Biosenzori Folositi pentru Determinarea Glucozei din Sange

Universitatea Aurel Vlaicu din Arad

Facultatea de Inginerie Alimentara, Turism si Protectia Mediului

Specializarea: Biotehnologii Industriale

Anul: IV

BIOSENZORI FOLOSITI PENTRU DETERMINAREA GLUCOZEI DIN SANGE2008

BIOSENZORI FOLOSITI PENTRU DETERMINAREA GLUCOZEI DIN SANGEDefinitia biosenzorilorBiosenzorii sunt detectori ce se bazeaza pe molecule selective ce intra in componenta plantelor si animalelor. Biosenzorii moderni au evoluat din combinarea a doua discipline separate: tehnologia informationala, (microcircuite si fibre optice, procesare numerica a datelor, teoria generala a sistemelor cu comportare neliniara) si biologia moleculara. Prima furnizeaza electrozi miniaturali sau senzori optici, tehnica de preluare si procesare a informatiei iar a doua, pune la dispozitie biomolecule care recunosc o substanta tinta.

Istoria biosenzorilor

In 1950 Leland C. Clark Jr., a inventat un electrod destinat a fi folosit pentru masurarea oxigenului dizolvat in sangele bolnavilor operati. Acesta este format dintr-un electrod de platina si un electrod cu o membrana de plastic permeabila la gaze. Polaritatea electrodului a fost astfel stabilita incat intensitatea curentului prin circuit sa depinda de viteza de difuzie a oxigenului prin membrana, viteza ce este direct proportionala cu concentratia externa a oxigenului.

In 1962 Clark extinde folosirea acestui "electrod de masurare a oxigenului" la determinarea nivelului de glocoza in sange. El a imbracat senzorul pentru oxigen cu un strat subtire de gel ce contine un biocatalizator, enzima numita gluco-oxidaza, urmat de o membrana semipermeabila de dializa ce permite glucozei sa difuzeze in senzor, dar opreste enzima sa difuzeze afara. Cu cat intra mai multa glucoza, cu atat mai mult oxigen este consumat de enzima. Deci, o cantitate mica de oxigen existenta se traduce prin existenta unui nivel ridicat de glucoza.

In 1969, G.Guilbault a inventat un sistem de masura a ureei in fluidele corpului. Dispozitivul lui foloseste o enzima, ureaza, ce converteste urea in bioxid de carbon si amoniac. Electrodul sesizeaza schimbarile in concentratia ionilor de amoniu. Acest dispozitiv a constituit o imbunatatire pentru ca se bazeaza pe o detectie potentiometrica (un fel de senzor potentiometric), o tehnica ce de atunci a fost folosita foarte mult. In timp ce senzorii lui Clark masoara trecerea curentului prin electrod, senzorul potentiometric masoara tensiunea ceruta pentru mentinerea curentului la zero. Electrodul nu consuma nici un fel de reactanti de aceea este mai putin susceptibil la erori cauzate de schimbarile survenite in mediul extern. In plus, sistemul potentiometric are o curba logaritmica de raspuns astfel incat poate urmari o concentratie de peste 100 de ori.

In deceniile ce au urmat, peste 100 de enzime au fost folosite in biosenzori. Cercetatorii in domeniu au realizat ca nu numai enzimele singulare se pot folosi, ci si tesuturi ce reactioneaza la aminoacizi si la alte biomolecule importante. De ex, folosirea pulpei de banana pentru masurarea dopaminei, miezul de porumb pentru piruvat, frunza de castravete pentru cisteina, sfecla de zahar pentru tirozina, ficatul de iepure pentru guanina si pudra de muschi de iepure pentru monofosfat de adenozina.

Biosenzorii au inceput sa fie folositi cu succes si in alte domenii decat cele medicale. Astfel, Isao Kurube si Shuichi Suzuki au masurat cerintele biochimie ale oxigenului, ce reprezinta un indiciu al prezentei materiilor organice in apa uzata.

Biosenzorul, bazat pe drojdie, face o citire a rezultatelor in 30 minute fata de 5 zile in care se obtin rezultatele prin metode conventionale.

Biosenzorii sunt folositi si pentru a determina calitatea hranei si prospetimea ei ( pentru peste, carne, etc). Cu mare succes sunt folositi in industrie, in procesele industriale, pentru a determina compozitia chimica a materialelor de-a lungul proceselor. Aceste masuratori sunt importante in special in biotehnologie, unde in mod curent nu se pot monitoriza culturile de microorganisme procese de fermentatie ce produc proteine active si alte produse ca interferon sau insulina. [1]

Aplicatii ale biosenzorilor

Principala cerinta pentru un biosenzor este aceea de a fi valoros in acord cu cercetarile si aplicatiile comerciale: identificarea moleculelor tinta, disponibilitatea recunoasterii elementelor biologice corespunzatoare si potentialul pentru detectarea posibilitatii sistemelor, sa fie sensibile tehnologiei de laborator in cateva situatii. [2]

Aplicatiile acestor dispozitive sunt cu atat mai variate cu cat moleculele incorporate sunt mai variate. Asistenta medicala este cea care beneficiaza imediat de biosenzori, nu numai in testele clinice, dar si in fabricarea de medicamente si inlocuirea unor organe ca pancreasul artificial pentru diabetici. Biosenzorii se folosesc de asemenea pentru stabilirea calitatii si sigurantei hranei si detectarea factorilor de mediu poluanti. Alte cateva exemple se pot aminti: detectarea patogenilor, determinarea nivelelor de toxicitate inainte si dupa bioremeditare, detectarea si determinarea organofosfatilor, determinarea metabolitilor toxici cum ar fi micotoxine, etc.

