7/25/2019 ADN-MTX

1/25

Metode spectroscopice i electrochimice de

analiz a interaciunii AND-ului cumedicamentul folosit n tratarea canceruluinumit metotrexat

7/25/2019 ADN-MTX

2/25

Metotrexat, acid 4-dezhidroxi-4-mino-N10-metil-folic, este unacid folic cu o grupare amino substituita la gruparea hidroxil la

pozitia C4 de la inelul piridinic rezultand un inhibitor al enzimeidehidrofolat reductaza. M ! impiedica sinteza bazelor purinice si

pirimidinice ale celulelor canceroase, inhiba sinteza de "#N, "$N si proteinelor fiind utilizat in tratarea numeroaselor disfunctiineoplastice ex% leucemie acuta infantila, cancer la gat si cap,

osteosarcoma in micrometastaza cu toate ca esterii polietileni aiacestuia au fost folositi in sistemul de eliberare a medicamentelor.

7/25/2019 ADN-MTX

3/25

&xista mai multe tipuri de interactiuni asociate medicamentelorcare se leaga de "#N % intercalare, legatura non-co'aleta in sant,legatura co'alenta, cli'are(scindare de "#N si incorporare denucleotide analoage. "ceste interactiuni de legatura implica modificariatat in moleculele medicamentului cat si in cele ale "N#-ului datorita

structurii complexe. )ruparile laterale *secundare+ ale moleculelormedicamentului se pot aditiona la% extremitatile perechilor de baze , in

santul minor sau ma or al substratului zahar-fosfat, pe suprafata

subtratului fosfat, sau la suprafata "#N-ului dublu-helix fie prinlegaturi de hidrogen fie prin interactiuni electrostatice.

7/25/2019 ADN-MTX

4/25

Interactiunea dintre ADN si medicament a fost studiata cuajutorul urmatoarelor metode: rezonanta magnetica nucleara,spectroscopia de masa, spectroscopia Raman si FT-IR, tehnicide modelare moleculara, dializa de echilibru, dicroism linearelectric, electroforeza capilara, rezonanta suprafetei

plasmonului, etc!nele metode electrochimice utilizate sunt "oltametria

ciclica, "oltametria anodica, analiza cronopotentiometrica sianaliza potentiometrica Interactiunea ADN-ului cu citrat desildena#l si cipro$o%acin, a fost studiata utilizand biosenzorulde AND electrochimic

7/25/2019 ADN-MTX

5/25

Numerosi mutageni, incluzi" metotre%at, se #%eaza inspatiul dintre doua perechi de baze adiacente processnumit intercalare &ei mai des intalniti agenti de tip

intercalati" sunt: etidiu, daunomicina, do%orubicina,talidomida, etc 'entru ca acesti mutageni sa se poata#%a, separa mai intai perechile de baze, denaturandlanturile AND-ului prin desfacerea dublului heli% Astfelimpiedica procesul de transcriptie si translatie cauzandto%icitate si mutatii (%emple de astfel de compusi sunt:benzopiren, acridina, bromura de etidiu si a$ato%ina

7/25/2019 ADN-MTX

6/25

Interactiunea dintre metotre%at si ADN a foststudiata utilizand diferite metode electrochimice

'rin analiza comportamentului "oltometric anodic al)T* pe electrodul de carbon sticlos in solutia tamponacetat +p ,./ 0utilizand tehnici cronocoulometrice si"oltametrice1, s-a demonstrat ca o%idareametotre%atului s-a realizat printr-un proces controlat de

difuzie ire"ersibila, metoda #ind aplicata si ladeterminarea metotre%atului din urina umana diluataInteractiunea AND-ului dublu catenar cu combinarea

metotre%at-emodin a aratat ca acti"itatea anticancer ametotre%atului este intensi#cata de legaturileintermoleculare de hidrogen formate De asemeneametotre%atul poate # folosit la deosebirea AND-uluimonocatenar de cel dublucatenar datorita interactiuniidiferite cu aceste moleculele

7/25/2019 ADN-MTX

7/25

2a interac3iunea dintre metore%at 4i ADN s-a utilizat unbiosenzor electrochimic de AND 5ntr-o solu3ie tampon deacetat cu p 6,7 +789 atanol/ )ecanismul de ata4are ametotre%atului de moleculele de ADN este determinat printehnici poten3iometrice la curent constant, cu ajutorulradia3iilor ! - I; 4i metoda FT-IR, constanta de ata4are #ind, ) -= ;emnalul analitic a fost dat de sc?derea

picului asociat concentra3iei de guanin?

