Disciplina Biologie celulara și moleculară -Lucrări practice

Metoda etalării materialului biologic în monostrat: aplicatii – tehnica efectuarii de frotiuri de sânge - coloratia May-Grünwald Giemsa

Etalarea materialelor biologice intr-un sigur strat este o tehnica rapida prin care se pot studia individual celule intregi.Este cea mai potrivita metoda cand se doreste studierea dinamicii celulare; spre deosebire de metoda sectiunilor fine in care celulele sunt fixate si apoi sectionate, prin metoda etalarii materialului biologic pot fi realizate si preparate proaspete, cu celule in stare vie.

Frotiu de sange este un preparat permanent, fixat şi colorat prin tehnici de colorare obişnuite sau speciale, cea mai des folosită fiind tehnica May Grünwald Giemsa.

Materiale necesare: lame obişnuite degresate (se spăla cu apă şi detergent, apoi se degresează cu alcool-eter) lame rodate ace sterilizate mănuşi de protecţie alcool, tampoane de vată hârtie de filtru stativ pentru aşezarea lamelor

Efectuarea frotiului:1. Recoltarea sângelui La adult se face prin puncţionarea părtii laterale a pulpei mediusului sau inelarului de la mâna stângă. Se dezinfectează pulpa degetului cu un tampon de vată îmbibat în alcool, se puncţionează locul dezinfectat cu un ac steril, având grijă să se perforeze numai pielea, fără a se pătrunde prea mult în adâncime. Se şterge prima picătură de sânge apărută la locul înţepăturii, prin tamponare cu o hârtie de filtru, deoarece conţine prea mult lichid interstiţial şi impurităţi de pe piele. La noul născut şi la copilul mic, locurile de puncţie sunt: tegumentul lobului urechii şi pielea călcâiului.

2. Efectuarea frotiului permanent A doua picătură se recoltează cu marginea mică a unei lame rodate şi se aplică pe una din extremităţile unei lame portobiect, aşezată orizontal pe o suprafaţă plană. Pentru recoltarea celei de a doua picături, se poate chiar exprima (stoarce) pulpa degetului, deoarece în rezultatul final formula leucocitară şi aspectul morfologic al elementelor figurate sanguine nu sunt influenţate de cantitatea de plasmă. Cu lama şlefuită pe a cărei latură mică s-a recoltat picătura de sânge, se imprimă picăturii câteva mişcări de lateralitate pe o lamă portobiect, pentru ca sângele să se întindă pe toată linia de contact. Se imprimă apoi lamei rodate o unică mişcare de translaţie în lungul lamei portobiect. Se recomandă ca unghiul realizat între cele două lame să fie de 30-35 grade

1

Disciplina Biologie celulara și moleculară -Lucrări practice

3. Fixarea frotiului permanentSe realizează prin : metode fizice- uscare (desicare) la temperatura camerei, prin agitarea lamei pentru a se obţine o uscare rapidă (uscarea lentă duce la ratatinarea celulelor). metode chimice– cu alcool metilic timp de 2 minute sau alcol etilic şi eter în părţi egale, timp de 5-15 minute.

Executarea unui frotiu permanent corect depinde de : -mărimea picăturii de sânge -unghiul dintre lama rodată şi lama portobiect să fie de 30-35 grade -viteza de întindere : la viteză mare se obţin frotiuri groase.

Frotiul permanent corect executat trebuie să îndeplinească următoarele condiţii : să fie omogen să fie subţire să aibă margini drepte să fie mai mic decât suprafaţa lamei să aibă culoare roz-cărămiziu după uscare să se termine în franjuriNu se utilizează frotiurile care nu îndeplinesc condiţiile mai sus arătate. se notează numele celui de la care s-a recoltat produsul pe un capăt al lamei, cu un ac subţire sau cu creionul.

Tehnica colorării frotiului sanguin permanent

Frotiurile de sânge se pot colora cu tehnici de colorare obişnuite (hematoxilin-eozină, tricromic) sau cu tehnici de colorare speciale. În practica medicală curentă se foloseşte tehnica de colorare panoptica May Grünwald Giemsa.

2

Disciplina Biologie celulara și moleculară -Lucrări practice

Materiale necesare -cutii Petri sau cristalizoare cu capac -suporturi de sticlă sub formă de “u” sau “v”. -soluţie May Grünwald (eozinat de albastru de metilen, colorant neutru, dizolvat în alcool metilic pur, neutru) -soluţie Giemsa concentrată (amestec de eozinat de azur de metilen, azur de metilen, glicerină neutră, alcool metilic) -apă bidistilată -cilindru gradat -pipeteTehnica de colorare1. Pe lamelele aşezate cu frotiul în sus se picură 10-15 picături din soluţia May Grümwald pentru a acoperi toată suprafaţa frotiului. Se lasă 2-3 minute, timp în care se produce o fixare a frotiului, alcoolul metilic din coloratul May Grünwald acţionând ca un fixator.2. Se toarnă apoi peste soluţia May Grünwald, un număr egal de picături de apă distilată neutră. Soluţia May-Grünwald diluată acţionează ca un colorant, colorând granulaţiile acidofile şi bazofile. Se lasă 1-2 minute.3. Se îndepărtează soluţia May Grünwald diluată fără spălare, prin înclinarea lamelelor, după care se acoperă frotiurile cu soluţia Giemsa diluată 1:1 cu apă distilată neutră. Se lasă 15-20 minute.Tehnica de colorare4. Se spală lama sub jet de apă.5. Se sugativeaza usor, se usucă.6. Se examinează la microscop cu obiectivul cu imersie, pentru a observa morfologia eritrocitelor, frecvenţa şi morfologia leucocitelor. Pentru a se studia frecvenţa şi morfologia trombocitelor, frotiul se colorează 45 de minute cu soluţie Giemsa şi nu se spală sub jet de apă , deoarece jetul de apă antrenează trombocitele. Rezultatele colorării 

