determinarea pH-ului salivar Măsurarea se efectuează prin etalonarea pH-metrului cu două soluţii

tampon de pH cunoscut. După echilibrarea aparatului, electrodul de citire se introduce în proba de analizat şi se realizează citirea pH-ului.

Valorile pH-ului salivei variază în funcţie de specie: - 6 - 7 om; - 7.1 - 7.5 porc; - 8.2 - 8.4 bovine; - 8.2 - 8.6 ovine; - 7.5 cal; - 7.2 câine.

Saliva conţine trei sisteme tampon care au rolul de a menţine în limite normale pH-ul din cavitatea bucală:

- acid carbonic/bicarbonat de sodiu; - fosfat disodic/fosfat monosodic; - mucină acidă/mucină alcalină.

Rumegătoarele deglutează cantităţi mari de salivă care tamponează pH-ul din prestomac având tendinţa spre acidifiere.

1.3.3 Determinarea capacităţii tampon

Saliva dispune de un important efect tampon exercitat de următoarele sisteme: dicarbonat, fosfat şi proteină (mucină).

Capacitatea sistemelor tampon se exprimă prin numărul de echivalenţi de acid sau bază care schimbă pH-ul unui litru de soluţie tampon cu o unitate. În scopuri practice capacitatea poate fi exprimată şi prin numărul de ml de acid sau bază de concentraţie cunoscută, tamponate de un anumit volum de soluţie tampon.

Materiale necesare: HCl 0.01 N, NaOH 0.01 N, metilorange (soluţie indicator) 0.1%, fenolftaleină (soluţie indicator) 0.1% în alcool.


Metodă de lucru şi interpretare O cantitate de 6 ml salivă se diluează cu 14 ml apă distilată. Saliva diluată

se împarte în două probe de câte 10 ml. Într-una din probe se adaugă 3 picături de metilorange, iar în cealaltă 3 picături de fenolftaleină. Cu ajutorul microbiuretei se adaugă în prima probă HCl N/100 iar celei de-a doua probă NaOH N/100, până la virarea culorii indicatorilor. Se notează volumul de HCl N/100 şi de NaOH N/100 consumate. Aceste volume se înmulţesc cu factorii soluţiilor respective şi se raportează la 1000 ml salivă.

1.3.4 Determinarea compoziţiei chimice a salivei

Saliva conţine 99.5% apă şi 0.5% reziduu uscat format din substanţe anorganice 0.2% şi substanţe organice 0.3%.

În compoziţia salivei întâlnim: - amilaza salivară care hidrolizează amidonul preparat până la maltoză

trecând prin stadii intermediare de dextrine; - mucinele salivare cu rol în formarea bolului alimentar, asigură masticaţia,

deglutiţia şi participă la sistemele tampon salivare; - natriul, clorul, potasiu, calciul, fluorul provin din plasmă, excepţie face

ionul carbonic care rezultă şi din metabolismul celular al glandei salivare; - imunoglobuline cu rol antibacterian; - lizozimul distruge mucopolizaharidele din peretele bacteriilor; - tiocianatul cu rol antibacterian.

A. Evidenţierea substanţelor anorganice Materiale necesare: salivă, acid azotic, azotat de argint, acid clorhidric

clorură ferică, acid acetic glacial, molibdat de amoniu, anse microbiologice, sticlă albastră de cobalt.

Metodă de lucru şi interpretare 1. Evidenţierea clorurilor Figura 1-5 Evidenţierea clorurilor

Într-o eprubetă se introduc 2 ml

salivă peste care se adaugă câteva picături de acid azotic concentrat. Se încălzeşte la flacără, după care se adaugă câteva picături de azotat argint. Se evidenţiază un precipitat lăptos de clorură de argint.


2. Evidenţierea sodiului Cu ajutorul unei anse se recoltează salivă şi se trece prin flacăra unui bec de

gaz. Se observă schimbarea în galben a flăcării, ceea ce indică prezenţa sodiului.

Figura 1-6 Evidenţierea sodiului

3. Evidenţierea potasiului Se recoltează salivă cu ajutorul unei anse şi se trece prin flacăra unui bec

de gaz. Se observă culoarea violet a flăcării printr-o sticlă albastră de cobalt. 4. Evidenţierea sulfocianaţilor

Într-o eprubetă se introduc 2 ml de salivă peste care se adaugă 4 picături de acid clorhidric 5% (HCl) şi 2 picături de clorură ferică 3% (FeCl3). Se observă virarea culorii spre roşu, culoare caracteristică rodanatului feric mai ales în jurul filamentelor de mucină.

Figura 1-7 Evidenţierea sulfocianaţilor

5. Evidenţierea carbonaţilor Se adaugă într-o eprubetă 2 ml de salivă şi câteva picături de acid acetic

glacial (CH3COOH). Se observă eliberarea unor bule gazoase (CO2), ceea ce indică prezenţa carbonaţilor.


6. Evidenţierea fosfaţilor Într-o eprubetă se pun 2 ml salivă fiartă şi se acidulează cu acid azotic concentrat. Se adaugă molibdat de amoniu ((NH4)6Mo7O24) în exces şi se încălzeşte la flacără până la fierbere. Se lasă la răcit, observându-se prezenţa unor cristale galbene de fosfomolibdat de amoniu.

B. Metode de laborator pentru evidenţierea substanţelor organice

Materiale necesare: salivă, acid azotic concentrat, hidroxid de sodiu sol. 20%, acid acetic 20%.

Metodă de lucru şi interpretare 1. Evidenţierea proteinelor a. Evidenţierea proteinelor prin proba fierberii

Într-o eprubetă se fierb 2 ml salivă până la apariţia unui precipitat albicios determinat de prezenţa proteinelor coagulate.

b. Evidenţierea proteinelor prin reacţia xantoproteică Se adaugă câteva picături de acid azotic (HNO3) concentrat peste 2 ml

salivă. Se fierbe la becul de gaz, observându-se virarea culorii galbene. După ce se răceşte la curent de apă se adaugă 1 ml hidroxid de sodiu (NaOH) soluţie 20%. Conţinutul eprubetei devine de culoare portocalie datorită prezenţei nucleului benzenic (fenilalanina, tirozina şi triptofanul).

Figura 1-8 Virarea culorii în reacţia xantoproteică

2. Evidenţierea mucinei

Peste 2 ml salivă se adaugă 5 picături acid acetic 20% observându-se apariţia unui precipitat cu aspect gelatinos (asemănător cu un nor de fum), ceea ce indică prezenţa mucinei.


1.3.5 Rolul salivei în digestia chimică

Saliva conţine două tipuri de secreţii proteice: secreţia seroasă, care conţine enzime; secreţia mucoasă, conţinând mucina cu rol în lubrefiere.

Saliva are un conţinut slab de enzime şi anume: - amilaza salivară, este prezentă în saliva omnivorelor (saliva ierbivorelor şi rumegătoarelor nu conţine amilază); - lipaza salivară, este prezentă la sugari şi păsări cu rol de a descompune tributiridele din lapte; - maltoza descompune maltoza rezultând dextrine; - lizozimul este o muramidază care descompune peretele unor microorganisme, având efect bactericid.

Rolul digestiv al salivei se datorează cu precădere amilazei salivare. Acţiunea ei se exercită asupra amidonului fiert sau copt, precum şi asupra glicogenului.

Scindarea amidonului are loc prin etape intermediare de dextrine.

Figura 1-9 Produşii intermediari (dextrine) de degradare a amidonului sub acţiunea ptialinei

Evideţierea produşilor de degradare a amidonului se realizează pin reacţii

de culoare pe care aceştia o dau cu soluţia Lűgol.

amidon fiert

amilodextrine

eritrodextrine

acrodextrine

izomaltoză maltoză


1. Evidenţierea amilazei salivare şi a dextrinelor Materiale necesare: amidon fiert 1%, soluţie Lűgol, salivă de omnivor. Metodă de lucru şi interpretare Într-o eprubetă se pun 5 ml amidon fiert 1% peste care se adaugă 1-2

picături soluţie Lűgol. Se observă colorarea amidonului în albastru (martor). Într-o altă eprubetă se adaugă 5 ml soluţie amidon fiert 1%, 2 picături

soluţie Lűgol, se omogenizează, după care se pun 2 ml salivă de omnivor, bogată în enzimă datorită hranei pe care o consumă.

Cele două eprubete se menţin pe baia de apă la 37ºC şi se observă modificarea culorii conţinutului eprubetei cu salivă. Iniţial culoarea virează de la albastru-violet spre roşu–violet şi în final conţinutul devine incolor.

2. Evidenţierea maltozei prin reacţia Trommer Materiale necesare: eprubete, salivă, amidon fiert 1%, hidroxid de sodiu,

sulfat de cupru 10%. Metodă de lucru şi interpretare Într-o eprubetă se adaugă 2 ml de salivă şi 5 ml amidon fiert 1% şi se pune

pe baia de apă la 37ºC. După încălzirea probei se adaugă 1 ml soluţie concentrată de hidroxid de sodiu (NaOH) şi câteva picături de sulfat de cupru (CuSO4) 10%, care imprimă preparatului culoarea albastru deschis. Eprubeta se pune pe baie de apă la fiert obţinându-se virarera culorii spre roşu-cărămiziu datorită formării acidului cupros. Reacţia are loc ca urmare a reducerii cuprului bivalent la cupru monovalent de către maltoză.

3. Dozarea activităţii amilazei în ser (metoda Wohlgemuth) Amilaza secretată de pancreasul exocrin, hidrolizează şi transformă

amidonul crud în glucide simple, parcurgându-se aceleaşi etape de la dextrine până la maltoză. Se determină diluţia maximă la care amilaza din serul sangvin de cercetat hidrolizează complet o anumită cantitate de amidon. Materiale necesare: soluţie NaCl 8.5‰, soluţie amidon 0.1% în NaCl 8.5‰, soluţie iod N/10 sau soluţie Lügol diluată ½. Metodă de lucru şi interpretare

Prepararea soluţiei Lügol diluată ½: 1 g iod, iodură de potasiu 2 g, 50 ml apă distilată.

Într-o serie de 10 eprubete mici se face o scară de diluţii de ser de la 1/1 la 1/312, astfel: Număr eprubetă 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Diluţia formată 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/312 NaCl 8,5‰ 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Ser 1ml 1ml


În prima şi a doua eprubetă se pune câte 1ml de ser sanguin iar în următoarele se pune câte 1 ml de ser fiziologic. Amestecul din a doua eprubetă se omogenizează prin agitare şi, din amestec, se transferă 1 ml în eprubeta a treia. Amestecul din eprubeta a treia se omogenizează prin agitare şi, din amestec, se transferă 1 ml în eprubeta a patra. Operaţia se repetă şi cu eprubetele următoare. Din ultima eprubetă se îndepărtează 1 ml de amestec. În fiecare eprubetă se adaugă:

Nr. eprubetă 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Soluţie amidon 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml

Figura 1-10 Realizarea scării etalon Toate cele 10 eprubete se incubează la 37o C, timp de 30 minute, după

care în fiecare eprubetă se adaugă şi se omogenizează: Nr. eprubetă 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Nr. picături de soluţie Lugol

1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2

Primul tub în care se dezvoltă culoarea albastră este tubul limită. Se

notează diluţia tubului anterior (culoare violetă). Valoarea diluţiei din eprubeta care precede eprubeta limită se înmulţeşte cu 2. Culoarea violetă este dată de prezenţa dextrinelor.

Rezultatul se exprimă în unităţi Wohlgemuth (UW). Unitatea amilazică Wohlgemuth reprezintă cantitatea de enzimă necesară pentru a hidroliza un mg amidon în 30 minute la 38ºC. Pentru calcul se consideră ultima diluţie în care nu apare culoarea albastră.

Rezultatul în unităţi Wohlgemuth se obţine înmulţind diluţia cu 2. De exemplu, dacă coloraţia albastră apare în eprubeta a 5-a înseamnă că amidonul a fost hidrolizat până la a 4-a eprubetă. Calculăm diluţia acestei eprubete care este 1/16 faţă de serul iniţial. Dacă: 1/16 ml ser hidrolizează 2 ml sol. amidon 0.1% atunci, 1 ml ser hidrolizează x ml sol. amidon 0.1% sau x mg amidon.


UW321/16

2 x 1X ==

Valori normale Amilazemie: 16 - 32 unităţi Wolgemuth Amilazurie: 32 - 64 unităţi Wolgemuth 1.4. Digestia şi absorbţia gastro-intestinală

Digestia gastrică reprezintă ansamblul proceselor mecanice şi biochimice care asigură transformarea şi absorbţia alimentelor. Procesele implicate asigură stocarea alimentelor, mărunţirea mecanică, sterilizarea parţială precum şi degradarea unor proteine. În stomac se realizează o digestie completă şi complexă bazată pe procese fizice (motilitatea gastrică) şi chimice (activitate enzimatică).

1.4.1 Motricitatea gastro-intestinală

După prelucrarea mecanică a alimentelor în cavitatea bucală, prin masticaţie, se formează bolul alimentar care este împins în faringe şi de aici prin mişcări peristaltice, de segmentaţie ritmică şi de pendulare, alimentele parcurg tot traseul gastrointestinal până când sunt eliminate prin rect la exterior. Contracţia şi relaxarea musculaturii striate (esofag) şi netede este realizată de mecanisme nervoase (parasimpatic prin acetilcolină: contractă şi simpaticul prin noradrenalină: relaxează), mecanisme umorale (ionii de potasiu contractă, cei de calciu relaxează), substanţe chimice (cele parasimpaticomimetice: contractă, cele simpatice mimetice: relaxează).

Materiale necesare: broască, ser fiziologic, ace cu gămălie, plăcuţă de plută, aţă chirurgicală, atropină sulfurică soluţie 1%, pilocarpină clorhidrică 1%.

Metodă de lucru şi interpretare Se imobilizează o broască prin distrugerea sistemului nervos central şi se

fixează pe o planşetă cu faţa ventrală în sus. Se pune în evidenţă stomacul făcând o incizie în partea stângă a abdomenului, pentru a proteja vena abdominală. Se ridică cu grijă regiunea pilorică aplicându-se două ligaturi pe pilor la distanţe de 3 mm una de alta, înaintea bulbului duodenal şi se secţionează între ele. Se dă cu ajutorul unui bold un punct fix la cardia, recurbându-l, iar pilorul se prinde printr-o serfină la o pârghie înscriitoare, având grijă să se umecteze organul la intervale de 2-3 minute cu ser. Se observă apariţia contracţiilor peristaltice spontane ce se îndreaptă de la jumătatea corpului stomacului spre pilor. Se alege o viteză mică de rotaţie a cilindrului şi se înregistrează 5-20 minute. Se pipetează direct pe stomac 1-2 picături din soluţia de pilocarpină (substanţă parasimpaticomimetică)


clorhidrică 1% şi se observă cum tonusul organului creşte brusc, contracţiile ritmice devin mai ample şi mai frecvente. După alte 10 minute se aplică 1-2 picături de atropină sulfurică (substanţă ortosimpaticomimetică), soluţie 1%. Se remarcă scăderea accentuată a tonusului, diminuarea contracţiilor peristaltice ritmice, chiar dispariţia lor.

1.4.2 Digestia chimică gastrointestinală

Sucul gastric se recoltează pentru examenul clinic curent cât şi în scop de cercetare ştiinţifică. În laborator se folosesc mai multe metode: fistula gastrică, metodă care este practicată doar la animalele de experienţă; tehnica micului stomac utilizată de Pavlov si Bâkov ce constă în izolarea unei porţiuni mici de stomac care îşi menţine funcţia şi se fistulizează; metoda “prânzului fictiv” caz în care alimentele nu ajung în stomac datorită fistulei esofagiene, totuşi sucul gastric se secretă prin mecanism reflex şi se colectează printr-o fistulă gastrică; sondajul buco-esofago-gastric, se poate practica la toate speciile, cu excepţia cabalinelor la care se realizează sondaj nazo-esofago-gastric. În cazul sondajului se recoltează mai întâi secreţia bazală, sucul gastric produs peste noapte şi apoi sucul gastric după stimularea cu substanţe secretogene administrate parenteral sau pe sondă. administrarea unor substanţe: - histamina administrată injectabil pentru stimularea secreţiei gastrice prin stimularea receptorilor H2; - pentagastrina, stimulează secreţia gastrică prin creşterea eliberării de gastrină; - insulina, induce hipoglicemie care stimulează creşterea gastrinei.

Materiale necesare: sondă din cauciuc cu diametru adecvat taliei animalului, seringă de capacitate mare, flacon steril pentru recoltare, unguent pentru uncţionarea sondei, speculum bucal, instrumente pentru contenţionarea animalului.

Metodă de lucru şi interpretare Se contenţionează animalul în poziţie patrupodală; se pregăteşte sonda

prin uncţionarea capătului distal, se fixează speculum în cavitatea bucală, astfel încât limba să rămână liberă pentru ca animalul să poată degluti sonda.

Se aşează sonda pe baza limbii, se introduce în faringe, se aşteaptă deglutirea ei, după care se înaintează încet prin esofag. După asigurarea declivităţii maxime posibile se ataşează seringa la capătul liber al sondei şi prin aspirări repetate se antrenează suc gastric pe sondă şi în seringă.


1.4.3 Prepararea sucului gastric în laborator

Pentru cercetarea ştiinţifică şi demonstraţii de laborator la lucrările practice cu studenţii, sucul gastric se poate prepara în laborator.

Sucul gastric se poate prepara din mucoasă stomacală de porc. Materiale necesare: stomac de porc, foarfece, mojar, HCl 0.4%. Metodă de lucru şi interpretare După îndepărtarea conţinutului stomacal, se desprinde mucoasa, se

secţionează cu foarfecele în bucăţi mici, se triturează în mojar, se amestecă cu doi litri de HCl 0.4% şi se lasă la macerat 24 de ore, la 37oC. În final se filtrează de mai multe ori prin hârtie de filtru obţinându-se un filtrat clar. O altă metodă folosită în laboratoarele de fiziologie, presupune dizolvarea a 4 g de pepsină în 1000 ml HCl 0.4%.

1.4.4 Examenul macroscopic şi fizic al sucului gastric

Sucul gastric este un amestec format din produsul de secreţie a glandelor gastrice şi a celulelor epiteliale din mucoasa gastrică. Sucul gastric este o soluţie apoasă de HCl liber sau combinat conţinând o serie de enzime cu acţiune digestivă, mucina cu acţiune protectoare, precum şi o serie de substanţe anorganice (cloruri, fosfaţi, bicarbonaţi de sodiu, de potasiu, de calciu).

Cantitatea de suc gastric se măsoară cu ajutorul unui cilindru gradat şi limitele normale diferă în funcţie de metoda de recoltare aplicată, de talia animalului şi tipul de alimentaţie.

Aspectul sucului digestiv, lichid fluid, uşor opalescent şi incolor. Apariţia culorii galben-verzui este datorată unui reflux de bilă în duoden. În caz de hemoragie, lichidul de stază are o culoare negricioasă “ca zaţul de cafea”. Dacă sucul are o consistenţă ridicată, înseamnă că are un conţinut bogat în mucus.

Mirosul normal este fad sau uşor acid, înţepător. Gustul este de acru. Culoarea este uşor gălbuie, aproape incoloră; devine brună-negricioasă

în hemoragiile cu stagnare şi roşie sangvinolentă în hemoragiile datorate traumatismelor cu sonda sau fragilităţii exagerate a mucoasei. Ea poate fi verde - galbenă atunci când conţine bilă.

Densitatea este de 1.002-1.009 g/cm3. Punctul crioscopic este cuprins în intervalul -1.55°C - 0.60°C. Valoarea pH-ului variază în intervalul 0.8-5.5. Limitele de variaţie a pH-ului la unele specii sunt:

- 0.8-0.9 carnivore; - 0.9-1.5 om;


- 1.5-5.5 cabaline; - 2-4 rumegătoare; - 1- 2 porc.

1.4.5 Examenul microscopic al sucului gastric

În sucul gastric se pot întâlni rare celule epiteliale plate, provenind de pe traseul digestiv superior, rare celule epiteliale cilindrice din stomac, rare leucocite, normale sau parţial digerate, mucus, rare microorganisme şi ciuperci.

În aclorhidrie leucocitele nu sunt distruse. În hiperaciditate se observă numai resturi nucleare, iar în gastrită se întâlnesc o abundenţă de celule epiteliale cilindrice care se desprind din mucoasa gastrică din cauza procesului inflamator.

În sucul gastric se pot întâlnii diverse microorganisme care pot fi stafilococi, levuri, enterococi, coci, bacili, în funcţie de starea de aciditate din stomac.

Examenul microscopic se face pe sedimentul obţinut prin sedimentare spontană sau prin centrifugare la 3000 de turaţii pe minut. Din acest sediment se pune câte o picătură pe 4 lame, perfect curate şi numerotate.

Materiale necesare: suc gastric, lame microscop, lamele, microscop electronic.

Metodă de lucru şi interpretare Pe prima lamă se realizează un preparat nativ între lamă şi lamelă şi se

observă la microscop. Pe lama a doua se etalează o picătură de suc gastric, se întinde cu lamela,

se usucă şi se colorează May Grünwald Giemsa. Lama colorată se examinează cu imersie, pentru punerea în evidenţă a elementelor celulare şi a microorganismelor.

Pe cea de a treia lamă se amestecă o picătură de suc gastric cu o picătură de soluţie Sudan III (soluţie 0.1% în alcool 60o). Se acoperă cu o lamelă şi se studiază la microscop. Grăsimile sunt colorate în roşu portocaliu.

Pe cea de a patra lamă se amestecă picătura de suc gastric cu o picătură de soluţie Lügol, se acoperă cu o lamelă şi se examinează la microscop. Granulele de amidon sunt colorate în albastru.

În sucul gastric patologic, pot fi întâlnite hematii, granule de amidon sub forma unor sfere, grăsimi, sub forma unor picături de diferite dimensiuni sau sub forma unor cristale de acizi solubili în eter şi fibre musculare cu striaţii transversale. Granulele de amidon nu au valoare diagnostică independentă. Grăsimile găsite în cantitate mare indică o încetinire a evacuării. Această indicaţie o dau şi fibrele musculare găsite, care sunt uşor vizibile, mai ales în hiposecreţie gastrică.


1.4.6 Identificarea HCl liber

Materiale necesare: suc gastric, reactiv Boas, bec de gaz, eprubete. Prepararea reactivului Boas: 1g rezorcină, 3 g zaharoză, 50 ml alcool 96%, 50 ml apă distilată.

Metodă de lucru şi interpretare Într-o eprubetă se adaugă 5 picături reactiv Boas şi 5 picături de suc

gastric. Se încălzeşte eprubeta la becul de gaz până la evaporarea conţinutului. Se observă apariţia coloraţiei roşu-deschis datorită HCl liber.

1.4.7 Determinarea acidităţii sucului gastric

Aciditatea sucului gastric este compusă din aciditatea liberă, dată de acidul clorhidric liber şi aciditatea combinată, dată de HCl şi alţi acizi legaţi de diferite substanţe din conţinutul stomacal, în special aminoacizi şi proteine. A. Determinarea acidităţii titrabile

Materiale necesare: balon Erlenmeyer, suc gastric, apă distilată, reactiv Töpfer (soluţie alcoolică 0.5% paradimetilaminoazobenzen), NaOH N/10, fenolftaleină.

Metodă de lucru şi interpretare Într-un balon Erlenmeyer se pipetează 10 ml suc gastric filtrat şi se

diluează cu 10 ml apă distilată. Se adaugă 1-2 picături din reactivul Töpfer, care în prezenţa acidului clorhidric liber dă o coloraţie roşie, iar în prezenţa acidităţii combinate o coloraţie galbenă-portocalie. Se titrează picătură cu picătură NaOH N/10, până la virarea culorii de la roşu spre galben-portocaliu. Fiecare ml de NaOH N/10 corespunde la 1 ml HCl N/10, deci fiecare ml de NaOH N/10 neutralizează 3.65 mg HCl. Se înmulţeşte numărul de ml de NaOH folosiţi la titrare cu 3.65 obţinându-se cantitatea ce se găseşte în cei 10 ml suc gastric titraţi. Se adaugă apoi 1-2 picături dintr-o soluţie alcoolică de fenolftaleină 1%, indicator care în mediu acid este incolor, iar în mediu neutru sau alcalin devine roşu. Se continuă titrarea până la apariţia culorii roz. Numărul de ml de NaOH N/10 folosiţi corespund neutralizării acidităţii legate. Aceştia se înmulţesc cu 3.65 şi raportând la litru se obţine valoarea acidităţii combinate (0.91 g HCl la %). Aciditatea sucului gastric, se poate exprima fie în grame HCl la litru de suc gastric, fie în unităţi clinice Jaworsky, care corespund la ml NaOH N/10 necesari neutralizării a 100 ml suc gastric. În exemplul luat se va înmulţi cu 10 numărul de ml de NaOH N/10 utilizaţi: aciditatea liberă=1.5 x 10=15 U.Cl.J. Cantitatea de HCl liber variază cu specia animalelor (g HCl la %): câine 0.5-0.6; porc 0.3-0.4; cal 0.24; bou 0.05-0.12; oaie 0.04-0.21.


B. Dozarea acidităţii sucului gastric metoda Töpfer-Linossier Suma acidităţii libere şi a celei combinate reprezintă aciditatea totală.

Materiale necesare: biuretă, pahare Erlenmeyer, pipete, suc gastric, indicator Linossier, 0.25 g dimetilaminoazobenzol, 1 g fenolftaleină, alcool sanitar, NaOH N/10.

Prepararea reactivului Töpfer-Linossier: paradimetil-aminoazobenzen 0.25 g, fenolftaleină 1 g, alcool etilic 960 100 ml.

Metodă de lucru şi interpretare HCl este titrat cu o soluţie de NaOH N/10 în prezenţa reactivului Töpfer-

Linossier, ca indicator. Acidul clorhidric liber colorează indicatorul în roşu, iar cel combinat în portocaliu. Acizii organici nu schimbă culoarea reactivului.

Într-un balon Erlenmayer de 100 ml se pun 10 ml suc gastric centrifugat. Se adaugă 5-6 ml apă distilată şi 3-4 picături reactiv Töpfer-Linossier. Datorită acidului clorhidric liber, lichidul se colorează în roşu.

Cu o biuretă se adaugă picătură cu picătură NaOH N/10, până când culoarea roşie virează spre cea galben-portocalie.

Se notează cu V1 numărul de ml de NaOH utilizaţi pentru neutralizarea HCl liber.

Se continuă titrarea până când se neutralizează cantitatea totală de HCl şi soluţia îşi schimbă culoarea, mai întâi în galben deschis apoi în roz.

Se notează cu V2 numărul de ml de NaOH utilizaţi la titrarea HCl combinat.

Determinarea acidităţii libere trebuie să se efectueze pe sucul proaspăt recoltat, deoarece HCl liber se volatilizează uşor.

Rezultatele se pot exprima în ml de NaOH sau în g de HCl la 1000 ml suc gastric.

Metoda de calcul Numărul de ml de NaOH utilizaţi pentru titrarea a 10 ml suc gastric se

înmulţesc cu 100 pentru a exprima rezultatul la 1000 ml suc gastric. HCl liber/1000 ml suc gastric = V1 x 100 HCl combinat /1000 ml suc gastric = V2 x 100 Aciditate totală /1000 ml suc gastric = (V1 + V2) x 100

Pentru exprimare în g de HCl se multiplică N cu echivalentul în grame al HCl; 1 ml NaOH N/10 corespunde la 0.00365 g HCl.

1.4.8 Evidenţierea acţiunii proteolitice a pepsinei

Pepsina este o enzimă a sucului gastric, fiind secretată sub formă inactivă de pepsinogen, cu activitate optimă la pH=2. Pepsina este termolabilă; acţionează asupra moleculelor proteice acidifiate transformându-le în proteoze şi peptone.


Pepsina, ca principală enzimă proteolitică a organismului, descompune proteinele atacate şi transformate de HCl în metaproteine. Este inactivată ireversibil prin fierbere şi inactivată reversibil la rece.

Pepsina scindează proteinele care au fost solubilizate sub formă de acid albumine, până la stadiul de proteoze şi peptone.

Materiale necesare: suc gastric, proteine din albuş coagulat sau fibrină, HCl 0.4%; NaOH 0.4%; cuburi de gheaţă, bec de gaz, eprubete, acid clorhidric soluţie 0.4%, soluţie de pepsină 2%.

