Tehnica Izolare Adn Rusa (Buna)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, Д.Н. Федорин

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ

ГЕНОВ

Учебно-методическое пособие для вузов

Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета

2008

2

Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 14 февраля 2008 г., протокол № 6 Рецензент доктор биологических наук, профессор М.А. Наквасина Учебно-методическое пособие подготовлено на кафедре физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского госу-дарственного университета. Рекомендуется для студентов 3 и 4 курсов дневного обучения биолого-почвенного факультета. Для специальности 020201 – Биология

3

Оглавление Раздел 1. Методы работы с нуклеиновыми кислотами. .......................... 5 Глава I. Выделение и очистка нуклеиновых кислот. ..............................

6

Работа 1. Методика выделения РНК методом фенол-хлороформной экстракции в присутствии хлорида лития. ..............................................

9

Работа 2. Методика выделения геномной ДНК с использованием СТАВ. ..........................................................................................................

11

Работа 3. Методика быстрого выделения РНК из грамм (-) бактерий. 12Работа 4. Методика экстракции ДНК из агарозного геля с использованием наборов фирмы QIAEX II. ........................................

13

Глава II. Определение качественных и количественных показателей нуклеиновых кислот. ..................................................................................

14

Работа 5. Определение концентрации ДНК или РНК. ........................... 15Работа 6. Определение чистоты препарата ДНК или РНК. ................... 16Работа 7. Методика электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле. ........................................................................................

18

Раздел 2. Методы анализа нуклеиновых кислот. ....................................

Глава I. Обратная транскрипция. ...........................................................

19

Работа 8. Методика проведения обратной транскрипции с использованием фермента M-MuLV Reverse Transcriptase. ...............

22

Глава II. Полимеразная цепная реакция. ..................................................

23

Работа 9. Методика проведения полимеразной цепной реакции. ......... 26 Глава III. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR). .........................................................................................

28

Работа 10. Методика амплификации с использованием красителя SYBR Green. ...............................................................................................

34

Работа 11. Методика амплификации ДНК с применением зондов Taqman. ...........................................................................................

36

Работа 12. Обработка данных. .................................................................. 37 Глава IV. Гибридизация нуклеиновых кислот. .........................................

41

4

Работа 13. Использование биотин-11-dUTP для нерадиоактивного мечения ДНК методом ПЦР ..............................

44

Работа 14. Использование биотин-11-dUTP для нерадиоактивного мечения ДНК методом удлинения затравки. ..........................................

45

Работа 15. Проведение гибридизации ДНК по Саузерну. ..................... 46Работа 16. Выявление меченых ДНК с образованием нерастворимого окрашенного продукта. .................................................

48

Работа 17. Дот-блот-гибридизация ПЦР-амплифицированной ДНК. ...... 49 Глава V. Клонирование ДНК в бактериальные системы. ......................

49

Работа 18. Приготовление компетентных клеток. .................................. 56Работа 19. Трансформация бактериальных клеток методом «холодового шока». ...................................................................................

57

Работа 20. Выделение плазмидной ДНК (лизис щелочью). .................. 58Работа 21. Выделение плазмидной ДНК методом фенол-хлороформной экстракции (экспресс-метод). .............................

60

Работа 22. Определение вставки ДНК в трансформированных клетках методом рестрикции. ...................................................................

61

Работа 23. Идентификация вставки ДНК в трансформированных клетках методом ПЦР. ...............................................................................

61

5

Раздел 1. Методы работы с нуклеиновыми

кислотами Исследования в области молекулярной биологии связаны с целена-

правленным манипулированием фрагментами нуклеиновых кислот (НК)

или целыми генетическими конструкциями, целью которых является полу-

чение с помощью лабораторных методов организмов с новыми, в том чис-

ле и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных

свойств. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с

помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных

фрагментов нового генетического материала, введения этого материала в

рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и

исследования его уровня экспрессии. В основе молекулярной биологии

лежат современные методы физико-химической биологии. Данные методы

позволяют получать в чистом виде генетический материал клетки, прово-

дить с ним различные манипуляции, позволяющие идентифицировать как

отдельные компоненты, так и целый геном организма. Важным в изучении

функционирования живого организма является исследование функцио-

нальной активности генетического материала клетки. На первой стадии проведения анализа проба подвергается специаль-

ной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного мате-

риала, удаление белковых и полисахаридных фракций и получение раство-

ра ДНК или РНК, свободного от ингибиторов и готового для дальнейшей

амплификации. Выбор методики выделения ДНК (РНК) в основном опре-

деляется характером используемого материала.

В зависимости от типа биологического материала лизис клеток осу-

ществляется различными способами. Клетки биоматериала разрушаются

различными способами, наиболее часто используемым из которых являет-

ся механическое разрушение. Часто (в случае работы с растительными и

6

бактериальными клетками) возникает необходимость применения допол-

нительных компонентов для избавления от клеточной стенки (лизирующие

ферменты, детергенты и т. д.).

После разрушения образца возникает необходимость очистки нук-

леиновых кислот от других компонентов клеток. Для этого существуют

различные методы, основанные на специфических свойствах нуклеиновых

кислот. Наиболее часто используется очистка НК методом фенол-

хлороформной экстракции, основанной на различной растворимости НК в

растворителях разной природы. Кроме того, применяются методы, осно-

ванные на способности НК адсорбироваться на специфических носителях с

последующей их элюцией.

Глава I. Выделение и очистка нуклеиновых кислот

Метод стал широко использоваться для выделения НК из биологиче-

ских образцов различных источников. Данный метод позволяет выделять в

чистом виде не только суммарною вытяжку НК, но и разделить между со-

бой ДНК и РНК. Принципиальная основа метода заключается в том, что

НК имеет высокую растворимость в водной фазе, в то время как большая

часть белков, углеводов и других компонентов клетки растворяются в ор-

ганических растворителях.

На первой стадии происходит суммарное выделение РНК и ДНК, в

присутствии гуанидин изотиоционата, ацетата натрия и других компонен-

тов. Гуанидин изотиоционат – один из самых мощных денатурантов белка.

Очень эффективен при очистке РНК из-за его способности быстро прони-

кать в клетки и подавлять активность РНКаз. Гуанидин изотиоционат, ис-

пользуемый комбинации со смесью фенол-хлороформ и осаждением спир-

та, что обеспечивает получение качественной неповрежденной РНК. Кро-

ме того, вместо гуанидин изотиоцианата часто используется додецилсуль-

7

фат натрия, также вызывающий лизис клеток и ингибирование клеточных

нуклеаз.

Применение фенола и хлороформа при выделении НК способствует

созданию двухфазной системы. Фенол отделяет белки от ДНК. Хлороформ

денатурирует белок и липиды и помогает поддерживать разделение орга-

нической и водной фазы, а также делает ДНК менее растворимой в феноле.

При pH 7–8, происходит растворение ДНК и РНК в водной фазе, в то вре-

мя как белки образуют непрозрачный слой между фазами. В кислых усло-

виях (рН < 5), суммарная РНК остается в верхней водной фазе, в то время

как большая часть ДНК и белков остается или в интерфазе, или в органи-

ческой фазе. Суммарная РНК впоследствии может быть выделена осажде-

нием с изопропиловым спиртом. Регулируя содержание фенола и его pH,

можно добиться разделения ДНК и РНК между собой, при этом ДНК будет

находиться в органической фазе, в то время как РНК будет в водной фазе.

На данной стадии возможно добавление изоамилового спирта, чтобы пре-

дотвратить вспенивание.

Добавление одновалентных катионов (K, Na, NH4) при выделении

НК приводит к формированию соли с отрицательно заряженными нуклеи-

новыми кислотами. Добавление спирта (этанол или изопропиловый спирт)

приводит к обратимой денатурации нуклеиновых кислот. LiCl часто ис-

пользовался, чтобы денатурировать РНК, хотя осаждение со спиртом и од-

новалентным катионом типа натрия или иона аммония намного более ши-

роко используется. Осаждение LiCl имеет преимущества перед другими

методами осаждения РНК, в которых не происходит эффективного удале-

ния ДНК, белок или углеводы. Другое преимущество состоит в том, что

литиевое осаждение эффективно удаляет несвязанные нуклеотидфосфаты,

которые учитываются при количественном анализе концентрации методом

спектрофотометрии.