Hematiile (globulele roşii, eritrocitele) Pe frotiul sanguin hematiile reprezintă majoritatea elemetelor celulare şi sunt răspândite pe toată suprafaţa frotiului. Ele sunt considerate echivalente celulare (celule anucleate), au formă de disc biconcav, cu diametrul de 7.1-7.3 microni (figura 6). Mişcând alternativ în sus şi în jos viza micrometrică, observăm centrul hematiei mai subţire, mai palid colorat (la periferie hematia este mai groasă). Aceste aspecte de mai sus, sunt datorate şi faptului că hematia conţine în citoplasmă hemoglobină în cantitate mai mare în zona periferică (unde grosimea este mai mare) ; încărcarea cu hemoglobină este uniformă şi proporţională cu cantitatea de citoplasmă. În aspectul normal denumim aceasta ca izocromie, iar încărcarea inegală cu hemoglobină (în stările patologice), anizocromie. Numărul hematiilor este constant (4-5 milioane hematii/ml. sânge), iar numărătoarea hematiilor se face prin diferite metode.

Leucocitele (globulele albe) Aceste elemente figurate prezintă nucleu, deci sunt celule. Pe un frotiu sanguin colorat May Grünwald Gimsa, se pot observa aspecte de structură, număr, ş.a

3

Disciplina Biologie celulara și moleculară -Lucrări practice

Dupa forma nucleului şi prezenţa (sau absenţa ) în citoplasmă a granulaţiilor specifice, leucocitele se clasifică în : -leucocite polimorfonucleare sau granulocite - neutrofile

- acidofile - bazofile

-leucocite mononucleare sau agranulocite - limfocite - monocite

Polimorfonuclearele neutrofile Aceste leucocite apar pe frotiul colorat May Grunwald Gimsa ca celule sferice, de 9-15 microni, cu citoplasma acidofilă care conţine fine granulaţii specifice, colorate în violet. Aceste granulatii au dimensiuni mici, sunt foarte dese si răspândite egal în toată citoplasma. Nucleul lor este format din mai mulţi lobi uniţi între ei prin filamente de cromatină. Numărul lobilor unui nucleu arată gradul de maturitate al granulocitului. Cu cât sunt mai mulţi lobi , 5-6, cu atât celula respectivă este mai bătrână (formula Arneth)

În sângele recoltat de la femei, 80% din neutrofile prezintă un corpuscul cromatinian, sferic sau oval, ataşat printr-un filament de unul din lobii nucleului. Acest corpuscul reprezintă cromatina sexuală şi după aspect se numeşte « drumstick » (beţişor de tobă). Numărul neutrofilelor dintr-o sută de leucocite variază între 62-68 ; Polimorfonuclearele neutrofile intervin activ în apărarea organismului, în procesele inflamatorii. Rolul lor este fie acela de a excreta fermenţi proteolitici în focarul inflamator, ce vor acţiona distrugând microbii sau ţesuturile alterate, fie prin fagocitarea microorganismelor pe care le distrug apoi cu ajutorul fermenţilor. Viaţa unui polimorfonuclear neutrofil este foarte scurtă, se admite că în sângele circulant ele nu depăşesc 3-4 zile.

Polimorfonuclearul acidofil (eozinofilul) Apare ca o celulă sferică, de 12-17 microni. Nucleul este în general bilobat, cei doi lobi fiind legaţi printr-o fină punte de cromatină (aspect de nucleu în desagă). În citoplasmă observăm granulaţii colorate în roşu viu, egale între ele, rotunde, uniform răspândite, mai mari decât la neutrofile. Prin forma şi culoarea lor, aceste granulaţii amintesc de Icrele de Manciuria (figura 8). Granulaţiile conţin peroxidaze, diferite de mieloperoxidazele neutrofilelor şi hidrolaze acide.Polimorfonucleatul bazofil. Este o celulă sferică de 10-14 microni. Nucleul bazofilului este ovalar, mai puţin lobulat, apărând uşor scobit, uneori ca o frunză de trifoi. Citoplasma deşi uşor acidofilă, conţine granulaţii răspândite în citoplasma de culoare albastră, de formă şi mărime diferită, deseori suprapuse pe nucleu, mascându-l .Limfocitul Este o celulă sferică, de 7-16 microni, cu nucleul mare ce ocupă aproape toată celula, sferic, intens colorat cu coloranţi bazici, datorită faptului că prezintă o cromatină bogată dispusă în grunji mari, conglomeraţi. Citoplasma este mult redusă, (apare ca o banda îngustă dispusă în jurul nucleului), intens bazofilă, colorată în albastru. Obiectivul cu imersie poate detecta inconstant în citoplasmă, rare granulaţii mici, azurofile, nespecifice. Dupa dimensiunile lor se clasifică în : -limfocite mici ( 7-8 microni) -limfocite mijlocii ( 8-10 microni)

4

Disciplina Biologie celulara și moleculară -Lucrări practice

-limfocite mari (10-14 microni)Trombocitele Trombocitele - (plachetele sanguine) au dimensiuni care variază între 2-5/ml şi se găsesc în sângele periferic în număr de 150.000-400.000/mm3. Trombocitele se formează în măduva hematogenă, din citoplasma unui precursor, megacariocitul. Trombocitul adult este elipsoidal, cu formă de lentilă biconvexă. Este anucleat, fiind alcătuit din membrană şi citoplasmă. Pe frotiu poate avea forme diferite: de stea, discoidală, poligonal, depinzând de gradul de uscare a frotiului, timpul scurs de la recoltare la fixare, etc

5