@n urma interac3iunii )T*-ADN au a"ut loc anumitemodi#c?ri analizate cu: Radia3iile ! - I; au indicat efecte hipercromice 4i

hipocromice 5n banda de absorb3ie ma%im? a metotre%atului Analiza FT-IR a aratat modi#c?ri 5n benzile caracteristice

absorb3iei 5n IR la toate grup?rile fosfat 4i bazelor AND-ului 'rin modi#carea benzilor caracteristice grup?rilor & B, N- ,

&- 4i B- ale metotre%atului s-a e"iden3iat leg?turaintercalata intre metotre%at si ADN

7/25/2019 ADN-MTX

8/25

Materiale si metode Aparatura

Ciosenzorul electrochimic de ADN consta intr-un electrod

de carbon sticlos si un electrod de referinta Ag Ag&l ;pectrul! - I; utilizand spectrometrul T

7/25/2019 ADN-MTX

9/25

Pretratarea electrodului si fxarea ADN-ului

Inainte de fxarea AND-ului electrodul de carbon a ostsle uit cu kitul de cutatare Alumina pentru a se obtine osupra ata asemanatoare oglinzii. Dupa ce alumina a ost

indepartata cu ajutorul undelor sonore, electrodul a ostspalat cu apa deionizata si apoi uscat.

Solutia de ADN a ost aplicata pe supra ata electrodului cuajutorului unei micropipete lasandu-se apoi la uscat timp de !minute la temperatura camerei. "onditiile potentiometrice utilizate

au ost# timpul de $! secunde% current constant,& '(A iar domeniulpotential cuprins intre ! si ),* +."antitatea de ADN fxata pe electrod a ost determinata prin

reprezentarea grafca a supra etei picului de guanina in unctie deconcentratia de ADN. Interactiunea metotrexatului cu ADN-ul

lectrodul cu ADN a ost imersat intr-o solutie acetat cu un p de,* solutie tampon " /ac-NaAc 0in care se a1a si metotrexat. 2rocesul aa3ut loc intr-un circuit desc is pentru selectarea timpilor. Dupaacumularea metotrexatului, electrodul a ost limpezit si reintrodusintr-o solutie tampon acetat ara metotrexat, inregistrandu-se o3oltamograma la curent constant.

7/25/2019 ADN-MTX

10/25

Rezultate si discutii

4ptimizarea fxarii ADN-ului4ptimizarea fxarii ADN-ului dublucatenar pe electrodulde carbon sticlos, a ost stabilita prin fxarea a * (5 deADN din solutii de di erite concentretii *, , $, ', )! si )*mg6ml0. Semnalul dt6d a ost reprezentat in unctie de

di erenta de potential. 7uanina din AND a ost oxidata la&!,'8 + scazand treptat la &!,'$ + cu o crestere initialaa concentratiei de AND fxat. 2e baza pikului oxidariiguaninei s-a determinat concentratia de AND fxat pesupra ata electrodului. 4xidarea guanine a ost olosit caparametru in determinarea AND-ului fxat pe electrod.

7/25/2019 ADN-MTX

11/25

9igura ). 4ptimizarea fxarii ADN-ului pe elctrodul de carbon sticlos utilizandanalize potentiometrice la current constant. Sunt reprezentate mai multeconcentratii de ADN in unctie de aria picului guaninei obtinute prin fxareaconcentratiilor corespunzatoare de ADN pe electrodul de carbon sticlos.

7/25/2019 ADN-MTX

12/25

Aria picului oxidarii guanine a aratat ocrestere treptata odata cu cresterea

concentratiei de AND fxat pe electrodul decarbon sticlos.Di erite concentratii de AND au ost

reprezentate determinate pe baza in unctie0

picului de guanina. Aria pikului a crescutconcomitant cu cresterea concentratiei deADN. :otusi prin 3ariatia concentratiei initialedin amestecul de solutii, cantitatea de ANDfxate pe electrod a crescut de la !,!) la !,)*mg. In acest studiu flmul gros de AND aplicat aimpiedicat atasarea nedorita a moleculelor demedicament pe supra ata electrodului.

7/25/2019 ADN-MTX

13/25

Studii electrochimice asuprainteractiunii MTX-AND

Bptimizarea timpului de interactiune2icul guaninei a scazut odata cu

cresterea timpul de acumulare. Dupa

minute de interactiune scaderea piculuiguaninei atinge limita minima si ramaneconstanta timp de ; minute. De aceea in

toate experimentele, timpul deinteractiune olosit a ost de ; minute,care in cazul interactiunii ADN-ului cucipro1oxacina a ost considerat insufcient.

