Consideratii teoretice, aparatura si aplicatii practice

Un biosenzor este un instrument analitic care transforma un raspuns biologic intr-

un semnal electric.

Termenul de „biosenzor“ este adesea utilizat pentru a ingloba dispozitivele utilizate in

scopul determinarii concentratiilor unor substante sau a altor parametri de interes biologic,

chiar daca acestea nu utilizeaza un sistem biologic in mod direct.

Producerea de Biosenzori reprezinta, in present, un domeniu cu o extindere rapida, a

carei viteza de crestere anuala a fost estimate la 60%. Impulsul major provine din industria

producatoare de dispozitive pentru sanatate (de exemplu 6% din populatia Europei de vest

este diabetica si trebuie sa beneficieze de disponibilitatea unor biosenzori rapizi, exacti si

simpli pentru determinarea glucozei) dar si alte domenii solicita astfel de instrumente, asa

cum sunt aprecierea calitatii alimentelor sau monitorizarea mediului inconjurator.Totusi, in

prezent si in viitorul apropiat , se preconizeza studierea intensa a tuturor tipurilor de traductori

principali, astfel incat sa se largeasca utilizarea de biosenzori cat mai rapid in urmatorii ani.

Un biosenzor adecvat trebuie sa posede cel putin urmatoarele caracteristici:

      Biocatalizatorul trebuie sa fie inalt specific pentru scopul analizei;

      sa fie stabil in conditii de depozitare normale si, cu exceptia benzilor enzimatice de hartie si dipsticks (a se vedea mai tarziu), sa prezinte o buna stabilitate pentru un numar larg de determinari (de exemplu mai mult de 100);

      Reactia nu trebuie sa fie afectata de parametric fizici cum sunt agitarea pH sau temperatura. Aceasta ar permite analiza probelor cu un minim de pre-tratament.

      Daca reactia implica cofactori sau coenzime, acestea ar trebui, in mod preferabil, sa fie co-imobilizati cu enzima;

      Raspunsul trebuie sa fie exact, précis, reproductibil si liniar pe domeniul analitic utilizat, fara dilutie sau concentrare.

      Trebuie de asemenea sa fie liber de zgomot electric;      Daca biosenzorul trebuie sa fie utilizat pentru monitorizarea sistemelor invazive in

situatii clinice, trebuie sa micut si biocompatibil, sa nu aibe efecte antigenice sau toxice. Daca se vor utiliza in bioreactoare trebuie sa fie sterilizabili. Sterilizarea se realizeaza preferabil prin autoclavare dar nici un biosenzor cu enzime nu poate rezista unui asemenea drastic tratament termic-umed. In ambele cazuri, biosenzorul nu trebuie sa fie predispus spre viciere sau proteoliza;

      Biosenzorul complet trebuie sa fie ieftin, mic, portabil si capabil de a fi utilizat chiar de operatori mai putin dotati;

      Trebuie sa existe o piata pentru biosensor. Este clar ca exista o mica sansa sa se dezvolte un biosenzor daca alti factori (de exemplu subventii guvernamentale, angajerea continua a unor analisti dotati, sau slaba perceptie a consumatorilor) incurajeaza utilizarea metodelor traditionale si descurajeaza descentralizarea laboratoarelor de testare.

Biosenzorii se caracterizeaza prin:-rapiditate in raspuns;-simplitate de operare cu cerinte de instruire minime pentru utilizatori;-posibilitati de operare “in situ” sau in procese tehnologice care necesita o

monitorizare continua;-portabilitate,miniatirizare;-pret de cost scazut.

Principiul biosenzorului

Indiferent de complexitatea lui un biosenzor este alcatuit din trei parti principale:

-un sistem sau un element biologic (molecule de recunoastere),care este sensibil ratie selectivitatii lui la un anumit compus organic si este numit bioreceptor;

-un senzor fizic,care converteste modificarea chimica produsa de primul sistem intr-o marime electrica (masurabila);

-partea electronica de prelucrare.

