Universitatea Valahia Târgoviște

Specializarea Controlul și Expertiza Alimentelor

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

1. Definirea metodei de analiză.........................................................................3

2. Principiul metodei..........................................................................................5

3. Avantajele metodei.........................................................................................8

4. Dezavantajele metodei...................................................................................9

5. Aparatura utilizată........................................................................................10

6. Etapa preparativă de pregătire a probelor.................................................14

7. Descrierea metodei de lucru specifice..........................................................15

8. Rezultate furnizate.........................................................................................17

9. Interpretarea rezultatelor obţinute..............................................................18

10. Aplicaţii în identificarea componentelor alimentare..................................19

11. Bibliografie ....................................................................................................24

1.Definirea metodei de analiză

2

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

Spectrofotometria reprezintă măsurarea cantitativă a spectrelor de absorbție /

emisie ale unei substanțe.

Spectrofotometria este o metodă optică de determinarea a concentraţiilor

constituenţilor existenţi într-o probă dată. Această metodă se bazează pe iradierea probei

de analizat cu un fascicol de radiaţii electromagnetice, a cărui putere radiantă se

micşorează la ieşirea din sistem în funcţie de natura şi concentraţia speciilor absorbante.

Substanţele care absorb radiaţii aparţinând domeniului vizibil se vor colora în

culori complementare. Acest fapt face posibilă determinarea cantităţii de lumină

absorbită de către soluţie, intensitatea radiaţiei transmise fiind proporţională cu

concentraţia speciilor absorbante din soluţia analizată.

Un fascicol de radiaţii de intensitate I0,ce străbate sub o incidenţă normală un strat

absorbant, pierde o parte din energia sa radiantă prin reflexie Ir iar o parte din aceasta este

absorbită de către sistem Ia. Deci din intensitatea iniţială numai o parte din radiaţie este

transmisă şi ea se notează cu It. Gradul de diminuare al intensităţii radiaţiei incidente este

(conform legii lui Beer-Lambert) proporţional cu grosimea stratului traversat şi cu

concentraţia speciei absorbante:

Legea Beer-Lambert - exprima legatura între intensitatea luminii care traversează

o soluție și concentrația soluției respective.

În spectrofotometrie se folosesc uzual doi parametri pentru a cuantifica absorbția:

T - este transmisia; E - este extincţia .

3

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

În fenomenele de propagare, lumina prezintă, după cum se știe, un aspect

ondulatoriu, de undă electromagnetică. În fenomenele de emisie, respectiv absorbție,

lumina prezintă un aspect corpuscular, adică se comportă ca fiind formată din cantități

bine determinate de energie, indivizibile, numite cuante sau fotoni.

Explicația existenței fotonilor rezidă în aceea că fiecare unitate de energie

radiantă este emisă de câte o microparticulă: atom,ion sau moleculă.

Absorbția sau emisia unui foton este legată de trecerea prin salturi a unei

asemenea microparticule de la o stare energetică posibilă la alta.Pentru un astfel de salt

este necesar ca energia cunatei, să fie egală cu diferențade energie dintre cele două

stări.Aceste tranziții, legate de interacțiunea foton-microparticulă urmează anumite reguli

de selecție care determină ce fel de salturi de la un nivel la altul sunt permise. Pe de altă

parte, o tranziție are loc numai dacă sunt îndeplinite anumite condiții de interacțiune

cuantă – particulă.

În chimie şi fizică, diferite tipuri de spectrofotometre acoperă game largi ale

spectrului electromagnetic: ultraviolet (UV), lumina vizibilă, infraroşu (IR), sau cu

microunde. Spectrofotometria UV este deosebit de utilă în detectarea şi cuantificarea

substanţelor incolore, în soluţie.

2.Principiul metodei

4

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

Spectrofotometrele sunt de diferite tipuri dar se compun, în principiu, din

următoarele dispozitive esenţiale: o sursă luminoasă, un monocromator, un recipient cu

pereţi transparenţi, numită celulă de absorbţie, un detector şi un dispozitiv pentru măsurat

şi înregistrat efectele detectate. Pentru determinarea spectrelor în infraroşu servesc drept

surse luminoase, vergelele de oxizi greu fuzibili (Zr, Th, Ce) sau de carbură de siliciu,

încălzite, prin trecerea unui curent electric, la cca. 1500°C. Ferestrele celulelor de

absorbţie trebuie confecţionate din materiale transparente pentru radiaţiile din regiunea

spectrală respectivă, în cazul infraroşului, se utilizează clorură de sodiu sau alte săruri.

