Tehnica realizrii unui preparat permanent Preparatele permanente sau durabile permint un studiu amnunit al celulelor pe seciuni fixate i colorate; ele rezist n timp i se pot realiza prin: metoda efecturii seciunilor fine i prin metoda etalarii materialului biologic n monostrat. Preparatul microscopic permanent reprezint modalitatea de examinare a unor celule, fragmente de esut sau organ, crora li s-au suprimat procesele vitale prin fixare. Permite examinarea la microscopul optic a principalelor caracteristici ale celulelor i a modului lor de organizare. Un preparat microscopic este alctuit din:*Obiect de examinat subire i transparent; * Mediu de fixare transparent; *Lam si lamel. Scopul realizrii unui preparat microscopic permanent este de a conserva structurile celulare si raporturile dintre ele pe un timp nelimitat. Este folosit n clinic, laborator de anatomie patologic, medicin legal, cercetare, n scop didactic. Obtinerea unor preparate microscopice permanente necesita efectuarea unor timpi operatori succesivi, fiecare din ei avnd o influen hotrtoare asupra reusitei finale. n ordinea executrii lor acetia sunt: recoltarea, fixarea, splarea(decalcifierea in cazul esuturilor dure), includerea, secionarea, aplicarea seciunilor pe portobiect, culoarea, montarea i etichetarea. n funcie de tehnica aleas, succesiunea acestor timpi poate fi modificat, unii dintre ei putand fi omisi. Dac unele greeli in efectuarea secionrii, colorrii sau montrii mai pot fi ulterior corectate partial, recoltarea, fixarea si includerea incorect fcute, compromit definitiv calitatea preparatelor microscopice. Recoltarea reprezint unul din timpii cei mai dificili din tehnica de biopsie celular, deoarece dup sacrificarea animalului de experien sau obinerea unui fragment de esut sau organ prin biopsie sau alt act operator cu maximum de operativitate, trebuie s confecionm o pies de material biologic care s conin populaia de celule necesar studiului propus. Recoltarea poate fi bioptic sau necroptic. Recoltarea bioptic se recolteaz de la om sau animalul viu si se practic n scop diagnostic. Se realizeaz prin raclare, puntie biotic (se obin fragmente dintr-un esut cu ajutorul unui tub ascuit-trocar-ex: puncie sternal pentru obinerea unor fragmente din mduva hematopoietic,punte hepatic, renal, ganglionar), aspiraie (pentru recoltarea cu ajutorul unui endoscop a produselor biologice existente n cavitile naturale-ex: endoscopie gastric), intervenie chirurgical. Recoltarea necroptic se realizeaz dup sacrificarea animalului i se practic n laboratoare n scop de cercetare sau didactic. Recoltarea de la cadavrele umane se practic in laboratoarele de anatomie patologic si medicin legal n scopul de a confrunta datele de anatomie clinic si tanatogenetic. Condiiile unei bune recoltri sunt: Ct mai aproape de momentul decesului pentru a evita procesele de autoliz, Dimensiunea pieselor sa nu depeasc 5mm; Calitatea instrumentelor: bine ascuite pentru a evita zdrenuirea i pierderea paralelismului dintre planuri; Adecvat in funcie de tipul organului;se vor evita modificrile de volum, form si relief. Fixarea este o etap decisiv n obinerea unui preparat microscopic permanent; un proces fizic sau chimic prin care sunt oprite ct mai rapid procesele vitale celulare, pstrndu-se cu alterri minime volumul, forma, relieful si raporturile spaiale i moleculare. Prin fixare urmrim : conservarea esuturilor, prevenirea pierderii de constitueni celulari, creterea diferenierii optice a structurilor celulare, mrirea consistenei esuturilor n scopul de a facilita trecerea lor prin celelalte etape ale tehnicii i mai ales pentru secionare. Fixatorii se clasific astfel: a. Dup natura lor: fizici si chimici;b. Dup reacia pe care o au cu proteinele solubile: coagulani si necoagulani. Fixatorii chimici pot fi de dou feluri: simpli si amestecuri fixatoare. Fixatorii simpli mai des utilizai sunt: acetona,acid tricloracetic, formol, acidosmic, alcool metilic. Amestecurile fixatoare au fost introduse in practic datorit afinitii inegale pentru deversele elemente structurale. Amestecurile fixatoare pot fi clasificate dupa compoziia chimic (apoase i alcoolice) i dup scopul urmrit (universale si citologice). Mecanismul fixrii:1. Insolubilizarea prin precipitare a unor constituenti celulari: proteine,glucide, sruri minerale, lipide;2. Formarea de compui de adiie ntre fixator i unii constitueni celulari;3. Coagularea proteinelor; Un bun fixator are urmtoarele caliti: ptrunde bine in piele; stabilizeaz esuturile pstrnd nealterate caracterul i distribuia constituenilor celulari; nu provoac artefacte; nu deformeaz esutul; nu dizolv constituienii; distruge microorganismele; extrage enzimele autolitice inactive; confer consisten; produce difereniere optic, nu-i modific compoziia; ieftin, netoxic, neinflamabil, neiritant. Includerea este procedeul prin care se realizeaz condiii optime care s permit secionarea pieselor n seciuni subiri de ordinulm, transportate i cu fee plane astfel nct s poat fi examinate la microscop. Mase de incluziune:1. Dupa modul de realizare al includerii : a. Penetreaza celula Penetreaza celula b. Ramane in spatiul intercelular22. Dupa solubilitatea in apa : a. Anhidre; ex. parafina, celoidina; paraplastul b. Apoase; ex . gelatina. Incluziunea la parafin-etape premergtoare:a. Deshidratare alcool inaconcentratii crescande incepand cu 50fiecare in 3 bai succesive.fieb. Clarificare indeprtarea alcoolului din pies cu ajutorul unorreactivi numiti clarificatori , miscibilircu parafin , care fac ca piesa s devinatranslucid. Se efectueaz cu alcoollanilic sau cu hidrocarburi benzenice.fic. Impregnarea ptrunderea piesei cucparafin topit i solidificarea n blocprin rcire pentru a oferi o consisten.omogen7d. Turnarea blocurilor blocul nglobattse monteaz pe un port-obiect.e s Secionarea -piesa inclus sau ngheat se taie n felii subiri de ordinul micronilor cu ajutorul unui aparat numit microtom. Secionarea la microtomul pentru parafin presupune urmtorii timpi pregtitori: modelarea blocului pentru secionare; lipirea blocului pe portobiect; secionarea propriu-zis; etalarea i lipirea seciunilor. Colorarea: se urmrete creterea contrastului ntre elementele tisulare sau celulare prin modificarea indicilor de refracie ai substratului morfologic cu ajutorul colorantilor. Tehnica de colorare depinde de natura fixatorului si de esutul pe care se aplic. Montarea reprezint protejarea seciunilor fragile de eventuale deteriorri,conservarea coloraiei i asigurarea unui mediu optic omogen si transparent necesar examinrii microscopice. Se face ntre lam i lamel n diferite medii de montare iniial fluide. Mediile de montare pot fi: apoase (glicerina,sirop Apathy) si anhidre (balsam de Canada,colofoniu). Etichetarea se face astfel: pe fiecare lam se noteaz: tipul celular, sursa de recoltare, fixatorul, metoda de colorare i data efecturii.

apoase ,ex . gelatina ,m m