Figura1. Biosenzor

Mai pot fi amintite in constructia biosenzorului si structurile membranare care separa elementele biosenzorului protejandu-le de variatiile mediului extern.

Clasificarea biosenzorilor se face in functie de:

-tipul bioreceptorului

-tipul traductorului

-aplicatia biosenzorului.

Biochimistii si inginerii,imitand principiile naturale de recunoastere,conversie si amplificare,incearca sa dezvolte senzorii performanti pentru substante organice. In natura exista recunoastere biologica,conversie biologica,amplificare biologica. La stadiul actual biosenzorul este alcatuit dintr-un sistem de recunoastere biologic in contact intim (fizic si functional) cu traductorul artificial. Deoarece senzorul vine in contact direct cu un material biologic,la alegerea lui trebuie sa se tina cont biocompatibilitate si interferentele chimice.

Dupa tipul senzorului fizic utilizat,biosenzorii se clasifica in:

-biosenzori electrochimici

-biosenzori optici

-biosenzori termici

-biosenzori sensibili la modificarea masei.

a). Biosenzori electrochimici

Compusul organic de dozat difuzeaza in compartimentul cu celule imobilizate,care prin metabolismul lor specific transforma acest compus in molecule mai simple,active din puncy de vedere electrochimic,detectabile apoi cu un electrod conventional. Senzorii (electrozii) conventional electrochimici sunt:

-potentiometrici-amperometrici

-conductimetrici

Biosenzori potentiometrici- se masoara potentialul celulei electrochimice la curent zero.

Potentialul celuei este proportional cu concentratia ionilor. In constructia biosenzorilor potentiometrici intra de obicei enzime ce determina schimbari semnificative ale pH-ului: penicilinaza, ureaza,esteraza.

Biosenzori aperometrici- se aplica un potential intre un electrod de lucru si un electrod de referinta,masurandu-se in mod continuu curentul din celula.- cele mai utilizate enzime sunt oxidoreductazele: glucozoxidaza, colesterol oxidaza, aminoacid oxidaza, etc.

Biosenzorii conductimetrici- se masoara conductanta / rezistenta unei solutii

- se pot utiliza cand in timpul conversiilor enzimatice sunt generate sarcini electrice(amidase, esterase, kinaze).

● Avantaje ale senzorilor electrochimici:+ usurinta in operare+ interfata directa cu sistemul electronic+ posibilitate de miniaturizare● Dezavantaje ale senzorilor electrochimici:- selectivitate limitata, fiind necesara utilizarea mediatorilor pentru imbunatatirea acesteia- poate fi aplicata numai sistemlor la car eparticipa specii electrochimic active.

b) Biosenzori termici

Acestia masoara prezenta sau concentratia unei substante chimice (compus organic)prin urmarirea schimbarii temperaturii datorita acelei substante.Cel mai simplu biosenzor termic este un termometru la care partea sensibila este acoperita cu enzime.

Dintre senzorii de temperatura care intra in componenta biosenzorilor pot fi amintiti:senzori piroelectrici,termistoarele si termocuplurile.

Deoarece cantitatea de caldura eliberata este mica.masurarea este perturbata de variatiile de fond ale temperaturii mediului (sub efectul agitatiei).

Trebuie utilizate doua termistoare si anume: unul de referinta fara enzime pentru a urmari variatia termica a mediului si unul pe care se afla stratul de enzime imibilizat.

In afara de masurarea diferentiala ,pentru a limita perturbatia termica datorata convectiei,se inconjoara termistorul cu un invelis de sticla avand cateva orificii pentru acces la substrat.● Avantaje ale senzorilor termici- pot fi utilizate pentru majoritatea reactiilor●Dezavantaje ale senzorilor termici- selectivitate scazuta- dificultati in miniaturizareUn exemplu de biosenzor termic este dat in figura 2.