Clasificarea biosenzorilor

Biosenzorii pot fi clasificati:

dupa tipul de agent biologic folosit: biocatalitic (enzime, celule, tesuturi), anticorp (imunosenzor) sau antigen (fragment de ARN);

dupa tipul traductorului folosit: amperometrice, potentiometrice, conductometrice, calorimetrice, optice, piezo-electrice, manometrice.;

printr-o combinatie a primelor doua criterii. dupa analitii sau reactiile pe care le monitorizeaza:

monitorizare directa a concentratiei analitilor sau a reactiilor care produc sau consuma analitii;

monitorizare indirecta care presupune monitorizarea unui inhibitor sau a unui activator al bioreceptorului.

Un alt tip de clasificare imparte biosenzorii in urmatoarele categorii:

Biosenzori de afinitate. Analitul nu se modifica chimic in timpul masuratorii. El doar se leaga de receptor. La sfarsit el poate fi indepartat chimic sau prin spalare.

Biosenzori de metabolism. Aici substratul biologic se consuma printr-o reactie chimica cu analitul, formandu-se un nou produs. Starea initiala se poate reface dupa completa consumare a analitului. (Exemplu: se doreaste detectarea microorganismului Helycobacter Pylor in substanta purtatoare: suc gastric. In metabolismul sau, acest microb produce NH3 (amoniac). Asadar, senzorul nu va detecta microbul in sine, ci concentratia de amoniac.)

Imunosenzori. Detectarea substantelor de tip antigen (Ag) se face cu ajutorul anticorpilor (Ac), pe principiul "lacat-cheie". Anticorpii sunt proteine cu molecule in forma de Y (numite imunoglobuline). In varfurile Y-ului sunt doar doua locuri, unde se poate lega un singur tip de antigen. Aceasti anticorpi sunt produsi de organism ca raspuns la o anumita substanta straina (antigen), pe care nu o poate elimina prin fagocitoza si careia, in ultima instanta, ii "incurca planurile", legandu-se de ea: Ac+Ag AcAg.

Senzori biomimetici. Cu ajutorul acestor senzori se detecteaza semnale fizice (sunet, stres mecanic, lumina) pe baza interactiunii lor cu substratul biologic activ (receptorul).

Atunci cand se face referire la un anumit biosenzor particular (si se doreste identificarea lui exacta) trebuie precizata clasificarea lui dupa toate criteriile. De exemplu: biosenzor de lactoza IMFET (adica acest biosenzor este un imunosenzor care are drept traductor un tranzistor cu efect de camp). [3] [4]

Caracterisitici ale biosenzorilor

1. Selectivitatea. Selectivitatea este probabil cea mai importanta trasatura a unui biosenzor. Selectivitatea inseamna ca senzorul detecteaza un analizor sigur si nu reactioneaza la amestecari sau cu contaminanti.

2. Precizia este o caracteristica al oricarui dispozitiv stiintific care realizeaza masuratori cantitative.

3. Stabilitatea semnalului arata semnalul imprastiat sub conditiile constante, care cauzeaza erori in masurarea concentratiei. Stabilitatea semnalului influenteaza precizia senzorului, este o caracteristica importanta a unui senzor care executa monitorizari continue.

4. Sensibilitatea (limita de detectie) arata cantitatea minima (sau concentratia) de analizor care poate fi detectat.

5. Distanta de lucru este distanta concentratiilor probelor de analizat cu care senzorul poate opera. Distanta de lucru a unui senzor trebuie corelata cu distanta concentratiilor posibile a probei analizate in matrice. De exemplu, concentratia glucozei in sange in mod normal variaza intre 0,2 si 20 mM. Distanta de lucru a senzorului de glucoza nu poate fi mai mica. Daca un senzor nu detecteaza doar proba de analizat , dar masoara concentratiile probei, distanta liniara este o alta caracteristica importanta. Distanta liniara este distanta concentratiilor probei in care senzorul raspunde schimbarilor liniare cu concentratia.

6. Timpul de raspuns este timpul cerut pentru a analiza matricea.

7. Timpul de regenerare este timpul cerut de senzor pentru a reveni la stadiul de lucru dupa interanctia cu proba.

8. Numarul de cicluri este timpul cerut ca senzorul sa poata opera. Degradarea materialului biologic este inevitabil si este necesar a fi inlocuit. [2]Pricinpii de detectie

Fotometrice

Biosenzorii optici bazati pe fenomenul de rezonanta plasmatica de suprafata sunt unde trecatoare ale tehnicilor. Aceasta utilizand o proprietate cunoscuta a aurului si a altor materiale; specifica pentru un strat subtire de aur pe o suprafata de sticla cu un indice mare de refractie este posibilitatea de a absorbi lumina laserului, producand valuri de electroni (suprafata plasmatica). Aceasta se gaseaste numai la unghiurile specifice si la lungimile de unda a luminii incidente; prezinta o mare dependenta de suprafata aurului, asemenea legarii probei tinta analizate la un receptor pe suprafata aurului producand un semnal masurabil.

Senzorii rezonantei plasmatice de suprafata opereaza folosind o parte dintr-un senzor constand dintr-o caseta de plastic pe un suport de sticla, plat, o parte din acesta fiind invelit cu un strat microscopic de aur. Aceasta parte contacteaza detectorul optic al instrumentului de masurat. Cealalta parte este apoi legata cu un sistem de curgere a unui microfluid. Contactul cu sistemul de curgere creaza canale peste care reactivii pot fi trecuti in solutie. Aceasta parte de sticla a senzorului poate fi modificata in mai multe moduri, pentru a permite atasarea moleculelor de interes mult mai usor. In mod normal, este acoperita in carboximetil dextran sau componente similare.