8

Рис. 1. Схематичный процесс выделения нуклеиновых кислот методом

фенол-хлороформной экстракции

Существует и иной способ экстракции нуклеиновых кислот, в основе

которого лежит способность ДНК и РНК сорбироваться на различного ро-

да носителях (пористое стекло, силикагель, смолы и др.). Принцип данного

метода заключается в сорбции НК на носителе за счет слабых связей (во-

дородные связи, электростатические силы, бисульфидные мостики и т. д.),

и последующей их элюцией солевыми растворами с высокой ионной си-

лой. На основе использования магнитных частиц или других сорбентов на

поверхности которых имеются ковалентно связанные poly-Т олигонуклео-

тидные последовательности разной длины, можно выделять чистые препара-

ты мРНК для исследования экспрессионной активности генома образцов.

9

Рис 2. Схема выделения нуклеиновых кислот с использованием

различного рода сорбентов

Работа 1. Методика выделения РНК методом фенол-хлороформной

экстракции в присутствии хлорида лития

1. Растворить образец ткани в буфере D (4M гуанидин изотиоционат,

30 мM цитрат натрия, 30 мM β-меркаптоэтанол, pH 7.0–7.5).

10

2. Поместить пробирку на лёд. Добавить один объём фенола и переме-

шать. Добавить 1/5 объёма смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1)

и перемешать образец. Перемешать на вортексе ещё 4 раза по 1 мин.

Между перемешиваниями пробирки инкубировать на льду.

3. Открутить на максимальной скорости при 4 °С в течение 30 мин.

Верхнюю (водную) фазу перенести в новую пробирку.

4. Добавить 1 мкл соосадителя и 2 объёма 96 % этанола. Перемешать на

вортексе и немедленно открутить на максимальной скорости при RT в

течение 10 мин.

5. Промыть осадок 80 % этанолом и высушить на воздухе до исчезно-

вения следов спирта. Не пересушивать!!!

6. Растворить осадок в 100 мкл деионизованной воды. Добавить равный

объём 12М LiCl и охладить раствор в течение 30 мин при –20 °С.

7. Открутить на максимальной скорости 15 мин при комнатной темпе-

ратуре. Промыть осадок 0.8 мл 80 % этанола.

8. Осадок высушить, как описано ранее, и растворить в 40 мкл деиони-

зованной воды, свободной от РНКаз.

9. Определить концентрацию и чистоту полученного препарата РНК.

Комментарии к методике:

1) Объем ткани не должен превысить 1/5 объема буфера D. Чтобы избегать деградации

РНК, гомогенизация ткани должна быть выполнена так быстро и полностью, на-

сколько возможно.

2) При выделении РНК может происходить загрязнение геномной ДНК. Однако, если

ее количество не превышает по свечению РНК в агарозном геле с бромистым эти-

дием, такое загрязнение не является критичным и дает возможность использовать

полученный препарат РНК в дальнейшем.

3) Для хранения выделенной РНК, добавьте 0.1 объема 3М ацетата натрия и 2.5 объе-

мов 96 % этанола к РНК в воде и смешайте полностью. Образец может быть сохра-

нен в течение нескольких лет в –20 °C.

11

Работа 2. Методика выделения геномной ДНК с использованием СТАB

1. Ткань растереть в ступке на холоде.

2. Перенести растертую ткань в прогретую до 65 оС пробирку с

2x CTAB (из расчёта 25 мл 2x CTAB (CTAB - 2% (w/v), 1.4M NaCI,

0.1М Tris-НCI, pH 8.0, 20mM ЭДТА, довести dН2О) на 2–5 г ткани),

очень хорошо и быстро перемешать.

3. Инкубировать при 65 оС минимум 20 мин (лучше 1 час).

4. Охладить до комнатной температуры, добавить равный объём хло-

роформа : изоамилового спирта (24 : 1), перемешивать и оставить

инкубироваться на 20 мин.

5. Центрифугировать на 5 000 rpm при комнатной температуре 10 мин.

6. Снять водную фазу, добавить к ней 0.2 объема 5x CTAB (CTAB –

5 % (w/v), 350mM ЭДТА, довести dН2О), перемешать и инкубиро-

вать при 65 оС 10 мин.

7. Добавить равный объём хлороформ : изоамиловый спирт, инкубиро-

вать 1 мин, периодически перемешивая.

8. Центрифугировать на 5 000 rpm при комнатной температуре 10 мин.

9. Добавить равный объём буфера для преципитации (CTAB –

1 % (w/v), 0.05М Tris-НCI, pH 8.0, 10mM ЭДТА, довести dН2О)

(можно и 2–3 объёма), перемешать и оставить на 1 час при комнат-

ной температуре.

10. Центрифугировать 8 000 rpm при комнатной температуре 20 мин.

11. Растворить осадок в 1–2 мл HS-TE буфере (1M NaCI, 0.01М Tris-

НCI, pH 8.0, 1mM ЭДТА, довести dН2О); добавить 2 объема 96 % эта-

нол и инкубировать 1 час при –20 оС или 30 мин при –70 оС.

12. Центрифугировать 8 000 rpm при 4 оС 10 мин.

12

13. К осадку добавить 200 мкл дистиллированной H2O и 100 мкл 7.5M

NH4Ac (pH 7.5) и инкубировать 20 мин при 0 оС.

14. Центрифугировать 13 000 rpm при 4 оС 10 мин, добавить к суперна-

танту 2 объема 96 % этанол и инкубировать 20 мин при –70 оС.

15. Центрифугировать 13 000 rpm при 4 оС 10 мин, осадок сполоснуть

80 % этанолом;

16. Растворить в TE буфере или dH2O;

17. Хранить при –20 оС.


1) Если количество ткани небольшое, удобнее добавлять буфер непосредственно в

ступку. Для совсем маленьких образцов используется пестик для микроцентрифуж-

ных пробирок.

2) Экстракция хлороформом может уменьшить объём водной фазы. В таких случаях

требуется добавить 1х CTAБ буфер до исходного объёма.

Работа 3. Методика быстрого выделения РНК из грамм (-) бактерий

1. Осадить клетки из 10 мл культуры центрифугированием 12 000 rpm

при 4 оС 10 мин. Ресуспендировать в 10 мл буфера (15мМ Трис-HCI

рН 8.0, 0.45М сахароза, 8мМ ЭДТА), добавить 80 мкл (50мг/мл) ли-

зоцима и инкубировать на льду 15 мин.

2. Центрифугировать протопласты 5 мин 6 000 rpm при 4 оС. Ресуспен-

дировать в 0.5 мл лизирующего буфера (10мМ Трис-HCI рН 8.0,

10мМ NaCI, 1мМ цитрат натрия, 1.5 % (w/v) SDS). Инкубировать

5 мин при 37 оС, затем охладить на льду.

3. Добавить 250 мкл насыщенного хлорида натрия, перемешать. Инку-

бировать 10 мин на льду.

13

4. Центрифугировать на максимальной скорости. Супернатант перене-

сти в новую пробирку и добавить 1 мл охлажденного 96 % этанола.

Инкубировать 30 мин при –70 оС.

5. Центрифугировать 15 мин на максимальной скорости при 4 оС. Про-

мыть осадок охлажденным 70 % этанолом и подсушить.

6. Растворить в подходящем объеме (40–100 мкл) деионизованной Н2О.

Хранит при –70 оС.


1) После лизиса клеток образуется вязкая масса, поэтому необходимо осторожно от-

бирать водную фазу, чтобы исключить загрязнение НК белками.

2) приготовление насыщенного раствора хлорида натрия лучше осуществлять с ис-

пользованием DEPC-воды, что уменьшает риск внесения экзогенных нуклеаз.

3) Осаждение РНК 96% этанолом можно проводить и при –20 оС, увеличив при этом

время инкубации до 1–1.5 часов.

Работа 4. Методика экстракции ДНК из агарозного геля с использова-

нием наборов фирмы QIAEX II.

