1

Capitolul I. Stadiul actual al cercetărilor în domeniul problematicii

biosenzorilor şi al materialelor folosite la realizarea acestora

1.1. Introducere

Cererea mare de metode de analiză sensibile, specifice, rapide şi precise a motivat

interesul pentru dezvoltarea de materiale a senzorilor şi biosenzorilor electrochimici ca

instrumente de analiză. Capacitatea acestora de a furniza în mod continuu şi reversibil un

răspuns selectiv şi rapid faţă de prezenţa unui compus specific dintr-un amestec complex de

compuşi este exploatată nu doar în industria alimentară ci şi în medicină, agricultură, mediu,

farmacie [1].

I.1.1. Biosenzori - considerații generale și clasificare

Biosenzorii pot fi clasificaţi în funcţie de elementul biologic ce conferă specificitatea,

sau în funcţie de tipul traductorului utilizat: se cunosc biosenzori electrochimici, optici,

termici şi piezoelectrici [2]. În Fig.I.1 este redată schema de principiu al unui biosenzor

amperometric.Traductorii electrochimici şi în special cei amperometrici sunt cel mai bine

descrişi în literatura de specialitate, preferaţi datorită avantajelor pe care le oferă, şi anume:

sensibilitate crescută, preţ scăzut, posibilitatea de miniaturizare şi integrare în aparate

portabile, sunt uşor de utilizat [3-5].

Conform definiţiei dată de IUPAC [6,7], un biosenzor chimic este un dispozitiv

capabil să furnizeze informaţii analitice cantitative sau semicantitative, folosind un element

biologic (receptor biochimic) aflat în contact direct cu un traductor fizic [8 -10].

Biosenzorii chimici sunt compuşi din două unităţi funcţionale de bază: un bioreceptor

şi un traductor. Bioreceptorul are rolul de a transforma informaţia chimică într-o formă de

energie ce poate fi măsurată de traductor, în timp ce traductorul transformă energia respectivă

într-un semnal analitic util.

Fig.I.1. Schemă reprezentând principiile funcţionale ale unui biosenzor amperometric [11]

Elementul biologic asigură fenomenul de recunoaştere specifică a analitului, iar

traductorul, aflat sub potenţialul aplicat, generează un semnal asociat cu recunoaşterea

specifică. Tehnologia biosenzorilor amperometrici a cunoscut progrese importante în ultimele

decenii, timp în care au fost studiaţi şi realizaţi cu succes biosenzori de mai multe tipuri,

pentru diferiţi analiţi. Astăzi, biosenzorii amperometrici se dezvoltă ca instrumente analitice

importante pentru testele în laboratoare clinice, monitorizare a proceselor biologice şi a

mediului. Problematica biosenzorilor o reprezintă dezvoltarea unui material ideal de electrod,

2

care să fie compatibil cu o componentă biologică, să prezinte stabilitate, posibilitate de

miniaturizare şi capacitatea de a răspunde rapid. Limitările majore în dezvoltarea

biosenzorilor sunt cauzate de compatibilitatea dintre materialul suprafeţei traductorului şi

componenta biologică [12-13]. În perioada de început a fabricării biosenzorilor, materialul

avea rolul de matrice suport pentru înglobarea elementului biologic de recunoaştere.

În ultimile două decenii, datorită progreselor înregistrate în ştiinţa materialelor, au fost

realizate noi metode de imobilizare a enzimelor şi a mediatorilor, cu transfer de electroni.

Actualmente, principalele direcţii de cercetare în domeniul biosenzorilor au drept scop

realizarea unor noi materiale de electrod care să permită adaptarea proprietăţilor, astfel încât

să fie aplicabile pentru detecţia unui număr mare de analiţi. Atunci când sunt complet

optimizaţi, biosenzorii sunt uşor de utilizat şi nu necesită personal specializat şi nici efort de

manevrare mare, pot fi integraţi în aparate portabile şi folosiţi în afara unui laborator

specializat [13]. Elementul cel mai problematic la orice tip de biosenzor este traductorul

sarcina lui principală este aceea de a furniza un semnal de tensiune și de curent proporţional

cu concentraţia analitului. Aceasta nu este însă singura sa sarcină astfel el trebuie să fie:

- selectiv ceea ce înseamnă ca mărimea de ieşire electrică să nu fie influenţată de

alte specii chimice sau biologice prezente în analit.

- sa prezinte sensibilitate ridicată ceea ce permite limite de detecţie bune

- sa prezinte reproductibilitate bună a datelor

- sa prezinte timp de răspuns rapid

În continuare sunt prezentaţi biosenzorii potenţiometrici şi cei amperometrici precum şi

problematica de materiale utilizate.

a) Biosenzori potenţiometrici

Măsurătorile potenţiometrice implică determinarea diferenţei de potenţial dintre un

electrod de lucru şi un electrod de referinţă, sau între doi electrozi de referinţă separaţi de o

membrană permselectivă prin care nu circulă un curent electric semnificativ. Traductorul

poate fi un electrod ion selectiv (ISE), un electrod de pH, un electrod selectiv pentru gaze

(CO2, NH3) etc.

Atunci cînd stratul biocatalizator este plasat pe traductorul potenţiometric, trebuie să

se aibă în vedere:

transportul reactanţilor la suprafaţa biosenzorului

difuzia reactanţilor în stratul sensibil

reacţia analitului cu specia biologică

difuzia produşilor de reacţie din stratul catalitic la suprafaţa electrodului

variaţia de potenţial indusă detectorului [14].

Dependenţa de potenţial şi concentraţia (activitatea) analitului este logaritmică [15].

b) Biosenzori amperometrici

Biosenzori amperometrici se bazează pe măsurarea curentului de electroliză rezultat

la oxidarea sau reducerea unor specii electroactive pe suprafaţa electrodului de lucru, atunci

cînd se lucrează la un potenţial constant [8].Curentul rezultat este corelat direct cu

concentraţia speciei detectate. Biosenzorul amperometric are un timp de răspuns mai scurt,

este mai sensibil şi precis decât cel potenţiometric, iar răspunsul este o funcţie liniară de

concentraţia analitului.

Selectivitatea traductorului amperometric este dată de potenţialele redox ale speciilor

electroactive prezente [1]. Prima generaţie de biosenzori amperometrici măsurau consumul

de oxigen sau producerea de apă oxigenată într-o reacţie enzimatică; un exemplu este

3

determinarea glucozei utilizând glucozoxidaza şi electrodul de oxigen de tip Clark [16].

Pentru a ameliora performanţele biosenzorilor amperometrici, electrodul de lucru poate fi

modificat cu mediatori electrochimici.

I.2. Materiale de electrod folosite la realizarea biosenzorilor

O atenţie deosebită se acordă naturii materialului de electrod, datorită faptului că

structura şi proprietăţile acestuia determină proprietăţile traductorului, precum şi ale

interfeţei traductor.

Materialele utilizate în construcţia biosenzorilor electrochimici pot fi clasificate în:

i) material pentru electrozi şi substratul suport

ii) materiale pentru imobilizarea elementelor de recunoaştere biologică

iii) elemente biologice [17].

Dezvoltarea rapidă a tehnologiei materialelor de electrod a permis extinderea

domeniului de compuşi detectabili. La ora actuală, sunt necesare noi materiale care să

îmbunătăţească stabilitatea mecanică şi chimică a senzorilor pentru aplicaţii practice în

condiţii variate şi totodată, care să simplifice metodologia de imobilizare a biomoleculelor,

asigurînd controlul spaţial al acestora. Cele mai importante materiale folosite pentru

construcţia senzorilor şi biosenzorilor chimici constau în polimeri organici, materialele sol-

gel, materiale semiconductoare şi compozite.