Metode de lucru şi interpretare a) Prima metodă

Se pregătesc 5 eprubete. În fiecare se repartizează 3 ml suc gastric exceptând ultima eprubetă. Eprubeta I - se adaugă proteina, un cub mic de albuş sau fibrină, şi se menţine la 37oC; Eprubeta II - sucul gastric se fierbe după care adăugăm proteina şi se menţine la 37oC; Eprubeta III - adăugăm proteina şi o păstrăm la gheaţă; Eprubeta IV - se neutralizează sucul gastric cu câteva picături de NaOH în prezenta fenolftaleinei la 37oC Eprubeta V - adăugăm HCl 0.4% (3 ml) şi proteină, menţinând eprubeta la 37oC. După aproximativ 6 ore se observă primele rezultate. Proteina nu mai este prezentă în prima eprubetă, unde a avut loc digestia acesteia, prin asigurarea condiţiilor fiziologice de acţiune a pepsinei (pH, temperatură). În eprubeta a II-a proteina este prezentă deoarece pepsina a fost inactivată prin fierbere. În eprubeta a III-a proteina este prezentă deoarece pepsina nu acţionează la rece. În eprubeta a IV-a proteina este prezentă deoarece pepsina nu acţionează în mediu neutru sau alcalin. În eprubeta a V-a proteina este prezentă, are aspect spongios deoarece proteina a fost atacată de HCl, dar nu a putut realiza digestia acesteia singur. b) A doua metodă: Se iau 3 eprubete, în prima se pune suc gastric artificial, în a doua acid clorhidric soluţie 0.4%, în a treia soluţie de pepsină 2%. Se adaugă albuş de ou coagulat secţionat în cuburi de dimensiuni egale şi se lasă la termostat la 38oC timp de 24 ore. Albumina va fi digerată doar în prima eprubetă.


Figura 1-11 Demonstrarea acţiunii proteolitice a pepsinei

1.4.9 Dozarea puterii peptice (experimentul lui Mett)

Materiale necesare: tuburi Mett, albuş de ou, suc gastric. Metodă de lucru şi interpretare În tuburile Mett se aspiră albuş de ou. Albumina este coagulată prin punerea

tuburilor în apă, la 85oC, unde se lasă timp de 30 minute. Apoi tuburile se sparg în bucăţi de 2-3 cm, astfel ca albuşul coagulat să ajungă exact la capătul tubului. Se imersează în sucul gastric şi se introduc în etuvă la 37oC pentru 24 ore. Se măsoară lungimea coloanei de albumină digerată la ambele capete ale tubului, în mm.

Figura 1-12 Experimentul lui Mett 1.4.10 Acţiunea digestivă a labfermentului

Laptele este format din două faze: - faza solidă (cheag), dată de cazeină, principala proteină a laptelui; ionii de calciu, sub formă de fosfati di- şi tricalcici; grăsimile din lapte, care au valoarea nutritivă cea mai mare, regăsindu-se în brânzeturi;


- faza lichidă (zer), care conţine lactoza, principala glucidă a laptelui; unele proteine solubile, lactalbumine, lactoglobuline; cantităţi mici de vitamine, minerale. Digestia laptelui începe în stomac imediat după ce acesta este coagulat de către enzima numită labferment sau cheag din sucul gastric şi ionii de calciu din lapte.

Coagularea laptelui are loc sub acţiunea labfermentului şi a ionilor de calciu, în 2 faze: 1. faza fermentativă – transformarea cazeinogenului în cazeogen, sub actiunea labfermentului; 2. faza fizico-chimică – transformarea cazeogenului în cazeină sub acţiunea ionilor de calciu.

Materiale necesare: lapte proaspăt; suc gastric; cristale de oxalat de amoniu sau potasiu; soluţie de clorură de calciu (CaCl2) 10-20%; eprubete, pipete, bec de gaz.

Metodă de lucru şi interpretare Se pregătesc 5 eprubete; în fiecare eprubetă se introduc câte 3 ml lapte

încălzit. Eprubeta 1: adaugăm 0.5 ml labferment, se ţine în mână 2-3 minute până la coagularea laptelui. Eprubeta 2: adăugăm 0.5 ml labferment fiert. Se observă că laptele nu se coagulează deoarece enzimele au fost inactivate prin fierbere. Eprubeta 3: adăugăm câteva cristale de oxalat de amoniu, se omogenizează bine, se adaugă 0.5 ml suc gastric. Laptele nu se coagulează deoarece ionii de calciu au fost blocaţi sub formă de oxalaţi de calciu (sare insolubilă). Nu se realizează faza a doua a coagulării. Eprubeta 4: adăugăm oxalat de amoniu, 0.5 ml suc gastric, observăm că nu se produce coagularea. Adăugăm 1 ml soluţie CaCl2, rezultă coagularea laptelui, ceea ce demonstreză necesitatea prezenţei ionilor de Ca în realizarea completă a coagulării laptelui. Eprubeta 5: demonstrarea succesivă a celor 2 faze ale coagularii: - faza 1: în eprubetă adăugăm cristale de oxalat, se omogenizează şi se adaugă suc gastric. Se lasă în contact aproximativ 3 minute. Ionii de calciu se blochează, labfermentul acţionează formând cazeogen. - faza 2: se fierbe conţinutul pentru inactivarea labfermentului, se adaugă 1 ml CaCl2 rezultând coagularea laptelui deoarece în faza a doua nu mai este necesar labfermentul. Pentru realizare s-au suplinit ionii de Ca.


1.4.11 Identificarea şi numărarea leucocitelor din sucul gastric

Sucul gastric conţine în mod normal un număr redus de leucocite, cu rol de apărare celulară locală.

Materiale necesare: suc gastric, ser fiziologic, albastru de metilen 2%, lame microscop, microscop.

Metodă de lucru şi interpretare Se lasă sucul gastric recoltat la sedimentat sau se realizează centrifugarea

la 3000 de turaţii pe minut. Se amestecă 1 ml de sediment cu 9 ml ser fiziologic. Din amestecul omogenizat se iau 2 ml într-o eprubetă şi se adaugă 2-3

picături de albastru de metilen 1%. Urmează numărarea leucocitelor la fel ca la frotiul din sânge. Numărul normal de leucocite este de 80-530/ mm3

1.5 Teste privind explorarea funcţională a ficatului Ficatul este cel mai mare organ al corpului, unitatea funcţională fiind

lobul hepatic. Ficatul îndeplineşte în organism următoarele funcţii:

- filtrarea şi depozitarea sângelui; - metabolizarea proteinelor, lipidelor, hormonilor etc.; - sinteza bilei; - sinteza factorilor de coagulare; - depozitarea vitaminelor şi fierului.

Ficatul are un rol esenţial în metabolismul proteinelor, hidraţilor de carbon, lipidelor, mineralelor şi în metabolizarea hormonilor.

Funcţiile metabolice se exercită în metabolismul glucidic, proteic şi mineral. În metabolismul glucidic, ficatul intervine în fosforilarea şi polimerizarea glucidelor în glicogen, asigurând rezerve de glucoză şi menţinerea homeostaziei glicemice. La nevoie produce glucoză din proteine şi grăsimi (gliconeogeneza). Metabolismul glucidic hepatic este insulinodependent. În metabolismul proteic, ficatul are funcţie proteinoformatoare şi de echilibru proteic şi funcţie ureogenă. Ficatul sintetizează albumina, 70% din cc-globuline, 50% din p-globuline, protrombina şi fibrinogenul, catabolizează nucleoproteinele. În metabolismul lipidelor, ficatul intervine în absorbţia grăsimilor şi în fosfarilarea lor, în sinteza şi esterificarea colesterolului, în sinteza lipoproteinelor, fosfolipidelor şi trigliceridelor. În metabolismul mineral acţionează prin depozitarea fierului şi a cuprului şi intervine în repartiţia apei şi a electroliţilor (ionii de Na, K şi CF) în organism.


Explorările ficatului în metabolismul glucidelor Proba hiperglicemiei provocate se bazează pe faptul că o lezare a hepatocitului tulbură depozitarea glicogenului, iar administrarea în exces a glucidelor determină creşterea lor serică.

Dimineaţa se administrează 100 g glucoză pură în 200 ml apă. Se dozează glicemia din oră în oră, timp de 3 - 4 ore. Proba nu este specifică pentru ficat, deoarece glucoza poate fi metabolizată şi în alte ţesuturi sau organe.

Testul toleranţei la galactoză (Bauer) are mai multă specificitate, galactoza fiind metabolizată numai de ficat, care o transformă în glicogen. Proba se efectuează dimineaţa înainte de administrarea tainului. Se goleşte vezica urinară şi se administrează 40 g galactoză pură în 300 - 500 ml apă. Se recoltează probe de urină la 2, 4, 6 şi 24 de ore. În mod normal nu trebuie să se elimine mai mult de 2 g galactoză; o eliminare de 3 g denotă o lezare funcţională moderată, iar o eliminare peste 6 g arată o insuficienţă hepatocelulară severă. Explorarea ficatului în metabolismul proteic: dozarea proteinelor plasmatice oferă informaţii asupra cantităţii de albumine şi de globuline. O scădere a valorii albuminelor sub 4 g% sugerează de asemenea, o insuficienţă hepatocitară. Scăderea fibrinogenului constituie un indice de alterare difuză a ficatului.

Testele de disproteinemie, utilizate pe scară foarte largă, nu pot fi considerate specifice, ele fiind pozitive în diferite alte stări sau afecţiuni în care apar modificări în compoziţia cantitativă şi calitativă a proteinelor (afecţiuni renale, procese inflamatorii, infecţii, cancere). Explorarea ficatului în metabolismul lipidic: dozarea colesterolului total şi a colesterolului esterificat este foarte folosită în explorarea funcţională a ficatului. Mai important este însă comportarea colesterolului esterificat. Raportul de colesterol esterificat/colesterol total este foarte scăzut în insuficienţa hepatică, fiind un test valoros de apreciere funcţională a ficatului.

1.5.1 Teste privind examenul bilei

Ficatul secretă bilă, care prin canalul coledoc ajunge în intestin. Canalul coledoc are o ramificaţie, canalul cistic care merge la vezica biliară. În perioadele dintre digestii, capătul dinspre intestin al canalului coledoc, unde se află sfincterul Oddi, este închis. Bila formată în ficat se scurge prin canalul cistic în vezicula biliară, unde o parte din apă se resoarbe, bila concentrându-se.

Bila este eliberată intermitent în duoden, în perioadele digestive, împreună cu sucul pancreatic.

Principalele componente ale bilei sunt: a) Sărurile biliare:

- acizi biliari primari, formaţi în hepatocit din colesterol; - acizi biliari secundari, formaţi în tractul intestinal, din acizii biliari primari.


b. Pigmenţii biliari: - bilirubină indirectă; - bilirubină directă; - biliverdina; - urobilinogenul.

Datorită reasorbţiei apei şi a sărurilor anorganice, bila veziculară este de câteva ori mai concentrată în substanţe organice solide decât bila hepatică.

Culoarea bilei este galben aurie, când provine direct din ficat, şi verzuie brună când provine din vezicula biliară. Bila veziculară este de culoare închisă datorită biliverdinei rezultată din oxidarea bilirubinei şi are un conţinut vâscos datorită prezenţei mucinei secretată de mucoasa veziculei biliare.

Bila are rol important în motricitatea intestinală (favorizează peristaltismul intestinal) precum şi în digestia şi absorbţia lipidelor, activităţi asigurate de sărurile biliare prezente în bilă. Sărurile biliare sunt substanţe dotate cu proprietăţi tensioactive şi în acest mod emulsionează lipidele, mărind în acest fel suprafaţa de contact a acestora cu lipaza pancreatică şi favorizând în acest fel digestia lor. Tot ele ajută la absorbţia compuşilor lipidici rezultaţi din digestie formându-se chilomicroni care se absorb. Sărurile biliare sunt eliminate şi revin în intestin pentru a relua ciclul. Bila are rol în activarea lipazei pancreatice şi stimularea peristaltismului intestinal. Bila neutralizează chimul gastric acid trecut în duoden, asigurând un pH favorabil acţiunii enzimelor pancreatice. Permite eliminarea unor produşi de degradare: pigmenţi biliari, excesul de colesterol, medicamente etc.

A. Examenul chimic al bilei

Materiale necesare: acid acetic 10%, bilă, apă distilată, zaharoză sol. 20%, acid sulfuric, floare de sulf, ulei vegetal.

Metode de lucru şi interpretare

Evidenţierea mucinei

Într-o eprubetă se introduc 2 ml de bilă şi câteva picături de acid acetic 10%. Se observă apariţia unui precipitat filamentos de mucină.

Evidenţierea sărurilor biliare

1. Reacţia Pettenkoffer În bilă se găsesc acizii glicolitic şi taurocolitic sub formă de săruri de

sodiu, mai rar de potasiu. Se prelevează într-o eprubetă 2.5 ml bilă veziculară de bou, se diluează cu 2.5 ml H2O distilată, se adaugă 1 – 2 ml soluţie de zaharoză 20%, apoi se toarnă cu grijă, ţinând eprubeta înclinată, 4 ml H2SO4 concentrat,


astfel încât acidul nu se va amesteca cu bila. La limita de separare dintre H2SO4 şi

bilă, apare un inel colorat intens în roşu – rubiniu. Acidul colic provenit din hidroliza acizilor biliari, reacţionează cu furfurolul provenit din soluţia de zaharoză tratată cu H2SO4 determinând o coloraţie roşie.

Figura 1-13 Reacţia Pettenkoffer

2. Reacţia Hay

Acizii biliari au proprietatea de a reduce tensiunea superficială a lichidelor în care sunt dizolvaţi.

Se prepară proba martor dintr-un pahar cu apă fără bilă, în care se adaugă floare de sulf, observând că aceasta se menţine la suprafaţa apei. Într-un pahar ce conţine apă, se toarnă câteva picături de bilă şi se agită. Se adaugă floare de sulf şi se constată că aceasta cade şi se acumulează la fundul paharului, cu atât mai repede cu cât lichidul conţine mai multă bilă. Se repetă reacţia cu 1, 10, 30 picături de bilă. Reacţia este foarte sensibilă şi este pozitivă în prezenţa unor cantităţi foarte mici de bilă, fiind folosită în clinică pentru a pune în evidenţă urmele de săruri biliare din urină.

Figura 1-14 Reacţia Hay A- proba martor, B-reacţia Hay

1-probă în care s-a introdus o picătură de bilă, 2- probă în care s-au introdus 10 picături de bilă, 3- probă în care s-au introdus 30 picături de bilă.


3. Emulsionarea grăsimilor Bila nu conţine enzime digestive, dar intervine, prin intermediul sărurilor

biliare, în digestia şi absorbţia grăsimilor. Sărurile biliare fiind substanţe puternic tensioactive, emulsionează gliceridele mărind suprafaţa de contact dintre substrat şi lipaza pancreatică, pe care o activează. Lipidele alimentare nehidrolizate şi produşii de hidroliză insolubili sau parţial solubili, împreună cu acizii biliari, formează o fază solubilă în apă, constituită din micelii mixte (agregate micelare), în care acizii biliari au un rol stabilizator esenţial.

Într-o eprubetă se pun 5 ml bilă, 0.5 ml ulei vegetal, 1 ml apă şi se agită, obţinându-se o emulsie stabilă.

Se fac două filtre şi se pun în pâlnii de sticlă cu diametrul de 1.5–2 cm. Unul din filtre se udă cu bilă, celălalt cu apă, iar apoi se toarnă puţin ulei vegetal. Prin filtrul udat cu bilă, grăsimea filtrează destul de repede, prin cel udat cu apă nu trece aproape deloc.

B. Evidenţierea pigmenţilor biliari Culoarea bilei este dată de pigmenţii biliari. Bilirubina este pigmentul cel

mai important în bila omului şi a carnivorelor; biliverdina este un derivat de oxidare al bilirubinei fiind pigmentul principal în bila păsărilor. În prezenţa HNO3 bilirubina se oxidează în biliverdină.

Materiale necesare: bilă, acid azotic fumans (HNO3), albastru de

metilen, cloroform, acid sulfuric concentrat. Metode de lucru şi interpretare

1. Reacţia Gmelin

Figura 1-15 Reacţia Gmelin

Într-o eprubetă se pun 4 ml bilă diluată 1:5. Cu o pipetă fină se introduc în fundul eprubetei 2 ml HNO3 fumans (conţinând vapori nitroşi). La limita de separaţie a celor două lichide vor apărea o serie de inele colorate suprapuse, galben – roşu la contactul cu acidul, apoi violet, albastru, verde, care corespund produşilor intermediari de oxidare ai bilirubinei (biliceanină, bilifuxină, biliverdină). Biliverdina este ultimul produs de oxidare al bilirubinei; după câtva timp, întregul conţinut al eprubetei se va colora în verde.


2. Reacţia Gmelin – Rosbach După filtrarea a 10 ml bilă diluată 1:5, se desface hârtia de filtru, se

aşează peste o altă hârtie de filtru uscată, iar în mijlocul ei se pune o picătură de HNO3 fumans. Se formează o serie de inele colorate, concentrice: galben, galben – roşiatic, violet şi albastru – verde (din centru spre periferie).

Figura 1-16 Reacţia Gmelin – Rosbach

3. Reacţia Trousseau

Într-o eprubetă se introduc 3 ml de bilă peste care se adaugă 3 picături de albastru de metilen. Se observă apariţia unei coloraţii verzui, caracteristică biliverdinei. Dacă în bila recoltată nu avem pigmenţi biliari, culoarea soluţiei finale va fi albastră.

Figura 1-17 Reacţia Trousseau

4. Reacţia Salcowscki Se introduc într-o eprubetă 4 ml de cloroform şi 3 ml de bilă. Se agită

conţinutul şi se lasă în repaus 5 minute observându-se separarea în două straturi:


- un strat inferior de colesterol care conţine colesterolul solvit; - un strat superior de bilă.

Se prelinge pe peretele eprubetei 1ml de acid sulfuric concentrat şi se observă formarea unui inel roşu la limita de separare a celor două straturi.

Figura 1-18 Reacţia Salcowscki

1.6 Teste privind explorarea funcţională a pancreasului Pancreasul este o glandă anexă a tubului digestiv, structura acestuia fiind

asemănătoare cu cea a glandelor salivare, fiind formată din celule acinoase şi de un sistem canalicular care se termină ântr-un canal principal Wirsung şi unul accesoriu Santorini. Canalul Wirsung se varsă în duoden la nivelul ampulei Vater, în vecinătatea canalului coledoc. Secreţia endocrină este realizată de insulele Langerhans, ce secretă hormoni cu rol esenţial în reglarea metabolismului: insulina, glucagon şi somatostatină. Sucul pancreatic este produsul de secreţie al glandelor tubuloacinare. Secreţia este discontinuă. Caracteristicile sucului pancreatic Aspect: lichid limpede sau uşor opalescent, inodor, vâscozitate redusă. Densitate:1.008 – 1.014 g/cm3 Punct crioscopic: de la -0.55°C la -0.630 C pH: 7.5 - 8.

Sucul pancreatic conţine 99% apă, 0,5% substanţe minerale şi substanţe organice 0,5%. Dintre substanţele organice cele mai importante sunt enzimele glicolitice, lipolitice şi proteolitice. Acţiunea enzimatică a sucului se manifestă asupra tuturor principiilor alimentare (glucide, lipide şi protide).

Sucul pancreatic conţine enzime a căror acţiune se exercită asupra proteinelor, lipidelor şi glucidelor alimentare. Enzimele pancreatice sunt secretate


sub formă de proenzime ce devin active numai în lumenul intestinal în prezenţa enterokinazei. enzimele glicolitice: amilaza pancreatică descompune amidonul care a scăpat amilazei salivare, chiar şi amidonul crud din cartofi, până la maltoză, iar maltaza pancreatică descompune maltoza în glucoză. enzimele lipolitice: - lipaza pancreatică şi steapsina, care sub influenţa sărurilor biliare devine tot o lipază, hidrolizează grăsimile emulsionate în prealabil de către sărurile biliare, scindându-le în glicerol şi acizi graşi. Dacă lipaza pancreatică lipseşte, grăsimile sunt eliminate nedigerate în fecale, apărând stiatoree. - colesterolesterhidrolaza, acţionează în prezenţa sărurilor biliare scindând colesterolul alimentar esterificat în colesterol liber şi acid gras. - fosfataza A2, descompune fosfolipidele în acizi graşi şi lizofosfolipide. enzimele proteolitice: Tripsina este secretată sub formă inactivă de tripsinogen, iar chimotripsina sub formă de chimotripsinogen. Tripsinogenul se transformă în tripsina sub acţiunea enterochinazei intestinale şi a sărurilor de calciu, iar chimotripsinogenul devine chimotripsina sub acţiunea tripsinei.

Tripsina scindează nucleoprotidele în holoproteide şi acizi nucleici, holoproteidele în albumoze şi peptone, acestea în polipeptide cu catenă mai scurtă (di, tri şi tetrapeptide) şi, în cazul unei acţiuni prelungite, chiar în aminoacizi. - chimotripsina are o acţiune proteolitică similară tripsinei, dar are şi capacitatea de a coagula laptele ca şi chimozina gastrică şi este adaptată la degradarea cazeinei în polipeptide solubile. - carboxipeptidaza este o exopeptidază care scurtează polipeptidele cu un aminoacid, acţionând asupra polipeptidelor cu grupare carboxilică terminal. - elastaza este secretată sub formă de proelastază şi este activată de către tripsină şi enterokinază, hidrolizând în special legăturile peptidice ale aminoacizilor: alanina, serina, glicina. - ribonucleaza şi deoxiribonucleaza acţionează asupra acizilor ribonucleic şi dezoxiribonucleic, desfăcând legăturile este-fosfat, rezultând oligopeptide.

1.6.1 Demonstrarea rolului vegetativ al pancreasului

Lipaza pancreatică este o enzimă lipolitică, al cărei substrat specific este reprezentat de trigliceride, pe care le descompune în glicerol şi acizi graşi.

Temperatura optimă la care lipaza pancreatică îşi desfăşoară activitatea este de 37º-38ºC, iar pH-ul optim de acţiune este unul alcalin. Activitatea lipazei pancreatice este favorizată de bilă (produs de excreţie a ficatului) care, prin


capacităţile sale tensioactive, măreşte considerabil frontul de acţiune al acestei enzime, eficientizându-i activitatea.

Materiale necesare: pancreas proaspăt de porc, viţel sau oaie, instrumente de disecţie, mojar, ser fiziologic, glicerină, nisip spălat, alcool 30%, pahar Berzelius, soluţie de NaOH diluat, soluţie de NaHCO3 0,5%, hârtie de turnesol, eprubete, pâlnie şi tifon, clei de amidon, unt proaspăt.

Metodă de lucru şi interpretare a. Pregătirea extractului de pancreas Pancreasul proaspăt se curăţă de grăsime şi ţesut conjunctiv şi se taie în

bucăţi mici, care apoi se mojarează cu nisip sau sticlă pisată. Pasta obţinută se pune într-un pahar Erlenmeyer de 500 ml şi se adaugă 150 ml alcool 30%. Se lasă să se macereze la temperatură scăzută 24 ore, agitând din când în când. Se filtrează apoi prin tifon şi se obţine un lichid tulbure, puţin roşu (au fost strivite eritrocitele din organ), cu reacţie acidă (datorită hidrolizei şi autolizei parţiale a ţesutului). Se neutralizează mai întâi cu soluţie de NaOH diluat, apoi se adaugă soluţie de NaHCO3 0,5%. Extractul conţine enzime pancreatice: amilază, lipază, tripsinogen, chemotripsină, cu rol amilolitic, proteolitic şi lipolitic.

Un procedeu mai simplu este următorul: peste pasta mojarată se adaugă puţin câte puţin ser fiziologic sau glicerină. Se amestecă bine şi se lasă în contact 1-2 ore. Apoi se filtreză prin tifon. Se obţine extractul activ, tulbure, cu aspect lăptos.

b. Acţiunea extractului pancreatic asupra albuminei se poate pune în evidenţă prin experieţe similare cu cele efectuate pentru acţiunea amilazei salivare, utilizând în loc de salivă, soluţie de extract pancreatic.

c. Acţiunea extractului pancreatic asupra amidonului Extractul pancreatic conţine enzime proteolitice, elaborate sub formă

inactivă, de exemplu tripsinogenul. Acesta se transformă în produs activ-tripsina în contact cu enterochinaza (coenzimă), secretată de mucoasa duodenală. De aceea pentru a cerceta acţiunea proteolitică a extractului pancreatic este necesar să se adauge şi extract de mucoasă intestinală care se obţine în acelaşi mod. În amestecul de extract pancreatic şi intestinal se introduc cuburi de albuş de ou fiert şi se ţin în etuvă la 380C. Se constată după un timp că proteinele sunt degradate chiar dacă ele nu au fost în prealabil peptonizate. Aceasta dovedeşte existenţa în sucul pancreatic al enzimelor proteolitice cu capacitatea de a acţiona asupra proteinelor netransformate în prealabil.

d. Acţiunea extractului pancreatic asupra grăsimilor Sucul pancreatic are o reacţie alcalină datorită bicarbonatului de sodiu

(NaHCO3). Din cauza alcalinităţii şi a săpunurilor ce se formează, sucul


pancreatic are rol în emulsionarea permanentă a grăsimilor. Aceasta se poate demonstra prin următoarele experienţe:

1. Într-o eprubetă se pipetează 3 ml extract pancreatic alcalinizat cu NaHCO3, se adaugă 1ml ulei vegetal şi se agită bine. Se obţine o emulsie permanentă care se datorează formării de săpunuri ce scad tensiunea superficială a apei.

2. Sucul pancreatic conţine şi o lipază puternică, care catalizează hidroliza grăsimilor. Extractului de pancreas i se adaugă câteva picături de fenolftaleină. Se alcalinizează cu o soluţie de NaHCO3 0.4%. Se adaugă puţin unt proaspăt, bine spălat, având reacţie neutră, sau o emulsie fină, obţinută prin agitarea în eprubetă a unei mici cantităţi de ulei în apă. Se lasă la cald (370C), timp de 1-2 ore. Se constată că treptat se decolorează, din cauză că prin scindarea grăsimilor se produc acizi, care intră în reacţie cu bicarbonatul alcalin formând săpunuri neutre.

Pancreasul elaborează enzime care catalizează hidroliza glucidelor, proteinelor, lipidelor. Amilaza pancreatică transformă amidonul în maltoză, complexul triptic transformă proteinele până la tri- şi dipeptide, aminoacizi, lipaza transformă grăsimile în acizi graşi şi glicerină. Mediul alcalin şi temperatura între 37-400C sunt indispensabile pentru activitatea acestor enzime.

35

Capitolul II

FIZIOLOGIA SISTEMULUI SANGVIN

37

Capitolul II Fiziologia sistemului sangvin

Cuprins

2.1 Metode şi tehnici de recoltare a sângelui 2.1.1 Recoltarea sângelui venos 2.1.2 Tehnica recoltării probelor de sânge la animale 2.1.3 Recoltarea sângelui capilar 2.1.4 Aditivii folosiţi la recoltarea probelor de sânge 2.1.5 Obţinerea serului şi a plasmei sangvine 2.2 Teste de laborator pentru evidenţierea proprietăţilor fizice şi chimice ale componentelor sangvine 2.2.1 Timpul de coagulare. Reacţia cheagului (RC) 2.2.2. Determinarea hemoleucogramei cu ajutorul analizorului de hematologie automat 2.2.3 Realizarea frotiului de sânge 2.2.4 Tehnici de colorare a frotiului de sânge 2.2.5 Morfologia eritrocitelor 2.2.6 Morfologia leucocitelor 2.2.7 Medulograma 2.2.8 Formula leucocitară 2.3. Metode de laborator clasice (manuale) pentru examinarea sângelui 2.3.1 Determinarea numărului de eritrocite 2.3.2 Determinarea numărului de leucocite 2.3.3 Determinarea numărului de reticulocite 2.3.4 Determinarea vitezei de sedimentare a hematiilor (VSH) prin metoda Westergreen 2.3.5 Determinarea rezistenţei osmotice a eritrocitelor 2.3.6 Determinarea hematocritului 2.3.7 Dozarea hemoglobinei 2.3.8 Explorarea hemostazei 2.3.9 Determinarea grupelor sangvine 2.4 Determinări biochimice sangvine 2.4.1 Spectrofotometria 2.4.2 Analiza biochimică a proteinelor plasmatice 2.4.3 Determinări biochimice ale lipidelor plasmatice 2.4.4 Analiza biochimică a glucidelor plasmatice 2.4.5 Analiza biochimică a enzimelor plasmatice 2.4.6 Determinări biochimice ale compuşilor azotaţi neproteici plasmatici 2.4.7 Determinări biochimice a compuşilor minerali plasmatici

Capitolul II Fiziologia sistemului sangvin 39

2. Fiziologia sistemului sangvin

2.1 Metode şi tehnici de recoltare a sângelui 2.1.1 Recoltarea sângelui venos

Pentru determinările hematologice la animale, sângele se poate recolta în mod clasic, cu ajutorul unei seringi, sau în sistem vacutainer sau venoject.

Sistemul vacutainer este format din: ac de puncţie, holder, tuburi vidate.