1. Вырезать фрагмент геля с ДНК, взвесить его и добавить 3 объема

буфера QX 1.

2. Размешать QIAEX II на вортексе 30 с. Прибавить 10–30 мкл

QIAEX II. Перемешать на вортексе.

3. Инкубировать 10 мин при 50 оС. Мешать на вортексе каждые 2 ми-

нуты.

4. Центрифугировать 30 с при 12 000 rpm, удалить супернатант.

5. К осадку добавить 500 мкл буфера QX 1 и перемешать на вортексе.

Центрифугировать 30 с, отобрать весь супернатант.

6. Добавить к осадку 500 мкл буфера PE. Перемешать на вортексе.

Центрифугировать 30 с при 12 000 rpm, отобрать весь супернатант.

14

7. Осадок сушить в течение 10–15 мин. Прибавить 30–40 мкл dН2О и

перемешать на вортексе. Инкубировать при комнатной температуре

5 мин.

8. Центрифугировать 30 с при 12 000 rpm. Перенести супернатант в но-

вую пробирку.

9. Повторить п. 9 и 10. Долить супернатант в ту же пробирку.

10. Хранить при –20 оС.


1) ДНК из геля необходимо вырезать как можно точнее. Кроме того, нельзя долгое

время светить на гель ультрафиолетом, поскольку ДНК может пришиться к гелю.

2) Буфер PE желательно готовить непосредственно перед использованием. Для его

приготовления 100 мкл необходимо взять 20 мкл раствора PE из набора и прибавить

80 мкл 96% этанола.

3) При подсушивании осадка в п. 7 важно не пересушить его, поскольку в длинных

молекулах ДНК могут образоваться разрывы, что значительно ухудшит качество

препарата.

Глава II. Определение качественных и количественных по-

казателей нуклеиновых кислот

Метод определения концентрации нуклеиновых кислот (ДНК или

РНК) в растворе основан на существовании у ДНК и РНК максимума по-

глощения при длине волны 260 нм (рис. 3). Это означает, что в растворах

нуклеиновых кислот максимальная фотометрическая абсорбция наблюда-

ется при 260 нм и прямо коррелирует с концентрацией ДНК или РНК.

15

Рис. 3. Спектр поглощения нуклеиновых кислот при разных длинах волн

Работа 5. Определение концентрации ДНК или РНК

При постановке измерения образец ДНК разбавляют дистиллирован-

ной водой в 40 раз (к 5 мкл раствора ДНК добавляют 195 мкл воды). Изме-

рение поглощения при 260 нм проводят в кювете с длиной оптического пу-

ти 1 мм, используя воду в качестве контроля. Значение концентрации ДНК

в исходном растворе (мкг/мкл) находят, умножая значение поглощения

при длине волны 260 нм на К = 20 (К – молекулярный коэффициент экс-

тинкции).

[ДНК] = А260 ⋅ К

РНК разбавляют водой в 10 раз (к 20 мкл раствора ДНК добавляют

180 мкл воды). Измерение поглощения при 260 нм проводят в кювете с

длиной оптического пути 1 мм, используя воду в качестве контроля. Зна-

чение концентрации РНК в исходном растворе (мкг/мкл) находят, умножая

значение поглощения при длине волны 260 нм на К = 4 (К – молекулярный

коэффициент экстинкции).

[РНК] = А260 ⋅ К

16

Работа 6. Определение чистоты препарата ДНК или РНК

Отношение поглощения при длинах волн 260 нм и 280 нм

(260–280 нм) показывает чистоту препарата ДНК или РНК. Препарат счи-

тается чистым, если отношение значений 260 / 280 нм приблизительно

равно 1.8 для ДНК и 2.8 для РНК. В случае меньших значений показателя

260–280 нм препарат содержит большое количество примесей белка, фено-

ла или иных контаминирующих агентов, имеющих значительное поглоще-

ние при 280 нм.

ДНК РНК

А260/А280 = 1.8 А260/А280 = 2.8

Другим показателем чистоты препарата ДНК или РНК является от-

ношение значений поглощения 260–230 нм. В случае чистого препарата

это соотношение обычно равно 1.8 – 2.2. Меньшие значения коэффициента

260/230 нм свидетельствуют о загрязнении препарата компонентами, кото-

рые остаются после процедуры выделения ДНК или РНК.

А2601.8 2.2А230

≤ ≤

Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле

Для нуклеиновых кислот широко применяется метод гель-

электрофореза. Его принцип заключается в следующем. Исследуемый пре-

парат (раствор ДНК или РНК) вносят в лунку, расположенную у края геля.

Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым

суммарным электрическим зарядом, и когда через гель пропускают элек-

трический ток, они перемещаются в электрическом поле.

Для учета результатов выделения нуклеиновых кислот среднего раз-

мера обычно применяют агарозные гели в присутствии специфического

17

красителя (как правило, бромистый этидий или SYBR Green I). Для фрак-

ционирования более крупных молекул ДНК (миллионы пар оснований) де-

натурированной ДНК и РНК приходится использовать специальные систе-

мы электрофореза. Иногда для решения специальных задач для разделения

ДНК применяют полиакриламидные гели. Так, в 20 % полиакриламидном

геле можно разделить фрагменты ДНК, состоящие всего из шести основа-

ний и различающиеся лишь одним нуклеотидом.

Детекция НК основана на использовании интеркалирующих веществ,

активирующих свою способность к флуоресценции в результате присоеди-

нения к ДНК или РНК. В качестве основного представителя применяется

бромистый этидий и SYBR Green I. Этот способ детекции основан на том

факте, что флуоресценция бромистого этидия под действием ультрафиоле-

тового излучения значительно возрастает при их внедрении в двухцепо-

чечные молекулы ДНК. Однако он способен взаимодействовать и с моле-

кулами РНК, но менее интенсивно.

Рис. 4. Механизм детекции ДНК с использованием интеркалирующего

красителя SYBR Green I

18

Для разделения нуклеиновых кислот применяют различные концен-

трации геля, в зависимости от длины исследуемой НК. Диапазон нормаль-

ного разделения линейных ДНК молекул для гелей с различной концен-

трацией агарозы приведен в таблице.

Таблица 1

Зависимость разделения линейных молекул ДНК от концентрации

агарозного геля

% агарозы 0.3 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.2 1.5

Размер

ДНК [kbp] 5–60 1–30 1–20

0.8–

12

0.6–

10 0.5–8 0.5–7 0.4–6 0.2–3

Работа 7. Методика электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном

геле

1. Взвесить необходимое количество агарозы (ее количество зависит от

концентрации используемого геля).

2. Долить 1х ТАЕ буфер до нужного объёма (можно использовать кон-

центрированный – 50х ТАЕ – буфер (2М Tris-HCI, 5.71 % ледяной

уксусной кислоты, 2мМ EDТА, довести рН до 8.5).

3. Довести до кипения, кипятить до полного растворения агарозы.

4. Остудить до 50–60 oС (можно держать банку в руках), добавить бро-

мистый этидий до концентрации 0,1 %.

5. Залить форму, дать агарозе застыть в течение 0.5–1 часа.

6. В кармашки внести образцы НК, предварительно добавив буфер для

электрофореза (0.1% бромфеноловый синий, 0.1% ксиленцианол, 60%

глицерин, 60мМ ЭДТА).

7. Нагрузка выбирается из расчета 6–10 В на 1 см геля.

19


1) Использовать гель в течение ~2 часов, либо, не вынимая гребёнку, завернуть в

SaranWrap, убрать в холодильник (можно хранить в течение месяца; для < 1% гелей

вынимать гребенку из геля можно лишь непосредственно перед применением).

2) При работе с короткими по длине фрагментами ДНК можно использовать ТВЕ бу-

фер (50х: 1М Трис-HCI, 0.9М борной кислоты, 1мМ ЭДТА, довести рН до 8.5), спо-

собствующий их лучшему разделению.

Раздел 2. Методы анализа нуклеиновых кислот

Глава I. Обратная транскрипция

Обратная транскрипция – перенос информации с РНК на ДНК, про-

цесс, обратный нормальной транскрипции, осуществляемый ферментом

обратной транскриптазой.

