8/14/2019 Alcooloxidaza

1/7

Alcooloxidaza

(EC 1.1.3.13)

Alcool + O2 -----> aldehida + H2O2

8/14/2019 Alcooloxidaza

2/7

Biosinteza alcooloxidazei de origine microbianaSursa de obtinere : celule de Hansenula polymorpha Drojdie metilotrofa

Parametrii biosintezei

volum de lucruraport inoculare

temp de lucru

debit de aer in perioada de lag si in urmatoarele ore

agitare

pH mediu initial

corectie pHantispumant

durata procesului

Caracteristica : alcooloxidaza este inhibata de prezenta apei oxigenate; din aceastacauza este obligatoriu insotita la nivel celular de catalaza, enzima care descompune apa

oxigenata

AlcooloxidazaAlcool + O2 -----> aldehida + H2O2

PeroxidazaH2O2 +DH2 -----> 2 H2O + D unde

D= o-dianisidina oxidata

AlcooloxidazaAlcool + O2 -----> aldehida + H2O2

Catalaza2 H2O2--> 2 H2O + O2

Sistem analiticSistem celular

8/14/2019 Alcooloxidaza

3/7

SCHEMA DE LUCRU

Mod de lucru

Preinocul pe tuburi

cu geloza inclinata72 h 370 C

Inocul: cultura agitata

pe mediu la 380 C, 48 h

Mediu minimal de geloza

Mediu nutritiv agarizatColonii izolate din cultur stoc

Selectie naturala infunctie de capacitatea debiosinteza aalcooloxidazei

Biosinteza in culturasubmersa, la 380 C, 36-44 h

Separare prin

centrifugarePurificare parial Celule

Mediu de cultura sterilizat

8/14/2019 Alcooloxidaza

4/7

Permeabilizareaperetilor celulari

Tampon fosfat de

sodiu 0,05-0,2 M

pH 7-9

Celule Hansenula polymorpha

Precipitare fractionata cu sulfat de amoniu 0-30% saturatie

Centrifugare

Supernatant

Proteine balast

Debriuri celulare

Temp 50 C

Dezagregare celule in moara cu bile (Dyno-Mill)

Centrifugare

Precipitat 0-30%

saturatie

Sulfat de

amoniu

Cicluri repetate deinghet-dezghet

Supernatant 30% saturatie sulfat de amoniu

8/14/2019 Alcooloxidaza

5/7

Precipitare fractionata cu sulfat de amoniu 30-60% saturatie

Centrifugare

Temp 50 C

Precipitat 60% saturatie

Supernatant 60%

saturatie sulfat deamoniu

Solubilizare

Omogenizare prin agitare magnetica

Centrifugare Particule insolubile

Sulfat deamoniu

apa distilata

Solutie de alcooloxidaza in prezenta de catalaza

Filtrare

Dializa Temp 50 C

8/14/2019 Alcooloxidaza

6/7

Glicerina

Adsorbtie selectiva

Catalaza adsorbita

Tampon fosfat

de sodiu 0,05-0,2 M pH 7-9 Agitare magnetica

Centrifugare

Solutie de alcooloxidaza fara catalaza

Conditionare

Produs finit: ALCOOLOXIDAZA

Aspect: lichid de culoare galbena, fara rezidii de decantare

Proprietati fizico-chimice: complex solubil in apa

Activitate alcooloxidazica: 32- 166 UI

Activitate catalazica: max 3% din activitatea initiala

Adsorbant pe baza desilice

Regenerare adsorbant

8/14/2019 Alcooloxidaza

7/7

Metoda colorimetrica de dozarea activitatii alcooloxidazei

Principiul metodei:cuplare doua reactii enzimatice

Reactivi si solutii:

1. Reactiv 1: peroxidaza+o-dianisidina in HCl+tampon fosfatde sodiu 0,05 M pH 7,5+ metanol

2. Solutie H2O2 0,08 M (solutie

stoc pentru construirea curbei

etalon)

3. Solutie HCl 1,2 N

Determinarea activitatii enzimatice

Proba Martor Blanc

Preparat enzimatic

(ml)

0,5 - -

Apa distilata (ml - - 0,5

Reactiv 1 (ml 1,0 1,0 1,0

Timp de reactie 30 secunde

HCl 1,2 N (ml 1,0 1,0 1,0

Preparat enzimatic(ml - 0,5

Colorimetrare la 446 nm

Calculare rezultate pe baza curbei de etalonare si exprimareaactivitatii in moli H2O2 consumat/ml preparat enzimatic/min

Alcooloxidazametanol+ O2 -----> aldehida formica+ H2O2

Peroxidaza

H2O2 + o-dianisidina redusa -----> 2 H2O + o-dianisidina oxidata