I.2.1. Proprietăţile materialelor ideale folosite pentru realizarea biosenzorilor

Un domeniu de cercetare din ce în ce mai dezvoltat în ultimul timp este reprezentat de

implementarea a noi materiale, utilizate în construcţia biosenzorilor, biocipurilor,

nanosenzorilor şi a altor traductori [18]. Se efectuează cercetări pentru găsirea materialului

ideal, care să asigure biosenzorului caracteristicile optime.

În principiu, în construcţia unui biosenzor trebuie respectate o serie de cerinţe în

selectarea materialului de electrod.

i) compatibilitate cu elementul biologic

ii) absenţa barierelor de difuzie

iii) stabilitate la modificările de temperatură, pH

iv) sensibilitate şi selectivitate satisfăcătoare pentru analitul de interes

v) cost mic şi posibilitate de producţie în masă.

De asemenea, materialele de electrod trebuie să prezinte grupările funcţionale

necesare pentru ataşarea biomoleculelor, sau să permită cu uşurinţă introducerea de grupări

funcţionale. Există situaţii când biosenzorii sunt aplicaţi şi utilizaţi în condiţii severe, în

aceste cazuri fiind necesare materiale cu rezistenţă mecanică şi chimică specială.

De asemenea, un material de electrod ideal trebuie să prezinte o bună conductibilitate,

pentru a asigura un transfer rapid de electroni. Electrozii de lucru utilizaţi în realizarea

biosenzorilor sunt în general solizi. Electrodul de mercur este singurul electrod lichid la

temperatura camerei, însă folosirea acestuia la biosenzori electrochimici este frecvent [19].

Materialele de electrod cele mai utilizate pentru construcţia biosenzorilor sunt platina,

cărbunele vitros şi aurul, folosite în special pentru oxidarea anodică a apei oxigenate.

Alte tipuri de materiale de electrod pe bază de carbon (grafit, pastă de cărbune sunt

folosite pentru oxidarea anodică a apei oxigenate şi a mediatorilor redox. Aceste tipuri de

electrozi îndeplinesc condiţiile necesare pentru obţinerea unui electrod de lucru cu

performanţe foarte bune [20], conductibilitate, prezintă curenţi de bază mici, iar suprafaţa lor

4

poate fi uşor modificată chimic sau electrochimic, un avantaj este cel al preţului de cost

scăzut.Introducerea materialelor paladiu, platina, ruteniu şi cobalt sub formă de nanoparticule

în pulberea de grafit oferă o activitate electrocatalitică mai eficientă (timp de răspuns mai

scurt, potenţial aplicat mai mic) în comparaţie cu pastele convenţionale de grafit [21]. Alte

materiale solide folosite în realizarea electrozilor sunt semiconductori de tipul oxizilor

metalici TiO2, SiO2 etc. [22-23].

I.2.2. Modificarea materialului de electrod

Prin modificarea electrozilor utilizaţi în tehnicile de analiză electrochimică devine

posibilă lărgirea domeniului de aplicabilitate al acestor metode, cât şi ameliorarea

performanţelor acestora. Un electrod modificat chimic prezintă un modificator, legat direct de

suprafaţa acestuia fie printr-o legătură chimică, fie printr-o interacţie de natură fizică.

Modificatorii depuşi pe electrozi sunt folosiţi pentru a da un înalt grad de selectivitate

sensibilitate şi răspuns rapid traductorilor electrochimici.

Modificarea unui electrod implică imobilizarea pe suprafaţa acestuia a reactivului,

care schimbă caracteristicile electrochimice ale suprafeţei acestuia. Există numeroase metode

de imobilizare, capabile să reţină materialul biologic activ pe suprafaţa traductorului fizic

[24]. În acest context, este esenţială alegerea materialului de electrod, care trebuie să fie

biocompatibil cu materialul suport şi să răspundă sensibil la produsul rezultat din reacţia

enzimatică. Suprafaţa materialului de electrod în starea naturală, poate servi ca matrice suport

pentru ataşarea biomoleculelor, prin procedeul de adsorbţie fizică. Acest proces implică doar

legături de tip van der Waals şi interacţii hidrofobe [25-26]. Prin urmare, aceşti biosenzori

sunt caracterizaţi de parametri analitici cu valori neperformante, în special cu privire la

stabilitatea operaţională şi de lungă durată. În plus, materialului biologic adsorbit este direct

expus şi influenţat de variaţiile de pH, temperatură. În majoritatea cazurilor, atunci când un

material în starea lui naturală nu îndeplineşte condiţiile necesare pentru imobilizarea stabilă a

componentei biologice [27] sau nu prezintă proprietăţi electrocatalitice satisfăcătoare pentru

analitul de detectat, sunt necesare etape suplimentare de modificare.

Astfel, selecţia corectă a materialului de electrod, precum şi funcţionalizarea acestuia,

sunt impuse de o serie de parametri cum sunt: natura componentei biologice, metoda de

detecţie utilizată şi aplicaţia finală a biosenzorului obţinut.

I.2.3. Metode de imobilizare a enzimei

O etapă deosebit de importantă pentru performanţele finale ale biosenzorului o

constituie imobilizarea bioreceptorului (enzimei) pe traductorul amperometric. Două aspecte

sunt considerate esenţiale pentru succesul acestui proces:

imobilizarea trebuie să asigure un contact cât mai strâns între enzimă şi

traductor

procesul de imobilizare nu trebuie să afecteze în nici un fel activitatea

enzimatică a bioreceptorului, ba mai mult, să-i asigure stabilitate în timp.

5

Începând cu simpla adsorbţie a enzimei pe electrod şi terminând cu înglobarea

enzimei în materialul de electrod (electrozi cu materiale nanocompozite), actualmente este

cunoscută o mare varietate de metode de imobilizare a enzimei pe suprafaţa electrodului

(Fig.I.2).

Fig.I.2. Reprezentarea schematică a diferitelor metode de imobilizare a enzimelor pe suprafaţa unui

electrod [28]

Din larga varietate de metode de imobilizare existente în literatura de specialitate, în

această teză au fost folosite patru proceduri diferite şi anume:

adsorbţia fizică

electropolimerizarea

legarea covalentă

includerea în membrane de nafion

I.2.3.1. Adsorbţia fizică

Unul din procedele simple şi rapide de imobilizare a enzimelor este adsorbţia fizică.

Metoda constă în simpla depunere a enzimei pe suprafaţa electrodului, legarea fiind făcută

prin interacţii electrostatice sau de tip van der Waals.

Obţinerea unui electrod modificat prin adsorbţie fizică se realizează prin simpla

acoperire a suprafeţei sale cu soluţia apoasă sau neapoasă de modificator, urmată de

evaporarea solventului. Pentru astfel de modificări se folosesc electrozi cu suprafeţe de

carbon grafit, carbon vitros, grafit pirolitic iar ca element modificator adsorbit se utilizează

complecşi organici şi organometalici. Un material mult studiat şi dezvoltat în ultima vreme

este frecvent utilizat pentru modificarea electrozilor de cărbune vitros sau grafit prin simpla

depunere din soluţii de acetonă, dimetilformamidă folosite pentru determinarea unui număr

mare de analiţi [29-31].

6

Acest procedeu nu implică funcţionalizarea electrodului sau legături covalente, şi din

acest motiv este cel mai nedistructiv pentru enzimă. Dezavantajul este că biosenzorii cu

enzimă adsorbită prezintă o stabilitate operaţională şi de stocare scăzută.

I.2.3.2. Electropolimerizarea

Enzimele pot fi imobilizate în polimeri conductori de tipul politiofen, poliacetilenă,

polianilină, polipirol aceştia formând un mediu optim pentru imobilizarea acestora pe

suprafaţa electrozilor, cu rol semiconductor de electricitate.

Două metode de imobilizare sunt utilizate, şi anume:

depunerea prin electropolimerizare directă a polimerului şi a componentei

biologice

imobilizarea materialului bioactiv după polimerizare.