Обратная транскриптаза (ревертаза, РНКзависимая ДНКполимераза) –

фермент класса трансфераз, осуществляющий ДНК-зависимый синтез

ДНК и синтез ДНК на матрице РНК (обратная транскрипция). Кроме того,

обратная транскриптаза обладает активностью РНКазы Н (т.е. разрушает

цепь РНК, входящую в состав ДНК/РНК-дуплекса). Подобно всем ДНК-

полимеразам, обратная транскриптаза способна функционировать только

при наличии затравки. In vivo обратная транскриптаза синтезирует двухце-

почечную ДНК на матрице геномной РНК ретровирусов, подготавливая ее

для интеграции в геном клетки-хозяина. Обратная транскриптаза широко

используется в генной инженерии для клонирования последовательностей

нуклеотидов мРНК эукариот. Впервые обнаружена в 1970.

В результате работы ревертазы образуется комплементарная ДНК

(кДНК), образующаяся на основе клеточной матричной РНК (мРНК). Для

20

синтеза новой цепи ферменту необходима точка инициации, являющейся

началом синтеза новой цепи, строительный материал для синтеза ДНК, ко-

торым являются дезоксинуклеотидфосфаты (дНТФ) и ингибитор рибонук-

леаз (RNAsin). Для получения кДНК возможно проведение трех вариантов

реакции обратной транскрипции.

Первый тип предполагает использование в качестве затравки

oligo(dT) праймер (набор олигонуклеотидов разной длины в состав которо-

го входит только нуклеотид тимин), при этом в качестве матрицы для син-

теза кДНК будет использоваться только мРНК, поскольку она имеет на

3’-конце поли-А последовательность, комплементарную oligo(dT) праймеру.

Рис. 5. Схема проведения обратной транскрипции с использованием

в качестве затравки oligo(dT) праймер

21

Второй тип реакции обратной транскрипции основан на применении

в качестве затравки случайных праймеров (random hexamer). В данном

случае матрицей для синтеза новой кДНК будут служить любые типы

РНК, поскольку случайные праймеры длиной шесть нуклеотидов будут

присоединяться к комплементарному участку любой цепи.


в качестве затравки random hexamer праймер

Третий вариант проведения реакции обратной транскрипции подра-

зумевает использование в качестве затравки специфического праймера, ко-

торый предполагается использовать для последующей реакции ПЦР.

В данном варианте проведения опыта матрицей для синтезируемой кДНК

будет выступать мРНК исследуемого гена.

22


в качестве затравки специфический праймер

Работа 8. Методика проведения обратной транскрипции с использова-

нием фермента M-MuLV Reverse Transcriptase

1. Приготовить смесь общим объемом 11 мкл, состоящую из РНК

и праймеров:

a. РНК: суммарная РНК – 0.1–5 мкг; мРНК – 10 нг–

0.5 мкг; специфическая РНК – 0.01 пг–0.5 нг.

b. праймер: oligo(dT) – 0.5 мкг; random hexamer – 0.2 мкг;

специфический праймер – 15–20 пМ.

c. довести деионизованной водой до 11 мкл.

23

2. Перемешать и инкубировать при 70 оС 5 минут и быстро пере-

нести на лед.

3. Добавить следующие компоненты:

a. 10х реакционный буфер – 2 мкл,

b. 10мМ дНТФ – 2 мкл,

c. ингибитор рибонуклеаз – 20 ед.,

d. деионизованной воды до 19 мкл.

4. Инкубировать смесь при 37 оС 5 минут. Если использовались

random hexamer, то инкубировать при 25 оС 5 минут.

5. Добавить 200 ед. M-MuLV Reverse Transcriptase, инкубировать

реакционную смесь, содержащую oligo(dT) и специфический

праймер при 37–42 оС 60 минут. Если использовались random

hexamer, инкубацию проводить при 25 оС 60 минут.

6. Остановить реакцию нагреванием до 70 оС. Охладить на льду.


1) Синтезированная кДНК может использоваться непосредственно для амплификации

методом ПЦР. Однако можно провести очистку полученной кДНК методом фенол-

хлороформной экстракции и осаждением этанолом, что позволит избавиться от

примесей, влияющих на качество ПЦР.

Глава II. Полимеразная цепная реакция

Суть полимеразной цепной реакции (ПЦР) заключается в амплифи-

кации (умножении) в пробирке определенного участка ДНК в процессе по-

вторяющихся температурных циклов. В основе ПЦР лежит обычная био-

химическая реакция синтеза, катализируемая ферментом ДНК-

полимеразой.

24

Открытие ПЦР было обусловлено расшифровкой нуклеотидных по-

следовательностей генома ряда микроорганизмов и обнаружением термо-

устойчивой Taq-ДНК-полимеразы. Данный фермент находится в живущих

в горячих источниках бактериях Thermus aquaticus, обладает исключи-

тельной термостойкостью и сохраняет ферментативную активность в тече-

ние 40 минут при температуре 95° и имеет оптимум работы при 70–72°.

ПЦР – это процесс, состоящий из многократно повторяющихся цик-

лов и заканчивающийся получением большого количества копий специфи-

ческого фрагмента ДНК. Ключевым компонентом реакции, помимо Taq-

ДНК-полимеразы, являются короткие (20–30 нуклеотидов) искусственно

синтезированные олигонуклеотиды – праймеры, комплементарные иско-

мым участкам на левой и правой границах матричной ДНК. Праймеры вы-

полняют ряд важных функций при проведении ПЦР: 1) праймеры являются

точкой инициации синтеза новой цепи ДНК, 2) достраивание новой цепи

ДНК протекает только между ними, 3) гибридная двуцепочечная система

ДНК-праймер является местом присоединения ДНК-полимеразы к матрице.

ПЦР проводят в специальном программируемом термостате – амплифи-

каторе, осуществляющем смену температурных циклов по заданной програм-

ме. Основным компонентом ДНК-амплификатора является элемент Пэльтье,

способный осуществлять быстрые температурные переходы. Каждый цикл

ПЦР состоит из 3 этапов. На этапе денатурации при 95° происходит плавление

цепочки ДНК и расхождение ее на две цепи. На последующем этапе отжига

при наличии в пробе искомого участка ДНК происходит присоединение (от-

жиг) праймеров (по одному на каждую цепь). Температура присоединения

праймеров составляет в зависимости от их нуклеотидного состава 58–62°. При

последующем подъеме температуры до 72° активируется Taq-ДНК-

полимераза и начинается этап синтеза, заключающийся в присоединении де-

зоксинуклеотидтрифосфатов и достраивании фрагмента ДНК. Образовавшие-

ся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для вто-

25

рого цикла амплификации, в котором происходит образование искомого спе-

цифического фрагмента ДНК (ампликона). С каждым последующим циклом

количество копий участка ДНК удваивается. Таким образом, происходит на-

копление ампликонов по формуле:

х = 2n , где n – число циклов.

В результате 30–40 циклов в растворе накапливается около 100 мил-

лионов молекул ампликона. Этого количества достаточно для визуальной

детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле, со-

держащем бромистый этидий.

Рис. 8. Схематическое изображение амплификации ДНК: 1 – денатурация

при 96 оC; 2 – отжиг в 68 oC; 3 – удлинение в 72 oC; 4 – окончание первого

цикла. (P – Taq-ДНК-полимераза). Две образующихся цепи ДНК являются

шаблоном для следующего цикла. Таким образом, происходит удваивание

количества ДНК в каждом новом цикле

26

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо под-

готовить смесь, содержащую все необходимые компоненты для по-

строения новой цепи ДНК:

1) нуклеотиды: dATP, dGTP, dUTP, dCTP, являются необходи-

мыми компонентами смеси и субстратами для ДНК-

полимеразы при построении новой цепи ДНК;

2) кофакторы фермента: поскольку Taq-ДНК-полимераза явля-

ется Mg-зависимым ферментом, для ее нормального функ-

ционирования требуется присутствие этих ионов в реакци-

онной смеси;

3) Taq-ДНК-полимераза: фермент, осуществляющий синтез

новой цепи ДНК на основе ДНК-матрицы;

4) буфер: используется для поддержания необходимого значе-

ния рН среди и концентрации солей;

5) праймеры: короткие нуклеотидные последовательности

ДНК (20–40 нуклеотидов), комплементарные искомому уча-

стку ДНК-матрицы;

6) ДНК-матрица: последовательность ДНК, на основе которой

ДНК-полимераза синтезирует новую цепь.