Figura 2-1 Sistemul holder-vacutainer 1-acul de puncţie; 2-holder; 3-vacuntainer

Acul de puncţie este alcătuit din:

-vârf care pătrunde în venă; -inelul de prindere care prezintă o zonă filetantă cu ajutorul căreia se înşurubează în holder; Materialele necesare: tampoane sterile, alcool, garou, sistem holder-

vacuntainer. Metodă de lucru şi interpretare

Alegerea locului pentru puncţia venoasă: • se tunde zona de elecţie; • se pune garoul la aproximativ 10 cm deasupra puncţiei; • după ce s-a aspirat sângele, se desface garoul, se fixează pe locul puncţiei

un tampon îmbibat cu alcool, se trage acul din venă; • recipientele cu sânge şi anticoagulant se agită uşor prin rotire pe o

suprafaţă plană. Nu se agită prin răsturnare şi nici puternic. În momentul recoltării probei de sânge pot apare probleme cauzate de

poziţionarea incorectă a acului în venă. Acestea pot fi: - dacă vârful acului se sprijină pe peretele vasului sângele nu curge; - atunci când acul este introdus prea adânc se perforează vena şi sângele

nu curge; - acul introdus parţial în venă determină formarea de hematom.


După ce a avut loc repartizarea sângelui în recipientele care conţin anticoagulant, acestea se agită uşor prin rotire. Se evită agitarea prin răsturnare sau prin mişcări bruşte.

Trebuie avut în vedere că staza venoasă prelungită ce depăşeşte 10 minute poate determina o creştere falsă a proteinelor totale cu până la 20%. Se recomandă ca durata de menţinere a garoului pentru stază să nu depăşească 2 minute.

Ingestia de alimente înainte de recoltare determină o creştere a nivelului glucozei, fosforului şi bilirubinei, potasiului şi ALT şi o creştere uşoară a acidului uric, proteinelor, calciului, colesterolului. De asemenea conţinutul în grăsimi al raţiei determină nivelul trigliceridelor.

Dacă proba nu este lucrată imediat după recoltare, ea trebuie refrigerată. Proba este stabilă la 18-26ºC timp de 36–48 ore sau la temperatura de refrigerare 2-8ºC. Se recomandă ca analizele să fie efectuate în primele 6 ore de la recoltare.

2.1.2 Tehnica recoltării probelor de sânge la animale

Locul de elecţie pentru recoltarea sângelui diferă în funcţie de specie. La bovine şi cabaline sângele se prelevează de obicei din vena jugulară.

La bovine se mai poate utiliza puncţia venei auriculare mari, mamare şi a venelor coccigiene. La bovine, se tunde locul de elecţie, se dezinfectează, se face staza venoasă prin compresiune cu policele mâinii stângi. Se introduce acul neadaptat la seringă, prin mişcare bruscă, perpendicular pe venă, după care acesta se dirijează pe lumenul venei. Se adaptează capătul liber al acului la seringă şi se aspiră cantitatea de sânge necesară.

Figura 2-2 Recoltarea probei de sânge din vena jugulară şi mamară la vacă


Tabelul 2-1 Locul de elecţie pentru recoltarea sângelui la animale

Specia Locul de elecţie Cal Vena jugulară Vacă Oaie Capră

Vena jugulară

Porc Confluentul jugular, vena cavă anterioară, vena auriculară Câine Vena safenă externă, vena cefalică antebrahială Iepure Vena safenă externă, vena auriculară Cobai Sinusul venos al ochiului Pasăre Vena axilară, vena ulnară Peşti Vena codală, vena brahială sau cord La ovine şi caprine se face puncţia venelor jugulare sau safenelor externe. La hamsteri se foloseşte puncţia cordului, secţionarea vârfului cozii sau

sinusul orbital.

Figura 2-3 Recoltarea probei de sânge din vena safenă la iepure

Figura 2-4 Recoltarea probei de sânge din vena auriculară la iepure


La peşti, recoltarea sângelui se poate efectua prin patru procedee: din aorta dorsală, prin puncţie cardiacă, din vena caudală sau prin secţionarea înotătorii caudale. Pentru salmonide se preferă recoltarea din vena caudală.

Vena caudală: proba se recoltează imediat posterior înotătorii anale. Se introduce acul în musculatură perpendicular pe suprafaţa ventrală a peştelui, până se ajunge la coloana vertebrală sau până când sângele apare în seringă. Dacă se atinge coloana, retrageţi acul încet. Vena se află ventral faţă de coloană. Vasul de sânge poate fi abordat şi lateral.

Figura 2-5 Recoltarea sângelui din vena caudală Aorta dorsală: introduceţi acul la un unghi de 30-40° pe linia de mijloc a

planşeului bucal, în dreptul celui de-al 3-lea sau al 4-lea arc branhial. În funcţie de dimensiunea peştelui, puncţia se poate face şi la nivelul arcurilor 1-2 branhiale. Ulterior, este posibil ca peştii să prezinte hemoragii bucale. Este un loc de elecţie pentru cateterizare.

Puncţia cardiacă: sângele se colectează din ventricul. Acul se introduce perpendicular pe suprafaţa peştelui, la mijlocul unei linii imaginare ce uneşte părţile anterioare ale bazelor şi înotătoarelor pectorale.

Secţionare caudală: se şterge pedunculul caudal. Coada se secţionează complet posterior orificiului anal. Primele picături de sânge sunt lăsate să curgă, apoi se colectează în tuburi pentru microhematocrit. Dupa colectarea probei, peştele se eutanasiază în containerul cu anestezic.

2.1.3 Recoltarea sângelui capilar

Recoltarea sângelui capilar, este o metodă recomandată în cazul tineretului şi pentru efectuarea frotiului de sânge. Astfel se obţine un amestec de sânge provenit din arteriole, venule şi capilare amestecat cu lichid interstiţial şi intracelular.


Compoziţia relativă a sângelui depinde de fluxul sangvin existent în patul vascular cutanat în momentul recoltării. Încălzirea locului de puncţionare înaintea recoltării facilitează arteriolizarea sângelui din teritoriul cutanat respectiv.

Materialele necesare: tampoane sterile, alcool, ace sterile. Metodă de lucru şi interpretare Se dezinfectează locul puncţionării cu un tampon steril îmbibat în soluţie

de alcool şi se aşteptă să se usuce zona înainte de a efectua incizia. Se evită folosirea altor dezinfectanţi deorece aceştia pot induce valori fals

crescute pentru acidul uric, fosfor sau potasiu. Prindeţi ferm zona adiacentă locului puncţionării şi se efectuează incizia rapid cu ajutorul unui ac steril. Prin mişcări de apăsare uşoară, fără a masa zona din jur, se colecteză picături de sânge care curg liber într-un vacuntainer etichetat. În cazul recipienţilor cu anticoagulant trebuie efectuate mişcări uşoare de inversiune a tubului pentru a amesteca sângele recoltat cu anticoagulant.

La sfârşitul recoltării se aplică un tampon steril compresiv care va fi menţinut până la oprirea sângerării.

2.1.4 Aditivii folosiţi la recoltarea probelor de sânge

Pentru a împiedica coagularea sângelui recoltat, acesta trebuie omogenizat imediat după recoltare cu substanţe anticoagulante. Sângele astfel recoltat poartă denumirea de sânge integral, deoarece păstrează toate elementele componente, inclusiv substanţele care se consumă în timpul coagulării.

Prin centrifugare sângele integral se separă în două componente: o componentă lichidă numită plasmă; o componentă solidă alcătuită din elementele celulare sangvine.

Aditivii de recoltare pentru teste biochimice din plasmă

sau din sânge integral Recoltarea pentru examenele biochimice se face folosind heparina ca

substrat anticoagulant. Heparina împiedică sângele să coaguleze prin inactivarea protrombinei. În mod uzual se utilizează 0,1-0,2 mg heparină la 1ml sânge.

Determinarea concentraţiei de glucoză în sângele integral se face pe sânge venos recoltat cu fluorură de sodiu. Se utilizează 2 mg fluorură de sodiu pentru 1 ml de sânge.

Aditivii de recoltare pentru examene hematologice Aditivii folosiţi la recoltarea probelor de sânge trebuie aleşi astfel încât

aceştia să nu modifice morfologia şi structura celulelor din sânge.


Se pot folosi: - sarea de sodiu a acidului etilendiaminotetraacetit (Na2 – EDTA); - sarea de potasiu a acidului etilendiaminotetraacetit (K2-EDTA). Moleculele de EDTA sodic sau potasic au proprietatea de a extrage

calciul din plasmă şi de a-l fixa pe molecule. În lipsa calciului, procesul de coagulare nu mai poate avea loc. Se utilizează 1-2 mg EDTA pentru 1 ml sânge. Pentru determinarea VSH-ului se foloseşte un anticoagulant special numit citrat trisodic soluţie apoasă 3.8%, care are rolul de a fixa calciul din sânge împiedicând coagularea. Concentraţia recomandată este de 0.4ml citrat 3.8% pentru 1.6 ml de sânge.

Aditivii de recoltare pentru testele de coagulare Testele de coagulare se lucrează pe sângele integral. Se foloseşte ca

anticoagulant amestecul de oxalat de sodiu şi oxalat de amoniu numit amestec Wintrobe. Amestecul Wintrobe conţine:

oxalat de potasiu 10.8 g; oxalat de amoniu 1.2 g; apă distilată ad. la 100 ml.

Se utilizează 1ml amestec oxalat pentru 9 ml sânge. Pentru testele de hemostază se poate folosi ca anticoagulant citratul de sodiu 3.8% sau oxalatul de sodiu 1.34%.

Codurile de culoare pentru substanţele anticoagulante sunt descrise în ISO/DIS 6710 (tab. 2-2): 1. Capac mov/roz - foloseşte ca anticoagulant EDTA-ul şi are utilitate în hematologie, biologie moleculară, unele teste imunochimice (ex. ACTH). 2. Capac bleu/verde - conţine Citrat 9+1 şi se foloseşte pentru analiza coagulării. 3. Capac negru/mov - conţine Citrat 4+1 şi se foloseşte pentru VSH. 4. Capac verde/portocaliu - conţine Heparinat şi se utilizează plasma pentru testele de chimie. 5. Capac roşu/incolor - este un tub fără anticoagulant. Serul este folosit pentru testele de chimie, imunologie şi serologie.

Tabelul 2-2 Codificarea vacutainerelor în funcţie de culoarea capacului

Tipul substanţei anticoagulante Codul de culoare Teste utilizate

EDTA Capac mov/roz Hematologie, biologie moleculară unele teste imunochimice

Citrat 9+1 Capac albastru/verde CoagulareCitrat 4+1 Capac negru VSHHeparinat Capac verde/portocaliu Plasmă pentru testele chimice Tub fără anticoagulant Capac roşu/incolor Ser pentru testele de chimie,

imunologie şi serologie


2.1.5 Obţinerea serului şi a plasmei sangvine

Sângele conţine 60% plasmă şi 40% celule sangvine. Celulele sangvine sunt suspendate în plasmă care este formată din apă şi diverşi constituienţi dizolvaţi: hormoni, anticorpi, enzime, substanţe anorganice şi organice.

Prin centrifugare se poate separa atât plasma cât şi serul. Diferenţa dintre acestea constă în faptul că plasma conţine fibrinogen.

După ce are loc recoltarea sângelui într-un vacutainer fără anticoagulant, este lăsat să se coaguleze, după care va fi centrifugat, având loc separarea serului. În ser se găsesc două tipuri de proteine: albumine şi globuline.

Plasma este obţinută din sângele recoltat într-un tub cu anticoagulant şi apoi este supus centrifugării. Anticoagulantul inhibă formarea coagulului.

Plasma conţine trei tipuri de proteine: albumine; globuline; fibrinogen.

Serul sau plasma trebuiesc separate cât mai repede de celulele sangvine pentru a împiedica obţinerea unor rezultate eronate.

Figura 2-6 Obţinerea plasmei sangvine

A- sânge recoltat pe anticoagulant şi lăsat să sedimenteze. Plasma este

lichidul transparent şi uşor gălbui aflat deasupra sângelui

B- sânge proaspăt recoltat.

Pentru determinarea glucozei, fosforului şi potasiului se recomandă ca separarea să se realizeze mai repede de 3 ore de la recoltare. Este permis un timp de până la 6 ore pentru albumine, bicarbonat, clor, HDL colesterol, sideremie, platină

Probele de sânge integral nu se refrigerează. Un exemplu constă în refrigerarea probelor pentru determinarea potasiului deoarece temperatura scăzută inhibă glucoza şi favorizează eliberarea potasiului din celule, obţinându-se rezultate fals crescute.

Centrifugarea probelor în vederea obţinerii serului trebuie efectuată numai după ce se constată că sângele a coagulat complet. Centrifugarea se efectuează la 3000 turaţii, timp de 5 minute.


2.1.6 Condiţiile de conservare a probelor recoltate

Stabilitatea componentelor sangvine variază foarte mult, motiv pentru care parametrii de conservare variază.

Probele de sânge total recoltat pe heparină se păstrează la 4°C, iar dozările trebuie făcute în mai puţin de 4 ore de la recoltare.

Conservarea probelor la temperatura camerei determină perturbări în compoziţia electroliţilor, enzimelor şi diferiţilor metaboliţi.

În cazul plasmei sau serului, determinările metaboliţilor şi enzimelor trebuie realizate, de asemenea, în decurs de 4 ore de la recoltare, în condiţiile păstrării la temperatura camerei. Dacă dozările enzimatice nu pot fi efectuate imediat, serul se congelează, enzimele fiind stabile 24 de ore. Congelarea serului stabilizează componentele până la 7 zile.

2.2 Teste de laborator pentru evidenţierea proprietăţilor fizice şi chimice ale componentelor sangvine

2.2.1 Timpul de coagulare. Reacţia cheagului (RC)

Reacţia cheagului apreciază activitatea plachetară din ultima fază a coagulării prin măsurarea acţiunii trombodinamice a F7p (trombostinină) asupra cheagului de fibrină dintr-o plasmă citrată cu număr standard de trombocite (100000/ µl). Se elimină astfel factorul de eroare legat de prezenţa trombocitelor.

Sângele se recoltează simultan în vacuntainer cu citrat de Na, 0.105 M şi în vacuntainer cu EDTA-K3.

Se centrifughează 5 minute la 1000 rotaţii/min vacutainerul de sânge recoltat pe citrat de Na, pentru a obţine o plasmă legată în trombocite.

Se centrifughează celălalt vacutainer recoltat pe citrat de Na, 10 min la 5000 rotaţii/minut pentru a obţine o plasmă săracă în trombocite.

Se amestecă cele 2 plasme pentru a obţine o plasmă cu circa 100 000 trombocite /µl.

Valori scăzute se vor întâlni în tuburile de hemostază datorate deficienţei funcţiei trombodinamice plachetare, fie prin deficit numeric, fie calitativ.

2.2.2. Determinarea hemoleucogramei cu ajutorul analizorului de hematologie automat

Hemograma este un test screening de bază, fiind primul pas în stabilirea statusului hematologic şi diagnosticul diverselor afecţiuni hematologice şi nehematologice. Cuantificarea parametrilor hematologici asociată uneori cu examinarea frotiului de sânge aduce informaţii preţioase, orientând în continuare spre efectuarea altor teste specifice.


Hemoleucograma completă constă din măsurarea următorilor parametri: • numărul de leucocite; • numărul de eritrocite; • concentraţia de hemoglobină; • hematocritul; • indici eritrocitari: VEM (vol. eritrocitor mediu), HEM (hemoglobina

eritrocitară medie), CHEM (concentraţia medie de hemoglobină) RSW (lărgimea distribuţiei eritrocitară);

• numărul trombocitelor şi indici trombocitori: VTM (vol. trombocitor mediu) PSW (lărgimea distribuţiei trombocitore);

• formulă leucocitoră; • +/- numărul reticulocitelor;

Analizorul automat funcţionează pe principiul citometriei în flux cu fluorescenţă, utilizând laser semiconductor şi focusare hidrodinamică.

Figura 2-7 Analizor hematologic automat

Determinarea numărului de eritrocite: reprezintă testul de bază pentru

analiza eritopoiezei. În combinaţii cu Ht şi concentraţia de hemoglobină, numărul de eritrocite este util în detectarea şi monitorizarea anemiei şi eritrocitozei/policitemiei.

Eritrocitele sunt numărate de analizatorul automat în timpul trecerii acestora printr-un orificiu prin care sunt dirijate într-un singur rând prin metoda de focusare hidrodinamică.

Numărul de eritrocite, ca parametru singular, are valoare diagnostică mică. O evaluare corectă a masei de eritrocite a organismului, poate fi obţinută doar în corelaţie cu hematocritul. Numărul de eritrocite este influenţat de modificarea volumului plasmatic (gestaţie, tulburări ale echilibrului).


Scăderea numărului de eritrocite determină anemie. Anemia este definită, funcţional, printr-o masă eritrocitară insuficientă pentru asigurarea unei cantităţi adecvate de oxigen ţesuturilor periferice. În practică, se consideră anemie atunci când concentraţia de hemoglobină, hematocrit şi/sau numărul de eritrocite sunt sub valorile de referinţă.

Diagnosticul este dificil doar dacă unul din parametri este sub valorile limită; în acest caz hemograma trebuie monitorizată în continuare.

În anemia acută datorită hemoragiei, numărul de eritrocite şi concentraţii de hemoglobină rămân nemodificate în primele ore datorită pierderii concomitente de plasmă, ele încep să scadă pe măsură ce se produce corecţia deficitului volemic.

În anemiile cronice volumul sangvin este aproape normal prin creşterea compensatorie a volumului plasmatic, iar numărul de eritrocite şi hematocritul sunt scăzute. În condiţiile asociate cu microcitoză marcată (anemie feriprivă severă, talasemie) numărul de eritrocite poate rămâne în limite normale sau poate fi chiar crescut.

Anemia relativă este caracterizată prin masă normală de eritrocite, dar cu volum sangvin crescut prin creşterea volumului plasmatic (gestaţie, splenomegalie). În această situaţie proteinele totale plasmatice sunt la limita inferioară a normalului, spre deosebire de anemia cronică în care proteinele totale sunt la limite normale.

Pentru a identifica cauza anemiei se fac teste cheie de laborator: determinarea numărului de reticulocite; indicatorii eritrocitari; examenul frotiului de sânge; examenul medulogramei.

Prezenţa altor anomalii hematologice (trombocitopenie, anomalii ale leucocitelor) orientează diagnosticul spre o posibilă insuficienţă medulară datorată anemiei aplastice, unei boli hematologice maligne sau dislocării măduvei osoase prin procese patologice de cauză extrahematologică. Pancitopenia poate apărea şi ca urmare a disfuncţiei periferice sau sechestrării celulelor prin hipersplenism.

Creşterea numărului de eritrocite (concentraţia de Hb şi/sau Ht) determină eritrocitoză. Eritrocitoza poate fi rezultatul creşterii masei eritrocitare totale (policitemie/eritrocitoză absolută) ori poate fi consecinţa reducerii volumului plasmatic (eritrocitoză falsă).

Recoltarea sângelui în poziţie de decubit lateral determină scăderea numărul de eritrocite (Ht) cu 5–10% datorită redistribuirii lichidului din spaţiul interstiţial spre circulaţie, datorită modificării presiunii hidrostatice la nivelul membrelor inferioare.


Stresul poate determina creşterea numărului de eritrocite. Staza venoasă prelungită mai mult de două minute în timpul venopuncţiei

determină creşterea numărului de eritrocite cu aproximativ 10% şi creşterea semnificativă a Ht. Recoltarea după efort fizic intens determină creşterea numărului de eritrocite cu până la 10%, respectiv şi creşterea concentraţiei de Hb datorită hemoconcentraţiei.

Deshidratarea cu hemoconcentraţie consecutivă (şoc, arsuri severe, obstrucţie intestinală, vomă, diaree) poate masca prezenţa anemiei.

Administrarea masivă de lichide i.v. poate determina un nivel fals, scăzut, al numărului de eritrocite.

Macrotrombocitele (trombocitele mari) pot fi numărate ca eritrocite. Determinarea hematocritului (Ht) reprezintă raportul dintre volumul

ocupat de eritrocite şi volumul sangvin total. Este folosit în detectarea şi monitorizarea anemiei şi policitemiei.

Analizorul automat calculează Ht prin determinarea numărului de eritrocite/L sânge şi măsurarea amplitudinii impulsurilor în eritrocite prin metoda luminii dispersate.

Ht depinde de masa eritrocitară, volumul eritrocitar mediu şi volumul plasmatic. Atunci când hematiile nu suferă modificări de mărime, modificările Ht sunt direct proporţionale cu modificările eritrocitare. În anemia micro/macrocitară, hematocritul scade datorită faptului că acestea au volum mai mic, în timp ce numărul poate să fie normal.

Valorile hematocritului scad în anemie sau atunci când se înregistrează o creştere a volumului plasmatic. Se înregistrează o creştere a hematocritului în caz de eritrocitoză sau hemoconcentraţie (şoc, aport insuficient de lichide, poliurie).

Excesul de anticoagulant determină scăderea volumului eritrocitar şi în consecinţă scăderea hematocritului determinat manual. Trebuie avut în vedere la recoltarea de sânge arterial deoarece în sânge arterial hematocritul este de aproximativ cu 2% mai mare decât în sângele venos. În reticulocitoză, leucocitoză marcată, prezenţa de crioglobuline sau macrotrombocite, analizorul automat poate determina valori fals crescute ale Ht datorită faptului că volumele mai mari ale reticulocitelor şi leucocitelor intră în calculul Ht. Valori fals scăzute ale hematocritul pot apărea în cazuri de hemoliză in vitro, autoaglutinare, micocitoză.

Determinarea hemoglobinei reprezintă componentul principal al eritrocitelor (95% din proteinele citoplasmatice eritrocitare) şi serveşte ca vehicul pentru transportul oxigenul şi CO2. Hemoglobina este o proteină conjugată constând dintr-un tetramer format din două perechi de lanţuri polipeptidice (globine), fiecare dintre acestea fiind înconjurat cu un grup Hem, un complex al unui ion de Fe 2+ cu pigmentul roşu, porfirină, care conferă sângelui culoarea roşie. Fiecare gram de hemoglobină poate transporta 1.34 ml O2/100 ml sânge.


Hemoglobina serveşte ca tampon în lichidul extracelular. În ţesuturi, la pH scăzut, oxigenul se disociază de hemoglobină. Hemoglobina dezoxigenată se leagă de ionii de hidrogen; în eritrocite anhidroza carbonică converteşte CO2 în bicarbonat şi ioni de hidrogen. Pe măsură ce ionii de hidrogen se leagă de hemoglobină, ionii bicarbonat părăsesc celula. Pentru fiecare ion bicarbonat care părăseşte celula intră un ion de clor.

Formele de hemoglobină prezente în mod normal în circulaţie includ: deoxihemoglobină (HHB), oxihemoglobina (O2Hb), carboxihemoglobina (COHb) şi methemoglobina (HetHb), toate acestea fiind determinate împreună cu sângele total.

Determinarea Ht şi numărul de eritrocite se folosesc pentru detectarea şi monitorizarea anemiei şi policitemiei.

Hemoglobina se determină automat prin metoda fotometrică în urma conversiei în SLS-Hb cu ajutorul unui surfactant Sodium Lauryl Sulfate.

Numărul de eritrocite, hemoglobina şi hematocritul pot fi analizate aplicând “regula lui trei” dacă eritrocitele sunt normocitare/normocrome:

Hb= Nr. eritrocite x 3 Ht= Hb x 3

Dacă se observă o deviere de la această regulă va trebui verificată existenţa unor anomalii ale indicilor eritrocitari şi aspectul frotiului de sânge.

Valori scăzute ale hemoglobinei sub nivelul de referinţă indică prezenţa unei anemii. De asemenea în timpul gestaţiei concentraţia de hemoglobină scade cu 2-3 g/dl datorită unei creşteri disproporţionate a volumului plasmatic faţă de masa eritrocitară.

La nou născut masa eritrocitară este mai mare la naştere decât la adult şi scade continuu în prima săptămână de viaţă (anemie fiziologică).

Valori crescute ale hemoglobinei se întâlnesc în eritrocitoză/policitemie.

Determinarea indicilor eritrocitari. Constantele eritrocitare derivate sau indicii eritrocitari oferă relaţii asupra mărimii, formei şi încărcăturii cu hemoglobina a hematiilor. Evaluarea eritrocitelor din punct de vedere al volumului şi conţinutului în hemoglobină se realizează prin măsurarea sau calcularea următorilor parametri:

VEM – reprezintă volumul ocupat de un singur eritrocit:

)μl(x10 Nr.Er.10 x Hct(%)6=VEM

- în cazul metodei automate, VEM este determinat prin împărţirea sumei volumelor eritrocitare la numărul de eritrocite;


- este exprimat în micrometri cubi sau femtolitri (fl); -este un indice util pentru clasificarea anemiilor şi poate sugera

mecanismul fiziopatologic al afectării eritrocitare. Împreună cu ceilalţi indici eritrocitari, poate permite detectarea precoce a unor procese care vor cauza anemii;

-VEM depinde de osmolaritatea plasmatică şi numărul diviziunilor eritrocitare.

HEM (hemoglobina eritrocitară medie) – măsoară conţinutul mediu de hemoglobină pe eritrocit şi este calculat de analizorul automat conform formulei:

)μl(x10 Nr.Er.10 x Hb(g/dl)

6=HEM

- este exprimat în picograme (pg/10-12g). În majoritatea anemiilor HEM se calculează cu VEM, astfel anemiile

microcitare sunt de obicei hipocrome iar cele normocitare sunt de obicei normocrome.

Atunci când valorile lui HEM sunt ridicate vom avea aproape întotdeauna VEM crescut, deoarece conţinutul eritrocitar normal de Hb este de aproximativ 95% din concentraţia de Hb maxim posibilă.

CHEM – concentraţia eritrocitară medie de Hb -măsoară concentraţia medie de Hb dintr-un volum dat de eritrocite (sau

raportul dintre masa de Hb şi volumul de eritrocite) şi este calculat de analizorul automat conform formulei

)(% HCT100 x Hb(g/dl)

=CHEM

- se exprimă în g/dl; - datorită comportamentului similar al volumului eritrocitar şi conţinutul

în Hb al fiecarui eritrocit în parte, CHEM rămâne constant în multe afecţiuni hematopoietice;

- CHEM scade – în anemiile hipocrome (anemie feriprivă). RDW (lărgimea distribuţiei eritrocitare) – este un indice eritrocitar care

cuantifică heterogenitatea volumului celular (gradului de anizocitoză). RDW este calculat de analizatorul automat în funcţie de prezenţa de

anomalii ale frecvenţei relative la anumite niveluri de discriminare, existenţa a două sau mai multe „peak”-uri şi lărgimea de distribuţie anormală. Distribuţia VEM într-o probă este prezentată sub forma unui grafic în care pe abcisă se proiectează volumul eritrocitar, iar pe ordonată frecvenţa relativă.

RDW(CV%) = Deviaţia standard a mărimii eritrocitelor x 100/VEM


RDW este util în caracterizarea iniţială a anemiilor, în particular a anemiei microcitare.

RDW creşte în anemie feriprivă, anemie megaloblastică, hemoglobinopatii (S, S-C, S-β-talasemia), anemia hemolitică imună, reticulocitoză marcată, prezenţa de fragmente eritrocitare, aglutinare, dimorfism eritrocitar.

Determinarea numărului de trombocite (numărul de plachete) Trombocitele sunt fragmente citoplasmatice anucleate bogate în granule,

cu diametrul de 2-4 µ. Trombopoieza are loc în măduva osoasă începând cu celula progenitoare multipotentă, continuă cu megacariocitopoieza care include proliferarea megakariocitară şi maturarea megacariocitelor cu formarea de trombocite. În mod normal, 2/3 din trombocite se găsesc în circulaţie, iar o treime sunt stocate în splină.

Trombocitele sunt implicate în hematopoieză şi în iniţierea proceselor de reparare tisulară şi vasoconstricţie după injuria vasculară şi în timpul proceselor inflamatorii când aderarea şi agregarea plachetară are ca rezultat formarea trombusului plachetar care astupă rupturile din pereţii vaselor mici.

Trombocitele sunt numărate la analizatorul automat prin aceeaşi metodă cu eritrocitele, în timpul direcţionării lor într-un singur rând printr-un orificiu, prin metoda de focusare hidrodinamică.

Volumul trombocitelor mediu (VTM) – indică uniformitatea de mărime a populaţiei trombocitare. Este util în diagnosticul diferenţial al trombocitopeniei.

Este calculat de analizorul automat după următoarea formulă:

x1000/µl)ite(x10Nr.tromboc

tocrit)(%)Pct(plache)/etocrit)(%Pct.(plachVTM(fl) 3=

VTM poate fi utilizat împreună cu PDW pentru distingerea condiţiilor asociate cu distrucţie plachetară crescută.

VTM este crescut în hipertiroidism şi în bolile mieloproliferative. În trombocitopoieza ineficientă asociată cu hematopoieza megaloblastică din deficitul de vitamina B12 şi/sau acid folic, trombocitele circulante sunt anormal de mari.