Polimerizarea electrochimică a monomerilor în prezenţa enzimei conduce la formarea

unui strat în care inclusă este enzima [32].

I.2.3.3. Legarea covalentă

Modificarea covalentă a suprafeţei electrodului reprezintă o metodă utilizată în

prepararea materialelor modificate, cu aplicaţii în construcţia biosenzorilor. Există două

modalităţi de realizare a acestui proces:

prima modalitate implică legarea directă a biomoleculei sau a compusului modificator

dorit, pe suprafaţa materialului de electrod care conţine în prealabil grupări

funcţionale (carboxil, carbonil, hidroxil). Un exemplu des întâlnit sunt grupările

funcţionale >C=O şi >C-O- (formate prin aplicarea unui potenţial controlat oxido-

reducător, într-un mediu adecvat, pe suprafaţa electrozilor de cărbune vitros) şi

grupările -OH de pe suprafaţa oxizilor metalici, utilizate în legarea covalentă a

diferiţilor compuşi [33-34].

a doua modalitate implică derivatizarea suprafeţei de electrod cu un agent de

reticulare, compus bi- sau polifuncţional (glutaraldehida, carbodiimida, succinimida

sau avidin biotina, care printr-o grupare funcţională se leagă de suprafaţa electrodului,

iar prin cealaltă grupare leagă enzima sau un alt compus modificator.

Suprafeţele de carbon sunt cele mai des şi mai eficient modificate prin legarea

covalentă, datorită grupărilor lor funcţionale ajustabile [35]. Compuşii conţinând grupările

amino (-NH2) [36], diazoniu R-N2+

[37-38] şi aril-acetat [39] sunt cei mai utilizaţi în

modificarea covalentă a suprafeţelor de carbon.

Biosenzorii realizaţi prin modificarea covalentă a materialului de electrod sunt

caracterizaţi de o bună stabilitate şi un răspuns rapid, însă procedura de modificare covalentă

este complexă, necesită condiţii experimentale speciale este slab reproductibilă şi prezintă

costuri relativ mare.

I.2.3.4. Includerea în membrane

Procedura de formare a membranelor presupune simpla acoperire/imersare a

electrodului cu/în soluţia de polielectrolit de natura urmată de evaporarea solventului.

Membranele astfel formate prezintă adeziune crescută faţă de suprafaţa electrodului şi

deformare minimă (datorită hidratării) atunci când sunt introduse în medii apoase [40-43].

7

În plus, membrana de polielectrolit poate stabiliza existentă la suprafaţa electrodului, lucru

esenţial pentru aplicaţiile biosenzorilor. Un electrolit mult utilizat în imobilizarea enzimelor

este Nafionul. Acest polimer (Fig.I.3) este disponibil comercial sub formă de soluţie, într-un

amestec de 80-90% alcool şi 20-10% apă. Nafionul formează o membrană schimbătoare de

cationi, care triază moleculele după sarcină şi mărime, şi este preferat în multe aplicaţii

datorită proprietăţilor mecanice bune [44].

Fig.I.3. Structura ionomerului perfluorinat Nafion® (tetrafloroetilensulfonat) [45]

Ca tehnică de imobilizare, Nafionul prezintă o serie de avantaje:

previne inactivarea electrodului şi creşte domeniul dinamic de răspuns al

biosenzorului [46-47].

fiind o matrice încărcată negativ, Nafionul prezintă permeabilitate redusă pentru

substanţele cu sarcină negativă, îmbunătăţind astfel selectivitatea senzorului [48-50]

şi eliminând parţial influenţa interferenţilor gen ascorbat [51] şi acetaminofen

[52-53] asupra răspunsului biosenzorului;

asigură stabilitate operaţională bună compuşilor redox cu sarcină pozitivă imobilizaţi

pe suprafaţa electrodului cu rol de mediatori [54-55].

I.2.3.5. Mediatori electrochimici

În principiu, toate substanţele pot fi oxidate/reduse dacă este aplicat un potenţial de

electrod suficient de mare. Din punct de vedere electroanalitic, un potenţial ridicat implică

însă interferenţe, produse de componentele electrochimic active prezente în matricea probei,

care vor fi oxidate/reduse împreună cu analitul. Mediatorii sunt substanţe care intermediază

transferul de electroni între electrodul de lucru şi analit sau o componentă biologică activă.

Aceştia sunt substanţe care au o comportare (cvasi) reversibilă electrochimic şi care

îndeplinesc două funcţii fundamentale.

reducerea suprapotenţialului necesar oxidării/reducerii analitului, în scopul

creşterii sensibilităţii determinărilor.

creşterea ratei transferului de electroni, pentru o mai bună sensibilitate.

8

În Fig. I.4 este redată schema mediatorului electrochimic care generează starea de oxidare şi

situl redox al enzimei.

Fig.I.4. Mediator electrochimic care regenerează starea de oxidare şi situl redox al enzimei

[56]

Caracteristicile unui mediator ideal sunt:

capacitatea de a reacţiona rapid cu analitul sau centrul redox al enzimei, în cazul

biosenzorilor enzimatici;

potenţialul redox al mediatorului (comparat cu potenţialul redox al analitului)

trebuie să fie redus;

trebuie să prezinte o cinetică reversibilă heterogenă;

suprapotenţialul pentru regenerarea mediatorului trebuie să fie scăzut, mai mic

decât al altor interferenţi, activ electrochimic, prezenţi în probă;

să nu participe la reacţii cu alte specii chimice în afara analitului, pentru a evita

interferenţele;

să fie independent de variaţia pH - ului (pentru mediatorii care nu schimbă

valoarea H+);

trebuie să fie stabil în formele oxidată şi redusă;

forma redusă a acestuia nu trebuie să reacţioneze cu oxigenul [55].

Avantajele utilizării mediatorilor sunt:

măsurătorile sunt puţin dependente de concentraţia de oxigen;

potenţialul de lucru al electrodului enzimatic este determinat de potenţialul de oxidare

al mediatorului;

utilizarea mediatorilor la potenţiale de oxidare scăzute implică eliminarea

interferenţilor [56].

Un exemplu de transfer de electroni către centrul activ al enzimei este cel al

biosenzorului bazat pe GOD (glucozoxidaza) pentru analiza glucozei, care utilizează electrozi

din oţel inoxidabil modificaţi cu un film conductiv de polipirol. În acest caz, mediatorul

reacţionează în primul rând cu enzima redusă şi apoi este oxidat la suprafaţa electrodului,

unde are loc un transfer rapid de electroni.

Există numeroase substanţe care pot fi utilizate drept mediatori electrochimici, din

diferite clase, cum ar fi: coloranţii organici (albastru de metil, Meldola Blue etc.), compuşi

anorganici (fericianurile, albastru de Prusia etc.) [57-60].

9

I.3. Nanomateriale folosite în realizarea biosenzorilor

Materialele folosite în mod curent la realizarea biosenzorilor electrochimici sunt

stabile termodinamic şi constau în polimeri, metale şi aliaje, materiale ceramice,

semiconductori organici, cristale, membrane şi materiale compozite pulberi etc. [61].

Descoperirea nanotuburilor de carbon [62] şi a fulerenelor [63] a deschis posibilitatea

utilizării unei noi clase de materiale, cu dimensiuni de ordinul nano, în construcţia senzorilor

şi biosenzorilor după cum urmează :

Carbonul element cu configuraţia electronică He 2s2 2p

2, prezintă diverse forme

alotropice: diamant, grafit, negru de fum, cărbune activ, fibre de carbon, cărbune vitros,

fluerene şi nanotuburi. Dintre toate aceste forme alotropice doar diamantul şi grafitul sunt

forme stabile din punct de vedere termodinamic.