Работа 9. Методика проведения полимеразной цепной реакции

1. Подготовить все необходимые реагенты для проведения ПЦР.

2. В стерильной пробирке смешать компоненты в следующих соот-

ношениях:

27

Компонент Конечная концентра-ция

Количество компонента на 50 мкл смеси

10х ПЦР-буфер 1х 5 мкл 10мМ смесь дНТФ 0.2 мМ каждого 1 мкл Праймер 1 (50 мкМ) 1 мкМ 1мкл Праймер 2 (50 мкМ) 1 мкМ 1мкл Taq-ДНК-полимераза 1.25 ед. 0.5 мкл 25мМ MgCI2 1–4 мМ 2–5 мкл ДНК-матрица 0.1–1 мкг варьирует от концен-

трации образца Деионизованная вода – до 50 мкл

3. Перемешать на вортексе. При необходимости добавить минераль-

ное масло (20–40 мкл) для ПЦР.

4. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и запустить программу.


1) Если матрица одноцепочечная или ПЦР-продукт, этап начальной денатурации мож-

но опустить. Кольцевая плазмидная или геномная ДНК требует тепловой денатура-

ции при 95 oC не менее 3 минут. Однако в данном случае не следует злоупотреблять

нагреванием, поскольку часть матрицы может повредиться. Для каждого типа ДНК-

матрицы необходимо подбирать индивидуальное компромиссное решение.

2) Число циклов обычно 25–35. Слишком большое число циклов чревато насыщением

PCR реакции: ограничение по праймерам (синтез длинных продуктов, образован-

ных в результате использования в качестве праймера готового продукта), ограниче-

ние по нуклеотидам (большая доля одноцепочечных продуктов, синтез коротких

продуктов).

3) Для повышения специфичности ПЦР можно использовать технику так называемого

горячего старта, суть которого заключается в добавлении фермента в пробирку с

реакционной смесью только после проведения первой денатурации.

4) Для проведения ПЦР часто бывает удобно использовать смеси:

a) все, кроме матрицы и Taq-полимеразы. Хранить при –20 oС продолжительное

время, при 4 oС – несколько суток;

b) все, кроме матрицы и праймеров. Хранить при –70 oС и –20 oС продолжитель-

ное время, при 4 oС – несколько недель.

28

c) все, кроме матрицы. Хранить при –70 oС и –20 oС продолжительное время, при

4 oС не более суток. Однократное замораживание-оттаивание не меняет эффек-

тивность работы Taq-полимеразы.

5) Если в методике предусмотрено использование масла, то после проведения ПЦР

можно избавиться от него следующим способом:

• заморозить на –20 oС. Вода замёрзнет, масло – нет;

• можно дополнительно сполоснуть охлаждённым (~4 oС) хлороформом.

Глава III. Полимеразная цепная реакция в реальном времени

(Real-Time PCR)

Данные методы основаны на использовании флуорофоров – молекул,

обладающих способностью к флуоресценции в результате поглощения

энергии света определенной длины волны и излучать ее на другой длине

волны. Для большинства флуорофоров существуют соединения-гасители,

молекулы которых, находясь в непосредственной близости с ними, значи-

тельно снижают уровень флуоресценции. Они как бы перехватывают на

себя энергию излучения от флуорофора. Различают два основных типа га-

сителей – флуоресцирующие и «темновые». В первом случае переданная

гасителю энергия излучается в виде света, отличающегося от свечения

свободного от гасителя флуорофора, а во втором – рассеивается в виде

тепла, т.е. свечение отсутствует. Эффект гашения резко снижается при уве-

личении расстояния между молекулами флуорофора и гасителя.

Основные преимущества детекции продуктов ПЦР заключаются в

следующем: в отличие от электрофорезной детекции, полученные в ходе

ПЦР ампликоны, не могут попасть в воздух и привести к появлению лож-

ноположительных результатов. Использование специальных флуоресцент-

ных меток позволяет отказаться от стадии электрофореза, что ведет к рез-

29

кому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продук-

тами амплификации. Кроме того флуоресцентная детекция продуктов ПЦР

в пробирке в 2–3 раза чувствительнее электрофорезной детекции.

Ниже представлены наиболее распространенные методы детекции

продуктов амплификации ДНК-олигонуклеотидных последовательностей.

Данные методы можно разделить на 2 основные группы.

В первой группе методов, детектирующих ДНК, находятся методы,

использующие олигонуклеотиды или зонды, меченые красителем, обла-

дающим способностью к флуоресценции.

1. Метод гидролизуемых проб или Taqman. В данном случае в реак-

ционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит

флуоресцентная метка в 5’-положении и гаситель флуоресценции в

3’-положении, а также фосфатная группа в 3’-положении. Эти зонды

имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель по-

глощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная

группа в 3’-положении блокирует ДНК-полимеразу. В ходе ПЦР во

время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда

к комплементарной цепи ДНК, причем, чем больше продуктов ампли-

фикации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с

соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полиме-

раза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда

начинает его расщеплять благодаря наличию 5’-экзонуклеазной актив-

ности. Таким образом, происходит разъединение флуоресцентной метки

и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения. Чем

больше ампликонов синтезировано в ходе ПЦР на данный момент вре-

мени, тем интенсивнее будет свечение.

30

Рис. 9. Принцип детекции ПЦР-продуктов с использованием зондов

Taqman. Ф – флюорофор. Г – гаситель

2. Метод с использованием зондов с комплементарными концевыми по-

следовательностями (Molecular Beacons). Данная методика отличается

от описанной выше лишь тем, что концевые последовательности зонда

представляют собой взаимно комплементарные области из 5–6 основа-

ний, вследствие чего они находятся в замкнутом состоянии и образуют

«шпильки». Внутренняя часть зондов содержит нуклеотидную последо-

вательность, комплементарную амплифицируемой области. «Шпилька»

зонда в процессе ПЦР денатурирует, и концы зонда (флуоресцентная

метка и гаситель) расходятся в разные стороны, и он специфически при-

соединяется к матрице. Затем под действием 5’-эндонуклеазной актив-

ности Taq-полимеразы, достраивающей новую цепь ДНК от праймера,

зонд разрезается, флуорофор оказывается свободным от гасителя. В ре-

зультате увеличивается интенсивность свечения. При отсутствии спе-

31

цифического отжига праймеров и зондов, не происходит присоединение

их к ДНК-матрице и сохраняется тушение флуоресценции.

Рис. 10. Принцип детекции ПЦР-продуктов с использованием зондов

Molecular Beacons. Ф – флюорофор. Г – гаситель

3. Метод с использованием частотного резонансного переноса энергии

(Light Cycler). В данном случае используют 2 зонда с резонансным пе-

реносом энергии. Данный способ детекции накопления продуктов ам-

плификации отличается повышенной специфичностью, так как увели-

чение флуоресценции происходит при комплементарном связывании с

ампликонами сразу двух ДНК-зондов. Принцип метода заключается в

переносе энергии от одного флуорофора, находящегося на 3`-конце

первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5`-конце вто-

рого зонда, причем расстояние между зондами, содержащими флуоро-

32

форы составляет 1–5 нуклеотидов. При одновременном связывании

обоих зондов с ДНК-матрицей испускаемое первым флуорофором из-

лучение передается на второй флуорофор, а его излучение детектирует-

ся прибором. Таким образом, возрастает специфичность анализа.

Рис. 11. Принцип детекции ПЦР-продуктов с использованием метода

частотного резонансного переноса энергии (Light Cycler).

