ADN Curs Carmen Duta

Acizi nucleici

Structura acizilor nucleiciStructura ADN

Introducere

• Acizii nucleici sunt produși de policondensare a nucleotidelor

• Au rolul de a păstra și mijloci transferul de informație genetică în lumea vie

• Dogma centrală a biologiei moleculare:

ADN ARNm Proteinã

replicare

transcriere traducere

reverstranscriere

Introducere• Se cunosc 2 clase de acizi nucleici:

– Acid dezoxiribonucleic (ADN)– Acid ribonucleic (ARN)

• ADN conține informația genetică cu privire la biosinteza proteinelelor (la om 50 000-100 000 proteine); are rolul de a stoca și transmite această informație la generația următoare

• ARN îndeplinește diverse funcții în procesul de biosinteză a proteinelor:– ARNm –ARN mesager, transportă informația genetică din nucleu

la ribozomi– ARNt – ARN de transport, transportă aminoacizii necesari

biosintezei proteice– ARNr – ARN ribozomal, este component esențial al ribozomilor

Structura acizilor nucleici

• Pentoză – D-b-riboză (în ARN) sau D-b-dezoxiriboză (în ADN)

• Baze azotate – molecule plane, relativ insolubile în apă având un maxim de absorbție în UV între 252-271 nm.– Purinice (derivați ai purinei): adenina (6-amino-purina),

guanina (2-amino-6-hidroxi-purina) – Pirimidinice (derivați ai pirimidinei): citozina (2-hidroxi-4-

aminio-pirimidina), timina (2,4-dihidroxi-5-metil pirimidina sau 5-metil uracil; se găsește numai în ADN) și uracilul ( 2,4-dihidroxi-pirimidina; se găsește numai în ARN)

• Acid fosforic

N

N NH

N N

N

N

N NH

N

NH2

NH

NNH

O

NH2 N

NH

N

NH2

O NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

CH3

Purinã Pirimidinã

1

2

34

567

8

91

2

3

4

5

6

Adeninã Guaninã

Citozinã Uracil Timinã

Baze azotate

• Prezintă tautomerie:– Lactam-lactim; structurile lactam sunt mai stabile– Amino-imino (cele care nu conțin grupări hidroxil);

structurile amino sunt mai stabile

NH

O

C

OH

NH2

N C

NH

NH C

forma lactam(mai stabilã)

forma lactim

NC

forma amino(mai stabilã)

forma imino

Nucleozide

• Rezultă prin stabilirea unei legături N-glicozidice între hidroxilul glicozidic de la C 1’ al pentozei și atomul de N din poziția 9 a unei baze purinice, sau atomul de N din poziția 1 a unei baze pirimidinice

Ribonucleozide

N

N N

N

NH2

O

H

H

OHOH

H

H

CH2OH

N

NNH

O

NH2 N

O

H

H

OHOH

H

H

CH2OH

N

N

NH2

O

O

H

H

OHOH

H

H

CH2OH

NO

NH

O

O

H

H

OHOH

H

H

CH2OH

Adenozinã Guanozinã Citidinã Uridinã

Dezoxiribonucleozide

N

N N

N

NH2

O

H

H

HOH

H

H

CH2OH

NO

NH

O

CH3

O

H

H

HOH

H

H

CH2OH

N

NNH

O

NH2 N

O

H

H

HOH

H

H

CH2OH

N

N

NH2

O

O

H

H

HOH

H

H

CH2OH

Deoxiadenozinã Deoxiguanozinã Deoxicitidinã Timidinã

Nucleotide

• Sunt esteri fosforici ai nucleozidelor; în structura acizilor nucleici intră nucleozide fosforilate la C 5’ al pentozei

• Se pot adăuga 1,2 sau 3 resturi fosfat formând nucleozid mono, di și trifosfați

Nucleotide

N

N N

N

NH2

O

H

H

XOH

H

H

O O O

OPOPO PO

O O O- - -

-1'

5'

Acid adenilic (adenozin 5'-monofosfat, AMP)or acid deoxiadenilic (deoxiadenozin 5'-monofosfat, dAMP)

Adenozin 5'-difosfat, ADPor deoxiadenozin 5'-difosfat, dADP)

Adenozin 5'-trifosfat, ATPor deoxiadenozin 5'-trifosfat, dATP)

Nucleotide naturale libere

• Pe lângă nucelotidele care constituie elemente de construcție a acizilor nucleici, există o serie de nucleotide care îndeplinesc roluri importante în țesuturi:– Compuși macroergici – ATP, GTP– Componenți structurali ai unor coenzime – NAD+, NADP+,