Diamantul prezintă o structură cristalină tridimensională, descrisă de o reţea cubică şi

dotată cu proprietăţi fizice şi chimice excepţionale: duritate, rigiditate, conductibilitate

electrică redusă, indice de refracţie mare şi chimic inert.

Grafitul este un material solid cu proprietăţi metalice, caracterizat de o structură

stratificată, formată prin suprapoziţionarea reţelelor hexagonale ale planurilor de grafit.

Nanotuburile de carbon sunt structuri tridimensionale constituite din planuri grafitice

rulate în forme tubulare. În funcţie de numărul tuburilor concentrice şi de dispunerea

acestora, există trei tipuri de materiale din această categorie şi anume: nanotuburi de carbon

cu un singur perete (single-wall carbon nanotubes, SWNT), cu mai mulţi pereţi (multi Wall

carbon nanotubes, MWNT) şi nanofibre de carbon (carbon nanofibres CNF) [64-65]. În

Fig.I.5 sunt prezentate materiale carbonice dupa dimensiune (0, 1, 2, și 3 D).

Fig.I.5. Materiale carbonice după dimensiune (0, 1, 2, si 3 D) [66-67]

I.3.1. Materiale (nano) compozite

Un material compozit este o combinaţie heterogenă a două sau mai multe materiale

diferite ca formă şi compoziţie. Un amestec dintr-o fază conductoare şi una izolatoare devine

conductor atunci când fracţia de volum a fazei conductoare excede un prag de percolare de

16%, care reprezintă cantitatea minimă pentru a obţine o traversare continuă prin întregul

amestec.

Acest prag este independent de mărimea şi forma fazei conductoare atât timp cât

particulele sale sunt echidistante. Când faza conductoare este alcătuită din particule subţiri şi

lungi, şansele de contact cresc, reducând astfel pragul de percolare. În aceste cazuri,

10

conductibilitatea amestecului se realizează şi pentru procente mai mici de 16% ale fazei

conductoare în volumul final.

Materialele compozite folosite în construcţia biosenzorilor sunt, în general, alcătuite

din carbon (pulbere de grafit) şi o matrice de legare ulei mineral, hidroxietilceluloză răşini,

sol-gel, rezultând binecunoscuţii electrozi pastă de cărbune. Proprietăţile excelente ale

nanotuburilor de carbon şi nanofibrelor de carbon şi, în special, conductibilitatea electrică

mare, fac aceste materiale ideale pentru obţinerea de amestecuri nanocompozite conductoare

[67]. Mai multe studii demonstrează că introducerea CNT într-o matrice polimerică creşte

conductibilitatea electrică şi proprietăţile mecanice ale matricii originale [68].

I.3.2. Polimeri conductori

Polimerii conductori care conţin electroni responsabili pentru proprietăţile electrice

neobişnuite, cum ar fi conductivitate electrică mare, tranziţii optice cu energie joasă,

potenţialul mic de ionizare. Care se aplică şi sistemelor conjugate ale polimerilor conductori,

care au una sau două legături duble ce alternează cu lanţul polimeric. Mecanismul conductor

al acestor polimeri este foarte complex. Prin dopare, aceste materiale prezintă o modificare

importantă a conductivităţii, ce implică diferite mecanisme, cu regimuri diferite [69].

Numeroase metode sunt disponibile pentru sinteza polimerilor conductori. Cea mai

utilizată tehnică este cuplarea oxidativă, ce implică oxidarea monomerilor pentru formarea

radicalilor cationici, urmată de cuplarea pentru formarea dicationilor. Altă metodă

reproductibilă şi simplă este sinteza electrochimică, care prezintă avantajul faptului că

reacţiile pot avea loc la temperatura camerei. În plus, grosimea filmului poate fi controlată

prin varierea potenţialului sau curentului şi a timpului de depunere.

Polimerizarea electrochimică poate avea loc la:

a) curent constant

b) potenţial constant

c) prin balierea potenţialului de scanare [70]

Aceste materiale conductoare au atras atenţia datorită utilizării lor în obţinerea de

senzori şi biosenzori. Polimerii conductori sunt utilizaţi în obţinerea de biosenzori enzimatici

pentru analiza glucozei, fructozei, lactatului, etanolului, colesterolului, ureei precum şi în

obţinerea imunosenzorilor [71]. Pasul esenţial în construcţia de biosenzori bazaţi pe polimeri

conductori este imobilizarea eficientă a componentei biologice pe suprafaţa electrodului.

Două metode de imobilizare sunt frecvent utilizate în construcţia biosenzorilor bazaţi

pe polimeri conductori:

- electropolimerizarea directă

- depunerea pentru includerea componentei biologice imobilizarea materialului

bioactiv, urmată de electropolimerizare [72]

Construcţia unui biosenzor prin electrodepunerea unui polimer conductor este un

proces simplu ce implică un singur pas. Electropolimerizarea are loc în soluţia ce conţine

monomerul şi specia biologic activă. Acest model a fost utilizat pentru încorporarea

enzimelor [73], anticorpilor [74] şi chiar a celulelor vii [75].

Imobilizarea enzimelor în filme electropolimerizate permite un control electrochimic

al diferiţilor parametri de depunere, cum ar fi grosimea stratului polimeric, cantitatea de

enzimă şi localizarea enzimei. Imobilizarea enzimelor prin încapsulare în filme polimerice

conductoare implică concentraţii mari de monomeri şi enzimă în timpul procesului de

electropolimerizare. De altfel, cantitatea de enzimă imobilizată în reţeaua polimerică nu poate

fi estimată prin simpla diferenţă dintre concentraţiile biologice iniţiale şi cele de după etapa

de electropolimerizare. Prin electropolimerizarea albastrului de metil pe electrozi serigrafiaţi,

11

al căror electrod de lucru este acoperit cu un strat subţire de aur, se obţin straturi conductoare

[75]. Avantajul acestui procedeu de imobilizare a enzimei este acela că oferă posibilitatea de

a controla şi îmbunătăţi compoziţia stratului polimer-enzimă.

I.4. Aspecte generale privind biosenzorii amperometrici

La biosenzorii enzimatici funcţia enzimei este aceea de a cataliza reacţia la care

participă specia de determinat. Pe parcursul desfăşurării acestei reacţii biochimice, fie se

produce (de exemplu apa oxigenată şi gluconolactonă), fie se consumă oxigenul, fie este

implicată în mod deliberat o specie electrochimic activă (mediator), a cărei concentraţie este

monitorizată pe cale electrochimică, prin intermediul unei reacţii de electrod, a cărei

intensitate constituie semnalul analitic se prezintă în Fig.I.6. Caracteristicile cineticii reacţiilor

enzimatice care se desfăşoară în sisteme eterogene au, fără îndoială, o influenţă hotărâtoare

asupra performanţelor biosenzorilor amperometrici.

Fig.I.6. Reacţia reprezentativă a GOD [76].

222 OHtonaGluconolacOGlucozaD azaGlucozoxid (I.1)

Majoritatea senzorilor de acest tip operează datorită fie consumului de oxigen din

timpul reacţiei biocatalitice măsurat prin controlarea reduceri catodului de O2 pe electrod la

un potenţial de -0.7V, sau prin generarea biocatalitică a peroxidului de hidrogen evaluat prin

monitorizarea oxidării anodului de H2O2 pe electrod la un potenţial de +0.65V [77].

I.4.1. CINETICA ENZIMATICĂ

Reacțiile enzimatice care implică un singur substrat pot fi exprimate într-un

mod general ca:

PEEPESSE (I.2)

unde,

E – enzima;

S – substratul;

P – produsul reacției.

Reacția de legare a substratului este considerată a fi reversibilă, în timp ce formarea

produsului este considerată ireversibilă. Reacția E + P este lentă și deci poate fi neglijată. La

o concentraţie de enzimă fixă, rata de reacţie (V) a enzimei catalizate este dată de ecuaţia

Michaelis-Menten.