Фд – флюорофор-донор. Фа – флюорофор-акцептор

Ко второй группе методов детекции продуктов ПЦР принадлежат

методы, основанные на использовании интеркалирующих веществ, акти-

вирующих свою способность к флуоресценции в результате присоедине-

ния к ДНК. В качестве основных представителей этих веществ можно на-

звать бромистый этидий, красители SYBR Green I/II и SYBR Gold. Этот

способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого

этидия и красителя SYBR Green I и SYBR Gold под действием ультрафио-

летового излучения значительно возрастает при их внедрении в двухцепо-

33

чечные молекулы ДНК (см. рис. 4). В настоящее время красители SYBR

Green I и SYBR Gold признаны более чувствительными по сравнению с

бромистым этидием. В настоящее интеркалирующие агенты используются

для детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе и по завершению

ПЦР. Для этого добавляют краситель SYBR Green I в реакционную ПЦР-

смесь перед запуском ПЦР. Однако следует отметить то, что в данном слу-

чае увеличение флуоресценции может быть связано как с накоплением

специфического, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмеры)

продукта. В этой связи детекция продуктов ПЦР с помощью предвари-

тельного добавления интеркалирующих агентов в ПЦР-смесь требует до-

полнительного изучения полученных ампликонов с помощью построения

так называемых «кривых плавления». Кроме того, в ряде случаев возника-

ет необходимость нормализации сигнала флуоресценции красителя, ис-

пользуемого в реакции, что достигается использованием пассивного рефе-

ренсного красителя, например ROX.

Принцип построения «кривых плавления» основан на том, что для

конкретной ДНК-последовательности существует своя температура плав-

ления. Если мы будем повышать температуру раствора ДНК, то на каком-

то уровне средняя кинетическая энергия молекул окажется выше энергии

водородных связей, которыми скреплены половинки двойной спирали.

Температура, при которой распадается (денатурирует) половина молекул

ДНК, называется температурой плавления. В паре гуанин-цитозин (ГЦ)

три водородные связи, в паре аденин-тимин (АТ) только две. Поэтому чем

больше ГЦ в ДНК, тем более она «тугоплавка». Отсюда следует, что по

ширине интервала температур, в котором ДНК плавится, можно судить о

ее составе. «Кривые плавления» исследуют после окончания ПЦР, когда

реакционную смесь нагревают, и молекула флюорофора отщепляется от

ДНК, и ее флуоресценция резко снижается. Если в пробирке находятся ам-

пликоны с разной температурой плавления, то на кривой будет заметно не-

34

сколько пиков, каждый из которых будет соответствовать своему ампли-

кону. Наличие ампликонов с разной температурой плавления свидетельст-

вует о накоплении неспецифических продуктов ПЦР.

Рис. 12. Исследование полученных ампликонов с помощью «кривых

плавления». Tm 1 и Tm 2 – температура плавления продуктов реакции.

Пунктирная линия – интенсивность свечения ПЦР-продуктов, содержащих

флуоресцентную метку. Сплошная линия – интенсивность свечения

референсного красителя

Процедура проведения ПЦР в реальном времени имеет некоторые от-

личия от базовой, связанные с необходимостью детекции продуктов ам-

плификации после каждого цикла.

Работа 10. Методика амплификации с использованием красителя

SYBR Green

1) Подготовить все необходимые реагенты для проведения ПЦР.

2) В стерильной пробирке смешать компоненты в следующих соотно-

шениях:

35



10х ПЦР-буфер 1х 5 мкл 10мМ смесь дНТФ 0.2 мМ каждого 1 мкл Праймер 1 (5 мкМ) 0.1 мкМ 1мкл Праймер 2 (5 мкМ) 0.1 мкМ 1мкл SYBR Green 0.125 мкл ROX 0.26 мкл Taq-ДНК-полимераза 1.25 ед. 0.5 мкл 25мМ MgCI2 5 мМ 10 мкл ДНК-матрица 0.1–1 мкг варьирует от концен-

трации образца Деионизованная вода – до 50 мкл

3) Перемешать на вортексе. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и

запустить программу:

1. Первичная денатурация ДНК при 95 оС. Время денатура-

ции зависит от типа используемой матрицы.

2. Денатурация цикла при 95 оС 30 с.

3. Отжиг праймеров при 60–65 оС 20–30 с.

4. Элонгация при 70–72 оС 1 мин.

5. Детекция флюорисцентного сигнала.

6. Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 5) 30–40 раз.

7. Построение кривых плавления в интервале от 60 оC до

95 оC с детекцией через каждые 0.2 оC. Комментарии к методике:

1) Поскольку краситель SYBR Green довольно быстро разлагается на свету, необходи-

мо все манипуляции совершать быстро и в затемненных пробирках.

2) Для того, чтобы предотвратить образование димеров праймеров, стадия отжига

должна быть как можно короче. Как правило, 15–20 с вполне достаточно для отжига

праймеров на специфическом субстрате.

3) Поскольку SYBR Green, как правило, дает достоверные результаты при C(T) не

больше 35–38, 40 циклов амплификации является оптимальным значением.

4) При работе с SYBR Green необходимо строить кривую плавления ДНК для опреде-

ления специфичности ПЦР-реакции.

36

Работа 11. Методика амплификации ДНК с применением зондов

Taqman


2) В стерильной пробирке смешать компоненты в следующих соотно-

шениях:



10х ПЦР-буфер 1х 5 мкл 10мМ смесь дНТФ 0.2 мМ каждого 1 мкл Праймер 1 (5 мкМ) 0.1 мкМ 1мкл Праймер 2 (5 мкМ) 0.1 мкМ 1мкл TaqMan 0.25 мкМ 1 мкл Taq-ДНК-полимераза 1.25 ед. 0.5 мкл 25мМ MgCI2 3.5 мМ 7 мкл ДНК-матрица 0.1–1 мкг варьирует от концентра-

ции образца Деионизованная вода – до 50 мкл

3) Перемешать на вортексе. Поместить образцы в ДНК-амплификатор и

запустить программу:

1. Первичная денатурация ДНК при 95 оС 10 мин.

2. Денатурация цикла при 95 оС 15 с.

3. Отжиг праймеров с последующей элонгацией цепи при

60 оС 1 мин.

4. Детекция флюорисцентного сигнала.

5. Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 4) 40–45 раз.


1) Поскольку при проведении такого типа реакции ПЦР-РВ используются специфиче-

ские типы полимераз (Pfu, Pwo и др.), их активность проявляется в диапазоне тем-

ператур 60–72 оС.

2) Построение кривой плавления после реакции не обязательно (это будет кривая

плавления не ПЦР-продуктов, а дуплекса зонда с ампликоном).

37

Работа 12. Обработка данных

Детекция в реальном времени флюоресценции продуктов ПЦР по-

зволяет вычислять первоначальное количество присутствия шаблона в раз-

личных образцах. Осуществляется это путем подсчета числа циклов ПЦР,

необходимых для достижения заданного уровня флюоресценции (порого-

вой флюоресценции). В связи с тем, что интенсивность флюоресценции

отражает количество продукта, то для образцов, которые первоначально

имели больше матрицы, потребуются меньше циклов ПЦР для достижения

заданного порога флюорисценции, чем для образцов с меньшим количест-

вом матрицы. Такая взаимосвязь может быть задана математически: коли-

чество циклов, необходимых для достижения порога (то есть пороговый

цикл, или величина CT), обратно пропорционально логарифму первона-

чального количества матрицы. Поэтому значения CT могут использоваться

для расчета исходного количества матрицы.

Для подсчета исходного количества матрицы в образце необходимо

сначала задать порог флюоресценции, при котором различные образцы бу-

дут сравниваться. Для этого сначала необходимо начертить зависимость

флюоресценции от номера цикла, а затем провести линию порога на гра-

фике в точке, где сигналы превосходят фоновые уровни и начинают увели-

чиваться экспоненциально. Величина CT для отдельного образца определя-

ется, как цикл, при котором линия флюоресценции образца пересекла ли-

нию порога.

Значения CT, полученные в разных образцах, сравниваются с CT

стандарта для вычисления абсолютного или относительного количества

шаблона. Если величины количественного анализа образцов совпадают с

диапазоном матрицы, то можно сгенерировать линейную стандартную

кривую зависимости логарифма количества матрицы от CT. Абсолютное

количество исходной матрицы в неизвестных образцах затем может быть

38

рассчитано из стандартов, используя значения CT образцов. Если способ

расчета по стандартам невозможен, то количество шаблона в одном образ-

це может быть вычислено относительно другого образца на основании

разницы в значениях CT – ΔCT.