La fixarea unei anumite valori a lungimii de unda, lumina este reflectata asupra partii aurite, la un unghi al reflectiei interne totale detectat in interiorul instrumentului. Aceasta produce o unda trecatoare care penetreaza complet sticla si intr-un fel oarecare patrunde in lichidul curgator peste suprafata sticlei. Indicele de reflactie al partii curgatoare de pe suprafata senzorului are o directa influenta asupra comportamentului luminii reflectate pe partea aurita. Legand-o de partea fluida a senzorului are un efect asupra indicelui de reflectie si in acest fel, interactiile biologice pot fi masurate la un inalt grad de sensibilitate cu cateva feluri de energie.

Alti biosenzori optici sunt in principal bazati pe schimbarile de absorbanta sau de fluorescenta a unui compus indicator convenabil. Peste tot se folosesc unelte de cercetare, micro-matricile fiind fundamentale pentru un biosenzor

Electrochimice

Biosenzorii electrochimici sunt in mod normal bazati pe cataliza enzimatica a unei reactii care produce sau consuma electroni (de asemenea enzimele sunt pe drept numite enzime redox). Substratul senzorului contine de obicei 3 electrozi, un electrod de referinta, un electrod activ si un electrod inclinat. Un electrod fisa poate fi de asemenea prezent ca si sursa de ioni. Proba de analizat tinta este implicata in reactii care au loc pe suprafata electrodului activ si ionii produsi isi creaza un potential scazut de la electrodul de referinta care da semnalul. Se poate masura orice curent ( rata de curgere a electronilor este proportionala cu concentratia probei de analizat) la un potential fixat sau potentialul poate fi masurat la curent zero (acest lucru da un raspuns logaritmic). Observatia despre potentialul lucrat sau despre electrodul activ este spatiul sensibil cerut si acesta este adesea folosit.

Alte exemple, biosenzorii potentiometrici, lucreaza in mod contrar curentului, cunoscandu-li-se abilitatile. Unii biosenzori sunt o imagine (screenprinted ), insotind un polimer invelit, deschid circuitul potential al biosenzorilor bazati pe incercarile imunologice ale polimerilor conjugati. Sunt doar doi electrozi si sunt extrem de sensibili, vigurosi si precisi. Dau posibilitatea detectarii probei de analizat la nivelele anterioare numai prin folosirea HPLC si LC/MS, fara preparari riguroase de proba. Semnalul este produs de schimbarile electrochimice sau fizice din comportamentul stratului de polimer datorita schimbarilor aparute la suprafata senzorului. Asemenea schimbari pot fi atribuite puterii ionice, pH-ului, hidratarii si a reactiilor redox.

Alte principii de detectie

Senzorii piezoelectrici utilizeaza cristale care suporta o deformatie elastica cand ii este aplicat un potential electric. Un potential alternativ produce o unda de pozitie intr-un cristal la o frecventa caracteristica. Aceasta frecventa este mult dependenta de proprietatile elastice ale cristalului, astfel ca daca cristalul este acoperit cu un element biologic apreciat legatura analizorului tinta la un receptor va produce o schimbare a frecventei rezonantei, care da un semnal legat. In cazul in care se foloseaste suprafata undei (SAW), sensibilitatea este foarte mult crescuta. Aceasta este o aplicatie speciala a cristalului Quartz, echilibrata in biosenzor. [2]

METODE DE DETERMINARE A GLUCOZEI DIN SANGE CU AJUTORUL BIOSENZORILOR

Senzorii de glucoza reprezinta un mare interes datorita faptului ca unul din cei mai importanti parametrii care sunt verificati in cadrul analizelor medicale de rutina este continutul de glucoza. Acesti senzori au fost de asemenea folositi si pentru masurarea glucozei din alte fluide biologice, si in procesele de fermentatie.

Determinarea glucozei din sange cu ajutorul biosenzorilor este de mare importanta in analizele clinice pentru cel putin trei motive:

este permisa o scurtare a intregii proceduri analitice pentru determinare, datorita eliminarii consumului de timp necesar separarii celulelor de sange si plasma;

este o nevoie binecunoscuta pentru monitorizarea glucozei bolnavilor critici si a clientelei chirurgicale;

designul unor astfel de senzori poate conduce direct la dezvoltarea unui senzor implantat in vivo folosit la inchiderea lantului de infuzii de insulina.

Determinarea glucozei din sange reprezinta numeroase dificultati in comparatie cu determinarea glucozei din limfa:

glucoza masurata in intreg sangele este 12-20 % , mai putin decat cea din limfa.

scaderea rapida a concentratiei de glucoza din proba de sange neconservata, datorita actiunii glicolitice a eritrocitelor si a leucocitelor

Determinarea nivelului de glucoza din sange se poate realiza folosind 3 mari metode:

utilizarea enzimei glucozoxidaza;

utilizarea enzimei peroxidaza;

metoda elecrochimica.

DETERMINAREA NIVELULUI DE GLUCOZA DIN SANGE FOLOSIND GLUCOZOXIDAZA:

Capacitatea glucozoxidazei de a cataliza oxidarea glucozei la acid gluconic a fost intens promovata ca un model de sistem pentru obtinerea senzorilor de glucoza. Enzima prezinta o activitate ridicata, este relativ stabila, accesibila, iar din aceste motive este intens utilizata pentru obtinerea de biosenzori electrochimici si optici. Un lucru important de care trebuie sa se tina seama in dezvoltarea acestor dispozitive il reprezinta imbunatatirea metodei de imobilizare. S-au studiat diferite metode, cum ar fi adsorptia fizica, legatura covalenta, cross linking si electropolimerizarea.