12

(I.3)

În acest mecanism, se presupune că enzima (E) și substratul (S) se combină reversibil

pentru a forma complexul enzimă-substrat (ES), care ulterior se descompune într-un pas mai

lent și ireversibil, pentru a produce enzima liberă (E) și produsul de reacție (P). În cinetica

enzimatică, condițiile cele mai importante sunt [S], V0, Vmax, și constanta Michaelis Menten,

Km.

Termenul Km corespunde concentraţiei de substrat pentru care rata este egală cu

jumătate din Vm. În construcţia electrozilor, enzima este de dorit să obţină cel mai mare Vm şi

cel mai mic Km.

- [S] – concentrația de substrat;

- V0 – viteza inițială (rata);

- Vmax – viteza maximă; este observată când efectiv întreaga enzimă e prezentă ca şi

complex ES şi [E] este foarte mic;

- Km – concentraţia substratului necesară pentru o enzimă (la o concentraţie fixă) pentru a

atinge jumătate din viteza sa maximă, denumită constanta Michaelis [78-79].

Fig.I.7. Cinetica enzimatică [13]

Rata de reacție (v) poate fi exprimată prin ecuația lui Michaelis–Menten:

SK

SVv

m max

(I.3)

În amperometrie, rata reacţiei (v) este exprimată ca şi intensitate a curentului (I):

SK

SII

max

max

(I.4)

Ecuaţia Michaelis–Menten poate fi simplificată la două etape:

- prima are loc la concentraţii mici ale substratului [S] << Km, apoi Km + [S] ≈ Km. În aceste

condiţii, o curbă de calibrare lineară poate fi obţinută, şi v devine:

mK

SVv max

(I.5)

Rata iniţială a reacţiei este, prin urmare, direct proporţională cu concentraţia iniţială a

substratului la [S] scăzut, şi poate fi folosită pentru cuantificarea substratului. Acest lucru este

arătat în Fig.I.7. în regiunea lineară iniţială a ratei zonei de reacţie, în contrast cu concentraţia

substratului, unde panta din această regiune este egală cu Vmax/Km [14].

În practică, gama lineară poate trece de concentraţia corespunzătoare lui Km, deoarece

concentraţia substratului local din apropierea electrodului este deseori mai mică decât

PESESE catk

k

k

1

2

13

concentraţia brută, fapt datorat, de exemplu, membranelor limitatoare de difuziune ce

învelesc electrodul.

- a doua simplificare are loc la o concentraţie mare a substratului, unde [S]>> Km, apoi:

1 SK

S

m (I.6)

şi v devine: EkVv 2max

(I.7)

Rata reacţiei iniţiale este acum independentă de [S], după cum se vede în regiunea de

platou din Fig.I.7. Rata depinde acum linar de concentraţia enzimei, şi o schemă a ratei

iniţiale, în comparaţie cu concentraţia totală a enzimei, va avea o pantă de k2. Astfel, la

concentraţii mari ale substratului, ratele reacţiei iniţiale pot fi utilizate pentru a determina

concentrația enzimei [13].

I.4.2. Calibrarea şi performanţă biosenzorilor enzimatici

La reacţia enzimatică, implicată în operarea biosenzorului, pot participa unul sau mai

mulţi analiţi, S şi S', care în prezenţa enzimei formează produşii de reacţie P şi P'.

S+P — PP’ (I.8)

Pentru a monitoriza transformarea substratului S în produsul P, se pot utiliza

următoarele strategii [80].

monitorizarea scăderii concentraţiei co-substratului S';

reciclarea unuia dintre produşii de reacţie;

detecţia stării centrului redox activ al enzimei, sau evoluţia cofactorului în

prezenţa substratului, folosind un mediator imobilizat, care să reacţioneze

suficient de repede cu biocatalizatorul şi să fie uşor detectabil de către

traductor;

detecţia transferului de electroni dintre centrul activ al enzimei redox şi

traductorul electrochimic.

Calibrarea senzorilor se realizează prin adaosul de soluţii standard de analit, măsurând

şi reprezentând grafic răspunsul corespunzător stării staţionare (Rss), corectat cu semnalul

soluţiei martor (linia de bază R0), în funcţie de concentraţia analitului (c) sau logaritmul

acesteia (log c/c0) (în general c

0-1

mol/L).

Sensibilitatea biosenzorului se determină din curbele de calibrare (Rss – Ro), în funcţie

de c sau de log c/0 şi este dată de panta dreptei.

Domeniul de variaţie liniară a răspunsului biosenzorului se determină tot din curbele

de calibrare şi reprezintă intervalul de concentraţii în care fiecărei variaţii de concentraţie îi

corespunde o variaţie proporţională a semnalului analitic. Dependenţa semnalului analitic de

concentraţie este reprezentată de ecuaţia:

R = Scx (I.9)

Domeniul dinamic de concentraţii este intervalul de concentraţii pentru care x ±.

Domeniul de variaţie liniară este acea parte a intervalului dinamic de concentraţii pentru care

x = 1. În general, domeniul de liniaritate se exprimă prin număr de decade cuprinse între

limita inferioară şi cea superioară, şi depinde de proprietăţile biocatalitice şi biocomplexante

ale receptorului biologic.

Acest domeniu poate fi considerabil mărit prin intermediul unei bariere de difuzie

externă (membrana), cu diminuarea consecutivă a sensibilităţii biosenzorului. Sensibilitatea

biosenzorului se determină în domeniul de liniaritate. Limita de detecţie şi limita de

cuantificare depind de zgomotul de fond al măsurătorii [80].

14

Selectivitatea este parametrul care cuantifică gradul de interferenţă a altor specii decât

analitul în cauză, asupra măsurătorii efectuate. Selectivitatea biosenzorilor depinde atât de

traductorul ales, cât şi de componenta biologică. Majoritatea enzimelor utilizate în construcţia

biosenzorilor prezintă specificitate pentru un singur substrat, însă există şi enzime cu

specificitate de clasă (alcooloxidaza, peroxidaza, lactaza, tirozinaza, ascorbat oxidaza,

glucozoxidaza etc.). Cea mai simplă modalitate de eliminarea interferenţilor este utilizarea

unei membrane protective, externă sau internă. O metodă de determinare a interferenţilor

constă în utilizarea de senzori compensatori fără enzimă [80].

Reproductibilitatea este o măsură a variaţiei rezultatelor obţinute într-o perioadă de

timp stabilită, pentru un anumit tip de biosenzor şi o anumită concentraţie a probei de

analizat.

Timpul de răspuns reprezintă timpul necesar unui senzor/biosenzor pentru a ajunge la

90% din semnalul analitic corespunzător stării staţionare [14]. Atunci când biosenzorii sunt

utilizaţi pentru măsurători secvenţiale (în flux) reprezintă numărul de probe analizate în

unitatea de timp, fără să existe interferenţe din partea probelor analizate anterior. Acest

parametru depinde de timpul de răspuns, dar şi de timpul de recuperare necesar biosenzorului

să revină la faza staţionară iniţială.

Timpul de viaţă al unui biosenzor este definit ca timpul de stocare necesar până când

sensibilitatea scade cu 10% sau 50% comparativ cu valoarea iniţială. Pentru determinarea

timpului de stocare pe termen lung, se compară sensibilitatea unor biosenzori diferiţi,

proveniţi din acelaşi lot de producţie, după timpi diferiţi de păstrare, dar în condiţii identice.

I.5. Metode electrochimice folosite la caracterizarea comportării biosenzorilor

Metode electrochimice sunt utilizate pentru studiul proprietăţilor unor specii redox şi

se bazează pe schimbul de electroni dintre electrod şi molecula de interes. Grupările

electrocatalitice ale unei molecule sunt capabile să primească sau să cedeze electroni,

producând astfel un curent pe durata acestei reacţii. Abilitatea unei molecule de a fi oxidată

sau redusă depinde de numărul de grupări electroactive, de poziţia acestora, de tipul şi pH-ul

soluţiei de electrolit şi de temperatură.