Fig 2. Principiu de masurare cu “termistor enzima”

c) Biosenzori optici

Acesti biosenzori sunt bazati pe:-fenomene optice liniare ca:absorbtia,fluorescenta,polarizarea,rotatia,interferenta.-fenomene optice neliniare,ca generarea armonicii a doua.Cel mai comun biosenzor optic este o fibra optica la capatul careia este imobilizat bioreceptorul. Intensitatea unui fascicol optic generat din exterior este modulata de modificarea absorbtiei la bioreceptor,astfel raspunsul este corelat cu concentratia esantionului.Un alt tip de senzor are la baza o fibra optica utilizata ca o celula cu multiple reflexii. Daca ea este acoperita cu un bioreceptor care creeaza straturi selective pe fibra de sticla,fascicolul emis de sursa exterioara nu mai este reflectat in intregime,deoarece indicele de refractie este schimbat prin prezenta esantionului.

d) Biosenzori sensibili la modificarea maseiDatorita relatiei liniare intre variatia frecventei de oscilatie a unui cristal de cuart si variatia mesei la suprafata lui ,cristalul poate fi folosit detectia modificarii masei unei substante.

Biosenzori Calorimetrici

Multe reactii catalizate de enzime sunt exoterme, generand caldura . Aceasta poate fi

utilizata ca baza pentru masurarea vitezei de reactie si astfel concentratia analitului. Aceasta

reprezinta tipul de biosenzor cel mai aplicabil la modul general. Schimbarile de temperatura

se determina, in mod obisnuit, prin intermediul termistorilor la intrarea si la iesirea dintr-o

mica coloana ce contine un pat cromatografic realizat cu enzima imobilizata si care se afla

intr-un mediu cu temperatura constanta . In asemenea conditii, precis controlate, pana la 80%

din caldura generata in reactie poate fi inregistrata ca o schimbare de temperatura in procesul

de curgere a probei prin coloana. Schimbarea de temperatura poate fi usor calculata din

modificarea entalpiei si cantitatea care a reactionat. Daca 1 mM reactant este complet

convertit in produs, intr-o reactie care genereaza 100 kJ/mol atunci fiecare ml de solutie

genereaza 0,1 J de caldura. La o eficienta de 80%, aceasta va determina o schimbare in

temperatura solutiei cu aproximativ 0,020C. Aceasta este in general schimbarea de

temperatura intalnita in procesele enzimatice si pentru ca biosenzorul sa fie utilizabil, acesta

trebuie sa aibe o rezolutie a temperaturii de 0,00010C.

Figura3. Diagrama schematica a unui biosenzor calorimetric.

Curentul de proba (a) trece prin cutia exterioara izolata (b) spre schimbatorul de caldura (c) din interiorul unui bloc de aluminiu (d). De acolo, curentul de proba depaseste termistorul de referinta (e) si curge in patul cromatografic al bioreactorului (f, 1ml volum), ce contine biocatalizatorul, unde are loc reactia. Schimbarea de temperature este determinate prin intermediul termistorului (g) si solutia trece la vasul cu reziduuri (h). Sisteme electronice externe (l) determina diferenta in rezistenta, si astfel diferenta de temperatura, dintre termistori.

In cazul acestor biosenzori presupunerea ca exista o corelatie liniara intre raspuns si

activitatea enzimatica a fost confirmata in practica.O problema majora cu acest tip de

biosenzori, este dificultatea de a se gasi o potrivire cat mai stransa intre constantele de

temperatura a termistorilor de masurare si a celor de referinta. O schimbare termica egala cu

numai 10C in temperatura de fundal, a mediului inconjurator a ambilor termistori cauzeaza in

mod obisnuit o modificare aparenta in rezistentele relative ale termistorilor, echivalenta cu

0,010C. Aceasta valoare este de multe ori egala cu intreaga scala de schimb datorata reactiei.

Este in mod clar, de mare importanta ca o asemenea schimbare a temperaturii mediului

inconjurator sa fie evitata. Aceasta a condus la includerea unui bloc de aluminiu bine izolat

in proiectul biosenzorului.