Aceasta metoda de determinare a nivelului de glucoza din sange bazata pe utilizarea glucozoxidazei se poate realiza in mai multe variante:

a) Metoda chemiluminescentei este una din variantele de determinare a glucozei din sange folosind glocozoxidaza.

Aceaste metoda se bazeaza pe diferenta de intensitate a chemiluminescentei luminolului in functie de cantitatea de apa oxigenata rezultata in urma reactiei catalizata de glucozoxidaza. S-a realizat o imobilizare a glucozoxidazei pe picaturi (margele) de sticla de aminopropil si a fost masurata chemiluminescenta cu ajutorul unei legaturi cu o fibra optica.

Principiul determinarii glucozei prin metoda enzimatica se bazeaza pe masurarea peroxidului de hidrogen (apei oxigenate) rezultat in urma reactiei de oxidare a glucozei in prezenta oxigenului molecular (1):

-D-glucoza + O2 + H2O glucozoxidaza acid gluconic +H2O2 (1)

Determinarea amperometrica a peroxidului de hidrogen rezultat in urma reactiei de oxidare a fost intens studiata. O alta metoda dezvoltata pentru determinarea peroxidului de hidrogen rezultat in urma reactiei enzimatice o reprezinta masurarea diferentei de semnal de chemiluminescenta in functie de continutul de peroxid de hidrogen.

Cel mai folosit agent chemiluminogenic il reprezinta luminolul (3- aminophthalhydrazide). Asa cum rezulta din ecuatia (2), luminolul reactioneaza cu peroxidul de hidrogen rezultat in urma reactiei enzimatice a glucozei, si duce la obtinerea de chemiluminescenta. Spectrul de chemiluminescenta arata o lungime de unda larga, a carei intensitate maxima este la 425 nm.

2H2O2 + luminol 3-aminophthalte + N2 + lumina (2)

In mod cert, intensitatea chemiluminescentei luminolului este direct proportionala cu concentratia de peroxid, de catalizator sau de luminol. Ionii metalelor de tranzitie, cum sunt Co2+, Cu2+ si Fe3+ sau diverse complexe de metal sunt folosite drept catalizatori. Metoda chemiluminescentei este in special folosita pentru determinarea de peroxid datorita limitei de detectie scazute, sensibilitatii inalte, selectivitatii ridicate, usurinta folosirii si a instrumentatiei ieftine. In ultimul timp, cablurile de fibra optica au fost intens folosite pentru masurarea intensitatii luminii.

Aparatura:

O schema de principiu a analizorului automat de injectie cu debit oprit este redata in fig.1 . Acest sistem de curgere este format din doua pompe peristaltice: una (P1) livreaza o solutie de reactiv chemiluminogenic (R1)si 1,0x10-1 M solutie tampon (pH 12 , R2), iar cealalta (P2) livreaza o proba de solutie (R3) si 1,0x10-1M solutie tampon fosfata (pH7, R4). Cele doua componente sunt amestecate, iar amestecul este trimis intr-o coloana de imobilizare a enzimei glucozoxidaza. Solutia trecand prin reactorul de enzima a fost amestecata cu mixul P1. Tubul PTFE (0,8 mm) este folosit pentru a conecta toate componentele acestui sistem.

Pentru masurarea intensitatii chemiluminescentei s-a folosit un fotomultiplicator electronic, a carui tensiune era de 850 V. Intensitatea chemiluminescentei la 424 nm a fost monitorizata pentru determinarea glucozei.

Pregatirea enzimei:

Dupa ce 2 g de picaturi (margele) de sticla de aminopropil au fost amestecate cu 30 ml de solutie tampon de fosfat de pH 7 care continea 2,5% glutaraldehida, amestecul a fost agitat timp de 5 ore la temperatura camerei. Margelele sunt apoi filtrate si spalate cu solutie tampon de fosfat. Margelele rezultate sunt amestecate cu 10 ml de solutie tampon de acetat cu pH 5,6 care contine 5g de glucozoxidaza, iar mixul a fost apoi incubat timp de 5 ore la 40C sub agitare continua. Margelele de enzima imobilizata sunt filtrate si introduse intr-o coloana de sticla de 70 mm. Ambele capete ale coloanei au fost inchise cu vata de sticla.

Procedeul de masurare:

Proba de sange colectata dintr-un vas de sange uman a fost diluata cu 1,0x10-1M solutie tampon de fosfat de sodiu (pH7) care continea 5.0x10-2M NaF, 2.0x10-1M NaCl si 3.5x10-3M EDTA. S-a preparat o solutie stoc de glucoza 500mM prin dizolvarea D(+)-glucozei intr-o solutie tampon care continea aceleasi ingrediente ca si cele folosite in cazul probei de sange. Solutia stoc a fost pastrata intr-un vas de sticla inchis la culoare, la 4 0C. Solutia standard a fost preparata proaspat prin realizarea unor dilutii apropiate de solutia stoc cu ajutorul unei solutii tampon care continea aceleasi ingrediente ca si cea utilizata la obtinerea solutiei stoc. O solutie de reactiv chemiluminogenic care continea 1.0x10-3M luminol si 1.0x10-2 M ferocianura a fost de asemenea folosita.