Măsurătorile electrochimice implică folosirea unor reacţii redox, ce pot fi realizate pe

suprafaţa electrodului de lucru cu ajutorul electricităţii, pe seama substanţelor de analizat.

Astfel, metodele electrochimice măsoară una dintre mărimile:

- potenţialul de electrod (E);

- intensitatea curentului electric prin celulă, I;

- rezistenţa (R) – sau conductanţa (I/R) - soluţiei din celulă;

- timpul de desfăşurare a procesului de electrod.

Oricare ar fi parametrul măsurat, acesta poate fi controlat cu concentraţia speciei

chimice din proba supusă analizei.

Studiul acestor corelaţii a condus la clasificarea metodelor de analiză electrochimică în:

metode potentiometrice – măsoară potențialul electrodului;

metode amperometrice – măsoară intensitatea curentului (Q = i·t);

metode conductometrice – măsoară rezistenţa (R) respectiv conductanța (I/R).

Unele dintre metode care măsoară curentul, însă în condiţii de tensiune variabilă se

numesc voltamperometrice, iar un caz particular al acestora care măsoară simultan curentul şi

modificarea ciclică a potenţialului în timp se numeşte voltametrie ciclică. Din categoria

15

tehnicilor electrochimice utilizate pe parcursul acestei lucrări fac parte: voltametria ciclică,

cronoamperometria şi amperometria.

I.5.1. Voltametria ciclică

Este una dintre metodele electroanalitice în care curentul electrodului de lucru este

măsurat ca funcţie de potenţialul aplicat electrodului. Reacţiile redox care au loc la electrod

sunt heterogene şi se desfăşoară în interfaţa dintre electrod şi soluţie.Voltamograma ciclică

este, cel mai adesea, primul experiment realizat într-un studiu analitic, deoarece oferă o

localizare rapidă a potenţialului redox al speciei electroactive analizate [81-83].

Voltamograma ciclică presupune o creştere liniară a potenţialului în timp la o anumită

valoare, după care variaţia se face în sens descrescător către valoarea iniţială. Reprezentarea

curentului generat în funcţie de potenţialul aplicat (voltamograma) este utilizată pentru a

identifica potenţialul redox format al comportamentului electroactiv. Această tehnică ajută la

înţelegerea comportamentului unei specii analizate şi la selectarea tipului de traductor potrivit

pentru compusul de determinat. Odată stabilit, potenţialul redox al unei specii poate fi folosit

pentru studiile următoare ale aceleiași specii, folosind tehnici la potenţial fix

(amperometrice).

I.5.2. Amperometria

Amperometria este una din tehnicile electroanalitice în care electrodului de lucru i se

aplică un potenţial fix, iar intensitatea curentului măsurat este corelată direct cu reacţia

electrochimică desfăşurată la electrodul de lucru. Electrodul acţionează ca o sursă de

electroni transferaţi către, sau de la o moleculă la nivelul interfaţei. În stare staţionară,

curentul care străbate electrodul este limitat de difuzia compusului electroactiv prin stratul de

difuzie, către suprafaţa electrodului.

Acest curent este descris de prima lege a lui Fick.

i = n F D A (I.10)

unde,

- n - numărul de electroni transferaţi;

- F - constanta Faraday (F = 96487 C/mol);

- D - coeficient de difuzie al compusului redox activ;

- A - suprafaţa electrodului;

- - grosimea startului de difuzie;

- C - concentraţia compusului în volumul soluţiei.

În măsurătorile amperometrice se folosesc de obicei trei electrozi. Pentru realizarea

electrodului de lucru se pot utiliza o serie de materiale cum sunt: carbonul, grafitul, cărbunele

sticlos sau metale inerte ca Au şi Pt. Pentru anumite aplicaţii specifice se pot folosi şi alte

metale precum Ni, Cu şi Rh. Ca electrod de referinţă care furnizează un potenţial stabil şi

reproductibil, faţă de care este comparat şi definit potenţialul electrodului de lucru, se

folosesc frecvent în amperometrie Ag/AgCl şi electrodul saturat de calomel (SCE). Ca

electrod auxiliar (contraelectrodul) se foloseşte un material inert conducător, cum este firul de

platină.

Amperometria este considerată ca fiind cea mai utilizată tehnică electrochimică şi are

numeroase aplicaţii în tehnologia biosenzorilor, deoarece permite determinări cu sensibilitate

16

ridicată, putând fi detectate concentraţii de 10-8

, chiar 10-9

[84]. Semnalul acestor biosenzori

este generat de schimbul de electroni dintre sistemul biologic din stratul bioreceptor şi

electrod. Înregistrarea intensităţii curentului se face în funcţie de timp, aplicând electrodului

un potenţial constant.

În Fig.I.8. este prezentat (A) răspunsul analitic al unui biosenzor amperometric şi

anume, variaţia intensităţii curentului la adiţia analitului și (B) analiza potențiometrică.

(A) (B)

Fig.I.8. Curba de răspuns obţinută cu un biosenzor amperometric și analiza potențiometrică [11]

Odată cu introducerea procesului de miniaturizare s-au înregistrat numeroase progrese

în electroanaliză [85]. Aceasta a condus la dezvoltarea de biosenzori portabili, utilizând

electrozi serigrafiaţi şi potenţiostate portabile cu baterie. Electrozii serigrafiaţi prezintă

dimensiuni reduse (o unitate poate măsura 5× 2 cm) şi pot fi obţinuţi în masă, cu un cost

moderat.

O atenţie deosebită se acordă naturii materialului de electrod, dat fiind faptul că

structura şi proprietăţile acestuia determină proprietăţile traductorului, precum şi ale interfaţei

traductor/detector. Dezvoltarea rapidă a tehnologiei materialelor de electrod a permis

extinderea domeniului de compuşi detectabili. Prin urmare, sunt necesare materiale noi, care

să îmbunătăţească stabilitatea mecanică şi chimică a biosenzorilor pentru aplicaţii practice în

condiţii variate, şi totodată să simplifice metodologia de imobilizarea biomoleculelor,

asigurând controlul spaţial al acestora. Cele mai importante materiale folosite pentru

construcţia senzorilor chimici biosenzorilor constau în: polimeri organici, materialele sol-gel,

materiale semiconductoare şi composite, oxizi metalici.

I.5.3. Analiza prin injectare în flux (FIA)

FIA se bazează pe inserarea / injectarea unei probe lichide într-un flux purtător

continuu nesegmentat constituit dintr-un lichid adecvat. Proba injectată formează o zonă care

este transportată de către purtător printr-un tub spiralat (sau nu) către detector. Detectorul

măsoară un anumit parametru fizic al probei (absorbanța, potențialul unui electrod, pH-ul

etc.) ce se modifică continuu în timp ce zona de probă trece prin celula în flux, cu alte

cuvinte, concentrația speciei de determinat se modifică continuu în timp. Astfel, răspunsul

detectorului în FIA este rezultatul a două procese, ambele de natură cinetică, și anume: un

proces fizic de dispersie al zonei de probă în fluxul purător; un proces chimic de formare a

speciilor chimice.

17

Schema celui mai simplu sistem FIA este prezentată în Fig. I.9 și constă din:

Fig. I.9. Schema unui sistem FIA

- o pompă (P) care este folosită pentru a propulsa fluxul purtător printr-un tub îngust;

- un dispozitiv de injectare (V) care introduce un volum bine definit de proba (S) în fluxul

purtător într-o manieră reproductibila; D- display; W- rezidii

- un tub spiralat denumit și tub de reacție (RC) în care zona de probă se dispersează și reacționează cu componentele purtătorului, formînd specii chimice ce sunt măsurate de un

detector prevazut cu celula în flux;

- un înregistrator.