Spectrele în infraroşu se determină la soluţii ale substanţelor în solvenţi

transparenţi pentru radiaţiile respective sau la gaze aflate la presiune normală. se

utilizează amestecuri de substanţe cu KBr, presate sub formă de pastile (KBr este

transparentă pentru infraroşu). Monocromatorul are scopul de a separa radiaţiile emise de

sursa luminoasă în fascicule de raze monocromatice, pe care le dirijează apoi succesiv,

printr-o fantă, asupra celulei de absorbţie.

Detectorul are rolul de a transforma radiaţia transmisă, neabsorbită în altă formă

de energie. În spectroscopia în infraroşu servesc drept detectoare termoelemente.

Curentul produs de detector este înregistrat, obţinându-se curbe de absorbţie.

Schema unui spectrofotometru

5

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

Principiul spectrofotometrului- determinarea frecvențelor la care au loc tranziții :

coeficientul de extinție prezintă un salt brusc pentru frecvențele cuantelor care provoacă

tranziții în probă. Pentru aflarea acestor frecvențe se fac deci determinări de coeficienți de

extinție în funcție de frecvență. În principiu se folosește un calorimetru, dar în loc să se

lucreze în lumină albă,se fac determinări în lumină monocromatică a cărei frecvență se

poate varia continuu. Se utilizează o sursă de lumină albă, de exemplu un bec cu filament,

și se selectează pe rând radiațiile de diferite frecvențe cu ajutorul unui dispozitiv numit

monocromator.

În figură este prezentată schema de principiu a obținerii luminii monocromatice

pentru un spectrofotometru cu monocromator cu rețea.

Figura 1. Schema de principiu a unui spectrofotometru

1- sursă de lumină, 2-lentile colimatoare, 3-sistem de fante, 4- sistem

monocromator cu prismă, 5- spațiu pentru cuvele cu soluție de analizat, 6- detector de

radiație luminoasă, 7- amplificator, 8- sistem de afișare.

6

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

Un astfel de ansamblu (fig.1) format dintr-o sursă albă, un monocromator și un

calorimetru cu citire directă, constituie cel mai simplu tip de spectrofotometru.

Cu ajutorul unor oglinzi mobile din monocromator se schimbă în salturi foarte

mici frecvența luminii selectate din radiația totală a sursei. De fiecare dată se măsoară

absorbția, transmisia sau extinția și se calculează valoarea coeficientului de extinție E.

Reprezentând grafic variația lui E în funcție de frecvență sau lungimea de undă se obține

o spectrogramă (un spectru).

Figura 2. Corespondența tranzițiilor posibile (a) cu liniile spectrale ideale

(b) respectiv benzile reale(c) dintr-o spectrogramă.

În fig. 2 se redă o astfel de spectrogramă pentru cazul în care proba prezintă în

domeniul cercetat trei nivele de energie permise, sunt îndeplinite condițiile de

interacțiune și nici una din tranziții nu este interzisă.

Valorile ε nu pot fi trasate direct de aparatele înregistratoare, aflarea lor

necesitând un calcul în funcție de concentrație și grosimea de strat.

7

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

3. Avantajele metodei

Metoda spectrofotometrică are numeroase şi variate domenii de

aplicabilitate, în special în analiza în urme iar în analizele tehnice metalurgice se aplică

pentru determinarea elementelor de aliere din oţeluri, fonte, aliaje, aplicaţii biologice,

medicale, clinice, de mediu, industria alimentară .

permite automatizare şi determinare foarte rapidă;

pot fi utilizate probe mici;

pot fi cercetare probe complexe;

prezintă o sensibilitate ridicată;

dau un grad mare de siguranţă a rezultatelor măsurătorilor.

precizie mare de determinare;

permite obținerea de date certe;

se poate aplica pentru dozarea majorităţii substanţelor. În cazul în care

compusul nu absoarbe lumina, poate fi transformat printr-o reacţie chimică adecvată într-

un compus colorat ce absoarbe lumina.;

folosirea reactivilor organici a condus la realizarea unor metode de

determinare a urmelor de substanţă;

sunt metode rapide, prin măsurarea directă, fără a fi necesară adăugarea de

soluţie titrată. În multe cazuri se poate evita separarea altor componente, iar prin folosirea

unor reactivi specifici şi prin controlul strict al reacţiei se poate elimina interferenţa

ionilor străini (controlul pH-ului, lungime de undă convenabil aleasă, utilizarea

solvenţilor organici pentru extragerea complecşilor coloraţi, utilizarea unor reacţii redox

etc.).

prin metodele spectrofotometrice se poate pune în evidenţă punctul de

echivalenţă într-o metodă titrimetrică (titrare spectrofotometrică).