В настоящее время разработано большое количество программного

обеспечения, которое автоматически генерирует стандартные кривые для

абсолютного количественного анализа, если стандарты заданы в настройке

плашки. Кроме того, программное обеспечение также оценивает эффек-

тивность реакции и вычисляет значения ΔCT для анализа относительных

значений.

Два основных принципа обработки данных ПЦР в реальном времени:

1. Метод калибровочного графика.

2. Прямое сравнение данных.

Метод калибровочного графика

Этот метод предполагает построение калибровочного графика в ко-

ординатах C(T) – log P0 с серией разведений ДНК-стандарта, из которого

находят концентрацию субстрата (P0) в экспериментальных образцах.

Точность метода зависит от того, насколько условия ПЦР (и, прежде

всего, эффективность амплификации) серии стандартов близки к условиям

ПЦР экспериментальных образцов. Поэтому при выборе стандартов необ-

ходимо руководствоваться следующими правилами:

1. Содержание примесей в стандартном препарате должно быть

сходно с таковым в экспериментальном препарате.

2. Доля амплифицируемого фрагмента в стандартной ДНК долж-

на быть близка к таковой в экспериментальной ДНК.

3. Серия разведений стандартной ДНК должна охватывать весь

диапазон возможных концентраций субстрата в экспериментальной ДНК.

39

Если достаточно определить лишь относительную концентрацию

субстрата, для построения калибровочного графика удобно использовать

серию разведений одного из экспериментальных образцов. В тех случаях,

когда образцы могут сильно отличаться по примесям и доле амплифици-

руемого фрагмента в реакционной смеси, имеет смысл при наладке экспе-

римента приготовить серию разведений каждого из них и сравнить эффек-

тивности.

Прямое сравнение данных

Из уравнения

C(T) = – (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E (1)

следует, что при равной эффективности реакции E в образцах 1 и 2, отно-

сительная концентрация субстрата

R = P1/P2 = E – (C(T)1–C(T)2) = E - С(T) (2)

Проведем нормализацию этих результатов по данным амплификации

с контрольной последовательностью REF (соответствующей, например,

housekeeping gene (конститутивный, референсный ген)). Пусть реакция

REF в обоих образцах протекает с эффективностью Eref. Тогда

R = E – С(T)/ Eref – С(T)ref . (3)

Если эффективности «контрольной» и «опытной» реакций

сходны, приближенно можно записать:

R = E – С(T)/ E – С(T)ref = E С(T)ref– С(T.) (4)

И, наконец, если обе реакции протекают со сходной эффектив-

ностью, близкой к 2, формула упрощается до вида:

R= E С(T)ref - С(T) ~ 2 С(T)ref - С(T) = 2- С(T.) (5)

40

При проведении ПЦР-РВ в качестве REF можно использовать после-

довательность, соответствующую референсному гену, однако нужно иметь в

виду, что уровень экспрессии некоторых референсных генов иногда значи-

тельно варьирует в разных тканях. Лучше всего проводить нормализацию по

усредненным данным амплификации нескольких house-keeping genes.

Рис. 13. Расчет данных ПЦР-РВ методом прямого сравнения

(ΔΔСТ метод)

41

Глава IV. Гибридизация нуклеиновых кислот

В 1961 году было обнаружено, что процесс денатурации ДНК обра-

тим: после денатурации при 100 оС, выдерживание ДНК при температуре

65 оС привело к восстановлению структуры двойной спирали. Этот про-

цесс называется ренатурация или гибридизация. Процессы гибридизации

происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементар-

ны: ДНК – ДНК, РНК – РНК, ДНК – РНК.

Для проведения гибридизации необходимо иметь чистый одноцепо-

чечный фрагмент ДНК, комплементарный той последовательности, кото-

рую необходимо обнаружить. Этот фрагмент получают либо клонировани-

ем, либо путем химического синтеза. Одноцепочечная ДНК, используемая

в качестве индикатора, называется ДНК-зонд. Она может содержать от 15

до 1000 нуклеотидов.

Анализ проводят по следующей схеме: исследуемую ДНК гидролизу-

ют рестриктазами, фракционируют электрофорезом, переносят разделен-

ные фрагменты на нитроцеллюлозный фильтр и проводят реакцию гибри-

дизации с мечеными олигонуклеотидами. Зонд метится какой-либо репор-

терной группой: радиоактивным изотопом, флуорохромом, ферментом,

дающим окрашенный или люминесцирующий продукт и т. д. Этот метод

был разработан Саузерном в 1975 году. «Блоттинг» – в переводе с англий-

ского означает «промокашка», «саузерн» – «южный».

Молекулы исследуемой ДНК разгоняют в агарозном геле электрофо-

резом. ДНК в геле денатурируют щелочью. После переноса щелочь ней-

трализуют, и пластину геля накрывают нитроцеллюлозой. Сверху на нит-

роцеллюлозу помещают стопку листов фильтровальной бумаги, обеспечи-

вая медленный ток буферного раствора через гель в направлении, перпен-

дикулярном направлению электрофореза. ДНК диффундирует из геля и

42

связывается с нитроцеллюлозным фильтром. Данный способ переноса

ДНК на нитроцеллюлозную мембрану получил название «мокрый пере-

нос». После прогревания фильтра при 80 оС в вакууме или обработки УФ-

светом ДНК необратимо связывается с нитроцеллюлозой. Затем мембрану

помещают в раствор с меченым зондом, в котором и происходит гибриди-

зация. После отмывки несвязавшейся радиоактивности результат выявля-

ют с помощью радиоавтографии или иных способов в случае использова-

ния нерадиоактивных меток. Расположение полос иммобилизованной ДНК

точно соответствует их расположению в геле.

Рис. 14. Схема проведения гибридизации ДНК по Саузерну

43

ДНК, связанную с нитроцеллюлозным фильтром, можно гибридизо-

вать с радиоактивно меченым ДНК-зондом. Блоттинг по Саузерну является

исключительно полезным также и для локализации изучаемых генов в оп-

ределенных фрагментах, полученных в результате гидролиза различными

рестриктазами гибридных молекул ДНК, хромосомной ДНК и т. д.

Аналогичным методом на нитроцеллюлозу переносят молекулы РНК

(Нозерн (северный) блоттинг) и белка (Вестерн (западный) блоттинг).

При проведении гибридизации РНК по Нозерну, стандартные условия

блотинга по Саузерну не применимы, так как она не связывается с обыч-

ными нитроцеллюлозными и нейлоновыми мембранами. Для иммобилиза-

ции РНК вначале был предложен специальный вид бумаги с диазобензи-

локсиметилом (DMB-целлюлоза), а затем были найдены условия для неко-

валентного связывания РНК с нитроцеллюлозой (предварительная денату-

рация РНК диметилсульфоксидом, формальдегидом и др.) и разработаны

для этого подходящие нейлоновые фильтры.

Одним из наиболее точных и современных методов анализа является

использование чипов. Они представляют собой пластинки с иммобилизо-

ванными меченными ДНК-зондами. Каждая такая пластинка может содер-

жать несколько десятков тысяч зондов, расположенных в определенной

последовательности. Метка проявляется только в спаренных двухцепочеч-

ных фрагментах. Если в исследуемом образце есть последовательности,

комплементарные последовательностям зонда, то гибридизацию можно

определить визуально или с помощью специальных приборов. Как прави-

ло, детекторы соединены с компьютером, то есть процедура считывания и

обработки информации автоматизирована.

При подготовке ДНК-зондов включение метки в ДНК возможно

двумя основными способами:

1) Удлинение затравки. Данный способ получения ДНК-зондов

подразумевает использование олигонуклеотида (менее 20 звеньев), ком-

44

плементарного какому-либо известному участку анализируемой ДНК.