Un înregistrator tipic pune în evidență un semnal care are forma unui pic a carui înălțime

este direct propoțională cu concentrația analitului.Timpul scurs între momentul injectarii S și apariția maximului picului, care reprezintă răspunsul analitic, corespunde timpului de

rezidență T, perioada în care are loc reacția chimică. Un volum de 100 L de probă de este

injectat în fluxul purtător prin intermediul valvei de injectare. Acest lucru face ca FIA sa fie o

tehnică microanalitică automată capabilă sa efectueze cel puțin 100 de determinări pe oră, cu

un consum foarte mic de probă și reactivi [86]. Înainte de începerea determinărilor, pompa

peristaltică se lasă să funcționeze 10 minute pentru a intra în regimul optim de lucru.

Schema unei pompe peristaltice este prezentată în Fig.I.10.

Fig.I.10. Schema unei pompe peristaltice. 1 – tub flexibil din plastic rezistent; 2 – rotor; 3 – role; 4 –

opritoare. Săgetile indică sensul de circulție al lichidului prin tubul pompei.

18

I.6. Metode de caracterizare a materialelor suport pentru biosenzori

I.6.1. Studiul prin spectroscopie FT- IR

Spectroscopia în infraroşu este o tehnică de investigare folosită în studierea atât a

materialelor organice, cât şi a celor anorganice. În principiu, se bazează pe măsurarea

absorbţiei undelor electromagnetice (IR) într-un anumit interval de frecvenţe. Undele

electromagnetice folosite în spectroscopia IR au frecvenţe cuprinse în intervalul 1.9 × 1013

-

1.2 × 1014

Hz, corespunzând unor energii a fotonilor situate în intervalul 0.078 - 0.5 eV, unde

h este constanta lui Planck, iar v frecvenţa.

Acest nivel de energie nu poate excita electronii, dar poate induce excitarea vibraţională

sau rotaţională a legăturilor covalente dintre atomi sau grupări funcţionale. Frecvenţele pentru

care are loc absorbţia sunt în directă legătură cu structura moleculelor sau a speciilor de

atomi, cu tipul legăturii şi cu modurile posibile de vibraţie. Pentru obţinerea unui spectru IR

tipic, proba de studiat este expusă la un fascicul de lumină în infraroşu, iar fasciculul transmis

sau reflectat este colectat şi analizat. Folosind frecvenţele de absorbţie caracteristice, diferite

grupări funcţionale pot fi identificate rapid [86-87].

Fenomenul de absorbţie în infraroşu rezultă din interacţiunea între componenta

electrică a radiaţiei incidente cu vectorii moment dipolari ai grupărilor chimice prezente în

moleculă. Spectrul în infraroşu al unei substanţe este determinat de natura, numărul şi

poziţiile relative ale atomilor componenţi, adică de structura moleculelor care o constituie.

Problemele identificate în spectroscopia IR tradiţională se rezumă la durata obţinerii

unui spectru complet pentru un domeniu larg şi cu o rezoluţie dată şi la coborârea domeniului

spectral măsurabil sub o anumită valoare, de ordinul a 400-500 cm-1

.

Principiul spectroscopiei IR

Un spectru în IR oferă două tipuri de informaţii: energia (sau frecvenţa) tranziţiilor

cuantice vibraţionale sau roto-vibraţionale şi măsura în care proba absoarbe sau emite

radiaţie (intensitatea acestui efect).

În raport cu spectrometrele dispersive, spectrometrele cu transformata Fourier prezintă

trei avantaje principale:

timpul de achiziţie a unui spectru infraroşu este redus considerabil;

obţinerea unor spectre cu eşantioane foarte absorbante, la care se adaptează accesorii

de eşantionare inutilizabile la un aparat dispersiv;

reproductibilitatea crescută a lungimii de undă, şi astfel ameliorarea raportului

semnal/zgomot.

Teoretic, se pot înregistra spectre în domeniul (0 - 4000) cm-1

(domeniul spectral

liber), cu o creştere a raportului semnal/zgomot de 2000x faţă de cazul lucrului cu un aparat

dispersiv obişnuit [88-89].

1.6.2. Studiul prin spectrometrie Raman

Spectroscopia Raman constituie principala sursă de informaţii asupra stărilor

vibraţionale ale materiei, alături de spectroscopia IR. Efectul Raman este un efect de

împrăştiere neelastică a radiaţiei electromagnetice la interacţia acesteia cu substanţa, când pot

avea loc următoarele fenomene:

19

emisie de radiaţie, datorită oscilaţiilor electronilor cauzate de unda electromagnetică

molecula devine polarizată la frecvenţa radiaţiei incidente;

au loc trei tipuri de împrăştiere

Tyndall - interacţia luminii preponderent cu particule coloidale, decât cu molecule

mici

Rayleigh - împrăştierea elastică a luminii, fără modificarea lungimii de undă. Este

proporţională cu inversul puterii a patra a lungimii de undă

Raman - împrăştierea inelastică, cu modificarea frecvenţei. Este mult mai slabă în

ceea ce priveşte intensitatea decât împrăştierea de tip Rayleigh şi reprezintă una

dintre principalele metode de analiză chimică nedistructivă.

Spectrometria Raman are multe avantaje faţă de spectrometria de absorbţie în IR. În

primul rând, spectrometria Raman poate fi utilizată pentru a identifica şi analiza molecule

care nu absorb în IR, ca de exemplu molecule diatomice homonucleare. Un alt avantaj îl

constituie faptul că spectrele Raman pot fi obţinute pentru soluţii, spectrul Raman al apei

fiind puţin intens. În IR însă, apa absoarbe puternic, mascând numeroase benzi de absorbţie

ale compuşilor studiaţi [90-91].

Difuzia Raman are câteva proprietăţi semnificative:

este o emisie spontană, incorectă;

intensitatea Raman este proporţională cu numărul moleculelor excitate;

pentru stările cristaline, intensitatea şi polarizarea emisiei Raman este dependentă

de proprietăţile de simetrie ale materialului [92-93].

I.6.3. Studiul prin microscopie de forță atomică

Prima descriere a unui microscop de forţe atomice a fost publicată în 1986 de Benning

(laureat al Premiului Nobel pentru Fizică în 1986), Quate şi Gerber [94-98]. Cu ajutorul

microscopului de forţe atomice se pot măsura forţe extrem de mici (<1 nN), prezente pe

suprafaţa vârfului şi pe suprafaţa probei de măsurat, forţe determinate prin contravaloarea

scării cantileverului (dispozitiv mecanic flexibil având o masă foarte mică). Forţele relevante

în microscopia de forţe atomice sunt: forţele electrostatice, legăturile dipol-dipol, forţele van

der waals, legăturile de H.

Microscopul de forţă atomică poate opera în două moduri: modul contact şi modul

noncontact. Când se lucrează în modul contact, suprafaţa probei este scanată de un vârf

ascuţit montat pe cantilever, iar proba este poziţionată pe un suport piezoelectric, care

controlează mişcarea de scanare. Caracteristicile suprafeţei probei cauzează o deviaţie a

cantileverului. Interacţia dintre suprafaţa probei şi vârf este determinată de interacţia dintre

moleculele sau atomii de pe suprafaţa probei şi vârf.

În timpul contactului iniţial, atomii de la vârf produc o forţă de repulsie foarte slabă,

datorită orbitalilor electronici suprapuşi cu atomii din suprafaţa probei. Dacă această tehnică

se utilizează la obţinerea informaţiilor topografice pe probe sensibile (de exemplu,

biostraturi), forţa laterală exercitată de vârf poate conduce la deviaţii, datorită scindării

suprafeţei.