8

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

4. Dezavantajele metodei

Nu determină nemetalele - în prezent, această metodă nu a fost găsită utilă

pentru determinarea directă de elemente nemetalice, cum ar fi halogenurile, oxigenul şi

azotul;

Nu analizează direct probele solide și gazoase - o altă problemă în

absorbţia atomică, este faptul că este foarte utilă pentru analiza probelor de lichid, dar nu

a fost utilizată cu succes pentru analiza directă de solide sau gaze;

Analizează doar un element pe rând - echipamentul care este disponibil în

prezent este construit pentru a determina doar un element pe rând. Acest lucru nu ar

constitui o problemă, dacă un număr de probe trebuie să fie analizate pentru un singur

element. Dar, în cazul în care o probă trebuie să fie analizată de o serie de elemente, ar

putea apărea o dificultate. Fiecare element trebuie să fie determinat separat;

este necesară o etalonare iniţială sau continuă a aparatului;

sensibilitatea şi precizia depind de aparatura sau metoda chimică de

etalonare;

precizia finală se află adesea în domeniul ±5%;

costul iniţial şi pentru întreţinerea echipamentului este ridicat;

intervalul de concentraţie este limitat (măsurători relative);

în mod obişnuit, necesită spaţiu destul de mare;

implică un personal cu o pregătire specială;

timp mai îndelungat pentru obținerea rezultatelor;

necesită un număr mre de determinări pentru o interpretare statistică;

dă indicații asupra unei singure caracteristici.

9

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

5. Aparatura utilizată

La modul cel mai general, un spectrofotometru este alcătuit dintr-o sursă de

radiații, o fantă de intrare reglabilă care modifică fluxul de lumină care vine de la sursă,

un element dispersiv (prisma sau rețea dar mai des se folosește o rețea), mai multe oglinzi

care asigură direcționarea fasciculului de lumină, departamentul probelor și elementul de

măsură (un fotodetector și un amplificator).

Adăugând diverse accesorii, spectrofotometrele pot efectua și alte tipuri de

măsurători cum ar fi cele de reflexie, difuzie, fluorescență etc.

Spectrofotometrele pot fi cu două fascicule sau cu un singur fascicul.

Spectrofotometrul cu un singur fascicul – aceste spectrofotometre au un singur

fascicul luminos care trece pe rând prin cuva cu soluție de referință și prin cuva cu soluție

de analizat.

Spectrofotometrul VSU-2G lucrează în domeniul 200-1600 nm, de la

ultravioletul apropiat la infraroșu.

Schema aparatului este reprezentată în figura 1.

10

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

Radiația care vine de la sursa 1 (un filament care emite radiație prin încălzire)

ajunge, dupa reflexiile pe oglinzile 2, 3, 4, pe fanta de intrare 5, care poate fi reglată din

exteriorul aparatului.

Fascicolul divergent este transformat în fascicul paralel prin reflexie pe oglinda

concava 6 și ajunge apoi la rețeaua de difracție prin reflexie 7. Fasciculul, care este acum

separat după lungimile de undă, este din nou reflectat de oglinda concava 6 care îl

transformă într-un fascicul convergent care ajunge la fanta de ieșire (nereglabilă) 8 și de

acolo, cu ajutorul lentilei 9, la cuvele cu soluții 10. După care fasciculul emergent ajunge

pe un fotodetector 11 legat direct la calculator. Se citește o tensiune care este

proporționala cu fluxul fasciculului.

O caracteristica importanta a unui spectrofotometru este lărgimea benzii pasante.

Ea se definește ca lărgimea domeniului spectral care iese din monocromator la o lungime

de unda dată. Datorită lărgimii finite a fantei de ieșire, aceasta este traversată de o bandă

de lungimi de undă. Distribuția energiei luminii, în funcție de lungimea de unda prezintă

aproximativ forma unui triunghi al cărui vârf se situează la lungimea de undă marcată pe

scală.