FAD– Mesageri secunzi ai unor hormoni – AMPc, GMPc– Donori de grupări metil – S-adenozil metionina (SAM)– Acceptori de fosfat în fosforilarea oxidativă – ADP– Efectori alosterici ai activității enzimelor


N

N N

N

NH2

O

H

H

OH

H

H

CH2O

O

PO O-

N

N N

N

NH2

O

H

H

OHOH

H

H

CH2

CH3

CH2CH2CHHOOC

NH2

S-adenozilmetionina AMP ciclic (AMPc)

S


• Metilxantinele = derivați metilați ai xantinei, identificați la plante; prezintă proprietăți farmacologice

NH

NNH

O

NH

O N

N

O

NO

NCH3

CH3

CH3

NH

NN

O

NO

CH3

CH3

N

NH

O

NO

N

CH3

CH3

Xantina Cafeina

Teofilina Teobromina

Structura primară covalentă a acizilor nucleici

• Acizii nucleici sunt formați din nucleozide legate fosfat diesteric

• Gruparea –OH de la C 5’ a unui nucleozid este legată de gruparea –OH de la C 3’ a nucelozidului următor prin legătură fosfat diesterică

• Fiecare catenă are două capete:– Capătul 5’ – la care gruparea –OH de la C 5’ are atașat un rest fosfat– Capătul 3’ – la care gruparea –OH de la C 3’ nu este angajată într-o

legătură internucleotidică• Prin convenție o catenă este scrisă întotdeuna în direcția 5’

– 3’

Structura primară covalentă a acizilor nucleici

• În fiecare catenă polinucleotidică (cu mai mult de 50 nucleotide), legăturile dintre nucleotide au aceeași orientare de-a lungul lanțului, catenele având o polaritate specifică

• Două lanțuri polinucleotidice sunt antiparalele când unul evoluează în direcția 5’ 3’ iar celălalt în direcția 3’ 5’

• Diversitatea polinucleotidelor este dată de bazele azotate legate de scheletul format de moleculele de monozaharid legate între ele fosfat disteric

P

O

O

O

-O

O

O

O

O

P

N

N N

N

NH2

O

H

H

OH,H

H

H

CH2

N

N

NH2

O

O

H

H

OH,H

H

H

CH2

O

O

O

O

P N

NNH

O

NH2 N

O

H

H

OH,HOH

H

H

CH2

P

P

P

O

-

-

Capãt 5'-terminal

Capãt 3'-terminal

-

5'

5'

5'

3'

3'

3'

5'

3'

A

C

G

legãturã fosfatdiestericã

Structura secundară a ADN

• Propusă de Watson și Crick (1953) pe baza rezultatelor altor cercetători:– Prin analiză cromatografică s-a stabilit că în toate

tipurile de ADN numărul de baze purinice este egal cu numărul bazelor pirimidinice (A+G = T+C)

– Prin difracție cu raze X s-a stabilit că ADN are 2 perioade de identitate, una de 34 Å iar alta de

3,4 Å


• Două catene antiparalele formează o dublă elice cu orientare dreaptă prin răsucire de la stânga la dreapta în jurul unui ax.

• Scheletul extern este format din ciclurile pentozelor legate între ele fosfat diesteric

• Resturile fosfat sunt ionizate și încărcate negativ la pH fiziologic• Bazele azotate sunt orientate spre interior și perpendicular pe

axul helixului• Între o bază purinică de pe o catenă și o bază pirimidinică de pe

cealaltă catenă, numite baze complementare, se formează legături de hidrogen; adenina se leagă de timină prin 2 legături de hidrogen iar guanina se leagă de citozină prin 3 legături de hidrogen

N

N

N

N

N

H

H

H

H

N

O

N

OCH3

H

H

N

N

NN H

HO

N HN

N

N

O

H

H

H

H

Adenină Timină

Sant mic

Sant mare

GuaninăCitozină

Sant mare

Sant mic


• Diametrul moleculei este de 20 Å• Distanța dintre 2 baze adiacente este de 3,4 Å• Pasul elicei are 10 perechi de baze și o lungime de 34 Å• Helixul prezintă în exterior două șanțuri: unul mic, cu

lățimea de 12 Å și unul mare, cu lățimea de 22 Å, prin inetrmediul cărora unele proteine și medicamente vin în contact cu bazelel azotate fără să fie necesară desfacerea dublu helixului

• Între bazele azotate se stabilesc legături dipol-dipol, interacții van Der Waals și interacții hidrofobe; acestea produc stivuirea bazelor și determină conformația helicoidală a catenei