VTM variază invers proporţional cu numărul de trombocite, cu volume plachetare mai mari observate la pacienţii trombocitopenici la care trombocitele sunt scăzute datorită disfuncţiei periferice şi unui turn-over plachetar crescut.

Numărul de trombocite şi VTM sunt de obicei scăzute în condiţiile asociate cu alterarea producţiei de trombocite : hipoplozia.


Determinarea numărului de leucocite şi formula leucocitară Leucocitele se împart în două grupe principale: granulocite şi

agranulocite. Granulocitele sunt numite astfel datorită prezenţei în citoplasmă de granulaţii distincte şi se identifică 3 tipuri de granulocite în funcţie de afinităţile de colorare pe frotiul de sânge: neutrofile, eozinofile şi bazofile. De asemenea, aceste celule sunt denumite şi leucocite polimorfonucleare datorită nucleului multilobat.

Leucocitele sunt determinate de analizorul automat (după ce hematiile sunt lizate, iar leucocitele sunt colorate cu o substanţă fluorescentă cu afinitate pentru acizii nucleici) prin metoda de citometrie în flux cu fluorescenţa utilizând laser semiconductor.

Sunt efectuate 2 scatergrame bidimensionale. În scatergrama 4DIFF în care axa x reprezintă intensitatea luminii dispersate lateral iar axa y intensitatea fluorescenţei laterale, sunt proiectate cele 5 clase leucocitare şi grupul de umbre eritrocitare. În scatergrama WBC/BASO axa x reprezintă intensitatea luminii dispersate lateral, iar axa y intensitatea luminii dispersate frontal şi sunt proiectate 3 grupuri, respectiv grupul de umbre eritrocitare, grupul de bazofile şi grupul de alte leucocite.

Leucocitoza se datorează unei creşteri a numărului de neutrofile sau limfocite, mai rar celelalte clase de leucocite determinând creşterea numărului absolut de leucocite. O creştere proporţională a tuturor tipurilor de leucocite se datorează hemoconcentraţiei.

Infecţiile reprezintă cauza majoră de leucocitoză. O infecţie acută tipică se caracterizează printr-o fază neutrofilică, o fază reactivă monocitară şi o fază de recuperare limfocito-eozinofilică. Infecţiile virale nu urmează în mod normal acest curs. Gradul leucocitozei depinde de severitatea infecţiei, vârsta şi rezistenţa pacientului, precum şi de rezerva medulară.

Alte cauze: traumative, tumori, toxine, uremie, hemoliză acută, hemoragie acută.

Leucopenie: infecţii virale, infecţii bacteriene severe, hipersplinism, depresie medulară produsă de intoxicaţii cu metale grele, benzen, leucemie, anemie megaloblastică.

2.2.3 Realizarea frotiul de sânge

Frotiul este un preparat microscopic care se realizează prin etalarea sângelui integral necoagulat în monostrat pe lame portobiect. Tehnica frotiului este o metodă des utilizată în citologie, devenind prioritară atât în domeniul cercetării biologice cât şi ca procedeu de diagnostic în practica medicală.


Figura 2-8 Realizarea frotiului de sânge

Examenul morfologic al elementelor celulare sangvine se poate face pe:

A. Preparate proaspete necolorate: Pentru examinarea elementelor celulare sangvine pe preparate proaspete

necolorate, se recoltează cea de-a doua picătură de sânge apărută după puncţionare, pe partea centrală a lamei, degresată în prealabil, după care se acoperă cu o lamelă şi se examinează imediat la microscop.

La examenul microscopic hematiile apar colorate galben-verzui, leucocitele apar ca celule mari, mai rare şi mai strălucitoare. B. Preparate proaspete colorate

Tehnica de obţinere a acestor preparate este identică cu precedenta, dosebirea constă în adăugarea la marginea lamei a unei o picături de albastru de metilen care pătrunde prin capilaritate.

La examenul microscopic se observă colorarea nucleilor leucocitari şi unele granulaţii în albastru. C. Preparate permanente fixate şi colorate

Se prelevează o picătură de sânge cu marginea mică a unei lame rodate şi se aplică pe una din extremităţile unei lame portobiect, aşezată orizontal pe o suprafaţă plană. Se realizează câteva mişcări de lateralitate pentru ca sângele să se întindă pe toată linia de contact dintre cele două lame care prin alunecare uşoară întinde sângele pe toată lungimea orizontală. Preparatul trebuie să aibă marginile regulate şi să nu fie groasă şi întreruptă. Se recomandă ca unghiul realizat între cele două lame să fie de 30-35°.

Urmează fixarea frotiului care se poate face prin agitarea lamei pentru a se obţine o uscare rapidă sau cu alcool metilic timp de două minute sau alcool etilic şi eter în părţi egale timp de 5-15 minute.

2.2.4 Tehnici de colorare a frotiului de sânge

Frotiurile o dată confecţionate se vor colora cât mai curând posibil. A. Tehnica de colorare panoptică May-Grünwald Giemsa

Colorarea May-Grünwald Giemsa oferă detalii admirabile şi complete pentru studiile de hematologie, folosind eozina şi albastru de metilen.


Pe lamele aşezate cu frotiul în sus se etalează 10-15 picături din soluţia May-Grünwald pentru a acoperi toată suprafaţa frotiului. Se lasă 2-3 minute, timp în care se produce o fixare a frotiului. Alcoolul metilic din colorantul May-Grünwald acţionează ca un fixator.

Peste soluţia May-Grünwald se adaugă un număr de picături de apă bidistilată identic cu cel al colorantului. Se agită uşor pentru omogenizare. Se ţine un minut.

Se îndepărtează amestecul de colorant de pe lamă şi fără spălare, se acoperă lamele cu soluţia Giemsa diluată (15 picături soluţie Giemsa la 10 ml apă distilată) timp de 30-35 minute.

Se îndepărtează soluţia Giemsa şi apoi se spală preparatele sub jet de apă la robinet. Dosul lamei se şterge cu un tampon de tifon înmuiat în alcool metilic sau etilic.

Lamele corect colorate sunt uşor translucide şi de culoare roz, cu o foarte uşoară tentă violacee.

Pentru a se evidenţia morfologia trombocitelor frotiul de sânge se ţine la colorat cu soluţia Giemsa 45 de minute şi nu se spală sub jetul de apă, deoarece acesta antrenează trombocitele.

O coloraţie corect efectuată are un rol primordial pentru identificarea amănuntelor de structură celulară.

Figura 2-9 Baie de colorat frotiuri

La celulele tinere reţeaua de cromatină se colorează violet către roşcat,

nucleii capătă o coloraţie albastru ortocromatic, iar protoplasma se colorează în albastru ortocromatic.

În cazul celulelor adulte, mature, cromatina nucleară este mai densă, colorate metacromatic violet închis, nucleii dispar, apărând granulaţii funcţionale specifice.

Eritrocitele în urma coloraţiei May-Grünwald Giemsa apar la examenul microscopic de culoare cărămizie, deoarece sunt încărcate cu hemoglobină care are afinitate pentru eozină.


Granulocitele în funcţie de natura fiecăruia se colorează diferit. Granulele neutrofile deoarece fixează atât coloranţii bazici cât şi pe cei acizi apar coloraţi în brun. Granulele eozinofile fixează numai eozina şi apar colorate în portocaliu. Granulele bazofilelor fiind foarte acide se colorează în albastru închis până la negru. Monocitele şi plasmocitele au granulaţii care fixează numai azurul de metilen, colorându-se în roşu-purpuriu.

B. Metode de colorare a reticulocitelor Reticulocitele pot fi considerate celule roşii "imature". În circulaţie le

întâlnim aproximativ 1-2 zile înainte ca ele să se maturizeze şi să se transforme în hematii. Numărul de reticulocite din sângele circulant este un indicator cu privire la funcţia eritropoetică a măduvei hematogene.

Determinarea numărului de reticulocite presupune parcurgerea unor etape. Aceste etape sunt: executarea pe lamă a unui frotiu; colorarea acestuia cu brillant crezil-coloraţie supravitală; examenul la microscopul optic al aspectului morfologic al reticulocitului.

Aspectul este de eritroblast de nuanţă albăstruie; numărătoarea reticulocitelor de pe mai multe câmpuri microscopice; calculul proporţiei numărului de reticulocite la 100 sau la 1000 de

eritrocite. Coloraţia cu albastru de crezil presupune prepararea a doi reactivi: Reactivul I: - oxalat de sodiu 1 g; - ser fiziologic 100 ml; Reactivul II: - albastru de crezil 1 g; - ser fiziologic 100 ml.

Într-o eprubetă se introduc 12 picături din primul reactiv, 3 picături din reactivul al II-lea şi 3 picături de sânge. Amestecul se lasă în repaus 2 ore pentru a avea loc sedimentarea eritrocitelor. Se prelevează o picătură pe lamă exact ca la frotiul de sânge obişnuit şi se realizează frotiul.

Figura 2-10 Reticulocite din sânge periferic de iepure Col Albastru de crezil x 100


Se numără 100 sau 1000 de eritrocite, concomitent notând reticulocitele găsite în toate câmpurile microscopice examinate.

2.2.5 Morfologia eritrocitelor

Eritrocitul sau hematia este celula finală, complet matură a seriei roşii, cu un diametru cuprins între 3-8 microni la mamiferele domestice şi de 12 - 15 microni la păsări. Se colorează în cărămiziu din cauza încărcării cu hemoglobină, mai intens pe margine şi mai puţin în centru din cauza formei biconcave.

În primele zile ale dezvoltării embrionare, eritrocitele sunt produse în sacul vitelin, după care această funcţie este preluată de către ficat. Un număr semnificativ de eritrocite se formează şi în splină şi în ganglionii limfatici. În ultima perioadă a gestaţiei şi după naştere hematiile sunt produse în măduva osoasă. La vârsta adultă, măduva oaselor lungi se încarcă cu lipide şi îşi pierde această capacitate, exceptând regiunile proximale ale humerusului şi tibiei, cantitatea cea mai mare de celule roşii se formează în mod continuu în măduva oaselor cu osificare membranoasă (vertebrele, sternul, oasele iliace, coastele).

Figura 2-11 Aspectul eritrocitelor la iepure Col. May Grünwald-Giemsa x100

Celula roşie la iepure este similară în mărime şi formă cu eritrocitele

câinelui. Aceasta se prezintă ca un disc biconcav având un diametru mediu de 6.7 - 6.9 µm care apar pe frotiu izolate sub formă de rulouri scurte. La cal rulourile sunt lungi, fapt ce determină ca VSH-ul să fie foarte crescut în primele 10-15 minute. La celelalte animale, din cauza rulourilor scurte şi a celulelor izolate, VSH-ul este scăzut în primele 10-15 minute.

În literatură este citată o variaţie destul de cuprinzătoare a diametrului eritrocitelor la iepure cuprinsă între 5 - 8 µm. Această variaţie este reflectată microscopic de anizocitoza evidentă întâlnită în examenul frotiului de sânge de


iepure. Anizocitoza caracterizează o anemie regenerativă, fiind totodată un fenomen fiziologic normal la iepure.

Examinând frotiul de sânge vom întâlni în mod obişnuit la iepure, celule policromatice, schizocite, stomatocite, celule roşii nucleate (1 sau 2 raportate la 100 celule albe) precum şi corpusculi Howell – Jolly.

În urma examenului frotiului din sânge periferic la bovine se observă variaţia mărimii eritrocitelor între între 4-8µ. Spre deosebire de frotiul din sânge periferic de iepure, se observă că eritrocitele provenite de la bovine nu formează rulouri.

Figura 2-12 Aspectul eritrocitelor la bovine

Col. May Grünwald-Giemsa x100 Eritrocitele la mamifere sunt anucleate, sub formă de discuri biconcave. La

păsări, amfibieni şi peşti eritrocitele sunt ovalare, nucleate.

Figura 2-13 Eritrocit de peşte

Col. May Grünwald-Giemsa x100Figura 2-14 Eritrocit de curcă

Col. May Grünwald-Giemsa x100 În timpul examenului microscopic se măsoară diametrul eritrocitar în

micrometrul ocular. Eritrocitele care se încadrează în limitele fiziologice le încadrăm ca fiind normocitare.


Anomalii de mărime care se pot întâlni: macrocite, celule cu volum mare datorită unei activităţi eritropoietice

intense, se întâlnesc în insuficienţă hepatică; microcite, celule cu diametrul inferior celui normal, apar în anemia

feriprivă hipocromă şi în icter hemolitic; anizocitoză, eritrocite de mărimi diferite, se întâlnesc în afecţiuni cu

hematopoieza crescută (corectarea anemiilor hemolitice, posthemoragice, tratamentul eficient al anemiei feriprive şi anemiei pernicioase).

Curba Price Jones

Stabilirea mai exactă a variaţiilor diametrului eritrocitar se efectuează prin determinarea diametrului eritrocitar mediu şi realizarea curbei Price Jones sau curba de distribuţie a diametrelor eritrocitare medii.

Se măsoară pe frotiu, cu ajutorul micrometrului ocular diametrul a 250 – 500 de eritrocite.

Se grupează eritrocitele numărate pe diferite valori de diametru şi înscriind valorile într-un sistem de coordonate. Vârful curbei corespunde diametrului eritrocitar mediu, baza curbei corespunde gradului de variaţie a diametrului eritrocitar.

Figura 2-15 Curba Price Jones la bovine

Anomalii de formă care se pot întâlni la eritrocite: Sferocitoză – hematii de formă sferică cu diametru mic (icter hemolitic

congenital) Celule în ţintă, formă discoidală cu punct central, (splenectomie) Drepanocite, eritrocite falciforme (hemoglobinoza S) în formă de S Poikilocitoză, forme diferite de hematii: aspecte de pară, de rachetă de

tenis (anemia megaloblastică ) Corpi în semilună, resturi de eritrocite distruse (anemii hemolitice)


Figura 2-16 Diferite anomalii morfologice eritrocitare

Anomalii de culoare ale eritrocitelor:

Hipocromie, eritrocite palide, mai puţin colorate decât normal (anemie feriprivă );

Hipercromie, imagine falsă dată de creşterea înălţimii hematiei fapt datorat creşterii volumului sau grosimii hematiei şi deci şi a conţinutului în hemoglobină (anemie megaloblastică, sferocitoză);

Anizocromie se caracterizează prin prezenţa concomitentă a eritrocitelor normocrome alături de cele hipocrome (anemii grave regenerative);

Anulocitele sunt eritrocite intens hipocrome care prezintă hemoglobina concentrată la periferie iar centrul este decolorat (anemia feriprivă). Prezenţa sau absenţa incluziunilor celulare În urma unui examen morfologic putem întâlni:

Corpusculii Heinz, granule mici rotunde, aşezate în citoplasmă la periferia celulei. Se colorează cu albastru de Nil. Se pot întâlni în intoxicaţii cu substanţe methemoglobinizante;

Corpusculii Howell – Jolly care sunt resturi de cromatină nucleară prezente în citoplasmă cu aspect rotund. Aceştia se pot întâlni în anemii grave, în special megaloblastice;

Inele Cabot, formaţiuni subţiri, filamentoase, în formă de inel sau sub forma cifrei opt, în citoplasmă. Aceste formaţiuni sunt întâlnite în anemii grave din neoplasme, anemii aplastice.

Figura 2-17 Prezenţa incluziilor Howell – Jolly Col. May Grünwald-Giemsa x100


2.2.6 Morfologia leucocitelor

Morfologia celulelor albe poate servi la stabilirea unui diagnostic diferenţial precum şi a stării generale a individului.

Neutrofilele reprezintă cel mai numeros tip de leucocite, joacă un rol major în apărarea antiinfecţioasă primară a organismelor prin fagocitarea şi digestia microorganismelor, iar activarea lor necorespunzătoare poate duce la lezarea ţesuturilor normale ale organismului prin eliberarea de enzime şi agenţi patogeni. În momentul apariţiei infecţiei sunt produşi agenţi chemotactici care determină migrarea neutrofilelor la locul infecţiei şi activarea funcţiilor defensive ale acestora, cu fagocitarea agentului respectiv, urmată de eliberarea conţinutului granulelor în vezicula de fagocitoză şi distrugerea agentului infecţios. Acest efect este adesea asociat cu creşterea producţiei şi eliberarea neutrofilelor din măduva osoasă.

Figura 2-18 Neutrofile din sânge periferic de iepure aCol. May Grunwald-Giemsa x100

Pe frotiul de sânge periferic neutrofilele apar cu citoplasmă abundentă,

cărămizie, cu granulaţii colorate în violet, cu nucleul segmentat în 2-6 lobi uniţi prin filamente subţiri de cromatină. Segmentarea nucleului se face treptat, numărul de lobi crescând cu vârsta.

Eozinofilele sunt celule mobile, cu originea în măduva hematogenă cu nucleu bilobat. Sunt implicate în apărarea organismului în invazii parazitare sau infecţii alergice fiind demonstrat faptul că mastocitele şi bazofilele eliberează factorul chemotactic pentru eozinofile care induce migraţia eozinofilelor către ţesutul afectat. Se presupune că eozinofilele facilitează eliminarea unora dintre substanţele inductoare ale inflamaţiei, eliberate de către mastocite şi bazofile.


Figura 2-19 Eozinofil din sânge periferic de iepure

Col. May Grunwald-Giemsa x100 Eozinofilele prezintă granulaţii în citoplasmă, acestea sunt sferice sau

ovale, acidofile, cu talia mai mare decât a neutrofilelor. Nucleul eozinofilelor are formă de desagă fiind format din doi lobi. Citoplasma este ocupată în întregime de granulaţiile eozinofile, cu aspect corpuscular de culoare portocalie.

Bazofilele se maturizează în măduva hematogenă, circulă în sânge şi reţin anumite trăsături ultrastructurale caracteristice după migrarea în ţesuturi în timpul proceselor inflamatorii şi imunologice.

Bazofilele şi mastocitele (celule tisulare mari, localizate în imediata vecinătate a capilarelor) au un rol important în reacţiile alergice deoarece imunoglobulina E are proprietatea de a se ataşa de acestea.

Bazofilele prezintă nucleul format din trei lobi iar granulaţiile sunt mari şi inegale. Bazofilele şi mastocitele conţin granulaţii intracitoplasmatice care se colorează metacromatic cu coloranţi bazici.

Monocitele sunt cele mai mari celule sangvine, cu nucleul reniform şi citoplasmă abundentă şi cenuşie. Sunt formate în măduvă unde staţionează foarte puţin, după care sunt eliberate în sânge migrând în ţesuturi ca răspuns la diferiţi factori chemotactici. În ţesuturi, ca răspuns la diferiţi stimuli solubili, ele se diferenţiază în macrofage tisulare.

În organism monocitele îndeplinesc o varietate largă de funcţii: - îndepărtarea particulelor străine şi a celulelor senescente, moarte; - reglarea funcţiilor altor celule; - procesarea şi prezentarea de antigene în reacţii imune; - participarea în diferite reacţii inflamatorii.

Monocitele prezintă o zonă citoplasmatică, cenuşie, cu granule fine, azurofile, repartizate uniform, cu nucleu excentric, reniform, cromatină fină, fără nucleoli.


Figura 2-20 Monocit din sânge periferic de iepure

Col. May Grünwald-Giemsa x100 Limfocitele prezintă nucleu sferoidal, protoplasma albastră ca cerul,

hialină, cu halou perinuclear, nu conţine granulaţii.

Figura 2-21 Limfocit din sânge periferic de iepure

Col. May Grünwald-Giemsa x100 Limfocitele reprezintă o populaţie celulară heterogenă care diferă în

funcţie în funcţie de origine, durata de viaţă, localizare la nivelul organelor limfoide. 65-80% din limfocite sunt celule T, 8-15% sunt celule B, iar aproximativ 10% sunt celule natural killer (NK). Din totalul de limfocite, doar 2% sunt prezente în sângele circulant.

Limfopoieza are loc la nivelul organelor limfoide (măduva osoasă hematogenă, timusul la mamifere şi bursa lui Fabricius la păsări) unde are loc diferenţierea antigenică, după care acestea sunt eliberate şi stocate în arii specifice din organele limfoide secundare (splină, ganglioni limfatici, plăcile Payer).

Din punct de vedere morfologic se deosebesc trei tipuri de limfocite: limfocit mare, limfocit mijlociu şi limfocit mic.


2.2.7 Medulograma (Examenul citologic al măduvei osoase)

Examinarea măduvei osoase hematogene furnizează informaţii privind hematopoieza.

Proba medulară se obţine prin puncţia osului iliac, sternului sau puncţia spinei iliace antero-superioare. La tineret se poate face puncţie tibială antero-medială.

Materiale necesare: tampon de vată, dezinfectant, ac de puncţie, lame microscop, colorant May-Grünwald-Giemsa.

Metodă de lucru şi interpretare Materialul recoltat se întinde rapid pe o lamă, asemănător cu tehnica

efectuării frotiurilor sau prin strivire. Frotiurile se fixează prin uscare la aer 30 minute după care se colorează May-Grűnwald-Giemsa. O parte din frotiuri pot fi fixate în metanol, fiind păstrate ulterior pentru coloraţii speciale.

Probele se examinează la microscop, iniţial cu obiectivul x10. La o astfel de examinare a frotiului cu grunji striviţi, se observă o zonă centrală de culoare închisă reprezentată de grunjul medular, care conţine celule stromale, adipocite, granulocite şi mulţi nuclei liberi proveniţi din distrugerea celulelor. La periferia frotiului se observă celule medulare unde pot fi examinate detaliile morfologice ale celulelor izolate.

După această scanare, frotiul se examinează cu obiectivul x100 cu imersie, examinându-se celulele nucleate intacte.

Figura 2-22 Măduvă osoasă hematogenă, iepure nou-născut

Col. May Grünwald-Giemsa x100

2.2.8 Formula leucocitară

Formula leucocitară reprezintă distribuţia procentuală a diferitelor tipuri de leucocite pe un frotiu de sânge periferic.

Materiale necesare: probă de sânge, lame microscop, ulei de cedru, microscop, colorant May-Grünwald-Giemsa.

Metodă de lucru şi interpretare Se evaluează în diferenţierea numărului total de leucocite circulante în

cele 5 tipuri de leucocite, exprimate procentual. Pe frotiul de sânge, în cameră


umedă (obiectiv de imersie) se numără un total de 100-200 celule albe notate fiecare la categoria corespunzătoare.

Tabelul 2-3 Formula leucocitară la animale

Specia Neutrofile %

Eozinofile%

Bazofile %

Limfocite%

Monocite%

Cal 60-70 2-4 1 30-40 3-4 Bou 25-35 5-6 1 55-65 5-10 Oaie 30-40 5-15 1 45-70 2-5 Capră 40-45 3-5 1 50-55 3-5 Porc 40-45 3-5 1 40-50 2-6 Iepure 35-55 1-5 2-6 40-60 2-6 Găină 15,8 7,5 1 40-60 2-5

2.3. Metode de laborator clasice (manuale) pentru examinarea

sângelui 2.3.1 Determinarea numărului de eritrocite

Determinarea numărului de eritrocite se poate efectua pe sânge capilar sau sânge venos recoltat pe anticoagulant, constând în numărătoarea directă, la microscop. Pentru aceasta este necesară diluarea prealabilă a sângelui.

Materialele necesare: lichid de diluţie Hayem, pipetă Potain, hemocitometru, microscop, ace pentru puncţie vasculară superficială, alcool, tampon steril.

Figura 2-23 Etapele determinării numărului total de eritrocite


Metodă de lucru şi interpretare Numărarea hematiilor presupune succesiunea următoarelor etape: - dezinfectarea zonei de elecţie (pavilionul urechii, buze, coadă), efectuarea

puncţiei cutanate şi recoltarea probei de sânge cu ajutorul pipetei Potain, până la gradaţia 0.5. Prima picătură rezultată se elimină prin tamponare fiind constituită din sânge stagnat în patul capilar subcutanat, fiind mai concentrat;

- aspirarea peste proba de sânge, în pipeta Potain, a lichidului de diluţie Hayem până la gradaţia 101;

- urmează omogenizarea probei prin fixarea pipetei între police şi index, agitându-se uşor aproximativ 3 minute. Se îndepărtează prin tamponare primele 3-4 picături;

- introducerea probei în camera de numărat, acoperită cu o lamelă specială, prin etalarea unei picături de sânge diluat pe camera de numărat, la marginea lamelei, astfel încât lichidul să pătrundă prin capilaritate pe întraga suprafaţă ocupată de cameră şi lamelă, unde se află reţeaua de numărat a camerei;

- sedimentarea eritrocitelor timp de 2-3 minute; - vizualizarea reţelei şi numărarea hematiilor observate pe suprafaţa a

cinci pătrate de ordinul II, delimitate de linii triple, respectiv 80 de pătrate de ordinul III delimitate de linii simple;

- calcularea numărului de hematii conform formulei:

80S x D x I x N

=eritrocite Nr.

N= număr de hematii rezultat după numărare I=înălţimea camerei de numărat 1/10 D=diluţia (1/200) S=suprafaţa unui pătrat mic (1/400)

840000080

400 x 200 x 10 x 420eritrocite Nr. ==

Figura 2-24 Aspectul eritrocitelor de peşte în camera Bürker-Turk


2.3.2 Determinarea numărului de leucocite

Globulele albe sau leucocitele au fost denumite astfel datorită distincţiei lor din masa globulelor roşii prin aspectul luminos, alb la examenul microscopic al sângelui proaspăt, necolorat.

Materialele necesare: pipetă Potain pentru leucocite, hemocitometru, lichid de diluţie Türk, microscop.

Figura 2-25 Etapele determinării numărului total de leucocite Metodă de lucru şi interpretare Numărarea leucitelor prin metoda hemocitometrică presupune

parcurgerea următoarelor etape: - dezinfectarea zonei de elecţie şi efectuarea puncţiei venoase pentru

recoltarea probei de sânge; - se aspiră sânge în pipeta Potain până la gradaţia 0.5; - peste proba de sânge se aspiră lichid de diluţie Türk până la gradaţia 11; - omogenizarea probei; - introducerea în camera de numărare; - vizualizarea şi determinarea mediei lecocitelor pe suprafaţa a patru

pătrate de ordinul I, delimitate de linii triple, în care se găsesc pătrate de ordinul II delimitate de linii duble;

- numărul de leucocite determinat conform formulei:

Nr. leucocite= N x I x D

N= numărul de hematii rezultat după numărare


I=înălţimea camerei de numărat (1/10) D=diluţia (1/200)

Nr. leucocite = 20 x 10 x 20 = 4000

Determinarea numărului de leucocite la păsări La păsări, datorită eritrocitelor nucleate, numărarea leucocitelor este mai

dificilă, necesitând soluţii speciale pentru diluarea sângelui. Materiale necesare: - lichid de diluţie:

- clorură de sodiu 3.88 g - sulfat de sodiu 2.50 g - fosfat disodic cristalizat cu 12 H2O 2.91 g - fosfat monopotasic 0.25 g - formol 37% 7.50 ml - briliant Krezlblau 0.25 g - apă distilată 1000 ml

- pipetă Potain pentru eritrocite - cameră de numărat Bürker-Türk. Se aspiră sânge în pipeta Potain pentru eritrocite până la diviziunea 0,5,

după care lichid de diluţie. Se agită şi se lasă în repaus 5 minute, timp necesar colorării leucocitelor. Are loc numărarea în camera Bürker-Türk, leucocitele prezentând culoare violet-albăstruie.

Figura 2-26 Aspectul leucocitelor la curcă în

camera Bürker-Türk Determinarea numărului de leucocite la peşti

Pentru determinarea numărului de leucocite la peşti este necesar să se prepare două tipuri de reactivi:

Reactivul I Reactivul II roşu neutral 0.025 g cristal violet 0.012 g clorură de sodiu 0.900 g citrat de sodiu 3.800 g apă distilată 100 ml formol 0.400 ml apă distilată 100 ml


Se aspiră sânge în pipeta Potain pentru eritrocite până la diviziunea 0.5, după care se aspiră reactiv I până la jumătatea pipetei, completându-se cu reactiv II.

Se omogenizează conţinutul pipetei, după care se etalează o picătură în camera de numărat. Le microscop se observă leucocitele colorate în violet.

Figura 2-27 Aspectul leucocitelor la peşte

în camera Bürker-Türk

2.3.3 Determinarea numărului de reticulocite

Reticulocitele sunt eritrocite anucleate tinere, imature, care conţin acizi nucleici reziduali (ARN). După expulzarea nucleului eritrocitele rămân în măduvă până la 4 zile, timp în care are loc o scădere continuă a numărului de poliribozomi (care conţin ARN) şi a sintezei de Hb. Aceste eritrocite tinere se maturizează complet în circulaţia periferică în circa 1-2 zile după ce părăsesc măduva osoasă, timp în care pierd complet capacitatea de sinteză practică (respectiv poliribozomii care conţin ARN), iar sinteza de Hb încetează.

Reticulocitele apar pe frotiul colorat Wright-Giemsa ca celule policromatofice la volum mai mare decât cel al eritrocitelor mature. Materialul reticular se colorează cu coloranţi cu albastru de crezil briliant/albastru de metilen.