Spectrofotometrul cu dublu fascicul – este un aparat automat construit după

principiul monofascicul, care să înregistreze zeci de puncte pe secundă, ar fi nevoit să

alterneze foarte repede cuva de dizolvant cu cea de soluție, operație greu de rezolvat din

punct de vedere mecanic și care ar necesita cuve perfect etanșe. De aceea este mult mai

rațional să se mențină cuvele pe loc și să se treacă, simultan sau succesiv, câte un fascicul

de lumină prein fiecare cuvă, realizând astfel aparate cu dublu fascicul .

11

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

Schema de principiu a unui asemenea dispozitiv este redată în figura 2.

Fig.2. principiul spectrofotometrului cu dublu fascicul

S – sursă; M – monocromatro; E1, E2, E01, E04- motoare electrice; O1, O4 – oglinzi

mobile; O2, O3 – oglinzi fixe; C1, C2 – cuve; R – receptor; A – amplificator; K –

compensator; Er – motor reversibil; Di – dispozitiv de înregistrare.

Sursa S trimite un fascicul de lumină albă pe fanta de intrare a monocromatorului

M. Motorașul E1 schimbă continuu elementele mobile ale monocromatorului, astfel încât

din monocromator iese o radiație monocromatică a cărei frecvență se schimbă uniform în

timp.La un moment dat radiația cade pe oglinda mobilă O1, rotiră de electromotorul E01

cu circa 10 rot/sec. Oglinda fixă O2 schimbă direcția razei cu 900 și o trece în cuva cu

soluția de cercetat.

Întru-cât în cuva C2 se găsește dizolvată și substanța de cercetat, aceasta va

introduce o absorbție suplimentară, iar ca urmare pe receptor vor cădea alternativ un

fascicul mai intens și unul mai slab.De la receptor semnalele sunt trecute la amplificatorul

A, care este informat printr-un sistem de sincronizare de pozițiile celor două oglinzi în

fiecare moment. Impulsurile amplificate sunt trecute la motorul reversibil Er, care

împinge în drumul fasciculului mai intens o pană de compensație K, în formă de

12

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

pieptene.Cu ajutorul penei compensatoare se reduce intensitatea radiațiilor de comparație

până la valoarea celor care au trecut prin cuva cu soluție, moment în care motorul E r se

oprește. Ajundându-se apoi într-un domeniu spectral în care substanța absoarbe și mai

intens,pana este împinsă și mai adânc în drumul radiațiilor de comparație de către

motorul Er. În acest moment faza impulsurilor de radiație de la receptorul R se

inversează, motorașul Er pornește în sens invers, trăgând pana în afară până la restabilirea

echilibrului.Solidar cu compensatorul K se mișcă și o peniță înregistratoare care înscrie

pe un tambur cu hârtie o diagramă.

Spectrofotometrul cu șir de fotodiode – una din realizările cele mai importante ăn

domeniul spectrofotometriei o reprezintă folosirea detectoarelor șir de fotodiode, în locul

detectoarelor clasice. Aceste tip de detector permite preluarea spectrului UV-VIS-NIR în

același timp nefiind necesară scanarea secvențială în timp a tuturor lungimilor de undă.

În figura de mai sus este prezentata un spectrofotometru UV-VIS cu șir de

fotodiode. Se remarcă în principal faptul că acest spectrofotometru nu are nici un element

mecanic sau electromecanic în mișcare așa cum au spectrofotometrele clasice cu scanare.

La acest tip de spectrofotometre lumina se desparte în lungimile de undă

individuale abia după ce trece prin cuvă. Pentru fiecare lungime de undă individuală

dorită există ca detector al intensității luminoase absorbite câte o fotodiodă individuală.

13

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

6. Etapa preparativă de pregătire a probelor

Efectuarea unei determinări cantitative (dozări) spectrofotometrice sau elaborarea

unei noi metode de dozare cuprinde următoarele etape de lucru:

a) Studiul reacţiei chimice ce stă la baza determinării (reacţie de culoare) implică:

alegerea reactivului de culoare;

a solventului;

viteza de apariţie a culorii;

stabilitatea în timp a speciei colorate;

influenţa diferiţilor factori asupra reacţiei de culoare (pH, temperatură,

ordinea adăugării reactivilor, prezenţa speciilor străine, interferenţi);

sensibilitatea reacţiei de culoare;

domeniul optim de concentraţie.

b) Studiul aspectului fizic al determinării: alegerea lungimii de undă la care

compusul colorat prezintă absorbanţă maximă şi a metodei de măsurare.

c) Verificarea valabilităţii legii Lambert-Beer.

d) Construirea curbei de etalonare.

e) Măsurarea absorbanţei probei de analizat (prelucrată în aceleaşi condiţii cu

etalonul) şi deducerea valorii concentraţiei de pe curba de etalonare.