Proba si solutia tampon de fosfat au fost pompate cu un debit de 3,8ml/min. Solutia tampon de bor si reactivul chemiluminogenic au fost pompate cu un debit de 2,5ml/min. Intervalele de timp pentru preluarea datelor si spalarea cu proba martor sunt de 100 si respectiv 150s.

In fig.2. este prezentat spectrul obtinut pentru lungimea de unda de 424nm. Sunt observati 2 picuri la lungimi de unda de 298 si 358 nm. Intensitatea corecta a spectrului obtinut la 298 nm pentru solutia proba este aratata in fig. 3(a). In fig. 3(b) este prezentat spectrul inregistrat pentru solutia care continea solutie tampon, reactiv chemiluminogenic si peroxid de hidrogen.

Rezultatele indica faptul ca glucoza poate fi determinata prin masurarea modificarii intensitatii chemiluminescentei datorita continutului diferit de peroxid de hidrogen rezultat in urma reactiei enzimatice a glucozei.

Fig.1. Fig.2.

Fig.1. Schema de principiu a analizorului cu debit oprit pentru determinarea glucozei prin metoda chemiluminescentei. R1=solutie de reactic chemiluminogenic; R2=solutie tampon de borat; R3=curentul probei; R4=solutie tampon de fosfat; P1 si P2=pompe peristaltice; E=reactorul de glucozoxidaza; FC=celula de curgere; MS=agitator magnetic; OF=legatura de fibre optice bifurcate; D=detector; W=reziduu.

Fig.2. Spectrul pentru solutia de reactiv chemiluminogenic obtinut prin folosirea analizorului cu debit oprit (luminol) 1.010-3 M; [Fe(CN)6 -3], 1.010-2 M; em, 412 nm.

Fig.3. Fig.4.

Fig.3. Spectrul solutiei de reactiv chemiluminogenic (a) si spectrul chemiluminescentei sistemului luminol-Fe(III)-H2O2 obtinut prin folosirea analizorului cu debit oprit (b).

Fig.4. Efectul pH-ului asupra intensitatii chemiluminescentei pentru glucozoxidaza.

Efectul pH-ului asupra intensitatii:

S-a studiat efectul pH-ului intre valorile 5-8 asupra glucozoxidazei prin masurarea intensitatii chemiluminescentei emisa pentru lungimea de unda de 424 nm. S-a observat ca are loc o crestere a intensitatii pe masura ce creste si pH-ul, pana la valoarea de 7, dupa care, intensitatea scade (fig.4).

Efectul temperaturii:

Performantele enzimei sunt direct influentate de temperatura. S-au studiat efectele temperaturii asupra intensitatii chemiluminescentei in intervalul 15-45 0C. Rezultatele arata faptul ca dupa 350C are loc, probabil, o denaturare a enzimei, motiv pentru care s-a luat ca temperatura de lucru valoarea de 250C pentru aceasta metoda de determinare a glucozei.

Curba de calibrare a glucozei:

Pentru calibrare s-a folosit media inaltimii picurilor a 3 semnale succesive de chemiluminescenta obtinute in conditii optime experimentale pentru fiecare solutie standard de glucoza. O masurare completa dureaza mai putin de 5 minute. Figura 7 prezinta o curba obisnuita de calibrare pentru concentratii diferite de glucoza de pana la 12 mM.

Stabilitatea enzimei folosita pentru determinarea glucozei a fost investigata prin realizarea a 20 de injectii succesive cu 5.0x10-1mM de solutie standard de glucoza, o data la trei zile, timp de 2 luni. Pentru primele 15 masuratori, intensitatea chemiluminescentei varia cu 5,8%. Pentru ultimele 5 masuratori, semnalul a scazut considerabil, avand un coeficient de variatie de 11%.

Fig.5. Tabel.1.

Fig.5. Curba de calibrare a glucozei obtinuta prin metoda chemiluminescentei.

Tabel 1. Rezultate analitice ale glucozei in probe de sange uman, obtinute prin metoda chemiluminescentei.

Analizarea sangelui uman:

Aceasta metoda a fost aplicata pentru determinarea glucozei din sangele uman. Au fost analizate 10 probe de sange folosind aceleasi conditii experimentale ca si in cazul curbei de calibrare, iar rezultatele au fost comparate cu datele obtinute prin metode clinice oficiale. Rezultatele sunt prezentate in tabelul 1.

S-au obtinut rezultate satisfacatoare intre cele doua rezultate, cu exceptia probelor 4 si 5. Acuratetea metodei a fost imbunatatita prin refacerea experimentelor. La fiecare din cele doua probe li s-au adaugat o cantitate de glucoza, iar apoi au fost analizate. Rezultatele sunt prezentate in tabelul 2; acestea indica faptul ca aceasta metoda poate determina cu succes continutul de glucoza din probele de sange uman[5].

Tabel 2. Rezultate obtinute in urma adaugarii de glucoza in probele de sange:

b) Metoda biosenzorilor cu membrana externa folosita pentru determinarea glucozei din limfa si din intreg sangele, nediluat. Aceasta metoda se bazeaza pe folosirea unei membrane externe de polipropilena umeda in combinatie cu diversi eteri ai polixietilenei.

In toate studiile s-a pus o mare atentie asupra optimizarii membranelor exterioare a biosenzorilor folositi in analizele complete de sange. Folosirea ionomerului perfluorinat Nafion ca si membrana dialitica exterioara produce un mult mai bun biosenzor decat cel care foloseste membrane celulozice. Rezultate bune au fost de asemenea raportate pentru folosirea membranei policarbonate. Cand microporii membranei policarbonate sunt tratati cu lichid izopropil miristic, linearitatea raspunsului la glucoza a fost bine extinsa deasupra substratului fiziologic limita.