În mod normal, în absenţa anemiei, un număr mic de reticulocite este prezent în circulaţie (în fiecare zi aproximativ 1% din eritrocite sunt înlocuite cu eritrocite tinere eliberate din măduvă).

Determinarea numărului de reticulocite oferă informaţii despre capacitatea medulară de a sintetiza celule roşii cu răspuns la o suprasolicitare fiziologică, cum este anemia.

Metoda de determinare este manuală prin numărarea microscopică. Materiale necesare: proba de analizat, eprubete, lame microscopice, microscop, reactivi pentru obţinerea colorantului specific.


Metodă de lucru şi interpretare Coloraţia cu albastru de crezil:

Oxalat de sodiu 1 g Ser fiziologic 100 ml Albastru de crezil 1 g Ser fiziologic 100 ml

Se pregătesc doi reactivi, reactivul A din amestecarea oxalatului de sodiu

cu ser fiziologic şi reactivul B din combinarea albastrului de crezil cu serul fiziologic. Într-o eprubetă se introduc 12 picături din primul reactiv şi 3 picături din cel de al doilea. Peste acestea se adaugă 4 picături de sânge din proba de analizat. Amestecul trebuie lăsat în repaus 2 ore, timp necesar sedimentării hematiilor. Se pipetează o picătură de amestec de pe fundul eprubetei şi se efectuează un frotiu după metoda descrisă la efectuarea frotiului sangvin.

Se examinează la microscop cu obiectivul de imersie, observându-se reticulocitele colorate în albastru-verzui.

Figura 2-28 Reticulocite de iepure

Col. albastru de crezil x100

2.3.4 Determinarea vitezei de sedimentare a hematiilor (VSH) prin metoda Westergreen

VSH-ul reprezintă rata de sedimentare a hematiilor dintr-o probă de sânge recoltată pe anticoagulat într-o oră. Cu cât hematiile sedimentează mai repede, cu atât VSH-ul este mai mare, fiind un indicator de răspuns de fază acută.

În afara organismului, sângele recoltat pe anticoagulant, realizează sedimentarea eritrocitelor pentru că dispare factorul principal - circulaţia sângelui. VSH-ul depinde de tendinţa la aglutinare a eritrocitelor când circulaţia încetează, precum şi de formarea rulourilor şi dimensiunea lor.

Sedimentarea hematiilor apare atunci când eritrocitele agregă sub forma unei coloane. Hematiile dintr-o probă de sânge sedimentează lent datorită încărcării electronegative de suprafaţă, care face ca celulele adiacente să se respingă când distanţa intercelulară scade sub un nivel minim. În anumite afecţiuni care determină


creşterea proteinelor de fază acută sau imunoglobulinelor, proteinele plasmatice se ataşează pe suprafaţa hematiilor şi reduc potenţialul de suprafaţă determinând agregarea hematiilor şi creşterea sedimentării acestora.

Materialele necesare: stativ Westergreen, tuburi gradate, probă de sânge recoltată pe anticoagulant.

Metodă de lucru şi interpretare Tehnica de lucru constă în aspirarea sângelui în pipetă Westergreen până

la diviziunea 0 mm. Se aşează pipetele Westergreen în stativ în poziţie verticală. Rezultatul se citeşte după 1h şi după 2h. Rezultatul este reprezentat de

distanţa până la care a coborât coloana de eritrocite exprimată în mm.

Figura 2-29 Stativ Westergreen pentru determinarea VSH-ului

Tabelul 2-4

Valori normale ale VSH-ului la unele specii Specia 15 minute 30 minute 1 oră

Cal 20-60 mm 40-110 mm 85-150 mm Vacă - 18-30 mm 45-65 mm 2.3.5 Determinarea rezistenţei osmotice a eritrocitelor

Rezistenţa globulară reprezintă rezistenţa eritrocitelor la solicitări mecanice, chimice şi la diverse afecţiuni. În laborator aceasta este determinată urmărind comportarea eritrocitelor în soluţii cu hipotonicitate prea agresivă.

Rezistenţa globulară este influenţată de vârsta celulei, pH-ul mediului, (în cel alcalin rezistenţa este mai mare decât în cel acid) şi de osmolarilate, (în mediile hipotone eritrocitele se distrug), la început cele tinere şi bătrâne (rezistenţa osmotică minimă), iar când hipotonia este severă se distrug toate eritrocitele (rezistenţa osmotică maximă).

Materialele necesare: 12 eprubete, stativ, clorură de sodiu 0.5%, apă distilată, proba de analizat.


Metodă de lucru şi interpretare Optsprezece eprubete se numerotează şi se pun într-un stativ. Se adaugă

în fiecare un număr de picături de soluţie de clorură de sodiu 0.5% corespunzător numărului de ordine al eprubetei. Ulterior se completează fiecare eprubetă cu apă distilată până la 14 picături.

În fiecare eprubetă se adaugă câte o picătură de sânge şi se omogenizează. Eprubetele se menţin la temperatura camerei timp de 30 de minute după care sunt supuse centrifugării.

Figura 2-30 Demonstrarea rezistenţei osmotice a eritrocitelor

Rezistenţa minimă a eritrocitelor este reprezentată de prima eprubetă cu

supernatant hemolizat, uşor colorat şi cu sediment eritrocitar, iar rezistenţa maximă de prima eprubetă fără sediment eritrocitar şi supernatant hemolizat colorat intens.

Concentraţia soluţiei din fiecare eprubetă se calculează înmulţind numărul eprubetei cu 0.02.

Nr. crt. 1 2 3 4 5 6 7 8

Soluţia NaCl 0.9% (mL)

1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1

Apă distilată (mL) - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Concentraţie (%) 0.9 0.85 0.8 0.75 0.7 0.65 0.6 0.55 În mod normal, dacă hematiile nu prezintă modificări patologice, se

observă în primele 9 eprubete că hematiile se depun la fund, formând un sediment roşu opac, iar supernatantul este incolor. În aceste eprubete nu există hemoliză, hematiile rezistă la condiţiile de mediu impuse.

Nr. Crt. 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Soluţia NaCl 0.9% (mL)

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1

Apă distilată (mL) 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 Concentraţie (%) 0,5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.01


Concentraţia soluţiei de NaCl de 0.45g% din a 10-a eprubetă (prima eprubeta la care apare hemoliza parţială) corespunde rezistenţei globulare minime.

Începând cu a 14-a eprubetă până la ultima, nu mai există separare sediment/supernatant, soluţia are culoare roţie, hemoliza fiind totală. Concentraţia soluţiei de NaCl de 0.3 g% din a 13-a eprubetă (ultima eprubeta la care hemoliza este parţială) corespunde rezistenţei globulare maxime.

Tabelul 2-5 Valori ale rezistenţei globulare la diferite specii

Specia Concentraţia soluţiei de NaCl g/100ml

care determină rezistenţa globulară minimă maximă

Cal 0.59-0.64 0.39-0.42 Vacă 0.52-0.68 0.42-0.44 Oaie 0.60-0.78 0.40-0.55 Capră 0.62-0.74 0.44-0.52 Porc 0.66-0.74 0.45-0.50 Câine 0.40-0.56 0.32-0.42 Pisică 0.62-0.72 0.44-0.54 Găină 0.40-0.59 0.32-0.37 Iepure 0.44 0.33 Om 0.48 0.26

2.3.6 Determinarea hematocritului

Hematocritul (Ht) reprezintă raportul dintre volumul total al eritrocitelor faţă de volumul sangvin total, după centrifugare, exprimat în %. În practică, pentru determinare se utilizează două metode: metoda macrohematocritului şi metoda microhematocritului.

Metoda macrohematocritului Materialele necesare: sânge venos recoltat pe anticoagulant, tuburi de

hematocrit Wintrobe, centrifugă, materiale necesare recoltării sângelui prin puncţie venoasă, pipete Pasteur.

Metodă de lucru şi interpretare Sângele recoltat pe anticoagulant este introdus cu ajutorul unei pipete

Pasteur într-un tub Wintrobe până la diviziunea 100 dacă tuburile sunt gradate sau se introduc 4 mm3 de sânge dacă acestea nu prezintă gradaţii. Tuburile sunt supuse centrifugării la 3000 turatii/min, timp de 3 minute. După centrifugare, conţinutul tubului va avea urmatorul aspect: coloana eritrocitară va fi dispusă spre fundul tubului, iar plasma va fi situată deasupra coloanei celulare. La limita de separare dintre cele două se va observa un strat subţire cenuşiu-roşiatic, format din leucocite şi trombocite.


Se citeşte valoarea exprimată în procente a înălţimii pachetului de eritrocite, înălţimea coloanei de sânge fiind de 100%. Dacă tubul nu este gradat, pentru determinare se va utiliza o riglă şi vom măsura: înălţimea coloanei de sânge (H) şi a coloanei de eritrocite (h) exprimate în mm. Valoarea Ht se determină conform formulei de calcul:

100 H

h(%)Ht x=

Metoda microhematocritului Această metodă este mult mai rapidă şi mai economică de cât metoda

clasica Wintrobe. Materiale necesare: tuburi capilare speciale din sticlă, microcentrifugă,

baghete din sticlă, capsulă din plastic, materiale necesare recoltării puncţiei venoase/capilare, bec de gaz, nomograma pentru determinarea hematocritului.

Metodă de lucru şi interpretare Se recoltează sânge pe anticoagulant. Se încarcă un tub capilar cu sânge

în proporţie de ¾, prin capilaritate. Capătul opus se închide prin încălzire la flacăra unui bec de gaz. Se adaptează tubul capilar la centrifugă şi se centrifughează 5 minute cu 15.000 turaţii/min.

Tabelul 2-6 Limitele de variaţie ale Ht la animale

Specia Limite de variaţie (%)Cal 32-52Vacă 24-46Oaie 27-45Capră 22-38Porc 35-50Câine 37-55Pisică 24-45Găină 22-35Iepure 22.9-42.7Hamster 36-55Cobai 37-48Şobolan 36-48

2.3.7 Dozarea hemoglobinei Hemoglobina este principalul pigment respirator sangvin al animalelor

superioare, conferind acestuia culoarea roşie datorită fierului bivalent. În timpul procesului de maturare, eritrocitul pierde nucleul şi mitocondriile şi se transformă într-un sac cu hemoglobină.

hH


Hemoglobina este o hemoproteina, cu masa moleculară de 64500 D, la limita superioară a capacităţii de filtrare a membranelor glomerulare renale (ceea ce înseamnă că hemoglobina liberă în plasmă se filtrează la nivelul nefronilor şi trece în urină). Este o proteină tetramerică, alcatuită din:

globină-formată din 4 lanţuri de aminoacizi aranjaţi într-o structură aproape sferică, aceasta reprezentând 90% din hemoglobină;

hem (feroprotoporfirina) alcătuit din fier bivalent Fe2+ şi un inel tetrapirolic, protoporfirina IX;

Metodele de dozare a hemoglobinei sunt: dozarea hemoglobinei ca oxihemoglobină; dozarea fotometrică a hemoglobinei ca cianhemiglobină şi cianmethemoglobină;

dozarea spectrofotometrică a hemoglobinei; dozarea electroforetică a hemoglobinei.

Dozarea hemoglobinei ca oxihemoglobină Soluţia diluată de amoniac produce hemoliza sângelui şi totodată

împiedică transformarea hemoglobinei în methemoglobină. Materiale necesare: soluţie de amoniac 0.1%, pipetă pentru hemoglobină

de 0.02 mm. Metodă de lucru şi interpretare Într-o eprubetă se măsoară 5 ml de soluţie de amoniac. În acesta se

introduc cu pipeta de hemoglobină 0.02 ml de sânge în prealabil agitat. După agitare se citeşte extincţia probei faţă de apă distilată la λ=540 nm în cuva de 1 cm. Rezultatul se raportează la o curbă de calibrare obţinută cu diluţii dintr-o probă de concentrat de eritrocite cu concentraţia hemoglobinei cunoscută. Dozarea fotometrică a hemoglobinei ca cianhemiglobină şi cianmethemoglobină

Această determinare este metoda standard pe plan mondial pentru dozarea hemoglobinei. Fericianura de potasiu oxidează fierul feros din hemoglobină în fier feric, iar acesta face ca toate felurile de hemoglobină să se transforme în methemoglobină sau hemiglobină, care pe măsură ce se formează, se tranformă în cianmethemoglobină sau cianhemiglobină, care se vor doza fotometric.

Se aspiră 0.02 ml sânge venos sau capilar, se amestecă cu 5 ml reactiv Kampen-Zylstra, se omogenizează şi se lasă în repaus 30 de minute. Extincţia se va citi la 540 nm. Concentraţia hemoglobinei se calculează prin interpolare pe curba de calibrare. Dozarea spectrofotometrică a hemoglobinei

Aceasta este o metodă cantitativă de dozare a hemoglobinei. Derivaţii hemoglobinei, fiind substanţe colorate prin componenta porfirinică, pot fi uşor


deosebite prin spectrul lor de absorbţie. Hematiile conţin oxi-hemoglobină (oxi-Hb) şi carb-Hb (carbhemoglobina sau carbamin-hemoglobina). Este importantă cunoaşterea spectrelor de absorbţie caracteristice fiecăruia din aceşti compuşi deoarece pe baza lor se identifică prezenţa acestora în sânge. Derivaţii hemoglobinei: Oxihemoglobina (HbO2) are două spectre de absorbţie în zona galben-verde (570-545 nm); reprezintă 97% din hemoglobină în sângele arterial şi 70-75% în sângele venos.

Soluţia de oxi-Hb se obţine din 20 ml apă şi 3 picături de sânge. La contactul cu aerul soluţia capătă o culoare roşu-deschis, deoarece Hb se saturează cu O2.

Spectroscopic, se observă 2 benzi de absorbţie, una mai lată care acoperă parţial culoarea galbenă şi una mai îngustă peste culoarea verde. Hemoglobina redusă (HbH+). Pentru prepararea soluţiei de hemoglobină redusă se folosesc 10 ml din soluţia de oxi-Hb la care se adaugă câteva cristale de hidrosulfit de sodium. Culoarea soluţiei este roşu-violaceu. Analiza spectroscopică arată o singură bandă de absorbţie care acoperă culorile galben şi verde, numită banda Stokes. Scăderea oxi-Hb şi creşterea proporţiei de HbH+ peste 1/3 din hemoglobina totală, adică peste 5g/%, duce la coloraţia albăstruie a tegumentelor şi mucoaselor, numită cianoză. Carboxihemoglobina (HbCO) în mod normal reprezintă 0.5-2% din hemoglobină. Obţinerea soluţiei de carboxi-Hb se realizează prin barbotarea timp de o oră în soluţia de oxi-Hb a CO provenit din arderea incompletă a cărbunilor. Soluţia are culoare vişinie şi se găseşte gata preparată în laborator. La spectroscop, se observă 2 benzi de absorbţie asemănătoare cu ale oxi-Hb: în galben şi verde, deplasate puţin spre violet. Pentru a deosebi oxi-Hb de carboxihemoglobină (HbCO), se adaugă soluţiei câteva cristale de hidrosulfit de sodiu şi se analizează din nou spectroscopic.

HbCO este un compus patologic al Hb, format rapid la expunerea sângelui la monoxid de carbon (afinitatea Hb pentru CO este de 200 ori mai mare decat pentru oxigen). O concentraţie a CO în aerul atmosferic de numai 0.1% este suficientă pentru ca 50% din Hb să se combine cu CO. Intoxicaţia este letală atunci când 70% din Hb totală este sub forma de HbCO. Methemoglobina în mod normal reprezintă 0.2-1%. Solutia de met-Hb se obţine prin adăugarea a 5 picături de fericianură de potasiu K3[Fe(CN)6] la 10 ml de soluţie oxi-Hb. Analizată spectroscopic, met-Hb are 4 spectre de absorbţie: roşu;


galben; verde; albastru.

Met-Hb este Hb ce conţine Fe3+, care nu fixează O2, ci radicalii–OH. În acest caz Hb transportă numai jumătate din cantitatea de oxigen fenomen numit hipoxemie. Legatura Fe3+–OH este mai stabilă ca legatura Fe3+– O2. La fel ca şi HbCO, met-Hb deviază la stânga curba de disociere a oxi-Hb, cedarea O2 la ţesuturi făcându-se mai greu. Ca urmare, apare hipoxemia şi hipoxia tisulară, semnele clinice apărând la concentraţii de peste 50% ale met-Hb din Hb totală. La concentraţii peste 60% se instalează coma. Sângele în care peste 15% din Hb totală este met-Hb (2g/%) are culoare brună şi apare cianoza albastră-cenuşie a mucoaselor şi tegumentelor.

Carbhemoglobina (HbCO2), concentraţia acesteia variază în limite largi, este mai mare în sângele venos şi mai mic în sângele arterial.

Dozarea electroforetică a hemoglobinei Hemoglobina şi derivaţii săi migrează în câmp electrostatic, datorită

componentei lor proteice. În comparaţie cu proteinograma efectuată din plasmă, la proteinograma

efectuată din ser hemolizat apar benzi în plus în fracţiunile în care migrează diferitele tipuri de hemoglobină, în special în β2.

Concentraţia hemoglobinei se poate determina densitometric. Tipuri de hemoglobină: a) HbA1 migrează în fracţiunea α2, β2 şi reprezintă 96-98 % din hemoglobină. b) HbA2 migrează în fracţiunea α2, δ2, reprezintă 1-3% din hemoglobină. c) HbF migrează în fracţiunea α2, γ2 şi reprezintă 0.5- 0.8% din hemoglobină.

Dozarea hemoglobinei prin metoda Sahli Se compară colorimetric o soluţie de clorhidrat de hematină obţinută din

sângele de cercetat, cu un etalon făcut din sticlă maron. Materialele necesare: hemoglobinometru, pipetă de 0.02 ml, pipetă

Pasteur, baghetă de sticlă pentru amestec, acid clorhidric N/10. Hemoglobinometrul Gowers-Sahli este format dintr-un comparator colorimetric, în care se află un dublu martor şi o eprubetă cu două scări: o scară are notată hemoglobina în grame, cealaltă în procente faţă de valoarea normală (100% corespunde la 16 g). Colorimetrului îi este ataşată o pipetă capilară de 0.02 ml, o baghetă pentru amestec, o pipetă simplă şi o eprubetă cu HCl N/10.


Figura 2-31 Hemoglobinometrul Gowers-Sahli

Metodă de lucru şi interpretare Se pun în eprubeta colorimetrului, cu o pipetă simplă, 6-8 picături din soluţia

de HCl N/10. Se aspiră cu pipeta 0.02 ml sânge. Ştergem vârful pipetei cu hârtie de filtru, apoi îi golim conţinutul în eprubeta gradată a hemoglobinometrului. Prin aspirare şi suflare, spălăm pipeta cu HCl din eprubeta gradată, pentru a goli toate resturile de sânge din pipetă în eprubetă. Agităm eprubeta puternic de câteva ori, pentru a omogeniza amestecul şi pentru a opri eventuala coagulare a sângelui. După 3 minute, diluăm soluţia brun-închis rezultată, cu apă distilată, până ajunge să aibă aceeaşi culoare cu martorul. Citim, la marginea de jos a meniscului, conţinutul sângelui în hemoglobină, exprimat în grame sau în procente. Rezultatele obţinute pe eprubeta gradată sunt valabile la lumina naturală.

Tabelul 2-7

Valorile hemoglobinei la animale Specia Valoarea Hb

(g/dl) Cal 11-19 Vacă 8-15 Oaie 9-15 Capră 10 Porc 10-16 Câine 15 Pisică 12 Găină 9 Iepure 12.9 Cobai 12.4 Hamster 16.8


2.3.8 Explorarea hemostazei

Hemostaza fiziologică implică un echilibru între două procese opuse care se desfăşoară simultan: formarea cheagului sangvin şi fibrinoliza. Formarea cheagului presupune interacţiunea dintre endoteliul vascular, plachete şi factorii de coagulare constând din două etape: hemostaza primară hemostaza secundară

Tratamentul cu anticoagulante (heparina, trombostop) modifică rezultatele testelor de coagulare (heparina pe calea intrinsecă, trombostopul pe calea extrinsecă), de aceea nu se fac investigaţii decât dupa 48 ore de la sistarea tratamentul. Testele care explorează hemostaza sunt: A. Teste globale timpul de coagulare (Lee- White) timpul de recalcifiere a plasmei (Howell) toleranţa la heparină –in vitro

B. Testele hemostazei vasculare timpul de sângerare testul de fragilitate capilară (Rumple- Leede) explorarea trombocitului

C. Explorarea primei fazei a coagularii (până la formarea complexului protrombinazic) timpul de cefalină sau de tromboplastină parţială (PTT) timpul de cefalină activat sau timpul de tromboplastină parţial activată

(APTT) timp de consum de protrombină dozarea factorilor antihemofilici ( VIII şi IX) testul de generare a tromboplastinei

D.Explorarea fazei a 2-a a coagulării (trombinoformarea) timpul Quick / timp protrombină testul Koller teste de diferenţiere

E. Explorarea fazei a 3-a a coagulării (fibrinoformarea sub influenţa trombinei) timpul de trombină timpul de reptilază dozare fibrinogen plasmatic activitate factor XIII


F. Evidenţierea anticorpilor antiplachetari: testul de inhibiţie a retracţiei cheagului testul Karpatkin

G. Punerea în evidenţă a anticoagulanţilor circulanţi test coagulare-diluţie timpul de cefalină

H.Determinarea inhibitorilor fiziologici: -determinarea nivelului de antitrombină III determinarea proteinei C determinarea activităţii proteinei S determinarea anticoagulantului lupic

Timpul de coagulare se realizează punând o picătură de sânge integral direct de la nivelul puncţiei vasculare pe o lamă de sticlă degresată, iar prin înclinări succesive se urmăreşte momentul în care picătura de sânge nu se mai deformează. Se notează timpul scurs care reprezintă valoarea timpului de coagulare în minute.

Tabelul 2-8

Timpii de coagulare pe specii Specia Timpul de coagulare

Cabaline 15-30 minute Bovine 8-10 minute Câine 4-8 minute Găină 10-15 minute

Timpul de sângerare reprezintă timpul scurs de la efectuarea unei injurii

vasculare şi până la apariţia trombusului plachetar ferm, care opreşte sângerarea. Timpul de sângerare dă indicaţii asupra hemostazei primare (mecanismul

vascular şi trombocitar), stadiu în care se formează trombusul plachetar; prelungirea sa indică o tulburare la acest nivel care poate ţine fie de peretele vascular, fie de plachete.

Se cunosc două metode pentru determinarea timpului de sângerare: METODA DUKE, care constă în dezinfectarea pavilionului urechii, sau

cuzinetului plantar sau palmar, inţeparea cu un ac steril la 3-4 mm adâncime, tamponare cu hârtie de filtru din 30 în 30 de secunde până la oprirea sângerării. Când pe hârtie nu mai apar amprente sangvine, numărul obţinut se împarte la 2, reprezentând timpul de sângerare în minute.

METODA IVY, constă în efectuarea unei incizii pe faţa anterioară a antebraţului sub o presiune constantă de 40 mm Hg obţinută cu un manşon de la tensiometru, cu cronometrarea timpului necesar hemostazei.


Tabelul 2-9 Valori de referinţă privind timpul de sângerare la animale

Specia Timpul de sângerare Cal 5-15 minute Vacă 5-12 minute Câine 3-10 minute Găină 4-5 minute

Timpul de tromboplastină parţială (PTT) şi timp de tromboplastină activat prin adaos de caolin (PTTK) sunt teste de coagulabilitate plasmatică a căii intrinseci în care nu sunt implicate plachetele.

Un gram de pudră de tromboplastină se amestecă cu 50 ml cloroform agitându-se timp de 30 minute la temperatura camerei. Se filtrează şi filtratul se evaporă la 56ºC rezultând un rezid de culoare brună care se preia în 50 ml ser fiziologic.

Proba de sânge se recoltează pe citrat trisodic şi se supune centrifugării la 5000 turaţii/min. timp de 15 secunde. Se pipetează 0.1 ml plasmă peste care se adaugă 0.1 ml cefalină-caolin, 0.1 ml clorură de calciu M/40. Se măsoară timpul în care are loc coagularea plasmei. Timpul Quick (TQ) este testul de coagulabilitate plasmatică a căii extrinseci, dă indicaţii asupra nivelului factorilor VII, X, V, II, I.

Factorii II, VII, IX, X sunt sintetizaţi în ficat sub formă inactivă. Activarea lor constă în transformarea acidului glutamic din structura lor în acid γ-carboxiglutamic, proces ce are loc în prezenţa vitaminei K. Formele active, γ-carboxilate au afinitate crescută pentru ionii de calciu.

TQ evaluează atât activitatea factorilor de coagulare dependenţi de vitamina K, a factorului V şi a fibrinogenului, cât şi funcţia de sinteză proteică a ficatului.

In vivo, activitatea căii extrinseci a coagulării este declanşată de eliberarea de tromboplastină tisulară din ţesuturile lezate.

Tromboplastina tisulară activează factorul VII care la rândul lui activează factorul X, care va determina conversia protrombinei în trombină.

In vitro, activitatea factorului VII este realizată prin adăugarea reactivului tromboplastină şi a ionilor de calciu într-o plasmă săracă în trombocite. Ca urmare are loc transformarea protrombinei în trombină, care la rândul ei converteşte fibrinogenul în fibrină.

Se recoltează sânge prin puncţie venoasă pe oxalat de sodiu 1.34% şi se centrifughează la 1800 turaţii/min, timp de 5 minute.

Se prepară tromboplastina calcică, amestecând în părţi egale soluţia de tromboplastină cu soluţie de CaCl2 0.02M (0.22 CaCl2/100ml apă distilată); reacţia se lucrează la 37ºC.


Într-o eprubetă se introduc 0.1 ml plasmă şi 0.2 ml tromboplastină calcică. Din acest moment se cronometrează. Coagularea s-a produs atunci când plasma nu mai curge.

Tabelul 2-10

Timpul Quick la animale Specia TQ

Cal 11,6 secunde Vacă 18 secunde Câine 7,8 secunde Găină 44,5 secunde Iepure 14,8 secunde

Timpul de protrombină serică (TPS) este testul care dă indicaţii despre

felul cum decurge coagularea când sunt implicaţi factorii: XII, XI, IX, VIII, X, V şi factorul plachetar. Interacţiunea lor are ca rezultantă protrombinaza, care consumă factorul II. Scurtarea testului sub 40 secunde trădează un insuficient consum al factorului II, ceea ce dovedeşte o deficienţă a acţiunii oricăruia dintre factorii mai sus citaţi. Singur acest test nu poate preciza diagnosticul, diferenţierea se poate face numai în corelare cu numarul plachetelor, TQ, PTTK.

Dozarea fibrinogenului este foarte utilă în apariţia unei coagulopatii de consum sau a unei fibrinolize, în instalarea unei boli tromboembolice.

Fibrinogenul (factorul I al coagulării) este o glicoproteină cu greutate moleculară de aproximativ 340 kD, prezentă în plasmă la o concentraţie între 200-400 mg/dl. Este sintetizat în ficat la o rată de 1.7-5 g/zi. Fibrinogenul constituie substratul de acţiune atât pentru trombină cât şi pentru plasmină.

În laborator determinarea fibrinogenului se realizează introducând 1mL plasmă sangvină într-o eprubetă şi păstrarea acesteia timp de 3 minute pe o baie de apă la 56ºC.

În aceste condiţii plasma coagulează. Dacă în eprubetă plasma rămâne limpede, semnifică lipsa fibrinogenului.

2.3.9 Determinarea grupelor sangvine

Celulele sangvine sunt grupate pentru fiecare specie în funcţie de antigenii localizaţi la suprafaţa eritrocitelor.

Numărul de antigeni depistaţi este foarte variabil de la o specie la alta. De exemplu la câine s-a ajuns la peste 11 grupe sanguine, din care 8 sunt catalogate şi recunoscute ca fiind antigene eritrocitare canine (AEC) şi clasificate ca: 1.1, 1.2, 3, 4, 5, 6, 7 şi 8. Dintre acestea cel mai frecvent identificate în cazuistica curentă au fost AEC-1 si AEC-7. La pisică se cunosc doar trei grupe sanguine: A, B şi AB


(la sub 0.1% din pisici). De reţinut că tipurile sanguine de la pisică nu au legătură cu cele umane. Grupul sanguin A este dominant (întâlnindu-se la 75-99% din pisici) asupra celorlalte, grupurile fiind alelice. Grupul sanguin B a fost identificat la 1 - 10% din cazuri, cu preponderenţă la rasele pure de pisici (ex. Abisiniană, Persană, Himalaiană, Rex). Un fapt interesant este că nici un exemplar din rasa Siameză nu a fost identificat cu grupa sanguină B. Până în prezent nu s-au identificat indivizi care să posede antigeni şi pentru grupul A şi pentru B. Determinarea grupelor sanguine A B 0 se face prin proba Beth-Vincenz, probă ce se bazează pe fenomenul de izohemaglutinare, ce apare prin amestecarea de ser la care se cunosc aglutinele (ser hemotest) cu hematii al căror aglutinogen este necunoscut - determinarea aglutinogenelor. Pentru mai multă siguranţă se practică şi proba Simonin - determinarea aglutinelor, în care se pune în contact serul de cercetat cu eritrocite test cunoscute, la care sunt precizaţi aglutinogenii. În cazuri de urgenţă se apelează la proba compatibilităţii directe. Materialele necesare: ser hemotest din grupele O, A, B, (anti-AB, anti-B şi respectiv anti-A), vată, alcool, eter, lame, ace de seringă, pipete Pasteur.