Sensibilitatea metodei spectrofotometrice depinde de doi factori:

sensibilitatea reacţiei de culoare ;

sensibilitatea înregistrării (observării) diferenţelor mici de absorbanţă.

Sensibilitatea reacţiei de culoare este proporţională cu coeficientul molar de

extincţie al substanţei ce absoarbe.

Proba supusă analizei se prelucrează corespunzător (tocare, marunţire, mojarare,

omogenizare) în aşa fel încât să se realizeze o masă uniformă şi omogenă. În timpul

prelucrării trebuie exclusă orice fel de impurificare. Proba astfel prelucrată se păstrează în

pungi de plastic bine închise.

14

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

7. Descrierea metodei de lucru specifice

Modul de lucru pentru determinarea concentrației unei soluții de acridin-

orange folosind spectrofotometrul

Materiale necesare:

spectrofotometrul Helios ε (fig1.);

soluția de referință: apă distilată;

soluții de cercetat: soluții de acridin-orange (AO) de concentrații cunoscute și de

concentrație necunoscută: 2‰, 4‰, 8‰, x‰ (AO este o substanță fluorescentă cu

două maxime de absorbție: 494 nm pt monomer și 465 nm pt dimer/ apare în

cazul soluțiilor concentrate);

cuve pentru spectrofotometru;

linie;

marker;

hârtie de filtru;

Fig.1 Spectrofotometrul HELIOS ε

Efectuarea măsurătorilor:

        1. Se pornește spectrofotometrul (butonul "ON"); se așteaptă 5 min înainte de a

începe măsuratorile, până când lampa aparatului se încălzește și temperatura acesteia

devine constantă;

15

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

        2. Se selecteaza metoda de înregistrare: Absorbanță (A), de la butonul 3;

        3. Se selecteaza lungimea de unda de la butoanul 1 (regiunea centrală a aparatului);

se va începe cu lungimea de unda 440nm;

  4. Calibrarea spectrofotometrului:

o cuvă se umple cu apă distilată până în dreptul liniei orizontale; se notează pe

cuvă tipul de soluție pe care îl conține;

se deschide capacul spectrofotometrului;

se introduce cuva cu apă distilată în spectrofotometru, astfel încât pereții

transparenți ai cuvei să permită trecerea neperturbată a luminii prin cuva cu

soluție;

se închide capacul spectrofotometrului;

se reglează transmitanța automat prin apăsarea butonului "Zero";

se îndepărtează cuva cu apă distilată;

        5. Se notează pe cuve numele soluțiilor ce vor fi analizate: soluțiile 2‰, 4‰, 8‰, x

‰ de AO și se umplu cuvele cu soluțiile de cercetat;

        6. Se introduc una câte una cuvele cu soluțiile de AO (2‰, 4‰, 8‰, x‰) în

spectrofotometru și se citește absorbanța pe ecranul spectrofotometrului pt fiecare soluție

în parte;

        7. Valorile absorbanțelor se notează într-un tabel. Este posibil ca aceste valori să fie

înregistrate și pe hârtie prin apăsarea butonului "Print";

        8. Se repetă etapele anterioare pentru o altă lungime de undă, deoarece se vor

efectua măsurători din 10 în 10 nm de la 440 – 540 nm;

 9. Se reorganizează locul de lucru;

       10. Se oprește spectrofotometrul, iar ștecherul se scoate din priză.

16

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

8. Rezultatele furnizate

Calcularea concentrației necunoscute a soluției de AO:

1. Se trasează un grafic A = f(λ);

        2. Se trasează cele patru curbe pentru fiecare soluție de AO (2‰, 4‰, 8‰, x‰);

Obs: toate cele patru curbe se trasează pe același grafic;

 3. Se selectează lungimea de undă corespunzătoare maximului de absorbție

pentru toate cele patru soluții de AO;