Senzitivitatea (10-4M) si domeniul (10-4 – 10-2 M) a biosenzorilor cu termistori sunt

ambele destul de scazute pentru majoritatea aplicatiilor, desi senzitivitati mai mari sunt

posibile prin folosirea unor reactii mai exoterme (de exemplu catalaza). Slaba senzitivitate a

sistemului poate fi crescuta substantial prin cresterea caldurii de reactie. In cel mai simplu

caz aceasta se poate realiza prin cumularea mai multor reactii, intr-o cale complexa de

reactii, toate contribuind la producerea de caldura. Astfel senzitivitatea analizei glucozei

folosind glucoz-oxidaza poate mai mult decat dublata prin co-imobilizarea cu catalaza in

coloana reactorului in scopul de a descompune peroxidul de hidrogen produs. Un model de

astfel de amplificare este prezentat in ciclul schemei de detectie a ADP:

(6)

ADP este analitul ce se determina si se adauga in sistem la un exces de glucoza, fosfoenol

piruvat, NADH si oxigen pentru a se asigura maximum de reactie. Patru enzime

(hexokinaza, piruvat kinaza, lactate dehidrogenaza si lactate oxidaza) sunt co-imobilizate in

patul cromatografic al reactorului. In ciuda unei entalpii pozitive a reactiei piruvat kinazei,

procesul global conduce la o crestere de 1000 de ori in senzitivitate, in primul rand datorita

ciclului dintre piruvat si lactat.

Limitarea reactiei datorata scazutei solubilitati a oxigenului, poate fi depsita prin

inlocuirea lui cu benzochinona, care este redusa la hidrochinona de catre flavo-enzime.

Asemenea sisteme de reactii, insa, au serioase dezavantaje prin faptul ca ele cresc

probabilitatea existentei unor interferente in determinarea analitului de interes.

Reactiile implicand generarea de ioni de hidrogen pot fi facute mult mai sensibile

prin includerea unei baze care degaja multa caldura la protonare. De exmplu, caldura

produsa prin reactia penicilinazei poate fi aprope dublata prin utilizarea Tris(tris-

(hidroximetil)aminometan) ca tampon.

In concluzie, principalele avantaje ale biosenzorilor cu termistori sunt aplicabilitatea generala si posibilitatea utilizarii lor in solutii tulburi sau puternic colorate. Cel mai important dezavantaj este dificultatea de a se asigura ca temperatura curentului de proba sa ramana constanta (± 0,010C).

Aplicatii ale biosenzorilor

Principala cerinta pentru un biosenzor este aceea de a fi valoros in acord cu cercetarile si aplicatiile comerciale: identificarea moleculelor tinta, disponibilitatea recunoasterii elementelor biologice corespunzatoare si potentialul pentru detectarea posibilitatii sistemelor, sa fie sensibile tehnologiei de laborator in cateva situatii. Aplicatiile acestor dispozitive sunt cu atat mai variate cu cat moleculele incorporate sunt mai variate. Asistenta medicala este cea care beneficiaza imediat de biosenzori, nu numai in testele clinice, dar si in fabricarea de medicamente si inlocuirea unor organe ca pancreasul artificial pentru diabetici.

Biosenzorii se folosesc de asemenea pentru stabilirea calitatii si sigurantei hranei si detectarea factorilor de mediu poluanti. Alte cateva exemple se pot aminti: detectarea patogenilor, determinarea nivelelor de toxicitate inainte si dupa bioremeditare, detectarea si determinarea organofosfatilor, determinarea metabolitilor toxici cum ar fi micotoxine, etc

Aplicarea biosenzorilor electrochimici în fermentare1.Abstract

Cercetare şi dezvoltarea biosenzorilor electrochimici aplicati la fermentare în ultimii 10 ani au fost revizuite în acest articol. În prima parte a articolului este data o scurta introducere pe biosenzori electrochimici . Apoi, sunt descrisi biosenzorii enzimatici şi biosenzorii microbieni care analizeaza impreuna în procesele de fermentare, inclusiv glucoza, alcool lactic, şi glicerol . În cele din urmă, sunt discutate tendinţele de dezvoltare a biosenzorilor electrochimici. 2 Introducere

Biosenzorii sunt în curs de dezvoltate pentru mai mult de patruzeci de ani. Un biosenzor este compus din două părţi: elementul moleculă recunoaştere şi traductor de semnal.