Metodă de lucru şi interpretare Pe lama de sticlă se pune în mod succcesiv, cu pipete diferite, câte o

picătură de ser hemotest, în ordinea următoare: 0 la stânga, A la mijloc, B la dreapta. Cu colţul unei lame se adaugă câte o picătură de sânge integral recoltată direct de la locul de elecţie, peste fiecare picătură de ser hemotest, amestecând pentru omogenizare, schimbând colţul lamei pentru fiecare picătură de ser. Se imprimă lamei o mişcare lentă, rotativă. Citirea se face în primele 2-3 minute, cu ochiul liber, în nici un caz la un interval mai mare de 5 minute.

La toate cele trei picături aglutinarea este absentă, amestecurile rămân uniform colorate în roz-sângele cercetat aparţine grupei 0; apare aglutinarea cu serurile 0 şi B, lipsind la serul hemotest A-sângele cercetat aparţine grupei A; apare aglutinarea cu serurile 0 şi A, lipsind la serul hemotest B-sângele cercetat aparţine grupei B; apare aglutinarea la toate cele trei seruri hemotest – sângele cercetat aparţine grupei AB.

În proba compatibilităţii directe, utilizabilă atât la om cât şi la animale, se amestecă 2-3 picături de ser sau plasmă de la primitor, obţinut prin centrifugare, cu sânge de la donator.

Producerea aglutinării indică incompatibilitatea.


2.4 Determinări biochimice sangvine 2.4.1 Spectrofotometria

Spectrofotometria este o metodă optică de determinare a concentraţiilor constituenţilor existenţi într-o probă dată. Această metodă se bazează pe iradierea probei de analizat cu un fascicol de radiaţii electromagnetice, a cărui putere radiantă se micşorează la ieşirea din sistem funcţie de natura şi concentraţia speciilor absorbante.

Principiul se bazează prin trecerea luminii cu lungime de undă cunoscută printr-o probă şi măsurarea cantităţii de energie luminoasă care este transmisă. Aceasta se realizează prin plasarea unei fotocelule în partea opusă a probei respective. O rază de lumină este formată din fotoni. Când un foton întâlneşte o moleculă de analit, există şanse ca analitul să absoarbă fotonul. Această absorbţie reduce numărul de fotoni din raza de lumină, reducând astfel intensitatea luminoasă. Toate moleculele absorb energie radiantă la anumite lungimi de undă. Cele care absorb energie în spectrul vizibil sunt cunoscute ca pigmenţi. Proteinele şi acizii nucleici absorb lumina în domeniul ultraviolet. Un spectrofotometru implică o sursă de lumină, o prismă, un suport pentru probe şi o fotocelulă care sunt conectate la un sistem electric care controlează intensitatea luminii, lungimea de undă şi conversia energiei primite la nivelul fotocelulei în fluctuaţii voltmetrice. Fluctuaţiile voltmetrice sunt apoi proiectate pe o scală digitală şi valorile sunt înregistrate într-un computer.

Pentru a utiliza un spectrofotometru este necesară stabilirea unei serii cunoscute de diluţii a unor cantităţi cunoscute de solvent. Una din acestea nu conţine solvent şi este cunoscută ca “blank”, fiind utilizată pentru ajustarea să citească 100% transmisia pentru absorbanţa 0. O valoare a transmisiei de 0% este stabilită prin plasarea probelor în calea luminii. După înregistrarea absorbanţei pentru o serie de probe standard este efectuată o dreaptă absorbantă versus concentraţie. Panta dreptei reprezintă coeficientul de extincţie.

Prin spectrofotometrie se evidenţiază şi se determină substanţele chimice organice şi anorganice din toate umorile organismului (sânge, urină, limfă, lichid cefalo-rahidian şi interstiţial). Materialele necesare metodă de lucru şi interpretare: analizor automat de biochimie, proba de analizat.

2.4.2 Analiza biochimică a proteinelor plasmatice

Concentraţia proteinelor plasmatice totale realizează constanta numită proteinemie, care depinde de echilibrul hormonal şi hidric al organismului, de starea de nutriţie şi de numeroşi factori care influenţează starea de sănătate a organismului.


Proteinemia este considerată ca fiind forma intermediară între organele proteinoformatoare şi proteinele tisulare, aceasta reflectând doar parţial starea metabolismului protidic global, deoarece concentraţia principalelor fracţiuni electroforetice se modifică fără a influenţa proteinemia totală.

Principalele fracţiuni proteice plasmatice sunt albuminele (sintetizate în ficat), globulinele (fracţiunile alfa şi beta sunt sintetizate în procent de 80% în ficat, iar restul în sistemul reticulo – histiocitar, fracţiunea gama este sintetizată în sistemul limfoplasmocitar) şi fibrinogenul (produs în ficat şi măduva osoasă). Funcţiile proteinelor plasmatice: 1. Realizează presiunea coloidosmotică sau oncotică a sângelui, albumina având cea mai mare contribuţie. 2. Controlează volumul plasmatic şi schimburile electrolitice dintre lichidele intravasculare şi cele interstiţiale prin intermediul presiunii osmotice. 3. Contribuie la menţinerea echilibrului acido-bazic prin sistemul tampon proteină acidă / proteină alcalină, sistem care are o capacitate de tamponare de aproximativ 15 % din capacitatea totală de tamponare a sângelui. 4. Asigură transportul oxigenului, lipidelor, vitaminelor, hormonilor, electroliţilor şi metaboliţilor. 5. Menţin echilibrul fluido-coagulant al sângelui, participând atât la procesul de coagulare cât şi la cel de fibrinoliză. 6. Participă la procesele de apărare specifică şi nespecifică faţă de agenţii patologici biogeni prin intermediul anticorpilor. 7. Contribuie la realizarea vâscozităţii sângelui, asigurând un protector pentru eritrocite şi circulaţia sângelui în sectorul microcirculaţiei.

Tabelul 2-11 Valori de referinţă ale proteinelor şi principalelor

fracţiuni proteice la animale Specia Proteine totale

g/dL Albumină

g/dL Globulină

g/dL Câine 5.5-7.5 2.6-4.0 2.1-3.7 Pisică 5.7-8.0 2.4-3.7 2.4-4.7 Vacă 6.2-8.2 2.8-3.9 2.9-4.9 Cal 5.7-7.9 2.5-3.8 2.4-4.6 Porc 5.8-8.3 2.3-4.0 3.9-6.0 Oaie 5.9-7.8 2.7-3.7 3.2-5.0 Capră 6.1-7.4 2.3-3.6 2.7-4.4

Albumina serică

Albumina este o proteină non-glicozilată de celulele parenchimului hepatic. Reprezintă cel mai important component proteic din plasmă, lichid


cefalo-rahidian şi urină. În plasmă, albumina este responsabilă în principal de menţinerea presiunii oncotice, de transportul diverşilor compuşi (acizi graşi liberi, bilirubină, hormoni, medicamente).

Albumina constituie un indicator global al stării de nutriţie a organismului fiind totodată un reactant de fază acută, valorile ei serice scad ca răspuns la procesele infecţioase şi inflamatorii acute.

2.4.3 Determinări biochimice ale lipidelor plasmatice

Lipidele organismului provin din grăsimi alimentare preluate din raţie sau sunt sintetizate din excesul de glucide sau protide prin neolipidogeneză.

În plasma sanguină se găsesc gliceride, acizi graşi liberi, fosfolipide, colesterol liber şi esterificat. Cantitatea totală de lipide plasmatice se numeşte lipemie şi este cuprinsă între 0.1-1.0 g/dl în funcţie de specie. Cantitatea totală de colesterol din sânge se numeşte colesterolemie.

Lipidele îndeplinesc în organism următoarele funcţii: • reprezintă un adevărat rezervor de energie chimică, un gram de grăsime producând în urma oxidării 9 kilocalorii; • participă la desfăşurarea proceselor de metabolism; • au rol în sinteza unor substanţe de constituţie, cum sunt hormonii steroizi şi vitaminele liposolubile; • au rol plastic, intrând în structura membranelor celulare şi subcelulare (sub formă de complexe lipido – polizaharidice, fosfolipide) sau asigurând izolarea axoplasmei fibrelor nervoase (sub formă de fosfolipide); • sub formă de acizi graşi esenţiali (se cunosc trei acizi graşi esenţiali: acidul linoleic, linolenic şi arahidonic) sunt indispensabili ca sursă alimentară, neputând fi sintetizaţi de către organism, încât trebuie asigurat aportul exogen. Acizii graşi esenţiali sunt grupaţi şi sub termenul de „vitamina F”.

Tabelul 2-12 Valori de referinţă ale lipidelor totale, colesterolului şi trigliceridelor

la animale Specia Lipide totale

g/dL Colesterol

mg/dL Trigliceride

g/dL Câine 465-640 115.6-253.7 50÷100 Pisică 50÷100 71.3-161.2 50÷100 Vacă 348 62.1-192.5 15÷45 Cal 352 70.9-141.9 Porc 378 81.4-134.1 Oaie 382 44.1-90.1 Capră 64.6-136.4


Determinarea lipidelor din serul sangvin trebuie efectuată după 12 ore de la administrarea ultimului tain.

Colesterolul HDL (HDL-C) Colesterolul HDL (High-density lipoprotein cholesterol) reprezintă un

grup de lipoproteine sintetizate şi secretate de hepatocite. Deţine un rol important în metabolismul colesterolului, participând la transportul acestuia din ţesuturile extrahepatice către ficat pentru catabolizare şi excreţie.

Împreună cu LDL participă la menţinerea nivelului colesterolului celular.

Colesterolul LDL LDL (Low-density lipoprotein cholesterol) este lipoproteina care conţine

cea mai mare cantitate de colesterol (60-70% din colesterolul seric total). LDL rezultă în principal din degradarea VLDL.

Acizii graşi liberi circulanţi formează în ficat trigliceride care sunt cuplate cu apoproteine şi colesterol, urmând a fi exportate în sânge ca lipoproteine VLDL (Very Low Density Lipoprotein cholesterol).

LDL colesterol este implicat în transportul colesterolului către ţesuturi, în principal în sistemul arterial, ceea ce explică incidenţa crescută a aterosclerozei şi a bolii coronariene.

Metoda de determinare este o metodă indirectă folosindu-se formula lui Friedewald.

LDL-C=colesterol total-(HDL-C)-(VLDL)

VLDL=

2.4.4 Analiza biochimică a glucidelor plasmatice

Glucidele plasmatice sunt reprezentate de glucoza circulantă şi produşii de metabolism glucidic. Glucoza circulantă asigură echilibrul permanent între aportul alimentar de glucide, dinamica stocării şi eliberării glucozei din depozite şi consumul tisular de glucoză.

Glucoza, principala substanţă glucidică plasmatică este „combustibilul” preferenţial al tuturor celulelor din organism, mai ales pentru hematii şi ţesutul sistemului nervos central.

Glucoza se metabolizează în sens anabolic şi catabolic în raport cu cerinţele generale energogene. În sens catabolic glucoza se oxidează până la CO2 şi apă, eliberându-se în acelaşi timp energia chimică ce va fi stocată sub forma unor valenţe macroergice (ATP). Metabolizarea glucozei în sens anabolic constă în condensarea ei reversibilă în glicogen sau transformarea în trigliceride.

5detrigliceri


Menţinerea homeostaziei glicemice este una din cele mai importante funcţii metabolice ale organismului. Glucoza este cel mai important monozaharid din sânge rezultat din digestia carbohidraţilor şi din conversia hepatică a glicogenului în glucoză. Glucoza este un furnizor indispensabil de energie care susţine activitatea celulară. Glucagonul şi insulina reglează în mod direct nivelul glucozei în sânge.

Tabelul 2-13 Valori de referinţă pentru glucide la animale

Specia Valori de referinţă (mg/dL)

Câine 61.9-108.3 Pisică 60.8-124.2 Vacă 42.1-74.5 Cal 62.2-114 Oaie 44-81.2

2.4.5 Analiza biochimică a enzimelor plasmatice

Enzimele plasmatice au constituit obiectul unor studii complexe. Din cele aproximativ 2000 de enzime cunoscute, doar o mică parte sunt prezente în plasmă, acestea fiind grupate în 3 categorii:

• enzime plastice funcţionale, de provenienţă hepatică (enzimele coagulării, pseudocalinesteroza, ceruloplasmina, renina, colesterol – aciltransferoza). Concentraţia acestor enzime scade proporţional cu gravitatea şi extinderea leziunilor hepatice, dozarea acestor enzime fiind utilă pentru diagnosticul şi urmărirea hepatopatiilor.

• enzime excretosecretorii, excretate de glande digestive în lumenul intestinal (amilaza, lipaza, tripsina pancreatică, pepsinogenul gastric), care se găsesc în condiţii fiziologice în plasmă în cantităţi mici.

• enzime celulare, ce îndeplinesc roluri fundamentale în metabolismul energetic, plastic celular.

Alaninaminotransferaza (ALAT/ALT) Alaninaminotransferaza este o enzimă ce face parte din clasa

transferazelor şi catalizează transferul reversibil al grupării amino (NH2) de la un aminoacid (alanină) α-cetoglutaratului, ducând la formarea de acid piruvic şi glutamat. Se găseşte în principal în ficat, în citosolul hepatocitului, în rinichi, miocard, muşchii scheletici, pancreas.

Dacă metabolismul energetic al celulei hepatice este tulburat de agenţii infecţioşi sau toxici, se produce o creştere a permeabilităţii membranei celulare, cu trecerea în ser a componenetelor citoplasmatice (citoliză).


Determinarea ALT este cel mai utilizat test pentru detectarea leziunilor hepatice.

Tabelul 2-14

Valori de referinţă pentru alaninaminotransferază la animale Specia Valori de referinţă

(U/L)Câine 8.2-57.3Pisică 8.3-52.5Vacă 6.9-35.3Cal 2.7-20.5Oaie 14.8-43.8

Amilaza serică

Amilaza face parte din categoria hidrolazelor, subgrupa de enzime care catalizează degradarea hidrolitică a amidonului, a glicogenului, a poli- şi oligozaharidelor. Amilaza este o enzimă de secreţie exocrină, care este reprezentată în ser sub două forme inzoenzimatice principale: pancreatică (40% din amilaza serică totală) şi salivară (60% din amilaza serică totală). În cantităţi mici, enzima se întâlneşte şi în ficat, sucul duodenal, intestinul subţire, muşchiul scheletic.

Tabelul 2-15

Valori de referinţă pentru amilază la animale Specia Valori de referinţă

(U/L) Câine 269.5-1462.4 Pisică 371.3-192.6 Vacă 41.3-98.3 Cal 46.7-188.1 Oaie 140-270

Aspartataminotransferaza (ASAT/AST)

Aspartataminotransferaza este o enzimă ce face parte din clasa transaminazelor şi catalizează transferul grupării amino de la aspartat grupului cetonic al cetoglutaratului, cu formare de acid oxalic.

Tabelul 2-16

Valori de referinţă pentru aspartataminotransferaza la animale Specia Valori de referinţă

(U/L) Câine 8.9-48.5 Pisică 9.2-39.5 Vacă 45.3-110.2 Cal 115.7-287 Oaie 49.9-156.1


Lactat dehidrogenaza (LDH) Lactat dehidrogenaza este o enzimă intracelulară, în organism fiind întâlnită cu precădere în rinichi, miocard, musculatura scheletică, creier, ficat, plămâni.

Tabelul 2-17 Valori de referinţă pentru lactat dehidrogenaza la animale

Specia Valori de referinţă(U/L)

Câine 24.1-219.2Pisică 35.1-224.9Vacă 308.6-938.1Cal 102.3-340.6Oaie 83.1-475.6

2.4.6 Determinări biochimice ale compuşilor azotaţi neproteici

plasmatici

Acid uric seric Acidul uric rezultă din degradarea acizilor nucleici, reprezentând

produsul final al metabolismului purinelor. De la nivelul ficatului, este transportat prin plasmă la rinichi, unde este filtrat şi excretat într-un procent de aproximativ 70%.

Restul de acid uric este eliminat şi degradat în tractul gastrointestinal.

Tabelul 2-18 Valori de referinţă ale acidului uric la animale

Specia Valori de referinţăBovine 1-3mg/dLCâine 7mg/dLGăină 4.5mg/dL

Creatinina

Creatinina este anhidrida creatinei (acidul metilguanidilacetic) şi reprezintă forma sa de eliminare.

Creatinina este sintetizată în ficat şi după eliberare este preluată la nivelul musculaturii în procent de 98% unde au loc fosforilări, având rol important în stocarea energiei musculare.

Când această energie musculară este solicitată pentru nevoile proceselor metabolice, fosfocreatina este scindată până la creatină.

Cantitatea de creatină convertită în creatinină se menţine la nivelul constant, care este în raport direct cu masa de ţesut muscular a organismului. Creatina provenită prin aport proteic măreşte stocul de creatină şi creatinină. Reducerea aportului proteic scade nivelul creatininei prin absorbţia aminoacizilor arginină şi glicină, precursorii creatinei.


Creatinina este cel mai fix constituient azotat al sângelui neinfluenţat de majoritatea alimentelor, efort, ritm circadian, fiind corelată cu metabolismul muscular.

Tabelul 2-19 Valori de referinţă pentru creatinină la animale


Câine 0.5-1.6 Pisică 0.5-1.9 Vacă 0.6-1.8 Cal 0.9-2.0 Oaie 0.9-2.0

Bilirubina

În plasma sanguină se găseşte bilirubina care circulă legată de albumine şi constituie constanta numită bilirubinemie.

Bilirubina este produsă în macrofage prin catabolismul enzimatic al fracţiunii hem din diverse hemoproteine. Aproximativ 80% din bilirubina circulantă derivă din eritrocitele îmbătrânite. Când eritrocitele circulante ating sfârşitul ciclului vital ele sunt distruse de celulele reticuloendoteliale. Oxidarea hemului generează biliverdină, care este la rândul său metabolizată în bilirubină. Restul de 15-20% din bilirubina circulantă provine din distrugerea eritrocitelor mature din măduva hematogenă şi din metabolismul altor proteine ce conţin hem-citocromi hepatici, mioglobina musculară.

Bilirubina este transportată la ficat sub forma unui complex solubil bilirubină-albumină. La nivel hepatic are loc conjugarea bilirubinei cu acidul glucuronic, sub acţiunea UDP-glucuronil transferazelor.

Bilirubina conjugată include bilirubin-monoglucuroid, care predomină în lichidul biliar. Bilirubina conjugată este transportată în canaliculele biliare, de unde este deversată împreună cu bila în căile biliare şi apoi în intestin, unde suferă o serie de reduceri succesive cu formare de urobilinogen şi stercobilinogen. Stercobilinogenul şi o mică parte din urobilinogen sunt eliminate prin fecale. Cea mai mare parte a urobilinogenului este reabsorbită intestinal, ajunge prin circulaţia portală la ficat (circuitul enterohepatic), fiind reexcretat prin bilă.

Tabelul 2-20 Valori de referinţă pentru bilirubină la animale

Specia Valori de referinţă(mg/dL)

Câine 0.1-0.6Pisică 0.1-0.5Vacă 0.1-0.8Cal 0.3-3Oaie 0.1-0.5


2.4.7 Determinări biochimice a compuşilor minerali plasmatici

În plasma sanguină, sărurile minerale sunt ionizate în cationi şi anioni. Cationii cei mai importanţi sunt Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Co, I, S, Ni, iar anionii CI-, CO2H-, PO4H-, SO4 şi proteine. Concentraţia lor în plasmă constituie constanta care le poartă numele (natremie, calcemie, etc.)

Calciul ionic Din cantitatea totală de calciu plasmatic 45% este legată de albumină sub

formă neionizată şi nedifuzibilă, constituind o formă inactivă fiziologic. 5% din calciu este difuzibilă dar neionizată, fiind reprezentată de citrat, fosfat şi bicarbonat de calciu. Restul calciului se găseşte sub formă ionică sau liberă şi constituie fracţiunea fiziologic activă în procesele de hemostază şi de reglare a excitabilităţii neuromusculare şi concentraţia sa plasmatică este direct reglată de PTH (Paratiroid Hormon) şi 1.25 (OH)2D3 (calcitriol). Determinarea calciului ionic oferă indicaţii despre acţiunea proteinelor totale şi albuminei asupra nivelului calciului seric. Calciul ionic se determină după următoarea formulă:

Ca2+= (6 x Ca- PT/3):(PT + 6) Ca= calcemia (mg/dl); PT=proteinemia (g/dl)

Calciul seric Calciul este un component mineral major al oaselor 9.99% din cantitatea

de calciu din organism se află în oase şi dinţi, iar restul este distribuit în lichidele biologice şi ţesuturi moi.

Ionii de calciu joacă un rol important în transmiterea impulsurilor nervoase, contracţia musculară, funcţia cardiacă şi în procesele de coagulare. Relaţiile reciproce între intestinul subţire, schelet, rinichi şi sistemul endocrin menţin homeostazia calciului şi fosforului.

Valorile calciului seric pot fi influenţate de calcitonină, vitamina D, estrogeni, androgeni. Proteinele din sânge afectează nivelul calciului deoarece 45% din calciul seric este legat de proteine. Scăderea albuminei serice determină scăderea calciului seric total.

Tabelul 2-21 Valori de referinţă ale calciului la animale


Câine 8.7-11.8 Pisică 7.9-10.9 Vacă 8.4-11 Cal 10.4-13.4 Oaie 9.3-11.7


Fierul Cantitatea totală de fier din organism diferă în funcţie de vârstă şi sex.

Cea mai mare parte a fierului din organism se găseşte în compuşii hem, în special hemoglobină şi mioglobină. O cantitate foarte mică este conţinută în enzimele care utilizează fierul în schimbul de electroni: peroxidaze, catalaze şi ribonucleotid reductaze. Cea mai mare parte a fierului non-hemic este depozitat sub formă de feritină sau hemosiderină în macrofage şi hepatocite. Numai o fracţiune foarte mică (~0.1%) circulă în plasmă sub formă de Fe3+ legată de o proteină de transport, transferina.

Fierul este absorbit din intestinul subţire proximal sub formă de fier hemic şi fier feros (Fe2+), absorbţia sa fiind influenţată de aciditatea gastrică (scade în aclorhidie sau gastrectomie), factori potenţiatori şi inhibitori alimentari. Absorbţia se realizează prin intermediul unor proteine transportoare şi cu ajutorul unor enzime: ferireductaza, care converteşte Fe3+ din alimente în Fe2+ pentru transferul în celulele mucoasei intestinale şi o ferioxidază (hefaestina), care converteşte Fe2+ în Fe3+ la nivelul membranei bazolaterale, pentru transferul plasmatic.

Excreţia de fier are loc prin pierderile celulare la nivel gastrointestinal, cutanat, urinar şi pierderile menstruale la femeie. Cea mai mare parte a fierului funcţional din organism provine din reutilizarea fierului deja existent provenit din eritrocitele senescente distruse la nivelul sistemului reticuloendotelial, în principal din splină.

95

Capitolul III

FIZIOLOGIA APARATULUI CARDIOVASCULAR

97

Capitolul III Fiziologia aparatului cardiovascular

Cuprins

3. Determinări privind fiziologia aparatului cardiovascular 3.1 Cardiografia directă la broască 3.2 Automatismul inimii de broască. Ligaturile lui Stannius 3.3 Cordul izolat de broască 3.4 Acţiunea cardioinhibitoare a nervului vag 3.5 Acţiunea temperaturii asupra frecvenţei cardiace la broască 3.6 Asculataţia zgomotelor cardiace 3.7 Observarea microcirculaţiei la animale

Capitolul III Fiziologia aparatului cardiovascular 99

3. Determinări privind fiziologia

aparatului cardiovascular Aparatul cardio-vascular este format din inimă, artere, capilare şi vene. El

are rol în asigurarea deplasării sângelui la nivelul ţesuturilor în vederea realizării schimburilor respiratorii şi nutritive şi îndepărtării deşeurilor rezultate din metabolismul tisular, realizarea proceselor de adaptare şi apărare, coordonarea funcţiilor somato-vegetative.

Cordul este alcătuit din trei tipuri de muşchi: - muşchi atrial şi muşchi ventricular cu proprietatea de a se contracta

identic cu fibra musculară dar cu o contracţie mai puternică; - fibre musculare specializate excitatorii care prezintă proprietate

conductivă şi care se contractă slab datorită numărului scăzut de fibre contractile.

Muşchiul cardiac posedă o serie de proprietăţi funcţionale din care cele mai importante sunt automatismul, excitabilitatea, conductibilitatea şi contractilitatea.

Proprietăţile ţesutului cardiac vor fi studiate pe inima de broască şi cea de mamifer.

Inima de broască se compune din patru compartimente: sinus venos, atrii, ventricul, bulb aortic, care se contractă succesiv. Faţa ventrală prezintă un şanţ transversal (silonul atrioventricular). Între cele două atrii, orientat oblic spre stânga, se află bulbul aortic iar în interior o lamă spiralată îl divide într-o parte aortică şi una pulmonară. Faţa dorsală prezintă acelaşi silon atrioventricular şi un diverticul de formă triunghiulară cu pereţii foarte subţiri (sinusul venos). În cele două unghiuri superioare ale acestuia se varsă venele cave superioare, iar în unghiul inferior vena cavă inferioară. Sinusul venos se deschide în atriul drept, iar trunchiul comun al celor două vene pulmonare în atriul stâng.

Figura 3-1 Cordul la broască


În condiţii normale, excitaţia se generează la nivelul sinusului venos şi se conduce de la un compartiment la altul, dar fiecare compartiment dispune şi de un pacemaker separat. În condiţii fiziologice, pacemakerul sinusului venos generează frecvenţa cea mai mare, 60 bătăi pe minut, guvernând activitatea electrică a inimii. Pacemakerul atrial poate genera un ritm de aproximativ 50 bătăi pe minut, cel ventricular un ritm de 25 bătăi pe minut, iar cel din bulbul aortic un ritm de 10 bătăi pe minut. Între fiecare compartiment există o zonă joncţională la nivelul căreia conducerea electrică este încetinită. La aceste nivele impulsul electric întârziat permite o umplere mai bună a compartimentului următor şi implicit o hemodinamică mai eficientă.

3.1 Cardiografia directă la broască Succesiunea evenimentelor care se produc de la începutul unei bătăi

cardiace până la începutul bătăii următoare poartă denumirea de ciclu cardiac. Ciclul cardiac este compus din sistole şi diastole periodice. La o frecvenţă cardiacă de 70 contracţii/minut durata ciclului cardiac este de 0.85 sec, din care 0.1 sec este timpul necesar pentru sistola atrială iar pentru cea ventriculară sunt necesare 0.3 sec.

Cardiografia reprezintă înregistrarea grafică a ciclurilor cardiace, fiind unul dintre procedeele uzuale pentru studiul activităţii mecanice a inimii.

Materiale necesare: broaşte, planşetă de plută, trusă cu instrumente, ser fiziologic, suport universal cu cremalieră, suport orizontal cu furcă şi excentric Pachon, pârghie Engelmann, kimograf, cronograf Jaquet.

Metodă de lucru şi interpretare Se distruge sistemul nervos central la broască şi se fixează broasca pe

planşeta de plută cu faţa ventrală în sus. Se detaşează pielea secţionând inserţiile cutanate ale muşchiului sternocutanat. Pentru a deschide cavitatea toracică se prinde cu o pensă capătul inferior al sternului, se ridică uşor şi se incizează cu foarfecele peretele toracic, apoi centura scapulară pe ambele părţi. Rezultă un lambou triunghiular cu vârful în jos, care se îndepărtează. După îndepărtarea cavităţii toracice apare inima învelită în pericard, care se secţionează în direcţia axului longitudinal. Cu o baghetă de sticlă cu vârful butonat se evidenţiază şi apoi se secţionează frenul. Se prinde vârful ventriculului prin intermediul unei serfine cardiace la o pârghie înscriitoare tip Engelmann, aplicând o contragreutate. La interval de 3-4 minute se pipetează câte 1-2 picături de ser fiziologic pe cord. Se înregistrează timpul cu ajutorul unui cronograf Jaquet.

Pe cardiograma obţinută, undele de amplitudine mare corespund activităţii ventriculare, iar undele mici, situate anterior, corespund activităţii


atriale; uneori se înregistrează sub forma unei mici inflexiuni şi activitatea sinusului venos (în special când se lucrează cu pensa cardiografică Marey).