        4. Se calculează concentrația necunoscută a soluției de AO - două metode:

a) calcularea concentrației folosind metoda grafică:

se trasează un grafic A = f(c) – cu valorile absorbanței pentru maximul

de absorbție al soluțiilor de AO;

se determină concentrația necunoscută a soluției de AO prin intrapolare;

b) calcularea concentrației prin metoda matematică (metoda celor mai mici

pătrate):

se scrie ecuatia dreptei de regresie:

Y = a + b X

A = a + b cx

A = absorbanța; cx = concentrația necunoscută

se calculează parametrii a și b – cu ajutorul unui program pentru

calcularea parametrilor dreptei de regresie;

se înlocuiesc în ecuația dreptei de regresie valorile parametrilor a și b;

se calculează concentrația necunoscută a soluției de AO;

        5. Se compară valoarea concentrației obținută prin metoda grafică cu valoarea

obținută prin metoda matematică;

        6. Se emit una – două concluzii.

17

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

9. Interpretarea rezultatelor obţinute

În funcţie de masa probei, volumul final al soluției, softul aparatului prelucrează

aceste date şi afişează direct rezultatul.

Se ia în considerare media celer două determinari, dacă sunt îndeplinite condiţiile

de repetabilitate.

r-repetabilitatea : valoarea sub care diferenţa absolută dintre rezultatele a

două teste separate obţinută în condiţii de repetabilitate( de exemplu : aceeaşi

probă, acelaşi operator, acelaşi aparat, acelaşi laborator şi interval scurt de timp)

se situează în limitele unei probabilităţi specifice ( în principiu 95%), astfel r=

2.8xs(r).

s(r) – deviaţia standard, calculată din rezultatele obţinute în condiţii de

repetabilitate.

18

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

10. Aplicaţii în identificarea componentelor alimentare

1. Identificarea coloranților alimentari prin metoda spectrofotometrică

Aditivii alimentari sunt încorporați în produsele alimentare cu scopul de a

îmbunătăţi calităţile lor senzoriale .

Culoarea este primul senzor de calitate în funcție de care fiecare aliment este

analizat, iar calitatea și aroma alimentelor este strans asociată cu aceasta. Coloranții sunt

ingrediente foarte importante în multe produse, cum ar fi produsele de patiserie, gustări și

băuturi, fără de care acestea ar fi incolore iar aspectul neatrăgător.

Concentraţia acestor aditivi trebuie să fie atent controlată, deoarece pot avea

diverse efecte dăunătoare asupra sănătăţii umane.

Cu toate acestea, în majoritatea alimentelor se adaugă 2 sau 3 coloranţi. Din acest

motiv şi ţinând seama de alţi factori, precum economie şi rapiditate, multe componente

sunt analizate cu ajutorul spectrofotometriei care poate fi o metoda pentru determinarea

prezenţei coloranţilor în alimente.

Mod de lucru:

Din proba de analizat se cântăresc cu precizie 25 g și se mojarează, apoi se

transferă într-un balon cotat de 50 ml, se tratează cu 25 ml soluție tampon de acetat

pentru a se aduce proba la un pH de 4,5 și apoi se încălzește la 700 C, timp de 10 minute.

Se răcește soluția și se aduce balonul la semn cu soluție tampon de acetat, se

amestecă bine și se filtrează.

Proba se introduce în spectrofotometru și se măsoară lungimea de undă la 481,7

nm iar apoi se repetă la 445,5 nm, după care spectrofotometrul printează graficul curbelor

de calibrare.

Rezultate şi discuţii

Spectrele de absorbţie (de ordin zero) ale probei la lungimi de unda între 300-550

nm sunt prezentate în figura 1.

19

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

În concluzie, metoda propusă este utilă pentru analiza coloranților alimentari din

amestecuri, fie în formă pură sau în băuturi pulbere. Teste de rutină pot fi efectuate prin

măsurarea spectrului simplu, după o extracţie directă.

Spectrofotometria mai este folosită și pentru identificarea fierului din alimente, a

conținutului de vitamine, conținutului de zinc,conținutului de nitriți.

2. Identificarea concentrației de amoniac din apă prin metoda

spectrofotometrică

Aceasta metoda este aplicată pentru determinarea conținutului de amoniac din

ape (de exemplu apa de precipitații) pentru domeniul de concentrații 0,04 – 2,0 mg

NH4/L.

Principiul metodei

Într-o soluție alcalină (pH 10,4-11,5) ionii de amoniu reacționeaza cu

hipocloritul formând monocloramina. În prezența fenolului și a unui exces de hipoclorit,

monocloramina va forma un compus albastru, indofenol, reacția fiind catalizata de

nitroprusiatul de sodiu.