Aparatura masuratorile voltmetrice au fost indeplinite folosind un voltamograf tip CV-37 din Sistemul Bioanalitic (SUA) conectat la o banda (diagrama) de inregistrare.

Designul biosenzorului masurand celula este prezentat in fig.1. Biosenzorul cuprinde 2 bile din poxiglas montate impreuna folosind 4 asuruburi. In partea A este prevazut cu un electrod de argint (1) acoperit cu clorura de argint, care serveaste drept electrod de referinta. In aceeasi parte, intrarea in vizuina pentru introducerea probei se realizeaza cu o pipeta automata si un debuaseu capilar din otel inoxidabil (2), care este un electrod auxiliar.

Fig. 1 : Diagrama schematica a biosenzorului detector de glucoza:

1-biela de Ag cu suprafata sensibila, acoperita cu AgCl; 2-capilar din otel inoxidabil; 3-cauciuc in forma de cerc; 4-electrod de Ag/AgCl; 5-disc de platina; 6-orificiu pentru introducerea probelor.

In partea B, un disc de platina de 2 mm diametru a fost aranjat precum Ag/clorura de argint in cerc, la 1 mm departare si 7 mm diametru (4), care poate fi folosit ca o alternativa pentru electrodul de referinta. Suprafata discului de platina a fost slefuit cu 3 grade diferite de pudra de alumina (1, 0.5 asi 0,03 m); a fost spalat cu apa distilata si metanol si apoi curatat electrochimic 10 minute intr-o baie fosfat alcalina fierbinte, cu o polaritate alcalina intre +5 asi -5 V. Dupa o atenta spalare si uscare la temperatura camerei, 8 l de solutie Nafion este plasata pe suprafata electrodului si lasata pentru o ora sa se evapore. Stratul de Nafion a fost acoperit cu o membrana poliester ce contine glucozoxidaza (GOD) imobilizata si o membrana exterioara protectoare. Masurarea glucozei se realizeaza la + 0,65 V in prezenta Ag/AgCl.

Reactivi

In toate masuratorile, au fost folosite diferite loturi de glucozoxidaza tip X-S cat. G-7141 de la Sigma are activitati specifice de la 117 la 138 unitati / mg. Pentru imobilizarea enzimei pe o membrana de poliester (PE 04 UM )cu o dimensiune a porilor de 0,4 m a fost aplicata 50 % din solutia apoasa de glutaraldehida. A fost preparata o cantitate de 20 mM glucoza in solutie fosfat tampon cu NaCl dizolvand 3,60 g glucoza analitica asi 9,19 g NaCl intr-un litru de solutie fosfat tampon, de 0,05 M, la pH = 7,1. Cantitatea de solutie stoc este filtrata folosind ca filtru nylon de 0,45 m si colectata intr-un vas inchis la culoare la 4C. Solutia stoc a fost preparata cu cel putin 24 ore inainte de folosire. Solutia standard folosita pentru determinare este proaspat preparata cu o dilutie apropiata de solutia stoc cu solutie fosfat tampon 0,05 M la pH = 7,1 continand 8,19 g/l NaCl.

Solutia stoc tampon fosfat la 0,5 M a fost preparata prin dizolvarea a 78,0 g NaH2PO4 . 2H2O in 700 ml apa distilata. Dupa ajustarea pH-ului la 7,1, se adauga 1 l apa distilata dupa care solutia este filtrata.

Procedura pentru determinarea glucozei din sange

Probele cu sange uman au fost colectate in microtuburi fluorinate sau heparinizate. Masuratorile amperimetrice au fost executate folosind un volum de 100 l proba nu mai tarziu de 45 minute, de cand probele au fost colectate de la pacienti. Inainte de introducerea probelor, detectorul a fost spalat cu 0,5 ml din solutia fosfat la pH = 7,1 continand 0,14 M NaCl. O parte din fiecare proba a fost centrifugata iar glucoza din limfa obtinuta a fost determinata folosind analizatori clinici comerciali.

Determinarea glucozei din limfa

Designul integrat al biosenzorului de glucoza cu disc de platina folosit ca electrod functional si membrana tristratificata a fost optimizat la inceputul masuratorilor rezultate din injectii. Designul biosenzorului detector folosit in aceste studii are aceeasi structura ca partea sensibila, prezentata in fig. 1. In masuratorile prealabile pentru determinarea glucozei din limfa, o membrana din poliester Nucleopore (0,4 m)a fost folosita ca si o membrana exterioara de protectie. Pentru o concentratie in glucoza mai mare de 5 M cu un detector avand 50 l volum mort al compartimentelor masurate, un semnal cert se obtine dupa 1,5 minute.

Stabilitatea functionarii dezvoltarii biosenzorului observat mai devreme in masuratorile injectiilor lichide a fost de asemenea confirmat intrt-o discreta masuratoare a sarjei. A fost testata pentru orice depozitare a detectorului intre masuratorile din refrigerator sau pentru folosirea constanta si pastrarea la temperatura camerei. Tabelul 1 arata rezultatele obtinute pe parcursul a 10 saptamini, in care intreg detectorul a fost tinut la 4 C intre determinari. Pe durata procedurii de testare detectorul a fost folosit pentru determinarea glucozei din limfa diluata 1:10 cu fosfat tampon.