Figura 3-2 Înregistrarea sistolei şi diastolei la broască S-sistola; D-diastola

Perioada ascendentă corespunde sistolei ventriculare, cea descendentă

diastolei. Totalitatea actelor sinergice în sens transversal şi succesive în sens longitudinal, care se produc la nivelul inimii în intervalul de timp de la începutul unei sistole atriale, până la începutul altei sistole atriale, constituie o revoluţie sau un ciclu cardiac.

3.2 Automatismul inimii de broască. Ligaturile lui Stannius

O inimă menţinută in vitro în condiţii fiziologice deşi este izolată de organism îşi continuă activitatea sa ritmică. Originea automatismului cardiac, conform teoriei miogene, larg acceptată în prezent, este legată de existenţa ţesutului nodal, ţesutul specializat, cuprinzând nodulul sinusal, nodulul atrioventricular, fasciculul atrioventricular Hiss, ramurile fasciculului şi sistemul Purkinje, compus din ţesutul muscular embrionar. Între fibrele miocardice embrionare sunt diseminate celule şi fibre nervoase – sistemul excitoconducător. La broască nodulul sinusal este situat în peretele sinusului venos, în apropierea ganglionului Remak, ganglion parasimpatic unde sinapsează fibrele preganglionare ale nervului vag, iar corespondentul fasciculului Hiss este fasciculul Gaskell, situat în apropierea ganglionului Bidder. În miocardul de broască se găsesc numeroase celule nervoase, formând următoarele trei aglomerări: ganglionul Remak, situat în peretele sinusului venos, ganglionul Ludwig, situat în peretele interatrial şi ganglionul Bidder, care se găseşte la baza ventriculului. Rolul funcţional al acestor formaţiuni şi raportul de forţe dintre ganglioni este diferit. Elementele nervoase şi cele musculare specifice din structura miocardului nu pot fi disociate unele de altele, încât este greu de precizat care dintre ele sunt


răspunzătoare de producerea stimulilor cardiaci. Gradul de automatism la inima de vertebrate scade cu cât ne depărtăm de zona sinusului venos (de atriul drept). Acest fapt poate fi demonstrat prin secţionarea unor porţiuni de inimă, urmată de observarea comportării lor, sau prin ligaturile lui Stannius, prin care se izolează mecanic, fără a se secţiona diferite zone cardiace.

Materiale necesare: broaşte, instrumentar de disecţie, plute, aţă, ser fiziologic, aparatură de înregistrare.

Metodă de lucru şi interpretare Se distruge sistemul nervos central la broască şi se fixează cu ajutorul acelor de gămălie pe o planşetă de plută. Se ridică plastronul sternocostal, se secţionează pericardul şi frâul dorsal.

Prima ligatură se face între sinusul venos şi restul inimii. Se introduce un fir de aţă pe sub aortă, se ridică şi se răstoarnă inima, apoi se face ligatura la limita dintre sinus şi atrii. Atriile şi ventriculul se opresc în diastolă (mai târziu, după un interval de 5 minute până la o oră şi jumătate, reîncep să funcţioneze, dar cu un ritm mai lent), în timp ce sinusul continuă să se contracte.

În urma acestei ligaturi, sinusul îşi continuă activitatea ritmică însă atriile şi ventriculul se opresc. Această primă ligatură excită fibrele post ganglionare vagale declanşându-se efectul inhibitor.

Atunci când se realizează izolarea ganglionului Remak, impulsul motor nu mai ajunge la inimă, aceasta rămânând sub influenţa predominantă a ganglionului inhibitor Ludwig şi se opreşte în diastolă.

După aplicarea primei ligaturi, se aplică cea de a doua ligatură la limita dintre atrii şi ventricul. Ventricolul va începe să se contracte cu un ritm mai redus şi asincron faţă de ritmul sinusal. În acest caz se exclude rolul inhibitor al ganglionului Ludwig, acesta manifestându-se numai asupra atriilor.

Cea de a treia ligatură se execută pe o altă inimă de broască, între atrii şi ventricul, la nivelul şanţului atrioventricular. Sinusul şi atriile se controlează normal, ventriculul cu un ritm de 2-4 ori mai lent, ritmul idioventricular.

Cea de a treia ligatură izolează ganglionii Bidder de restul centrilor nervoşi, obţinându-se contracţiile asincrone ale atriilor şi ventriculului. Sinusul venos şi atriile au un ritm de contracţie mai alert fiind sub coordonarea ganglionului Remak, ventriculul înregistrând un ritm contractil mai scăzut datorită acţiunii ganglionului Bidder.

Se secţionează vârful ventriculului cu un foarfece; fragmentul se opreşte în diastolă, fiind deci lipsit de automatism.


Figura 3-3 Ligaturile lui Stannius pe cordul de broască

SV - sinus venos; A - atriu; V - ventricul; BAo - bulb aortic; Ao - aorta; VCS - vena cavă superioară.;VCI - vena cavă inferioară

3.3 Cordul izolat de broască Inima se poate contracta ritmic chiar după scoaterea ei din organism;

automatismul cordului se datoreşte sistemului excitoconducător. Acest lucru este posibil datorită capacităţii celulelor pacemaker de a genera impulsuri.

Componentele sistemului excito-conducător (SEC) al inimii sunt: 1. nodulul sinusal (sino-atrial, SA) reprezintă pacemakerul activ al inimii, generează impulsurile ritmice normale, fiind situat în apropierea deschiderii venei cave craniale. Fibrele nodulului sino-atrial sunt conectate cu fibrele musculaturii atriale astfel încât orice potenţial de acţiune care este generat în nodulul sino-atrial diseminează rapid în peretele atrial; 2. nodulul atrio-ventricular (AV) este situat în partea inferioară a septului interatrial. Nodulul reprezintă singura cale de legătură între atrii şi ventricul, realizând întârzierea conducerii excitaţiei la ventriculi. Această conducere lentă este cauzată de numărul redus de joncţiuni gap între celulele succesive din căile de conducere. Nodulul atrio-ventricular preia funcţia de pacemaker al inimii în momentul în care nodulul sino-atrial este distrus şi protejează ventriculii, datorită perioadei refractare lungi, de stimulii rapizi din centrii ectopici atriali. 3. Fasciculul Hiss porneşte din nodulul atrio-ventricular, parcurge partea superioară a septului interventricular după care se divide în două ramuri (dreaptă şi stângă) şi reţeaua Purkinje. Rolul sistemului Hiss-Purkinje este să conducă rapid excitaţia de la nodulul atrio-ventricular la pereţii ventriculari.

Materiale necesare: broaşte, aţă chirurgicală, ser fiziologic Metodă de lucru şi interpretare Se spinalizează o broască şi se recoltează cordul prin secţionarea marelor

vase. Se aşează cordul pe o sticlă de ceas în ser fiziologic. Se observă activitatea inimii şi se cronometrează contracţiile ritmice în afara organismului.


3.4 Acţiunea cardioinhibitoare a nervului vag Contingentul cel mai important de fibre parasimpatice bulbare provine

din nucleul dorsal al vagului, de unde fibrele preganglionare merg prin nervii vagi până în vecinătatea organelor pe care le inervează şi după sinapsă se distribuie vaselor organelor toracice şi din abdomenul superior. Segmentul sacral al parasimpaticului prin ramurile pelvine ale nervilor sacraţi (S2-S4) inervează vasele viscerelor pelvine (colonul sigmoid, şi rectul, vezica urinară, organele genitale), controlând irigaţia lor. Inervaţia parasimpatică eferentă a cordului provine din ambele ramuri vagale, fibrele preganglionare pleacă din nucleul dorsal al vagului, fac sinapsă în ganglioni situaţi în vecinătatea sau chiar în miocardul atrial şi ventricular, iar fibrele postganglionare scurte se distribuie atât sistemului excitoconductor cât şi miocardului atrial şi ventricular. Prin inhibarea principalelor proprietăţi ale inimii şi în special prin bradicardie, parasimpaticul reprezintă sistemul de protecţie al cordului. Nervii vagi în condiţii fiziologice exercită o acţiune de frenare permanentă asupra inimii (tonusul vagal), efect întreţinut reflex prin aferenţele provenite în special de la zonele reflexogene principale (sinocarotidiană şi endocardioaortică). De aceea, secţionarea nervilor vagi este urmată de creşterea frecvenţei cardiace. La om administrarea de blocanţi muscarinici (atropină) produce creşterea frecvenţei cardiace de la 70 la 150-180/min. Inervaţia parasimpatică eferentă vasculară are o importanţă funcţională minoră comparativ cu cea simpatică, fibrele parasimpatice fiind absente în anumite sectoare vasculare (capilare).

Materiale necesare: broaşte, instrumente de disecţie, aţă chirurgicală, ace cu gămălie, instalaţie pentru excitare electrică.

Metodă de lucru şi interpretare Se pune în evidenţă inima unei broaşte prin îndepărtarea plastronului sternal. Se disociază ţesutul conjunctiv şi musculatura din dreptul uneia din articulaţiile maxilarelor punându-se în evidenţă traseul carotidei alături de nervul laringelui şi nervul vag.

Se introduce o baghetă de sticlă cu vârful butonat pe sub întregul pachet vasculonervos, se izolează cu grijă trunchiul vagosimpatic, după care se trece un fir de aţă pe sub nervul vag şi se ridică peste excitator. Excitarea nervului cu un curent de intensitate medie timp de 2-3 secunde determină oprirea cordului. După reluarea activităţii contracţiile sunt mai frecvente, fapt ce corespunde excitării fibrelor ortosimpatice. La un excitant de intensitate mai slabă, efectul cronotrop şi inotrop negativ va fi mai puţin net, producându-se doar o rărire a contracţiilor cardiace, paralel cu diminuarea amplitudinilor, a forţei de contracţie.


La o excitaţie prelungită a nervului vag, inima oprită în diastolă îşi reia contracţiile, deşi se continuă stimularea nervului, dar cu un ritm mult mai rar (fenomenul de „scăpare ventriculară”). Reluarea activităţii se explică prin destinderea cavităţilor cardiace de către sângele ce se acumulează.

3.5 Acţiunea temperaturii asupra frecvenţei cardiace la broască

Creşterea temperaturii corporale determină creşterea frecvenţei cardiace, iar scăderea temperaturii corporale produce diminuarea acesteia. Aceste lucru se poate explica prin faptul că temperatura ridicată creşte permeabilitatea membranei celulare cardiace pentru ionii ce controlează frecvenţa cardiacă.

Materiale necesare: cord izolat de broască, ser fiziologic. Metodă de lucru şi interpretare Se aşează cordul izolat de broască pe o sticlă de ceas. Cu ajutorul unei

pipete se picură pe suprafaţa acestuia ser fiziologic rece (5⁰C), observându-se scăderea ritmicităţii cordului, după care se adaugă ser fiziologic încălzit la 25-30⁰C, observându-se creşterea frecvenţei cardiace.

3.6 Ascultaţia zgomotelor cardiace Fiecărui ciclu cardiac îi corespund două principale zgomote cardiace,

zgomotul sistolic şi zgomotul diastolic. Ascultaţia permite perceperea zgomotelor cardiac cu ajutorul unui stetoscop.

Zgomotele cardiace sunt produse de mişcările valvelor în timpul ciclului cardiac. Există două zgomote care se aud în mod normal (zgomotul 1, zgomotul 2), iar zgomotul 3 şi zgomotul 4 apar de obicei în situaţii patologice.

Zgomotul sistolic - este observat la începutul sistolei ventriculare, produs de închiderea valvelor mitrală şi tricuspidă, are o frecvenţă joasă. Zgomotul mitral 1 se aude cel mai bine la nivelul apexului iar zgomotul tricuspidian 1 se aude mai bine la baza xifoidului.

Zgomotul diastolic - este produs de închiderea valvelor aortică şi pulmonară, se observă la începutul diastolei ventriculare, are o frecvenţă mai înaltă şi se aude cel mai bine la baza cordului.

Zgomotul protodiastolic - este un zgomot care apare în prima partea a diastolei şi are o frecvenţă mai joasă. La tineret se aude în tahicardia paroxistică, iar la adulţi apare, de obicei, în insuficienta cardiacă.

Zgomotul presistolic - apare în partea de final a diastolei şi are o frecvenţă joasă.


Materiale necesare: câmpuri de ascultaţie, stetoscop, animale de fermă. Metodă de lucru şi interpretare Ascultaţia cordului se poate face direct sau indirect. Ascultaţia directă se

face cu ajutorul unui câmp de ascultaţie, confecţionat dintr-o bucată de pânză fină sau tifon, aplicând urechea pe aria cardiacă, înapoia articulaţiei humero-radio-ulnare. Ascultaţia indirectă este mai comodă, dă rezultate bune în delimitarea focarelor de ascultaţie, se face cu ajutorul stetoscopului.

Cele două zgomote cardiace marchează începutul, respectiv sfârşitul sistolei ventriculare. Cele două principale zgomote sunt separate de pauza mică, când are loc sistola ventriculară. Pauza mare, dintre sfârşitul celui de-al doilea zgomot şi începutul primului zgomot, coincide cu diastola ventriculară.

Limitele normale ale frecvenţei cardiace pe minut la diferite specii sunt următoarele: - cal 28-40; - vacă 36-60; - oaie şi capră 70-100; - porc 60-80; - câine 70-120; - pisică 110-140; - găină 200-300.

3.7 Observarea microcirculaţiei la animale Capilarele reprezintă segmentul vascular prin care are loc schimbul de

substanţe între sânge şi ţesuturi. Materiale necesare: broaşte, microscop, planşetă de plută cu un orificiu

circular la o extremitate cu diametrul de 2 cm, instrumentar de disecţie, clopot de sticlă, ser fiziologic clorurat 0.6% şi 0.9%, eter, cloroform, uretan, curara soluţie 1%, soluţii 0.l‰ de adrenalină şi de histamină, ace cu gămălie.

Metode de lucru şi interpretare: 1. Observarea circulaţiei sanguine la nivelul membranei interdigitale

la broască Se imobilizează broasca cu faţa dorsală în sus pe plăcuţa de plută.

Membrana interdigitală a piciorului posterior este întinsă în dreptul orificiului prin fixarea degetelor cu ace de gămălie.

Se distruge sistemul nervos central şi se fixează broasca pe o planşetă de plută, prevăzută la unul din colţuri cu un orificiu circular. Se examinează la microscop. Se observă arteriole în care globulele roşii de formă eliptică se deplasează mai repede în centrul vasului (curent axial) decât la periferia acestuia


(curent parietal). În capilare, al căror calibru este doar cu puţin mai mare decât diametrul hematiilor, acestea circulă încet, în coloană continuă, unele după altele. În venule curentul circulator este centripet, mai puţin rapid decât în arteriole şi lipseşte diferenţierea întâlnită la arteriole privind deplasarea cu viteze diferite a globulelor roşii din centrul vasului, respectiv de la periferia lui. Cu răbdare se pot vedea la periferia capilarelor şi fenomene de diapedeză, leucocite care străbat endoteliul capilar. Pipetând o picătură de adrenalină, soluţie 0.l‰, pe preparat, se constată o încetinire sau chiar o oprire a circulaţiei capilare din cauza acţiunii vasoconstrictoare a acestei substanţe. Dacă se pune o picătură dintr-o soluţie de histamină 0.l‰, se produce o dilataţie enormă a capilarelor. Prin secţionarea nervului sciatic se observă o vasodilataţie paralitică; la excitarea capătului periferic al nervului sciatic (se evită mişcarea labei prin obosirea muşchiului), se remarcă vasoconstricţia arteriolelor. Pe lângă vase, răspândite în stroma conjunctivă laxă, se văd celule cromatofore.

2. Observarea circulaţiei pe limba de broască Broasca se aşeză în decubit ventral. Se prinde limba de cele două

proeminenţe de la vârf, se trage în afară, se întinde deasupra unui orificiu practicat în placa de contenţie şi se fixează cu ace cu gămălie. Se umectează cu ser fiziologic şi se examinează la microscop. În limbă se văd două artere linguale şi trei vene, cea impară fiind situată pe linia mediană. Se remarcă prezenţa onor anastomoze arteriale şi venoase.

109

Capitolul IV

FIZIOLOGIA RESPIRAŢIEI

111

Capitolul IV Fiziologia respiraţiei

Cuprins

4. Fiziologia respiraţiei 4.1 Reglarea neurohormonală a respiraţiei 4.2 Automatismul centrului respirator la broască 4.3 Rolul diafragmei în respiraţie. Experienţa lui Donders 4.4 Valoarea presiunii interpleurale şi variaţiile acesteia 4.5 Determinarea capacităţii vitale a plămânilor cu ajutorul spirometrului 4.6 Determinarea dioxidului de carbon în aerul expirat

Cuprins

Cuprins

Capitolul IV Fiziologia respiraţiei 113

4. Fiziologia respiraţiei

4.1 Reglarea neurohormonală a respiraţiei Generarea şi adecvarea frecvenţei şi a volumului respiraţiei la necesităţile

metabolice şi la menţinerea pO2, pCO2 şi pH-lui sanguin în limite normale se realizează prin reglare nervoasă şi umorală sau chimică.

Materiale necesare: animal de laborator, cloraloză, uretan, kimograf, capsulă Marey, bobină de inducţie, cheie întrerupătoare, excitator de mână, semnal electric, cronograf, manometru cu mercur, aparat Kipp, instrumentar chirurgical obişnuit, vată, aţă, soluţii 1‰ de adrenalină, acetilcolină.

Metodă de lucru şi interpretare Experimentarea se poate face pe câine sau iepure anesteziat, fixat în

decubit dorsal. Se tunde părul în regiunea inferioară a gâtului şi se practică o incizie de 7 – 8 cm, pe linia mediană. Sub piele se găsesc cei 2 muşchi sternohioidieni, reuniţi printr-o aponevroză şi sub ei muşchii sternotiroidieni. Cu o sondă canelată şi prin dilacerare se pătrunde în profunzime până la trahee. Pe laturile ei se găseşte un pachet vasculonervos cuprinzând la câine carotida, jugulara internă şi cordonul vagosimpatic; la iepure vagul, conectivul simpatic cervical şi nervul depresor sunt individualizaţi din punct de vedere anatomic. Se izolează vagul şi se introduc sub acesta două fire de aţă. Respiraţia se înregistrează cu ajutorul unui pneumograf tip P. Bert sau se izolează traheea şi se introduce în lumenul ei o sondă traheală, fixând-o printr-o legătură; printr-un ac cu diametrul mare, înfipt perpendicular în sondă, se face comunicarea dintre sondă şi un tambur înscriitor Marey. Se poate folosi şi o canulă respiratorie în Y, cu două ramuri în partea liberă, una deservind respiraţia, cealaltă transmiţând variaţiile de presiune la tamburul înscriitor. Se conectează la carotidă un manometru cu mercur tip Ludwig. Excitarea nervilor se face cu curentul furnizat de către bobina de inducţie. Acţiunea dioxidului de carbon asupra respiraţiei. Inspiraţia unui amestec gazos care conţine 3 – 5% CO2 şi 50 – 60% oxigen este un bun mijloc pentru mărirea ventilaţiei pulmonare şi înlăturarea hipoxiei la animalele intoxicate cu gaze sufocante sau în urma unei narcoze profunde. O creştere de numai 0.01% a conţinutului de CO2 în aerul alveolar măreşte ventilaţia pulmonară în medie cu 5%.

Pentru a demonstra acest lucru se prepară, cu ajutorul unui aparat Kipp, dioxid de carbon. Se face legătura dintre aparat şi canula respiratoare, astfel ca aerul inspirat să antreneze şi CO2 ce se degajă. Se înregistrează o intensificare a amplitudinilor mişcărilor respiratorii şi o uşoară tahicardie. Centrul respirator este stimulat de creşterea conţinutului de dioxid de carbon din sânge. Prin creşterea


conţinutului de CO2 în sânge (ca şi prin sărăcirea acestuia în oxigen) se produce în plus excitarea chemoceptorilor din zona endocardoaortică şi sinocarotidiană. Aceasta provoacă în mod reflex adâncirea respiraţiei şi o creştere a frecvenţei mişcărilor respiratorii.

Reducerea CO2 alveolar, prin hiperventilaţie, cu ajutorul unui aparat de respiraţie artificială, cu o frecvenţă de 120 min, este urmată de o apnee, apoi de o bradipnee, datorită hipocapniei.

Prin ocluzionarea celeilalte carotide primitive se produce o hipertensiune, cu polipnee, consecinţa hipoxiei sinocarotidiene prin chemosensibilitate.

Baroceptorii zonelor aorticocarotidiene, în caz de creştere a presiunii sanguine, determină reflex de vasodilataţie, bradicardie şi bradipnee (barosensibilitate). Scăderea presiunii sanguine, în caz de hemoragie, dă un rezultat contrar. La injectarea noradrenalinei (5 µg/kg intravenos) apare creşterea presiunii urmată de bradicardie (presiunea diferenţială crescută) şi rărirea sau oprirea respiraţiei – apnee adrenalinică.

Excitaţia mucoasei traheii şi a bronhiilor provoacă reflex o expiraţie puternică cu strâmtorarea simultană a glotei. Curentul de aer se elimină sub o presiune considerabilă, eliminând particulele iritante. Prin excitarea capătului central al nervului laringian superior se poate provoca tusea. Se produce o expiraţie puternică urmată de inhibiţia ulterioară a mişcărilor respiratorii.

Se intensifică anestezia (se administrează intravenos 0,5 ml/kg-1 pentobarbital sodic - Nembutal) şi se fixează o canulă în T la extremitatea liberă a sondei traheale; una din ramuri se branşează la o seringă de 100 ml. Prin aspirarea bruscă a 100 ml aer la sfârşitul expiraţiei apare o inspiraţie suplimentară sau „extrasistolă respiratorie”, consecinţă a reflexului de repliere Hering şi Breuer; reflexul nu mai apare în urma secţionării trunchiurilor vagosimpatice.

Se înregistrează mişcările respiratorii normale, după care se secţionează simultan ambii nervi vagi. Apare o adâncire şi o încetinire a respiraţiei, precum şi tahicardie. După dubla vagotomie impulsurile nu mai ajung de la mecanoreceptorii plămânului dilatat (excitaţiile de „inflaţie pulmonară” de la receptorii de întindere peribronhici lent adaptabili) la centrul respirator bulbar, excitaţia subcentrului inspirator se menţine, inspiraţia nu se întrerupe, mişcările respiratorii devin mai rare şi mai profunde (bradipnee), care după câteva ore se transformă într-o respiraţie periodică de tip Cheyne - Stokes – perioade relativ lungi de apnee întrerupte de câteva mişcări respiratorii inegale ca amplitudine.

La excitarea capătului central al nervului vag se obţine oprirea mişcărilor respiratorii în stadiul de inspiraţie sau de expiraţie.


Pereţii bronhiolelor mici conţin fibre musculare netede (muşchii Reisseisen), care contractându-se duc la îngustarea lumenului. Inervaţia musculaturii bronhice este dublă: parasimpatică şi ortosimpatică.

Filetele parasimpatice provin din vag direct sau din recurent. Cele ortosimpatice derivă din ganglionul stelat şi din ganglionii segmentari toracici V-VI-VII, alipindu-se bronhiilor în dreptul hilurilor. Excitarea filetelor parasimpatice produce contracţia musculaturii bronhice (bronhospasmul). Excitarea filetelor ortosimpatice are efect inhibitor, relaxând musculatura bronhiilor. Adrenalina, atropina, anihilează spasmul bronhiolelor. La acetilcolină intravenos (50 - 500 µg) presiunea scade în urma vasodilataţiei şi uneori apar manifestări de bronhospasm. La excitarea capătului periferic al vagului se remarcă, de asemenea, o bronhoconstricţie, tradusă prin respiraţii mai ample şi mai frecvente.

4.2 Automatismul centrului respirator la broască Centrul respirator bulbar emite în mod ritmic stimuli care prin intermediul

neuronilor medulari ajung la muşchii respiratori. Iniţierea acestor stimuli se face în afara oricărui impuls nervos periferic. Activitatea ritmică a centrului respirator nu este abolită printr-o secţiune retrobulbară şi suprapontină, la care se asociază deaferentarea sa totală. Neuronii inspiratori au proprietatea de a elabora printr-un mecanism intrinsec, descărcări ritmice, fapt condiţionat de nivelul desfăşurării locale a proceselor metabolice.

Materiale necesare: broaşte, kimograf, pârghie simplă, eter, alcool, ser fiziologic pentru poikilotermie, instrumentar chirurgical obişnuit.

Metodă de lucru şi interpretare Se lucrează pe o broască imobilizată, prin inhalarea vaporilor de eter sau

badijonarea pielii cu alcool, fixată în decubit dorsal pe placa de vivisecţie, cu serfina peniţei înscriitoare ancorată în regiunea submandibulară; se înregistrează câteva mişcări de respiraţie normale (mişcările de înghiţire ale aerului). La broască, aerul este introdus în cavitatea bucofaringiană prin orificiile nazale, în urma negativizării presiunii din această cavitate, prin relaxarea musculaturii planşeului; ulterior, prin contracţia aceleiaşi musculaturi, aerul va fi împins spre plămâni.

Se întrerupe înregistrarea şi se îndepărtează cei doi saci pulmonari, după incizia pereţilor laterali ai corpului în regiunea toracică; faţă de eupneea iniţială respiraţia nu suferă modificări semnificative prin îndepărtarea principalei zone reflexogene.


Se întrerupe din nou înregistrarea, se fixează broasca în decubit ventral, cu capul flectat şi se efectuează secţionarea transversală, retrobulbară, a măduvei spinării. După suprimarea acestor aferenţe somato-viscerale respiraţia persistă, ceea ce demonstrează că activitatea automată a centrilor respiratori bulbari este suficientă pentru asigurarea ventilaţiei pulmonare.

Broasca va fi umectată cu ser fiziologic pe toată durata experimentului; se va preveni hemoragia exagerată.

4.3 Rolul diafragmei în respiraţie. Experienţa lui Donders Respiraţia asigură schimburile de gaze între organism şi mediu necesare

proceselor metabolice tisulare. La mamifere respiraţia se realizează în trei etape: - pulmonară, reprezentată de schimburile de gaze între atmosferă şi alveolele pulmonare; - sanguină, prin schimbul de gaze între alveolele pulmonare şi sânge; - tisulară, determinată de schimbul de gaze respiratorii între sânge şi ţesuturi.

Plămânii nu conţin musculatură ale cărei contracţii să condiţioneze modificările ritmice, ale volumului lor. Plămânii îşi modifică volumul prin mişcările de ridicare şi coborâre ale diafragmului care modifică volumul cavităţii toracice.

Aderenţa pleurei viscerale la pleura parietală se datorează „tracţiunii hidraulice”, realizată de filmul de lichid pleural şi de inegalitatea Pip>Pipl (presiunea intrapulmonară fiind mai mare decât presiunea interpleurală). Distensia plămânilor se produce în cazul când presiunea aerului pe suprafaţa lor internă depăşeşte presiunea exercitată asupra suprafeţei exterioare. Această diferenţă a presiunii de pe ambele părţi ale plămânilor se poate obţine atât prin ridicarea presiunii intrapulmonare (din interiorul plămânilor) cât şi prin reducerea presiunii din spaţiul ce înconjoară plămânii. Pentru ilustrarea acestui principiu se foloseşte modelul lui Donders.

Materiale necesare: dispozitiv Donders, plămâni de câine, cobai sau broască, instrumentar de laborator.

Metodă de lucru şi interpretare Modelul lui Donders constă dintr-un clopot de sticlă cu gâtul larg, al cărui

fund este înlocuit cu o membrană de cauciuc. Plămânii fixaţi în interiorul acestui clopot comunică cu aerul exterior prin dopul care închide ermetic gâtul clopotului. Prin întinderea membranei de cauciuc a clopotului, volumul acestuia se măreşte şi aerul din spaţiul care înconjoară plămânii se rarefiază, presiunea în clopot devenind mai joasă decât cea atmosferică. Presiunea atmosferică acţionează la nivelul alveolelor prin tubul introdus în trahee. Datorită diferenţei de presiune de


pe cele două feţe, plămânul îşi va mări volumul, aerul pătrunzând în interiorul acestuia. Variaţiile de presiune din interiorul clopotului se pot citi la un manometru cu mercur sau cu apă, care este în legătură prin dopul de cauciuc, cu interiorul şi corespund presiunii interpleurale. Se evidenţiază astfel rolul diafragmei în realizarea inspiraţiei.

La recoltare se va avea grijă să nu se lezeze plămânii. Recoltarea plămânilor la broască se face în urma decapitării şi distrugerii măduvei spinării. În fanta glotică se introduce o canulă care se fixează printr-o ligatură; se deschide cavitatea toracică, se scot plămânii şi se fixează canula în dopul cu care este astupat orificiul clopotului de sticlă. Dispozitivul Donders pentru plămânul de cobai sau broască poate fi mai mic şi mai simplu; poate fi înlocuit printr-un vas prevăzut cu o tubulatură laterală, prin care se introduce sau se scoate aerul cu o seringă.