Concentrația de amoniac este determinată spectrofotometric la 630 nm.

20

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

Reactivi si aparatura

Toate substanțele chimice trebuie să fie de puritate analitică. Apa utilizată pentru

diluare și spalare trebuie să fie dublu-distilată sau deionizată și apoi distilată.

Fenol (C6H5OH);

Nitroprusiat de sodiu (Na2Fe(NO) (CN)5x2H2O);

Hidroxid de sodiu (NaOH);

Solutie de hipoclorit de sodiu (NaOCl) 1M - se prepara o solutie ce

contine aproximativ 3,5% clor activ (35 g/L) în NaOH 0,1M;

Clorura de amoniu (NH4Cl);

Tiosulfat de sodiu (Na2S2O3);

Reactiv A: se dizolva 3,5 g fenol si 0,040 g nitroprusiat de sodiu în

100 mL apa. Solutia se pastreaza în frigider, la întuneric. În cazul în care culoarea

solutiei devine verde, trebuie preparata o alta solutie;

Reactiv B: se dizolva 1,8 g hidroxid de sodiu într-un volum mic de

apa într-un balon cotat de 100 mL. Se adauga 4,0 mL solutie de hipoclorit de sodiu 1 M

si se aduce la semn cu apa. Solutia se pastreaza în frigider, la întuneric. Daca solutia este

pastrata un timp mai îndelungat (câteva saptamâni) concentratia acesteia trebuie

verificata prin titrare cu o solutie de tiosulfat de sodiu;

Solutie standard de amoniu I, 100 mg NH4/L: clorura de amoniu

trebuie uscata timp de o ora la 100 °C. Se dizolva apoi 0,2965 g sare în apa într-un balon

cotat de 1000 mL. Se dilueaza pâna la semn cu apa. Aceasta solutie este stabila pentru

sase luni atunci când este pastrata în frigider;

Solutie standard de amoniu II, 4 mg NH4/L: cu ajutorul unei pipete, se

transfera 20,0 mL de solutie standard de amoniu I într-un balon cotat de 500 mL. Se

aduce la semn cu apa. Aceasta solutie standard de amoniu cât si solutiile etalon de

amoniu folosite pentru obtinerea curbei de calibrare trebuie sa fie proaspat preparate;

Spectrofotometru dotat cu o celula de drum optic de 10 mm;

Baie de apa termostatata, 50 °C;

Eprubete: 30 ml;

Baloane cotate: 10, 500 si 1000 ml;

Pipete: 1,0; 2,0; 4,0; 5,0; 10,0; 20,0; 25,0; 50,0 ml;

21

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

Micropipeta: 250 µl.

Calibrarea

Prepararea soluțiilor etalon pentru curba de calibrare:

1. Se transferă în baloane cotate de 100 ml: 0,0; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 25,0 si

50,0 m soluție standard de amoniu II. Se aduce la semn cu apă. Concentrațiile acestor

soluții sunt: 0,00; 0,04; 0,08; 0,2; 0,4; 1,0 si 2,0 mg NH4/L. Se transferă 5,0 ml din

fiecare dintre aceste soluții standard și 5,0 ml apă în eprubete de 30 ml.

2. Se adaugă în fiecare eprubeta câte 250 ml reactiv A cu ajutorul unei

micropipete și se amestecă bine. Se adaugă 250 ml reactiv B cu ajutorul unei micropipete

și se amestecă din nou bine. Se acoperă eprubeta cu un material inert. Eprubetele sunt

ținute timp de 2 ore într-o baie de apă la 50°C.

3. Se răcesc soluțiile la temperatura camerei și se transferă în celula de 10

mm. Se măsoară absorbanța la 630 nm.

4. Se realizează o curbă de calibrare prin reprezentarea absorbanțelor

soluțiilor standard în funcție de concentrația de amoniu. Se trasează noi curbe de

calibrare pentru fiecare serie de probe.

5. Pentru verificarea conținutului de amoniu în reactivi, se realizează o

citire fotometrică a probei martor (0,00 mg NH4/L) față de apă. Absorbanța nu trebuie să

depășească 0,020 unități.