Forma B a ADN

Formele structurale A și Z ale ADN

• Structura ADN este dinamică în mediul apos al celulei• Pe lângă forma B, predominantă în celule, pot exista

formele A-E și Z.• Conformația A – este o elice dreaptă mai compactă,

cu un pas de 28 Å si având 11 perechi de baze• Conformația Z – corespunde unei elice stângă, cu 12

perechi de baze pe spiră și cu un pas al elicei de 57 Å. Aspectul catenei este de zigzag, datorită conformației adoptate de bazele azotate din componență

Denaturarea și renaturarea ADN• Ruperea legăturilor de hidrogen și a diferitelor tipuri de

interacțiuni dintre catenele moleculei de ADN se poate realiza prin creșterea temperaturii, la valori extreme de pH (ADN este stabil între pH 4-10) sau la modificarea tăriei ionice a soluției; acesta duce la separarea celor 2 catene = denaturare

• Dacă denaturarea este determinată de modificări de temperatură procesul se numește topire

• Prin denaturare se modifică unele proprietăți fizice ale ADN:– Scade vîscozitatea– Crește absorbanța la 260 nm (absorbanța bazelor azotate în catenele

libere este cu 40% mai mare decât în ADN = efect hipercrom)– Crește densitatea– Se modifică capacitatea de rotire a luminii polarizate

Denaturarea și renaturarea ADN

30 50 70 90

1.1

1.0

1.2

1.3

1 .4

1 .5

0

1 0 0

5 0

Tm

(oC )

De

nsi

tate

op

ticã

(2

60

nm

)


• Denaturarea se poate urmări prin creșterea absorbanței la 260 nm

• Temperatura de topire, Tm, este temperatura la care jumătate din ADN este denaturat

• Compoziție ADN în baze azotate influențează Tm; un procent mai mare de GC față de AT din ADN determină o creștere a Tm. Conținutul de perechi de baze GC la om este de 40% iar punctul de topire in jur de 87 C

• În celule pentru denaturare se folosesc enzime numite helicaze, care utilizează ATP


• pH >11,3 determină deprotonarea bazelor azotate, ceea ce le împiedică să mai formeze legături de hidrogen

• Se preferă denaturarea cu soluții de baze pentru a preveni ruperea legăturilor fosfat diesterice (se poate întâmpla în cazul temperaturilor mari sau a pH acide)

• La adăugarea unor agenți denaturanți (formaida) se produce destabilizarea legăturilor de hidrogen dintre baze, putându-se face denaturarea la temperaturi mai mici


• Renaturarea este procesul prin care se reface dublul helix prin restabilirea valorilor de pH, temperaturii sau tariei ionice la valorile fiziologice

• Renaturarea este folosită în tehnica hibridizării moleculare care permite combinarea unei catene de ADN cu o catenă de ARN dacă există un grad mare de complementaritate între cele două catene.

Hidroliza acizilor nucleici

• ADN este rezistent la hidroliza bazică; ARN este hidrolizat la un amestec de 2’ și 3’ nucleotide

• ADN este relativ stabil – poate fi păstrat în soluții apoase la pH ~ neutru

• ADN mono și bicatenar precum și ARN poate fi hidrolizat de enzime numite nucleaze:– Exonucleaze- hidrolizează nucleotidele terminale de la capetele 3’

sau 5’ ale unui lanț polinucleotidic (ex. ADN polimerazele I și II)producând 3’ monocleozid fosfați sau 5’ mononucleozid fosfați

– Endonucleaze- hidrolizează legături fosfat diesterice din interiorul catenei polinucleotidice; pot hidroliza și polinucleotide ciclice

Hidroliza acizilor nucleici• Un grup special de endonucleaze produse de microorganisme

se numesc endonucleaze de restricție sau restrictaze• Au fost izolate peste 100 restictaze și au fost denumite în

funcție de specia bacteriană de la care au fost izolate (deoarece fiecare bacterie conține mai multe restictaze, se utilizează o cifră romană pentru a identifica fiecare enzimă)

• Enzimele recunosc secvențe specifice, numite secvențe de recunoaștere de 4-6 nucleotide și taie ambele catene

• Scevențele de recunoaștere sunt palindroame = secvențe cu dublă simetrie rotațională, în care secvența nucleotidică, citită pe ambele catene în direcția 5 ’ 3 ’ este identică


• Unele endonucleaze de restricție taie ADN bicatenar formând capete boante, drepte, neadezive (“blunt ends”), altele formează capete monocatenare, coezive (“sticky ends”)

5' AAGCTT 3'

3' TTCGAA 5'

Hind III

5'

3' TTCGA

A 3'AGCTT

5'A

5' TGGCCA 3'

3' ACCGGT 5'

5' GAGCTC 3'