4.4 Valoarea presiunii interpleurale şi variaţiile acesteia În spaţiul interpleural există o presiune inferioară celei atmosferice,

impropriu denumită presiune negativă sau vid pleural - presiunea interpleurală (Pipl).

Materiale necesare: kimograf, capsulă Marey, semnal electromagnetic, cronograf, manometru cu apă, animal de laborator.

Metodă de lucru şi interpretare Demonstrarea existenţei unei presiuni negative în spaţiul virtual dintre

cele două foiţe pleurale se face în urma pleurocentezei, recomandabil în partea dreaptă, pentru a se înlătura pericolul traumatizării cordului. Se preferă a se lucra pe animale narcotizate.

Locul puncţiei se determină prin numărarea coastelor începând cu a 18-a la cal, a 13-a la vacă, a 14-a la porc, a 13-a la câine. Puncţia se face cu 2-5 cm deasupra venei toracice externe, la marginea anterioară a coastei, pentru a evita lezarea vaselor şi a nervilor intercostali. Înainte de introducerea acului se tunde şi se badijonează cu tinctură de iod locul respectiv, iar pielea se deplasează lateral. Acul se introduce perpendicular, apreciind grosimea peretelui toracic (3-4 cm la cal), până când apare senzaţia de pătrundere în gol. Acul comunică printr-un tub de cauciuc cu un manometru cu apă. În momentul pătrunderii în cavitatea pleurală, apa din manometru urcă în ramura legată de cavitate. Denivelarea apei din cele două ramuri ale manometrului, măsurată în mm H2O, transformată în mm Hg (se împarte la 13.6), reprezintă forţa elastică a plămânilor - presiunea elastică (Pel) fiind egală cu diferenţa dintre presiunea atmosferică (Pa) şi presiunea ce există în fanta interpleurală (Pel = Pa - Pipl). Se ştie că în timpul când plămânii nu


se destind şi nici nu se colabează (în condiţie statică), presiunea ce se exercită asupra peretelui intern al plămânilor prin căile respiratorii (presiunea intrapulmonară - Pip) este egală cu presiunea atmosferică existentă în momentul şi locul dat. Presiunea intrapulmonară ţine deci în echilibru presiunea interpleurală şi presiunea elastică a plămânului: Pip = Pipl + Pel.

Tabelul 4-1

Spaţiul de elecţie pentru pleurocenteză

Specia Spaţiul de elecţie stânga dreapta

Cal 7-8 5-6 Vacă 7 6 Porc 8 7

Câine 8 6

Presiunea elastică este mai mare în inspiraţie decât în expiraţie (presiunea interpleurală scade în inspiraţie şi creşte în expiraţie). Legând cealaltă ramură a manometrului cu apă la un tambur înscriitor Marey, oscilaţiile coloanei de apă se vor transmite şi se vor putea înscrie astfel variaţiile de presiune din spaţiul interpleural. Scăderea presiunii interpleurale din cursul inspiraţiei activează afluxul de sânge spre inimă, umplerea atriilor, circulaţia limfatică, progresiunea bolului în esofag (deglutiţia se efectuează în apnee de inspiraţie). Presiunea în spaţiul interpleural la iepure este mai mică decât cea atmosferică la sfârşitul unei expiraţii obişnuite cu 2.5 mmHg, şi cu 4.5 la sfârşitul unei inspiraţii obişnuite, la câine cu 4 şi respectiv 10, la oaie cu 8 şi respectiv 14, la cal cu 6 şi respectiv 16, iar la om cu 3-4 şi respectiv 10-15. La sfârşitul unei inspiraţii maxime depresiunea atinge 20 mm Hg la iepure. Prin astuparea orificiilor nazale se reproduce inspiraţia cu glota închisă de la rumegătoare, în timpul rejecţiei bolului mericic şi se apreciază scăderea însemnată a presiunii interpleurale.

4.5 Determinarea capacităţii vitale a plămânilor cu ajutorul spirometrului

Capacitatea vitală pulmonară sau indicele spirometric reprezintă volumul maxim de aer care poate fi eliminat din plămâni printr-o expiraţie forţată în urma unei inspiraţii forţate.

Materiale necesare: spirometru, alcool, vată. Metodă de lucru şi interpretare Spirometrul este un aparat în care se introduce aerul expirat şi care indică

volumul introdus. Cel mai cunoscut este spirometrul cu apă Hutchinson. Acesta este format din 2 cilindri metalici, care se întrepătrund; cilindrul exterior este


deschis la partea superioară şi se umple cu apă. Un tub metalic pătrunde prin mijlocul cilindrului exterior, de jos în sus, până la suprafaţa lichidului, iar în afară se continuă cu un tub de cauciuc prevăzut la extremitatea sa cu un tub de sticlă, ebonit sau o mască. Cilindrul interior, lipsit de baza inferioară, este introdus în primul, realizând datorită apei, un spaţiu etanş; el va fi ridicat de aerul expirat, iar volumul acestuia este indicat de o scară gradată fixată pe cilindru. Deseori, cilindrul superior (clopotul) este echilibrat cu greutăţi prin intermediul unui scripete.

Figura 4-1 Spirometru Volumele pulmonare sunt:

1. Volumul respirator curent (VRC), reprezintă volumul de aer care intră în plămâni în timpul inspiraţiei lejere sau volumul de aer care iese din plămâni în timpul unei expiraţii lejere; 2. Volumul inspirator de rezervă (VIR), reprezintă volumul de aer care intră în plămâni în timpul unei inspiraţii efectuate în continuarea unei inspiraţii lejere; 3. Volumul expirator de rezervă (VER), reprezintă volumul de aer care iese din plămâni în timpul unei expiraţii forţate efectuate în continuarea unei expiraţii lejere; 4. Volumul rezidual (VR), reprezintă cantitatea de aer care rămâne în plămâni la sfârşitul unei expiraţii forţate; 5. Volumul de colaps (VC), reprezintă volumul de aer care iese din plămâni în timpul producerii pneumotoraxului; 6. Volumul minimal (VM), reprezintă volumul de aer care rămâne în interiorul plămânilor după realizarea pneumotoraxului.

Capacităţile pulmonare sunt: 1. Capacitatea pulmonară totatală (CPT), reprezintă suma tuturor volumelor pulmonare;


2. Capacitatea vitală (CV), reprezintă suma dintre volumul respirator curent, volumul inspirator de rezervă şi volumul expirator de rezervă; 3. Capacitatea reziduală funcţională (CRF), reprezintă suma dintre volumul expirator de rezervă şi volumul rezidual; 4. Capacitatea inspiratorie (CI), reprezintă suma dintre volumul respirator curent şi volumul inspirator de rezervă.

Volumul aerului respirator curent, care ventilează plămânii în cursul mişcărilor respiratorii normale, neforţate, este:

- om 400-500 ml; - cal 7500 ± 300 ml; - bou 3400-4200 ml; - oaie 290-450 ml; - porc 286 ± 25 ml; - câine 200 ± 80 ml; - pisică 2 5-34 ml. Capacitatea vitală (volumele de aer expirate forţat în urma unei inspiraţii

forţate AC + VRI + VRE) - a fost propusă de Hutchinson ca măsură a funcţiei respiratorii. Efortul fizic determină creşterea capacităţii vitale. În condiţii patologice (modificări de elasticitate ale cutiei toracice, paralizia unor muşchi respiratori, pneumotorax, insuficienţă cardiacă cu stază circulatorie pulmonară etc), se produce o scădere a capacităţii vitale. La cal, aerul complementar (VRI), respectiv cel de rezervă (VRE) este apreciat la 10-12 litri.

Figura 4-2 Reprezentarea grafică a volumelor şi capacităţilor respiratorii

Capacitatea vitală a diverselor animale poate fi apreciată utilizând formula:

Capacitatea vitală (litri) = 0.0565. Greutatea (kg)1,02


Pentru a determina aerul respirator curent, persoana examinată trimite în spirometru aerul de la 5 expiraţii normale (cantitatea de aer expirat fiind egală cu cantitatea de aer inspirat). Cifra indicată de scara spirometrului se împarte la 5. Aerul complementar (VIH) se află, făcând o serie de cinci expiraţii normale, în urma unor inspiraţii forţate cu pauză între ele cu un minut; din media obţinută se scade aerul respirator curent. Aerul de rezervă (VER) se calculează scăzând aerul respirator curent din media a 5 expiraţii forţate în urma unor inspiraţii normale, făcute la un interval de 1 minut.

4.6 Determinarea dioxidului de carbon în aerul expirat Dioxidul de carbon care rezultă din catabolizarea substanţelor organice

este transportat pe cale sanguină de la ţesuturi la plămâni, unde difuzează în aerul alveolar, iar de aici este eliminat împreună cu aerul expirat.

Materiale necesare: spirometru sau sac Douglas cu mască şi supapă expiratorie, două tuburi de sticlă, soluţie saturată de hidroxid de bariu, soluţie N/10 de acid sulfuric, indicator (metil-orange), pipete, centrifugă cu eprubetele respective, biuretă, vase de titrare.

Metodă de lucru şi interpretare Într-un balon curat, se iau 10 ml de hidroxid de bariu soluţie saturată, se

adaugă 1-2 picături de metil-orange şi se titrează cu soluţie N/10 de acid sulfuric. La virarea culorii indicatorului din galben-pai în roz, se face citirea. Titrarea se repetă, calculându-se media cantităţii de acid folosită.

În două tuburi, unul cu o capacitate de 100 ml şi altul de 50 ml, se toarnă hidroxid de bariu soluţie saturată, se astupă cu dopuri şi se unesc între ele. Într-un spirometru se strâng 3 litri de aer expirat şi se pune în legătură cu tubul de 100 ml. Se trece din spirometru (sau din sacul Douglas) prin tubul cu hidroxid de bariu 2 litri aer, încet, cu bule mici. Soluţia tulbure care se obţine se toarnă într-un balon (soluţia din tubul de control mic de 50 ml trebuie să rămână limpede). Din lichidul tulbure se umplu două eprubete şi se centrifughează. Se iau din fiecare eprubetă câte 10 ml soluţie transparentă şi se titrează. Se găseşte o diferenţă de titrare, numărul de mililitri de acid sulfuric folosit pentru titrarea soluţiei de hidroxid de bariu fiind de data aceasta mai mic.

Exemplu de calcul. Presupunând că diferenţa în titrarea soluţiei de hidroxid de bariu înainte şi după barbotarea aerului expirat este de 6 ml acid sulfuric N/10, la 100 ml hidroxid de bariu revin 60 ml acid sulfuric. Diferenţa se datorează faptului că o parte din hidroxidul de bariu s-a combinat cu dioxidul de carbon:

Ba (OH)2 + CO2 = BaCO3 + H2O


Diferenţa de titrare se va exprima în unităţi ponderale. Titrul acidului sulfuric N/10 este egal cu 0.0049 g. La cei 60 ml SO4H2 corespund 0.294 g.

În continuare se determină la ce număr de grame de CO2 corespunde această cantitate de SO4H2 (0.294 g). Se ştie că 49 g SO4H2 sunt echivalente cu 22 g CO2.

De unde: X= (22 x 0.294)/49 = 0.132 g CO2

Se exprimă această cantitate în unităţi de volum. Un litru de CO2 cântăreşte 1.94 g (greutate specifică) sau 1.97 g CO2 ocupă un volum de l000 ml. Prin urmare 0.132 g vor ocupa: X = (1000 x 0.132)/1.97 = 67 ml. Deci în 2 litri aer expirat au fost 67 ml CO2 sau procentual: X = (67 x 100)/2000 = 3.35%. În mod normal conţinutul în CO2 în aerul expirat oscilează între 3.3 şi 4%.

Dacă în tubul de control s-a obţinut tulburarea soluţiei, se va amesteca şi aceasta cu hidroxidul de bariu din tubul mare, principal. Se manipulează la fel, însă la calcul se va porni nu de la 100 ml, ci de la 150 ml.

123

Capitolul V

FIZIOLOGIA SISTEMULUI EXCRETOR

125

Capitolul V Fiziologia sistemului excretor

Cuprins

5 Fiziologia sistemului excretor 5.1 Densitatea urinei 5.2 Teste privind compoziţia chimică a urinii

Capitolul V Fiziologia sistemului excretor 127

5. Fiziologia sistemului excretor Rinichii au rolul de a filtra deşeurile metabolice şi produselor înrudite din

sânge, ajutând la reglementarea cantităţii de apă din organism şi stocarea proteinelor, electroliţilor şi a alţi compuşi pe care organismul îi poate refolosi.

Tot ce este nefolositor organismului animal este excretat prin urină. Urina este, în general, de culoare galbenă şi relativ clară, dar aceasta poate varia în funcţie de constituenţi.

Urina este un lichid cu o compoziţie chimică complexă, conţinând apă în care sunt dizolvate diverse substanţe minerale şi organice. În mod uzual, concentraţia acestor componente în urină este stabilă, analiza compoziţiei urinei ne poate da indicaţii asupra modului de funcţionare a rinichiului.

Analiza completă de urină include determinarea caracterelor fizice (culoare, aspect, greutate specifică), chimice (pH, proteine, glucoza, corpi cetonici, hematii, bilirubina, urobilinogen, leucocite, nitriţi) şi examenul microscopic al sedimentului.

Biochimia urinei se determină printr-o metoda semicantitativă, cel mai adesea pe un analizor automat, folosind stripuri de urină. Acest tip de test este rapid şi măsoară elementele din urină care sunt semnificative pentru disfuncţii renale, urinare, hepatice şi metabolice. În eventualitatea unei modificări patologice, se produce o schimbare de culoare în zona testului respectiv, care se compară cu o scală de culori predefinită. Intensitatea culorii permite o evaluare semicantitativă a rezultatului.

Metodele de dozare cantitativă a componenţilor urinari anorganici (sodiu, potasiu, calciu, clor) sunt identice cu cele de la sânge, folosindu-se urina primară. Atunci când se urmăreşte dozarea unui anumit component urinar, se foloseşte urina colectată pe parcursul a 24 de ore, deoarece excreţia unor constituienţi este supusă unui ritm circadian.

Pentru corectitudinea rezultatelor, urina trebuie examinată cel mult la 2-3 ore de la emisie. Dacă acest lucru nu este posibil, proba de urină trebuie supusă conservării:

congelare la temperaturi sub -20°C; 5 ml timol 10% în izopropanol; 1.5g/l metil-4-hidroxibenzoat; 5 ml HCl 10N pentru dozarea catecolaminelor şi steroizilor; 1 ml formaldehidă 40% în 10 ml urină pentru conservarea

elementelor morfologice din sedimentul urinar.


5.1 Densitatea urinei Densitatea urinei măsoară capacitatea rinichiului de a concentra urina.

Testul compară densitatea urinei faţă de densitatea apei distilate, care are greutatea specifică 1.0.

Testul detectează concentraţia de ioni din urină. În prezenţa cationilor protonii sunt eliberaţi de un agent complex şi produc o schimbare a culorii pe strip.

Densitatea urinară este dependentă de cantitatea de fluide ingerată, transpiraţii abundente, efectul temperaturilor scăzute.

Densitatea variază invers proporţional cu cantitatea de urină excretată; în anumite condiţii această relaţie nu este valabilă: diabet (volum şi densitate urinară crescută); hipertensiune (volum normal, densitate scazută); afecţiuni renale cronice (volum crescut, densitate scăzută).

Tabelul 5-1

Volumul şi densitatea urinii la animale

Specia Volumul (ml/Kg/zi) Densitatea

Pisică 10-20 1.020-1.040 Vacă 17-45 1.030-1.045 Câine 20-100 1.016-1.060 Capră 10-40 1.015-1.045

Cal 3-18 1.025-1.060 Porc 5-30 1.010-1.050 Oaie 10-40 1.015-1.045

5.2 Teste privind compoziţia chimică a urinii Evidenţierea clorului

Materiale necesare: eprubete, urină de analizat, acid azotic 5%, azotat de argint 2%.

Metodă de lucru şi interpretare Într-o eprubetă se adaugă 5 ml urină de analizat şi câteva picături de acid

azotic 5%, până când reacţia urinei devine acidă. Se adaugă 1 ml soluţie de azotat de argint 2% observându-se obţinerea unui preciptat abundent de clorură de argint.


Evidenţierea amoniacului Prin urină, se elimină în mod normal o cantitate mică de amoniac, sub

formă de săruri de amoniu. Această excreţie urinară de amoniac contribuie la conservarea rezervei alcaline a sângelui. Concentraţia amoniacului urinar împreună cu aciditatea totală a urinii constituie un indicator al echilibrului acido-bazic al organismului în condiţiile de integritate morfofuncţională renală.

Materiale necesare: pahar Berzelius, baghetă de sticlă, proba de analizat, hârtie de turnesol, lapte de var.

Metodă de lucru şi interpretare Într-un pahar Berzelius se tratează 25 ml urină cu lapte de var, se

introduce hârtie indicator de turnesol, observându-se virarea culorii acesteia în albastru, ca urmare a degajării vaporilor de amoniac.

Evidenţierea creatininei

Creatinina este un component sanguin, eliminat numai pe cale renală, fiind reprezentativ pentru determinările ratei de filtrare glomerulară.

Materiale necesare: eprubete, urină, soluţie saturată de acid picric, hidroxid de sodiu 10%

Metodă de lucru şi interpretare Într-o eprubetă se prelevează 5 ml de urină de cercetat peste care se

adaugă câteva picături de soluţie saturată de acid picric şi hidroxid de sodiu 10%. Se va observa apariţia unei coloraţii roşii-purpurii, caracteristică creatininei.

Evidenţierea glucozei

Detectarea glucozei în urină depinde de nivelul glicemiei şi de integritatea funcţională a rinichiului.

Materiale necesare: sulfat de cupru, apă distilată, hidroxid de sodiu, tartrat dublu de sodiu şi potasiu, hidroxid de sodiu 10%, sulfat de cupru 10%, Reactiv Nylander (100 ml hidroxid de sodiu 10%, azotat bazic de bismut 2g, 4g sare Seignette).

Metode de lucru şi interpretare a) Metoda Fehling utilizează doi reactivi: Reactivul I: 4 g sulfat de cupru se dizolvă în 100 ml apă distilată; Reactivul II: 15 g hidroxid de sodiu şi 20 g tartrat dublu de sodiu şi

potasiu se dizolvă în 100 ml apă. Într-o eprubetă se introduc 5 ml din proba de analizat şi câte 0.5 ml din cei doi reactivi. Se agită conţinutul eprubetei şi se fierbe la becul de gaz. Se observă apariţia unui precipitat de culoare galben-roşcat datorită prezenţei oxidului cupros.


b) Metoda Trommer Într-o eprubetă se introduc 5 ml de urină de cercetat peste care se adaugă

hidroxid de sodiu 10% pentru ca aceasta să devină alcalină. Se adaugă sulfat de cupru 10%, picătură cu picătură până la virarea culorii în albastru. Reacţia este considerată pozitivă atunci când în eprubetă apare un precipitat roşcat.

c) Metoda Nylander Într-o eprubetă se introduc 10 ml urină şi 1 ml reactiv Nylander, se agită

şi se încălzeşte la becul de gaz. Se observă apariţia unui precipitat negru de bismut metalic datorită reducerii azotului.

Evidenţierea proteinelor

Materiale necesare: reactiv Esbach (10 g acid picric, 20 g acid citric, 1000 ml apă distilată), acid acetic 10%, soluţie de acid sulfosalicilic (10 g la 100 ml), acid tricloracetic 10%, acid azotic.

Metode de lucru şi interpretare

a) Metoda Esbach Într-un tub gradat (albuminometru) se introduce urina de analizat şi

reactiv Esbach, care are proprietatea de a precipita proteinele. Se lasă conţinutul în repaus 24 de ore, după care se citeşte înălţimea stratului de precipitat care este direct proporţională cu cantitatea de proteine.

b) Metoda cu acid acetic Într-o eprubetă se introduc 10 ml urină şi se supune încălzirii la becul de

gaz. Se adaugă câteva picături de acid acetic 10%, observându-se precipitarea albuminei, urina devenind tulbure.

c) Metoda cu acid sulfosalicilic Se adaugă într-o eprubetă 1 ml urină peste care se adaugă câteva picături

de soluţie de acid sulfosalicilic. Se observă apariţia unui precipitat alb care indică prezenţa proteinelor în urină.

d) Metoda cu acid tricloracetic La 4 ml probă de analizat se adaugă 1 ml soluţie de acid tricloracetic

10%. Se observă apariţia unui precipitat alb care indică prezenţa proteinelor. e) Metoda Heller

Într-o eprubetă se adaugă 2 ml acid azotic concentrat peste care se pipetează uşor, prin prelingere, 2 ml de urină. În prezenţa proteinelor la limita de separare a celor două lichide se formează un inel albicios.

Bibliografie 131

BIBLIOGRAFIE

1. Alexandru N., Barnu I., Bârză H., Maria Coloianu-Iordăcher, Pârvu G., Otilia

Zărnesc, 1998 - Tratat de hematologie animală. vol. I, Editura Fundaţia România de Mâine, Bucureşti.

2. Andrew J. Rosenfeld, 2007 – Veterinary Medical Team Handbook, Blackwell Publishing, USA.

3. Archetti I., Tittorelli C., Cerioli M., Brivia R., Grilli G., Lavazza A., 2008 - Serum Chemistry and Hematology values in commercial rabbits. 9th World Rabbit Congress, Verona, Italy.

4. Berceanu Şt., Manolescu N., 1985 - Hematologie comparată. Editura Medicală, Bucureşti.

5. Buss S.L., Bourdeau J.E., 1984 - Calcium balance in laboratory rabbits. Mineral Electrolyte Metab., vol. 10, p. 127-132.

6. Campbell T.W., 2004 - Mammalian hematology: Laboratory animals and miscellaneous species. In: Thrall MA: Veterinary Hematology and Clinical Chemistry, 1st edition, Lippincott Williams and Wilkins, p. 211-224.

7. Cheeke P.R., Amberg J.W., 1973 - Comparative calcium excretion by rats and rabbits. J. Anim. Sci., vol. 37, p. 450-454.

8. Chiericato G.M., Rizzi C., 1999 - Etude du profil métabolique, enzymatique et minéral de la lapine du sevrage à 120 jours. 8e Journ. Rech. Cunicoles Fr., Paris, ITAVI Édit. - Paris, p. 155-158.

9. Christopher D. M., Schulte P.M., 2006 - Principles of animal physiology. Ed. Benjamin Cummings.

10. Ciudin Elena, 2004 - Biologia animalelor de laborator. Editura Alfa, Iaşi. 11. Constantin N., Cotruţ M., Şanea A., 1998 - Fiziologia animalelor domestice.

Editura Coral Sanivet, Bucureşti. 12. Corringer T., Lebas F., Courtot D., 1972 - Régulation et contrôle de

l'évolution de l'équipement enzymatique du pancréas exocrine de la naissance à 6 semaines. Ann. Biol. Anim. Biochim. Biophys., vol. 12, p. 221-231.

13. Cunningham G. J.., KLEIN G B., 2007 - Veterinary Physiology. Ed. Elsevier. 14. Dojană N., Militaru Manuela, Militaru D., 1997 - Biologia şi patologia

animalelor de laborator. Editura Coral Sanivet, Bucureşti. 15. Domini R., 1967 - Anatomia macro et microscopia dei viceri e dei vasi epato-

splancnici del coniglio (Studio propedeutico alla chirurgia sperimentale). Lo Sperimentale, vol. 117, p. 341-362.

16. Dorofteiu M., 1989 - Mecanismele homeostaziei sanguine. Editura Dacia, Cluj-Napoca.

Bibliografie 132

17. Dorothy M.Black, Kirsten V.K. Gilardi, Laurissa P. Hamilton, 2009 - Hematologic and biochemistry reference values for the Endangered riparian Brush Rabbit. Journal of Wildlife Diseases, vol. 45, Issue 2.

18. Duncan & Prasse`s Veterinary Laboratory Medicine, 2003 - Clinical pathology.Wiley / Blackwell.

19. Feldeman B.F., Zinkl J.G., Jain N.C., 2000 - Veterinary hematology. Narajona Press, Denmark, ISBN 0-638-830692-8.

20. Freeman Kathleen P., 2007 - Veterinary cytology. Manson Publishing. 21. Fudge A.M., 1999 - Laboratory medicine: avian and exotic pets. WB

Saunders, Philadelphia. 22. Goad D.L., Pecquet M.C., Warren H.B., 1989 - Total serum calcium

concentrations in rabbits, J. An. Vet. Med. Assoc., 1994 (11), p. 1520-1. 23. Guyton C. A, Hall E.J, 2007 – Tratat de fiziologie a omului, Ed a 11-a,

Bucureşti, Editura Medicală Callisto. 24. Ghergariu S, Pop A., Kadar L, Spînu Marina, 2000 – Manual de laborator

clinic veterinar, ALL Educational, Bucureşti. 25. Harkness J.E.,Wagner J.E., 1989 - The biology and medicine of rabbits and

rodents. Ed. Lea & Febiger, Philadelphia, London. 26. Harvey W. John, 2001 – Atlas of Veterinary hematology. Elsevier`s Health

Sciences, Philadelphia. 27. Hăulică I., 2002 - Fiziologie umană. Editura Medicală, Bucureşti. 28. Hewitt C.D., Innes D.J., Savory J., Will M.R., 1989 - Normal biochemical

and haematological values in New Zealand White rabbits. Clinical Chemistry, vol. 35, No. 8.

29. Jones RT., 1975 - Normal values for some biochemical constituents in rabbits. Lab. Anim., vol. 9, Issue 2.

30. Kaneko J.J., Harvey J.W., Bruss M.L., 1989 - Clinical biochemistry of domestic animals. Academic Press, New York.

31. Kerr M., 1989 - Veterinary laboratory medicine. Clinical biochemistry and hematology. Blackwell Scientific Publications.

32. Kathleen P. Freeman, 2007 – Veterinary Cytology Dog, Cat, Horse and Cow, Manson Publishing London, UK.

33. Manolescu N., Nicolaie A., Avram N., 1999 - Tratat de hematologie animală, vol. I şi II, Editura Fundaţiei România de Mâine, Bucureşti.

34. Marcu Elena, Codrea M., 1997 – Fiziopatologie. Editura Universitatea Agronomică şi de Medicină Veterinară “ Ion Ionescu de la Brad”, Iaşi,.

35. Marcu Elena, Pavel Geta, 1999 – Fiziologie. Editura Vasiliana, Iaşi. 36. Mărgărint I., Bioşteanu P.C., Chelaru A., 2002 – Fiziologia animalelor.

Editura Ion Ionescu de la Brad, Iaşi.

Bibliografie 133

37. Morag G. Kerr, 2002 – Veterinary Laboratory Medicine, Clinical Biochemistry and Haematology. Blackwell Science Ltd, London.

38. Meyer J. Denny, Harvey W. John, 2004 – Veterinary laboratory Medicione. Interpretation and Diagnosis. Saunders, Missouri.

39. Mitruka B.M., Rawnley H.M., 1977 - Clinical biochemical and haematological references values in normal and experimental animals, Masson Publishing USA, Inc. 83, p. 134-135.

40. Nicolae Alexandru, Ilie Barnu, Horia Bârză, Coloianu-Iordăcher Maria, G. Pârvu, Zărnesc Otilia, 1998 - Tratat de hematologie animală. vol. I, Editura Fundaţia România de Mâine, Bucureşti.

41. Ognean L., Dojană N., Corina Roşioru, 2000 - Fiziologia animală. vol. I, Editura Presa Universitară Clujeană.

42. Oprean O.Z., 2002 - Diagnosticul necropsic la carnivorele de companie. Editura „Ion Ionescu de la Brad”, Iaşi.

43. Pârvu Gh., 1992 - Supravegherea nutriţional metabolică a animalelor. Editura Ceres, Bucureşti.

44. Pârvu Gh., Borna I., Teuşean V., 1997 - Tehnici, semiologie şi diagnostic hematologic veterinar. Bucureşti.

45. Pârvu Gh., Ilie Borna, Aurel Căprărin, 1984 - Hematologie veterinară practică. Editura Ceres, Bucureşti.

46. Răileanu C., Ioana Răileanu-Moţoiu, 1974 – Atlas de hematologie clinică. Editura Academiei Republicii Socialiste România, Bucureşti.

47. Scholem O.W., Jain N.C., Carroll E.J., 1975 - Veterinary Haematology. Lea and Febiger, Philadelphia.

48. Soru Eugenia, 1963 - Biochimie medicală. Editura Medicală, Bucureşti. 49. Teodorescu Exarcu I., 1974 - Patologie biochimică. Editura Medicală,

Bucureşti. 50. Thrall Mary Anna, 2005 - Veterinary Hematology and Clinical Chemistry,

Wiley-Blackwell. 51. Whithers Philip C., 1992 - Comparative animal physiology, Thamson

Learning, USA.

CARTE Final

Documents

Transcript of CARTE Final