Materialul biologic pentru recunoaşterea molecuei ar putea fi enzime, microorganisme, ţesuturi de origine animală sau vegetala, de anticorpi şi de acid nucleic, şi aşa mai departe. Traductorul de semnal este folosit pentru a transforma schimbarea chimica sau fizica de semnal, care este capturat de către elementu recunoscând un semnal electric.

Fermentarea este un proces în care microorganismul descompune nutriţia în produsele alimentare şi alte materiale în anumite circumstanţe. Pentru a controla procesul de ferment, oamenii trebuie să monitorizeze concentraţiile de componente diferite în bulionul fermentat. Prezentul articol prevede aplicarea biosenzorilor electrochimici pentru industria de fermentare, în ultimii zece ani. În prima parte a articolului, principiile de bază ale biosenzorilor electrochimici sunt prezentati.Apoi, biosenzori electrochimici pentru analizat în procesele de fermentaţie, inclusiv glucoza, acidul lactic, alcool, şi glicerol, este discutat în detaliu. În cele din urmă, sunt discutate tendinţele de dezvoltare a biosenzorilor electrochimici.

Într-o celulă electrochimică, curentul care trece prin electrozi sau potenţialul pe teritoriul interfaţa electrod / electrolit depinde de componentele chimice ale soluţiei. Prin urmare, reacţia chimică şi schimbarea componentelor pot fi detectate prin măsurarea actuala şi potenţiala. Amperometria, potentiometria, şi impedimetria sunt trei tipuri principale de metode electrochimice de detecţie .În măsurarea amperometrica, un potenţial constant este aplicat pe electrod şi curentul rezultat este măsurat.

Acest curent este proporţional cu concentraţia speciilor electroactive în soluţie. Amperometria ar putea fi considerată ca o măsură a impedanţei Faraday . Potentiometria este de măsurare a potenţialului unei celule electrochimice, cu condiţia de curent zero.

Potentiometria poate fi considerata ca un caz special de amperometrie în cazul în care actuala impedanta Faraday este păstrată la zero. Impedimetria este de a măsura schimbări ale impedantei electrolitului prin aplicarea unei mici amplitudini de tensiune în curent alternativ pe o pereche de electrozi inerti. Impedimetria este robust şi uşor de implementat.

Dezavantajul impedimetriei este non-selectivitatea. Amperometria şi potentiometria sunt două tipuri principale de metode folosite pentru senzorii electrochimici aplicati în domeniul fermentaţiei. Biomaterialul este folosit ca element de recunoaştere pentru a compune un biosenzor electrochimic. Există diferite tipuri de biosenzori electrochimici în conformitate cu biomaterialele diferite utilizate pentru recunoaştere, inclusiv senzorul de enzima, senzor microbian, senzorul sistemului imunitar, de ţesuturi şi de celule senzor, şi ADN-ul senzor. Printre ei, senzorul de enzimă este cel mai important biosenzor electrochimic aplicat în fermentaţie. Senzorii enzimă pot fi clasificati în trei generaţii în funcţie de transferul de electroni a mediatorilor utilizati.Oxigenul este considerat ca mediator de electroni de transfer pentru prima generaţie, întrucât mediatorul artificial, cum ar fi ferocenul care este considerat ca fiind mediatorul transferului de electroni pentru a doua generaţie. Senzorul enzimă a treia generaţie ar trebui să fie capabil să transfere electroni între electrod şi enzime în mod direct, prin urmare, este mediatorul trei.

Dintre cele trei generaţii de senzori de enzime, senzorii de a doua generaţie, sunt bine dezvoltati. Deşi a fost mai mulţi ani de la propunerea de biosenzor enzimei de a treia generaţie, dezvoltarea sa este încă în mişcare lentă. Figura 1 prezinta mecanismul transferului de electroni de a doua generaţie pe bază de enzime electrod.Pentru a evita această problemă, Bârsan , a proiectat o celulă de debit, cu un biosenzor electrochimic enzimă bazat pe low-cost carbon-film de electrozi. Şi trei tipuri de mediatori, cobalt şi hexacianoferati de cupru şi poli (roşu neutru) (PNR), au fost investigati de monitorizarea concentraţiei glucozei în mustul de struguri. În toate aceste cercetări, oxigenul este folosit ca mediator de electroni pentru enzimă, şi diferite elemente de metal sunt folosite ca si oxidarea catalizatorilor pentru H2O2 pentru a reduce la minimum interferenţa de acid ascorbic.

