12/3/2010 Biosenzori 1

§2. Elemente biologice

2.1. Introducere

Elementele biologice furnizează elementul selectiv principal într-un biosenzor. Ele trebuie să fie substanțe care se atașează ele însele cu o substanță particulară și nu cu altele. Materiale care pot realiza acest lucru se împart în patru grupe: enzimele, anticorpii, acizii nucleici și receptorii. Enzimele Se folosesc cel mai adesea ca elemente biologice. Pot fi utilizate fie în formă pură, fie prezente în microorganisme sau

în părți din țesuturi intacte. Sunt catalizatori biologici pentru reacții specifice și se pot lega ele

însele cu substraturi specifice. Acțiunile catalizatoare sunt utilizate în cadrul biosenzorilor.

12/3/2010 Biosenzori 2

Anticorpii Se leagă cu antigenii corespunzători în scopul eliminării acestora din

sfera de acțiune, dar nu au un efect catalizator. Sunt capabile să dezvolte o sensibilitate foarte ridicată în cadrul

biosenzorilor. Acizii nucleici Au fost utilizați mai rar până în prezent. Operează selectiv datorită caracteristicilor lor de formare de perechi

de bază (base-pairing). Au un mare potențial de utilizare în identificarea dezordinii genetice, în

special la copii. Receptorii Înăuntrul membranei de plasmă cu două straturi a lipidei, care

înconjoară o celulă, sunt proteine care traversează întreaga lățime a membranei și care au proprietăți de recunoaștere moleculară. Acestea se numesc receptori.

Sunt dificil de izolat, dar realizează o legătură a dizolvanților cu un grad de afinitate și o potrivire specifică a anticorpilor.

12/3/2010 Biosenzori 3

2.2. Enzimele

Enzima este o macromoleculă complexă cu conținut mare de proteină, uzual conținând un grup proteic, care include adesea unul sau mai mulți atomi de metal.

La multe enzime, în special la cele utilizate în biosenzori, modul de acțiune implică reacții de oxidare sau de reducere, care pot fi detectate electrochimic.

12/3/2010 Biosenzori 4

Reacția catalitică la care participă o enzima E și substratul S

S + E ES E + Pk1

k-1

k2

k1, k-1, k2 = constante de viteză chimică de reacție

La ciocnirea (cu o anumită viteză și sub un anumit unghi) unei moleculei de enzimă E cu o moleculă de substrat S se formează o moleculă de compus intermediar enzimă-substrat notat ES(enzima se “atașează” substratului). Moleculele ES pot da naștere unui produs P cu eliberarea enzimei E. Enzima joacă, astfel, rolul de catalizator pentru transformarea substratului S în produsul P.

12/3/2010 Biosenzori 5

Exemplu:

Glucoză + O2 + GOD Acid gluconic + H2O2ES

S = Glucoză + O2

E = Glucozoxidază (GOD)

P = Acid gluconic + H2O2

12/3/2010 Biosenzori 6

Modelul matematic al reacției enzimatice este constituit dintr-un sistem neliniar cu două ecuații diferențiale, neliniaritatea fiind de tip biliniar.

Pentru rezolvarea sistemului se consideră ipoteza: concentrația complexului enzimă-substrat este constantă. Astfel, viteza de formare a complexului din componentele sale este echilibrată de viteza de descompunere înapoi în enzimă și înainte în produs.

Ipoteza este plauzibilă dacă avem o concentrație mult mai mare a substratului în raport cu enzima, ceea ce este în concordanță cu realitatea.

12/3/2010 Biosenzori 7

Viteza de formare a complexului = k1[S][E] – k-1[ES]

Viteza de descompunere a complexului = k2[ES]

Datorită ipotezei avem:

k1[S][E] – k-1[ES] – k2[ES] = 0

Vom descrie concentrația enzimei în termeni totali:

[E0] = [E] + [ES]

k1[S][E0] – k1[S] [ES] – k-1[ES] – k2[ES] = 0

12/3/2010 Biosenzori 8

Skkk

SEkES

121

01

KM = (k-1 + k2)/k1 – constanta Michaelis

SKSEES

M 0

Viteza chimică totală de reacție (viteza de formare a produsului) este dată de ecuația Michaelis – Menton:

SKSEk

ESkdtSd

dtPd

M 02

2

12/3/2010 Biosenzori 9

Dacă [S] >> KM, atunci viteza chimică de reacție este maximă:

02max EkV

Dacă [S] = KM, atunci = Vmax/2

12/3/2010 Biosenzori 10

Pentru a obține grafic o dreaptă se determină inversa ecuației Michaelis – Menton:

maxmaxmax0202

111/1VSV

KVSEk

KSEkSK MMM

Graficul 1/ = f(1/[S]) este o dreaptă cu panta KM/Vmax și decalajul 1/Vmax. Ca urmare, valorile pentru KM și Vmax pot fi determinate.

12/3/2010 Biosenzori 11

2.2.1. Exemple de biosenzori bazați pe enzime

Ureea

Reacția de descompunere hidrolitică a ureii este catalizată de enzima ureează, obținându-se amoniacul și dioxidul de carbon:

CO(NH2)2 + H2O CO2 + 2NH3ureează

Reacția este, în general, urmărită în funcție de potențial cu ajutorul unui electrod sensibil la ioni de amoniac, care poate detecta 10-6 M de amoniac.

12/3/2010 Biosenzori 12

Performanțe:

Domeniu: 3 x 10-5 – 5 x 10-2 M;

Timpul de răspuns: 1 – 5 minute;

Timpul de revenire: 5 – 10 minute;

Durata de funcționare: 60 zile.

12/3/2010 Biosenzori 13

Glucoză Reacția de oxidare a glucozei de către oxigenul molecular,

catalizată de enzima glucozoxidază (GOD), care conduce la obținerea acidului gluconic și a apei oxigenate:

Glucoză + O2 Acid gluconic + H2O2

GOD

Reacția a fost inițial urmărită cu ajutorul electrodului oxigen a lui Clark, care monitorizează pe baza curentului descreșterea concentrației de oxigen.

12/3/2010 Biosenzori 14

Performanțe:

Domeniu: < 1 - 30 mM;

Timpul de răspuns: 1 – 1,5 minute;

Timpul de revenire: 30 secunde;

Durata de funcționare: câteva luni.

12/3/2010 Biosenzori 15

2.2.2. Avantajele și dezavantajele enzimelor

Avantaje:

Se leagă de substrat.

Au o sensibilitate ridicată.

Acționează ca și catalizatori, ceea ce conduce la creșterea sensibilității.

Acțiunea lor este relativ rapidă.

Sunt cele mai utilizate componente biologice.

12/3/2010 Biosenzori 16

Dezavantaje:

Sunt scumpe. Prețul de extragere, izolare și purificare a enzimelor este foarte ridicat, iar uneori și prețul sursei de proveniență este ridicat. Cu toate acestea, un număr mare de diferite enzime este disponibil pe piață.

Imobilizarea cu traductorul conduce la o pierdere a acțiunii lor.

Într-un interval de timp relativ scurt acțiunea lor tinde să se piardă conducând la dezactivare.