Pentru determinarile practice, dilutia 1:10 probelor cu limfa cu 0,1 M fosfat tampon la pH=7,1 si citirea semnalului au fost inregistrate dupa 90 s. Inainte de introducerea probelor, masurarea compartimentelor detectorului au fost spalate cu 0,5 ml apa distilata. Probele cu limfa recoltate proaspat au fost simultan analizate folosind Analizorul de glucoza Beckman 2 sau Kone progress. Corelatiile sarjelor obtinute pentru 2 serii ale probelor naturale folosite pentru compararea cu analizele comerciale sunt prezentate in fig. 2.

Fig.3: Corelarea loturilor obtinute pentru determinarea glucozei din limfa si Analizorul de glucoza Beckman 2 (A) si Analizorul Kone Progress (B).

Optimizarea membranei externe pentru masurarea intregii cantitati de sange nediluat

Importanta folosirii membranei externe protectoare in designul biosenzorului pentru determinarea glucozei in tot sangele a fost deja prevazuta de mult timp. Retezarea speciilor macromoleculare si reducerea ritmului de transport a interferentei oxidabile amelioreaza exactitatea ambelor determinari si durata de viata a biosenzorului.

Folosirea de membrana macroporoasa de poliester Nucleopore PE 04UM produce rezultate satisfacatoare pentru determinarea glucozei din limfa in oricare dintre determinari, lichide sau nelichide. Oricum, din cauza unui complex mare de matrici din intreg singele pentru acelasi exemplar, au fost examinate mai multe diferente a membranelor. In aceste teste comparatia dintre rezultatele obtinute pentru intreg singele nediluat cu toate cele obtinute pentru aceeasi proba cu sange intreg nediluat la o diferenta proportionala cu solutia tampon de fostat facuta. Au fost examinate profilul schimbarii semnalului in timp si rezultatele determinarilor in corelatie cu rezultatele determinarilor obtinute din limfa cu glucoza comerciala.

Un biosenzor are o membrana externa de poliester, privind satisfacator configuratia pentru analizele de limfa, se expune mai putin favorabil schimbarilor de semnal cand se aplica pentru analizele din singe (Fig. 3).

Comparand cu analizele din limfa pentru ambele probe de singe, diluate si nediluate, observarea schimbarilor de semnal expune cu certitudine magnitutidea maxima de semnal intre 10-20 s dupa introducerea probei si apoi arata o scadere a magnitudinii semnalului (curba A-C din Fig. 3). Natura imaginilor prezentate in Fig. 3 si 4 cand o solutie standard sau o proba sunt schimbate cu o solutie de spalare nu a fost investigata, de cind aceasta nu a intervenit cu o estimare a unui rezultat analitic.

Mai precis, se pare ca acest lucru este cauzat de atacul si ne-atacul procesului, raportat anterior de catre oxido-reducerea electroactiva a suprafetei functionale, sugerata pentru un electrod de carbon sticlos.

B. DETERMINAREA NIVELULUI DE GLUCOZA DIN SANGE FOLOSIND PEROXIDAZA:

Peroxidaza catalizeaza reactia dintre peroxidul de hidrogen cu 3-metil-2-benzotiazolin hidrazina (MBTH) si cu acidul 3-dimetilaminobenzoic (DMAB)

Sarea acidului naftalensulfonic inlocuieste DMAB.

C6H12O6 + O2 GOD acid gluconic + H2O2

H2O2 + MBTH + DMAB peroxidaza MBTH-DMAB (albastru)

C. DETERMINAREA GLUCOZEI FOLOSIND METODA ELECTROCHIMICA:

Detectarea electrochimica care foloseste un potential fix functioneaza foarte bine cu molecule pentru care produsii de transfer ai electronilor sunt stabilizati prin localizarea cu ajutorul unui system conjugat . O astfel de stabilitate nu este posibila pentru glucoza, motiv pentru care cei trei radicali formati in urma reactiei de reducere sau oxidare au o energie ridicata; astfel ca procesele prezinta o energie de activare ridicata. De aceea este necesara o supratensiune mare, care reprezinta un dezavantaj pentru detectarea electrochimica. Oxidarea catalitica la un potential moderal cu electrod de platina sau de aur este posibila cu ajutorul unui mecanism care implica adsorbtia glucozei pe suprafata unul electrod curat. (fig.1.). Din pacate, produsii acestei oxidari catalitice pot ramane adsorbiti pe suprafata electrodului, blocand situs-urile catalitice si impiedica urmatoarele oxidari. In mod normal, comportamentul glucozei pe electodul de platina sau de aur la un potential fix este caracterizat de o scadere a activitatii electrozilor.(fig.2.).

Efectele negative ale adsorbtiei pot fi anulate si activitatea catalitica a suprafetei electrodului poate fi refacuta printr-un proces de curatare in doua etape dupa etapa de detectare.(fig3.). Primul pas este la un potential mai pozitiv decat cel folosit pentru detectie, iar cel de-al doilea pas, la un potential mai negativ. Efectele acestor potentiali pot fi intelese prin examinarea rotirii discului voltamogram al electrodului de aur in hidroxid de sodiu 0.1M in absenta (a) si in prezenta glucozei (b). (fig.4.). In absenta glucozei sunt 2 mari caracteristici in rotirea discului voltamogram. Curentul anodic, reprezentat in figura cu litera A, apare datorita formarii la suprafata a unui strat de oxid , iar curentul catodic, reprezentat cu C, apare datorita dizolvarii acestui strat. Aditia de glucoza conduce la o crestere insemnata a curentului anodic de la E la F datorita oxidarii unor grupuri de aldehide si alcooli pe suprafata electrodului gol. Curentul pentru aceste oxidari catalitice este micsorat la potential mai pozitive din moment ce formarea stratului de oxid blocheaza situs-urile active de pe suprafata electrodului. Oricum, curentul G este inca mare in prezenta glucozei datorita desorbtiei oxidative a produsilor de oxidare adsorbiti. Dizolvarea stratului de oxid permite reinceperea catalizei enzimatice, lucru care este aratat de curentul oxidativ H.