I.6.4. Studiul prin microscopie electronică de baleiaj (Scanning Electron Microscopy)-

SEM

Un microscop electronic cu baleiaj permite obţinerea unor imagini ale topografiei şi

compoziţiei caracteristice suprafeţei unor probe netransparente la fascicule electronice.

Formarea imaginii se realizează cu ajutorul unui fascicul electronic incident primar (cu

20

energii de 1-5 KeV) foarte îngust, care baleiază suprafaţa unei probe de studiat. Baleierea se

poate realiza prin două metode:

deviaţia fasciculului de electroni cu ajutorul unor câmpuri electrostatice sau

electromagnetice variabile pe două direcţii reciproc perpendiculare;

deplasarea mecanică a probei în fasciculul electronic menţinut fix.

Prin interacţiunea electronilor primari cu suprafaţa, o parte dintre ei sunt

retroîmprăştiaţi prin reflexie elastică pe atomii probei, iar altă parte determină generarea de

electroni secundari din probă. Imaginea se realizează cu ajutorul acestor electroni fie

secundari, fie retroîmprăştiaţi care creează un contrast dependent de unghiul de incidenţă al

fascicului (adică dependent de înclinarea faţă de fascicul a unei zone sau alta din suprafaţă) şi

de compoziţia probei. Imaginile sunt construite punct cu punct pe ecranul unui tub catodic.

Rezoluţia unui microscop electronic cu baleiaj, de ordinul a 20-50 A, este un ordin mărime

inferioară microscoapelor electronice prin transmisie [99-100].

21

Capitolul II. Logistica de laborator folosită în cercetare

În cadrul studiilor efectuate s-au utilizat următorii reactivi:

- peroxid de hidrogen 30% (Sigma);

- Na2HPO4· 2H2O (Riedel-de Haën);

- KH2PO4 (Riedel-de Haën);

- KCl (Sigma);

- HCl 37% (Riedel de Haën);

- FeCl3 (Sigma);

- K3[Fe(CN)6] (Sigma);

- AOT (Dioctyl sulfo-succinate sodium salt) (Carlo Erba)

- Apă bidistilată

- 2-(4-aminofenil)-etilaminei (AP-EA), Sigma

- dihidroxinaftalină (2,6-DHN), Sigma

- Glucozoxidază, glutaraldehidă (2,5 % v/v diluata în apă) Sigma.

- soluţie Nafion 5% Dupon,

- TiO2 bioxid de titan (nanoparticule 50 nm)

Toţi reactivii chimici sunt de puritate analitică şi utilizaţi ca atare. S-au folosit

electrozii serigrafiaţi de carbon, model DRP-110, au fost achiziţionaţi de la Dropsens

(Spania). Acesti electrozi, serigrafiaţi pe un suport ceramic, sunt formaţi dintr-un electrod de

lucru de carbon cu o suprafaţă de S=0,4cm-2, un electrod de referinţă de Ag şi un

contraelectrod de carbon Fig. II.1.

Fig.II.1. Modul electrozi grafit de carbon, model DRP 110 (Dropsens, Spania)

Studiile de voltametrie ciclică, amperometrie, cronoamperometrie au fost realizate cu

ajutorul unui analizor electrochimic type III Autolab (EcoChemie, Olanda) conectat la un PC

pentru setarea parametrilor şi conectarea datelor, precum şi un potentiostat / galvanostat

portabil PalmSens (PalmSens, Olanda) controlat prin intermediul software-ului PalmSensPC.

22

Fig.II.2. Potentiostat type III (EcoChemie, Olanda)

Pentru caracterizarea senzorului SPCE/PB/copolim într-un sistem de analiză în flux cu

detecţie amperometrică s-a utilizat un montaj monocanal format din: dintr-o pompă

peristaltică Minipuls 3 (Gilson), un sistem de injectare bazat pe o valvă cu 6 canale

(Rheodyne, model 7725i), şi celula de analiză în flux tip jet pe perete prevazută cu electrod

de referință Ag/AgCl şi contraelectrod de aur. Bucla valvei de injectare este de 100µL.

Detectorul utilizat este un potentiostat/galvanostat – Autolab. Au mai fost utilizate două

agitatoare magnetice (Elma) şi o baie cu ultrasunete (Velp Scinetifica).

Fig.II.3. Sistem de analiză în flux

Toate experimentele au fost realizate la temperatura camerei, folosind tampon fosfat 50

mM cu un conţinut de 0.1 M KCl, pH 6,5. Determinările amperometrice au fost realizate în

soluții agitate cât şi în picătură, prin aplicarea potenţialului corespunzător. Când linia de bază

s-a stabilizat, se adaugă volumul potrivit de analit pentru a obţine o anumită concentraţie

finală, urmată de înregistrarea curentului staţionar corespunzător. Agitarea soluţiei s-a facut

cu ajutorul unui agitator magnetic, care asigură transportul convectiv pe toata durata

măsurătorii amperometrice.

23

Senzorul serigrafiat de grafit a fost curaţat înainte de folosire prin voltametrie ciclică în

soluţie de H2SO4 0.5 M (între -0,2-0,12V, timp de 50 de cicluri, la o viteza de scanare de 50

mV/s).

Măsurătorile SEM au fost efectuate folosind un microscop de înaltă rezoluţie, FEI

Quanta model 2D si 3D FEG, la o tensiune de accelerare de 5kV, în modul vid înalt cu

Everhart-Thornley secundar de electroni (SE) detector şi SEM Tescan Vega II LMU iar cel

AFM au fost efectuate în modul non-contact cu un XE-100 (< 7 nm tip radius; PPP-NCLR tip

de la Nanosensors TM) cu lungime de 225 µm, 38 µm laţime si 48 N/m spring constant și ~

190 KHz frecvenţa de rezonanţă.

Fig.II.4. Microscop Vega II LMU Tescan

Studiile AFM au fost realizate cu ajutorul unui microscop XE-100 Park System cu un

sistem non-contact. Spectrele Raman au fost obţinute cu un Spectrometru RM 100 Renishau

RAMAN echipat cu CCD. Înregistrarea spectrelor FT-IR s-a realizat cu ajutorul

spectrometrul FTIR model Nicolet iS10 (Thermo Scientific). Măsurătorile electrochimice au

fost realizate cu ajutorul unui potențiostat/galvanostat PARSTAT 4000 cu analizor de

frecvență (FRA), controlat prin intermediul unui software VersaStudio.

Fig.II.5. Potentiostat/ galvanostat PARSTAT 4000 cu analizor de frecvența (FRA)

24

Determinările amperometrice au fost realizate în soluţii agitate cât şi în picatură, prin

aplicarea potenţialului corespunzător.Agitarea soluţiei s-a facut cu ajutorul unui agitator

magnetic, care asigură transportul convectiv pe toata durata măsuratorii amperometrice.

Celula electrochimică a fost asamblată dupa modelul convenţional cu 3 electrozi: electrodul

serigrafiat DRP 110 a fost folosit ca electrod de lucru, Ag/AgCl ca electrod de referință şi

contraelectrod.

Fig.II.6. Sistem de conectare a senzorului cu electrozi de grafit (serigrafiaţi)

Măsurătorile de voltametrie ciclică (CV) şi amperometrie au fost realizate folosind un

sistem electrochimic 302 N Autolab (Eco Chimie, Utrecht, Oland) conectat la un PC pentru

controlul parametrilor și colectarea datelor și un software GPES. Rezultatele au fost

prelucrate cu ajutorul softwerul Origin 8.1.

Matricea oxidică pentru imobilizarea enzimei GOD s-a realizat pe suport de carbon

folosind pentru studiu două sisteme, carbon vitros (electrod GC) şi grafit serigrafiat (electrod

SCPE). Suprafața celor doi electrozi folosiţi a fost curăţată înainte de folosire ca suport.

25