7/25/2019 ADN-MTX

14/25

Optimizarea pH-ului Analiza potentiometrica a interactiunii dintre ADN si

7/25/2019 ADN-MTX

15/25

7/25/2019 ADN-MTX

16/25

2rin cresterea concentratiei de medicamentde la ! la ,$ (< picul pentru ADN s-a micsoratcauzand o scadere a picului potential de la !,'8la !,8 ceea ce a indicat ca

7/25/2019 ADN-MTX

17/25

Spectroscopia UV-VIS a interactiunilor MTX-ADN

Spectroscopia F+-+IS a ost olosita pentru e3identierea ormariide noi compusi de ADN cu medicament. Domeniul spectral alabosorbtiei interactiunii dintre

7/25/2019 ADN-MTX

18/25

9igura .Spectrul F+-+IS pentru ADN a0,

7/25/2019 ADN-MTX

19/25

7/25/2019 ADN-MTX

20/25

7/25/2019 ADN-MTX

21/25

Spectroscopia in in rarosu cutrans ormata ourier

Spectroscopia 3ibrationala >aman Oi nin raroOu 0 este adesea olosita pentru acaracteriza natura interacPiunii medicament -ADN Oi pentru a monitoriza e ectele di eritelormedicamente asupra structurii ADN-ului.Analiza prin spectroscopie in in rarosu cutrans ormata 94F>I > 9: - I>0 este olositQpentru a determina situsuri de fxare amedicamentelor pe un anumit substrat,structura secundarQ a AND-ului , precum Oi3ariaPiile structurale ale complexelormedicament - ADN n soluPie apoasQ.

7/25/2019 ADN-MTX

22/25

9igura . Spectrul 9:-I> al AND-ului a0, al

7/25/2019 ADN-MTX

23/25

Aspectul benzilor de absorbPie puternice din zona !!!-*;!! cm -) sunt de obicei cauzate 3ibratiilor de intindere a legaturilor dintreidrogen Oi alPi atomi cu masQ de )8 sau mai puPin.

Renzile din regiunea )'!!-);!! cm -) pot f datorate intinderiilegaturii " 4 , 3ibratiilor legaturii N-/ ale resturilor de baze . Renzilorde absorbPie ale AND-ului la )$;' cm -) reprezinta 3ibratiile legaturii"$ 4 ale guaninei Oi legaturii " 4 ale timinei % la ),;C8 Oi ), '8 cm -) se identifca adenina Oi citozinQ Oi la ) )C cm -) 3ibraPiille inelului deguanina%

Renzile din regiunea de amprente ) !!-8)! cm -) 0 includ 3ibratiilede interactiune a compusului ormat.In spectrul AND-ului se identifca benzi la )* ! , )!'C Oi 8$; cm -)

corespunzQtoare 3ibraPiei simetrice Oi antisimetrice de intindere alegaturii gruparii os at a ADN-ului.

+ r uri de absorbPie puternica aparute la ' * Oi C8) cm-)

, se potdatora ntinderii legaturilor 2-4 , "-4 Oi 3ibratiilor legaturii N-/ dina ara structurii planare sau cauzate de prezenPa inelelor aromatice ."u toate acestea anumite molecule nearomatice , cum ar f aminele Oiamidele pot contribui , de asemenea, absorbtiei n aceastQ regiune .

7/25/2019 ADN-MTX

24/25

"reOtere n intensitate a benzii de absorbPie a ADN-ului ),$;'cm -) 0 de la *CE la *E este asociata cu trecerea benzii de la )$;'la )$;C cm -) care corespunde 3ibratiilor legaturii guaninei "$ 4 Oi

timinei " 4. Sc imbQrile in intensitate ale altor 3ibratii de ADNsunt associate cu trecerea benzilor de la );C8 adeninQ , *$ E 0 la);') cm -) ! E 0 Oi de la ), )C 3ibraPiile din inelul guaninei , 8E 0 la ), ); cm -) )* E 0 % banda de absortie a ADN-ului la ) '8cm -) citozina 0 a dispQrut complet dupQ interacPiunea cumedicamentul . Aceste modifcQri sunt semnifcati3e n benzile deabsorbPie I> caracteristice tuturor bazelor de ADN Oi re1ecta modulde intercalare a al

7/25/2019 ADN-MTX

25/25

Conclu ii&antitatea ma%im? de ADN care poate # imobilizat +#%at/ peelectrodul de carbon sticlos este de 8,87 mg

'icul o%idarii guananei a sc?zut cu creEterea concentra iilor de)T*2a intercatiunea dintre )T* si AND s-a determinat p ul optim de6,7 iar timpul de interactiune de > minaloarea constantei de legare a fost 5n inter"alul de =8 -> pentru

)T* aratand modul electrostatic de intercalare la interac iunea cu ADN ;tudiile ! - I; au aratat caracterul hipercromic Ei hipsochromic alinterac iunii )T* - ADN

Analiza FT-IR a AND-ului si )T* 5nainte Ei dup? interac iune ailustrat implicarea bazelor azotate , a grup?rilor fosfat din ADN prinleg?turi de hidrogen si interactiuni electrostatice si de intercalare

Aceste studii arata importanta biosenzorului electrochimic de ADNin intelegerea interactiunii medicamentelor cu AND-ul oferindinforma ii rapide Ei sigure cu pri"ire la a#nitatea compuEilor chimiciEi mecanismul lor in interac iunea cu ADN-ul