Acesti biosenzori sunt considerati a fi prima generaţie de biosenzori de glucoză. În a doua generatie de senzori de glucoză, mediatorii artificiali de electroni sunt substituiti de glucoză oxidată. Şerban a dezvoltat o metodă rapidă şi sensibilă pentru monitorizarea glicemiei, care ar putea fi utilizata în timpul fermentaţiei vinului şi prelucrarea cu ajutorul unui electrod pastă de carbon modificat cu glucoză oxidată şi peroxidază de hrean, şi ferocenul ca mediator redox. În acest fel, interferenţele cauzate de alte substanţe electrochimice au fost minimizate datorita eficientei ridicate a redoxului mediator de electroni. Serban a folosit biosenzorii pentru a testa diferite vinuri, iar rezultatele arată că metoda propusă este foarte rapidă, simplă, şi de încredere şi nu are nevoie de nici o pretratare a eşantionului. În consecinţă, în comparaţie cu biosenzorii de glucoza din prima generaţie, senzorii de a doua generaţie aduc noi probleme, cum ar fi mobilizarea transferul de electroni-mediatori artificiali.

Numeroase studii au fost efectuate cu privire la aplicarea într-un biosenzor FIA (analiza fluxului de injecţie) de sistem. Nandakumar a ales două tipuri de coloane enzimă pentru dezvoltarea unui senzor de glucoză extrem de sensibil, care a fost operat în modul de FIA. Ferreira a dezvoltat un biosenzor lactoză enzimatic, care a fost compus din imobilizarea galactozidazei si glucoza oxidata. Consumului de oxigen în timpul reacţiei catalizate de către aceste enzime, a fost detectat,biosenzorul a fost integrat într-un sistem FIA si a fost folosit pentru a monitoriza concentraţia de lactoză în timpul producţiei de galactozidaza de drojdie. Lidgren a dezvoltat un nou biosenzor SIRE pentru a măsura în timp real, concentratia de glucoza în timpul fermentării. Avantajul de biosenzor SIRE este faptul ca foloseste membrană

de dializă pentru a separa lichidul din celula biosenzor pentru a preveni pasivarea de biosenzor.

Figura1.Mecanism de transfer de electroni de a doua generaţie pe bază de enzime senzor electrochimic.3 Biosenzorul electrochimic aplicat industriei fermentatiei Senzor enzimatic Biosenzorul glucoza

Glucoza este un important hidrolizator de produse alimentare. Fluctuaţia de concentraţie de glucoză în timpul fermentării este, de asemenea, crucială, pentru că este strâns legată de procesul de fermentaţie şi de contaminare de microorganisme. Concentraţia de glucoză poate fi un indicator-cheie în industria alimentară pentru controlul calităţii şi al procesului.

Astfel, biosenzorii glucoză sunt aplicati pe scară largă în fermentaţia de produse lactate, vin, şi zahăr. Khoo a studiat un electrod de carbon sticlos acoperite cu straturi subtiri oximetallicie de Co (II), Fe (II), Ni (II), Pb (II), Ce (III), Cr (III), Ti (I) şi Mn (II) pentru a investiga efectul electrocatalitic pe H2O2 oxidata. Tothill a încercat pentru a minimiza interferenţa cu ajutorul unui nou material catalizator pe bază de carbon pentru a reduce potenţialul necesar pentru H2O2 oxidare. Scopul principal al activităţii lor este de a îmbunătăţi activitatea electrochimica a H2O2 prin modificarea electrodului. Prin urmare,interferenţele de la alte materiale cu activitatea electrochimică poate fi redus în detectarea de glucoză.