Mod de lucru

Se transferă 5,0 ml de proba și 5,0 ml de apă într-o eprubetă de 30 ml. Se

procedează conform instrucțiunilor prezentate la punctele 2 și 3 de mai sus. Se

transformă citirile spectrofotometrice ale probei în mg NH4/L folosind curba de

calibrare. Concentrația poate fi exprimată în mg N/L prin multiplicarea rezultatului

obținut cu 0,778.

Probele ce conțin mai mult de 2,0 mg NH4/L trebuiesc diluate. Cu ajutorul unui

echipament corespunzator, metoda indofenolului poate fi automatizata.

22

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

3. Analiza spectrofotometrică a cobaltului

Pentru etalonarea spectrofotometrului în cazul determinării cu sulfat de Co se

prepară o soluţie 0.2M dizolvându-se 5.831 g în apă şi aducându-se la cotă într-un balon

cotat de 100 ml. Din această soluţie se prepară prin diluare soluţii 0.04M, 0.08M, 0.12M,

0.16M în baloane de 25ml.

Algoritmul de lucru

1. Se conectează aparatul la reţea;

2. Se alege lungimea de undă prin răsucirea butonului ce comandă lungimea de

undă λ la valoarea 425 nm;

3. Se alege deschiderea fantei; se recomandă deschiderea cea mai mică;

4. Se reglează punctul “0” transmitanţă (1 extincţie) prin deplasarea comutatorului

în poziţia “0”; în acest caz se obturează complet fasciculul luminos; se reglează punctul

“0” folosind butonul “0” de calibrare;

5. Se reglează punctul de “100” transmitanţă (0 extincţie) folosind proba martor

cu apă distilată; menţionăm în cazul soluţiilor cu mai mulţi ioni, se foloseşte o probă

martor care să conţină toţi ionii soluţiei de analizat, mai puţin cei ai Co; se roteşte butonul

“1” de reglare până când acul se deplasează la valoarea “100” transmitanţă (0 extincţie);

6. Se consideră soluţia cu concentraţia de 0.2M. Se introduce în cuva

spectrofotometrului cu ajutorul unei pipete de 2ml şi se introduce în spectrofotometru; se

notează valoarea absorbanţei;

7. Se repetă paşii 1-6 pentru valorile lungimii de undă λ de la pasul 2 următoare:

440nm, 455 nm, 470 nm, 480 nm, 490 nm, 500 nm, 510 nm, 520 nm, 530 nm, 550 nm,

565 nm, 580 nm;

8. Se reprezintă grafic în coordonate Extincţie = f(λ); se stabileşte maximul

curbei; din desen se extrage valoarea corespunzătoare a lungimii de undă;

9. Se fixează lungimea de undă λ la aparat la valoarea găsită pentru maxim;

10. Se reglează din nou punctul de “0” şi “100” (paşii 4 şi 5);

11. Pentru fiecare din soluţiile 0.04 M, 0.08 M, 0.12 M, 0.16 M, 0.2 M se citeşte

valoarea extincţiei pentru lungimea de undă fixată;

12. Se interpolează liniar; aceasta constituie dreapta de etalonare a

spectrofotometrului pentru ionii de cobalt;

23

Analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie

1. Iuliu Pogany – Metode fizice în chimia organică, Editura Științifică,

București, 1972 (pag. 69-77, 178-185);

2. Lorentz Jäntschi - Chimie Fizică. Analize Chimice

şi Instrumentale , Editura AcademicDirect, 2004 (http://ph.academicdirect.ro);

3. Lorentz Jäntschi ,Sorana Bolboacă - Analiză Chimică şi Instrumentală

Aplicată, Editura AcademicDirect (http://ph.academicdirect.ro), ( pag. 40-42);

4. www.umftgm.ro/old/laborator/LP_2.pdf .

5. www.hydrop.pub.ro/Spectrofotometrul.pgf

6. http://www.fizica.unibuc.ro/fizica/studenti/cursuri/doc/DBejan/

spectrofotomtru%20uv-vis%20VSU-2G.pdf

7. http://www.fia.usv.ro/avizier/files/cursuri/CURS_absorbtie_moleculara.pdf

8. http://www.umfiasi.ro/atdoc/Doctorate/Cursuri/Metode-analitice-

performante-cercetarea-farmaceutica.pdf

9. sites.google.com/site/biophysicsumfcd/didactic/biofizica-medicala/lucrari-

practice2/spectrofotometrul 1

10. http://www.scritube.com/geografie/ecologie/Determinarea-

spectrofotometric 74245.php

24