Potentialul optim de detectie pentru glucoza este in regiunea de potential in care nu are loc formarea de oxid si nici reducerea oxigenului (reducerea oxigenului are loc la potentiale mai mici de -0,1V). Produsii de oxidare adsorbiti care rezulta din aceasta oxidare catalitica pot fi eliberati oxidativ prin aplicarea unui potential mai mare. Oricum, aplicarea acestui potential conduce la formarea unui strat oxitativ, care conduce la pasivizarea suprafetei. Activitatea catalitica a suprafetei electrodului se reface prin aplicarea unui potential mai mic, producand dizolvarea stratului de oxid. Detectarea glucozei (si a altor zaharuri) folosind acest val de potential triplu-impuls se refera la Detectarea Amperometrica a Impulsului (Pulse Amperometric Detection) sau la Detectarea Electrochimica a Impulsului (Pulsed Electrochemical Detection). Eficacitatea lui PAD este ilistrata in figura 2, care compara reproducerea cromatogramei folosind PAD (a) si un potential constant de detectie (b). Se poate vedea ca picurii curentilor in cazul detectiei la potential constant scad odata cu timpul, in timp ce pentru PAD raman constanti.

Oxidarea catalitica a glucozei a fost incercata si prin modificarea electrozilor cu sari de cupru sau cu metal de cupru. Potentialul optim pentru detectarea glucozei este independent de metoda folosita pentru fabricarea electrodului de cupru, care sugereaza existenta unui mecanism comun. Un avantaj major al electrozilor de cupru este faptul ca produsii oxidarii nu sunt adsorbiti.

BIBLIOGRAFIE

[1]. http://www.csc.matco.ro/biosenzo1.html[2]. http://en.wikipedia.org/wiki/Biosensor[3]. http://www.tesionline.com/intl/preview.jsp?idt=16222[4].http://209.85.135.104/search?q=cache:AfPJhyDv62AJ:arh.pub.ro/cravariu/Biodispozitive.doc+biosenzori+pentru+detectarea+glucozei&hl=ro&ct=clnk&cd=2&gl=ro&client=firefox-a

[5].http://209.85.135.104/search?q=cache:xeJjEu8xcgJ:newjournal.kcsnet.or.kr/main/j_search/j_download.htm%3Fcode%3DK010305+biosensor+for+glucose+determination+from+blood&hl=ro&ct=clnk&cd=67&gl=ro[6].http://www.journalarchive.jst.go.jp/jnlpdf.php?cdjournal=analsci1985&cdvol=10&noissue=3&startpage=423&lang=en&from=jnlabstract[7]. http://www.currentseparations.com/issues/17-1/cs17-1d.pdfCatalizator OH-

Mici fluctuatii in valorile observate ale semnalului pot fi atribuite partial la minim tuturor determinarilor care au dus la bun sfarsit sub conditiile ne-termostatate. Detectorul tinut la temeratura camerei arata o crestere a semnalului cu aproximativ 10 % dupa 2 saptamani.

Un studiu implica precizia unei determinari discrete a glucozei dusa la bun sfarsit pentru controlul probelor de limfa diluate 1:10 cu fosfat tampon.

Obtinerea valorii RSD (de la 2,1 la 2,3 %) a fost cea mai rea din toate observatiile, care poate fi in mod cert atribuita tuturor determinarilor realizate manual.

Fig. 2: Stabilitatea raspunsului amperometric a biosenzorului de glucoza cu o membrana externa de poliester Nucleopore folosita pentru determinarea sensibila a glucozei din limfa, stocata intr-un refrigerator intre probe.

Fig. 4: nregistrarile obtinute pentru determinarea glucozei in probele cu sange nediluat (A-J) folosind un biosenzor optimizat de glucoza standardizat cu 7,4 (1) i 3,7 (2) mM soultie apoasa de glucoza. [6]

Fig. 3: Raspunsul biosenzorului de glucoza avand o membrana poliester Nucleopore tip PE 04UM si electrod de referinta Ag/AgCl. Solutiile standard de glucoza: 0,5 (1), 1,0 (2) si 2,0 (3). Probele cu sange diluat: 1:5 (A), 1:2,5 (B) si nediluat (C).

Fig.1. Reprezentarea schematica a oxidarii catalitice a glucozei cu un electrod de platina sau aur

Fig.2. Comparatie PAD si detectarea la potential constant a unei solutii ce contine 30 ppm Lys, 10 ppm glucoza si 40 ppm sucroza

Fig.4.Rotirea discului voltamogram al electrodului de aur in hidroxid de sodiu 0.1M in absenta (a) si in prezenta glucozei (b).

Fig.3. Forma valului de potential pentru PAD

Oxidarile catalitice mentionate mai sus sunt specifice doar pentru grupari functionale apropiate. Altfel, nu se realizeaza o separare (discriminare) intre glucoza si alte zaharuri, sau intre alcooli inerenti in PAD, fiind necesara o separare cromatografica.

In consecinta, nu este necesara realizarea unui val de potential de puls , ci poate fi folosit un potential constant.(fig.5).

Fig.5. Cromatograma unui suc de grapefruit

PAGE 6