3' CTCGAG 5'

CCA 3'

GGT 5'

Bal I Sst I

5' GAGCT

3' C

C 3'

TCGAG 5'

5' TGG

3' ACC

capete coezive capete boante capete coezive


• O enzimă de restricție are aceeași secvență de recunoaștere indiferent de sursa ADN (bacterian, din plante sau din animale)

• O moleculă de ADN poate să nu aibă nici un situs de recunoaștere, unul sau mii de situsuri

• Capetele ADN pot fi legate de ADN ligază rezultând ADN recombinat, utilizat în ingineria genetică, diagnosticul prenatal al unor boli genetice sau la alcătuirea hărților de restricție

Organizarea ADN la procariote și eucariote

• Moleculele de ADN dintr-o celulă alcătuiesc cromozomii celulei• Fragmentele cromozomiale care conțin informația genetică cu

privire la sinteza unui singur lanț polipeptidic au fost denumite gene.

• Fiecare cromozom conține un set unic de gene• Totalitatea genelor cuprinse în cromozomii unei celule

constituie genomul acesteia• La procariote avem un singur cromozom, circular, care conține

setul complet de gene pentru specificarea caracterelor celulei (4,6 x 106 perechi de baze, lungime aprox. 1,6 mm)


• În celulele procariote, ADN este distribuit într-o masă cromozomială

• În citoplasma celulei se află cantități mici de ADN extracromozomial. Aceste molecule se numesc plasmide și conțin o cantitate redusă de informație genetică

• Plasmidele:– Trec ușor prin membrana celulei gazdă– Conțin gene ce le conferă bacteriei rezistență la antibiotice– Se autoreplică extrem de rapid, independent de ADN cromozomial– Pot migra de la o celulă cu rezistență la antibiotic la altă celulă, cu

sensibilitate la antibioticul respectiv, făcând-o și pe aceasta rezistentă


• La eucariote ADN se află în nucleu• În perioadele de repaus, materialul se găsește sub

formă de cromatină = material amorf, dispersat în nucleu, care conține ADN, proteine bazice (histone), proteine nehistonice (hertine) și mici cantități de ARN

• În timpul mitozei cromatina se condensează și se subdivide în cromozomi = complexe ADN-proteine (o singură moleculă de ADN)


• Genomul uman constă în 46 cromozomi grupați în 23 perechi și conține aproximativ 6 x 109 perechi de baze

• Cea mai mare parte a genomului este necodificatoare având rol în reglarea exprimării genelor în timpul dezvoltării, diferențierii și adaptării la condițiile de mediu

• În mitocondrii se află molecule de ADN circular, cu masă mică, care diferă de ADN nuclear prin structură și proprietăți (reprezintă 1% din ADN total) ; specifică proteine mitocondriale, cum ar fi proteine ale lanțului respirator; majoritatea proteinelor mitocondriale sunt însă specificate de ADN nuclear.

Cromozomii eucariotelor

• Fiecare cromozom conține o singură moleculă de ADN cu o lungime de aprox. 2 m !!!

• Împachetarea presupune scurtarea de 10 000 ori a lungimii sale

• Primul stadiu în condensarea ADN, realizând un grad de compactare egal cu 7, este nucleozomul

• Nucleozomul este unitatea de bază a cromatinei; fibra de cromatină arată ca un “șirag de mărgele”, mărgelele fiind nucleozomii iar “ața” porțiuni de ADN liber (ADN de legătură cu 8-120 perechi de baze)


• Histonele sunt proteine bazice, cu masă moleculară mică, care interacționează ionic cu anionii fosfat din catenele de ADN; există 5 clase de histone:– Histone bogate în lizină – H2A, H2B

– Histone bogate în arginină – H3, H4

– Histone de legătură – H1, cu rol de protejare a ADN de acțiunea nucleazelor


• Nucleozomul are forma unui cilindru si cuprinde un octamer histonic constituit din 2H2A, 2H2B, 2H3, 2H4 în jurul căruia se înfășoară de aprox. 2 ori cu răsucire spre stânga ADN format din 140 perechi de baze

• Histona H1 se leagă de ADN de legătură; ea are rol esențial în etapa următoare de compactare cu formarea unei structuri care arată ca un solenoid și care asigură o scurtare de 40 ori a moleculei de ADN

• Solenoizii se asociază între ei determinând o condensare suplimetară

• Proteinele nehistonice din structura cromatinei au rol în destinderea stării condensate a cromatinei, pentru a permite replicarea și transcrierea, au rol în viabilitatea celulei

• Nucleozom

• Solenoid

ADN Curs Carmen Duta

Documents

Transcript of ADN Curs Carmen Duta