В процессе его гибридизации с денатурированной ДНК в реакционную

смесь добавляют ДНК-полимеразу и набор всех четырех дезоксирибонук-

леозидтрифосфатов (дНТФ), один из которых несет метку. Используя оли-

гонуклеотид в качестве затравки, полимераза удлиняет растущую цепь,

встраивая в нее меченый нуклеотид. В результате образуется полинуклео-

тидный меченый зонд.

2) Полимеразная цепная реакция. ПЦР предусматривает наличие

двух олигонуклеотидных затравок, комплементарных участкам, фланки-

рующим выбранный район ДНК. При проведении ПЦР в присутствии нук-

леотида, несущего метку, происходит синтез ПЦР продуктов, несущих в

своем составе меченые нуклеотиды. При повторении процедуры денатура-

ции, гибридизации и полимеризации около 30 циклов можно получить не-

сколько миллионов меченых полинуклеотидов, используемых в качестве

ДНК-зондов.

Работа 13. Использование биотин-11-dUTP для нерадиоактивного ме-

чения ДНК методом ПЦР


2) Для постановки реакции смешайте в пробирке следующие компо-

ненты:

Компоненты реакции Количество компонента на 25 мкл смеси

смесь биотин-11-dUTP 1/3 4.0 мкл 10х ПЦР-буфер 2.5 мкл Праймер 1 (50мкМ) 1 мкл Праймер 1 (50мкМ) 1 мкл Taq-полимераза 0.5–2.5 ед. ДНК-матрица 0.02–0.15 мкг 25мМ 3.5 мкл Деионизованная вода до 25 мкл

45

3) Перемешать компоненты на вортексе и установить следующий цикл

амплификации:

1. Первичная денатурация при 94 оС – 1 мин;

2. Денатурация цикла при 94 °С – 10 с;

3. Отжиг праймеров при 37–68 °С – 10 с;

4. Элонгация при 72 °С – 10–60 с (в зависимости от длины

получаемого продукта);

5. Повтор цикла амплификации (этапы со 2 по 4) 40 раз.

6. Время инкубации после последнего этапа при 72 °С – 3 мин.

Работа 14. Использование биотин-11-dUTP для нерадиоактивного ме-

чения ДНК методом удлинения затравки

1. В пробирку внесите следующие компоненты в указанном порядке:

– матричная ДНК (50-100 нг) – 5.0 мкл,

– 10х реакционный буфер – 2.5 мкл,

– гексануклеотидная затравка – 2.5 мкл,

– деионизированная вода – 6.0 мкл.

2. Встряхните пробирку на вортексе и собирите капли центрифугированием.

3. Инкубируйте пробу 5–10 мин в кипящей водяной бане для денатурации

ДНК и затем быстро перенесите пробирку в лед. Соберите капли центри-

фугированием.

4. Добавьте к пробе следующие компоненты:

– смесь дНТФ с биотин-11-dUTP – 8.0 мкл,

– ДНК-полимеразу: фрагмент Кленова – 1.0 мкл или термостабиль-

ная полимераза – 0.5 мкл.

5. Инкубируйте пробу в течение часа при 37 °С при использовании фраг-

мента Кленова или при 45 °С при использовании термостабильной поли-

меразы.

46

6. Остановите реакцию добавлением 1 мкл 0.5М ЭДТА рН 8.0.

7. Полученную меченую ДНК можно использовать сразу или храните при –

20 °С. Еще лучше переосадить меченую ДНК. Для этого к реакционной

смеси (25 мкл) добавьте 8 мкл 7 М ацетата аммония, 100 мкл этанола, хо-

рошо перемешайте и оставьте минимум на 30 мин при –70 °С или на 2 часа

при –20 °С.

8. Отцентрифугируйте при 12 000 об/мин в течение 10 мин, промойте оса-

док холодным 70 % этанолом, высушите под вакуумом и растворите в под-

ходящем объеме воды или ТЕ буфера. Комментарии к методике:

1) Повысить включение меченого основания можно, оставляя реакционную смесь для

инкубации на ночь при 37 °С или при комнатной температуре (~22 °С). Инкубация

при комнатной температуре продлевает жизнь фермента (фрагмента Кленова) и де-

лает включение более эффективным.

2) Количество синтезированной меченой ДНК зависит не только от чистоты, но и от

количества взятой в реакцию матричной ДНК.

3) При использовании термостабильной полимеразы добиться большего выхода мече-

ного продукта можно, повторив процедуру денатурация–отжиг–ферментативная ре-

акция. Для этого после стадии 4 в вышеприведенной методике переходите к стадии 2.

Работа 15. Проведение гибридизации ДНК по Саузерну

1. Исследуемую ДНК обработать соответствующими рестриктазами со-

гласно рекомендациям производителя.

2. Для денатурации фрагментов ДНК гель вымачивают в буфере для де-

натурации (1,5М NaOH, 0,5М NaCI) при осторожном покачивании в

течение 30 мин при комнатной температуре, затем выдерживают в

буфере для нейтрализации (1,5М Трис-НСI, 0,5М NaCI, pH 6,5) в тече-

ние 30 мин.

47

3. За это время замочить нейлоновый или нитроцеллюлозный фильтр

для переноса ДНК в 6х SSPE в течение 5 мин.

4. Собрать систему для переноса ДНК, и провести перенос при комнат-

ной температуре в течение ночи. В качестве буфера для переноса ис-

пользуют 20х SSPE (1,5М Трис-НСI, 0,5 М NaCI, pH 6,5):

• сполоснуть H2O;

• инкубировать покачивая в 0.4N NaOH ~30 мин;

• в это время подготовить: * 3 куска ватмана 3MM по размеру геля; * 2 больших куска ватмана 3MM – на подложку; * мембрану Hybond N+ (размер геля + 3–5 mm c каждой стороны); * 4 ленты парафилма или полиэтилена; * стопку фильтровальной бумаги;

• поочередно обмакнуть в 0.4M NaOH большие куски ватмана и положить их на подложку без пузырей, опустить концы в NaOH;

• положить гель дном вверх (без пузырей), налить сверху немного 0.4M NaOH;

• подложить рядом ленты парафилма (полиэтилена) так, чтобы мембрана не

соприкоснулась с ватманом 3MM, когда гель сожмется;

• мембрану смочить в 0.4M NaOH, положить на гель (без пузырей);

• сверху – 3 куска ватмана 3MM (нижний перед укладкой смочить в 0.4N

NaOH), стопку фильтровальной бумаги, плоскую пластину и груз (~300 г для

10 × 10 см2 геля); 5. По окончании переноса снять фильтровальную бумагу и отметить

положение лунок на фильтре. Фильтр снять и для удаления прилип-

шей агарозы промыть в 20х SSPE в течение 1 мин.

6. Пришить ДНК к фильтру, поместив последний (стороной с ДНК

вверх) на 5 мин под УФ-лампу (254 нм).

7. Поместить фильтр в полиэтиленовый пакет и запаять его. Провести

предгибридизацию при 42 оС в течение 10 мин и гибридизацию с соот-

ветствующим меченым зондом при той же температуре в течение

30–60 мин.

48

8. Промыть фильтр в двух-трех сменах 2х SSPE, 0,1% ДСН, по 5 мин в

каждой смене.

9. Гибридизовавшийся зонд выявляют соответствующими методами де-

текции.


1) Считается, что присутствие Mg2+ ингибирует связывание ДНК с мембраной (даже

при ~1мМ Mg2+). Добавление ЭДТА до 100мМ перед денатурацией восстанавливает

связывающую способность даже для 6мМ MgCl2.

Работа 16. Выявление меченых ДНК с образованием нерастворимого окрашенного продукта

1. После переноса ДНК на мембрану гель сполоснуть в 2х SSC буфере

при комнатной температуре. Промокнуть излишек жидкости.

2. Проинкубируйте мембрану в течение 30 мин в блокирующем буфере

(0.1 мл на 1 см2 фильтра). Буфер: 5% БСА, 0.1% Tween 20, 150мМ

NaCI в 50мМ фосфатном буфере.

3. Промойте мембрану в 2х SSC буфере.

4. Разведите коньюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза в буфере

(0.1% Tween 20 в 50мМ фосфатном буфере) до разведения 1 : 3000

(0.1 мл на 1 см2 фильтра). Разведенный коньюгат стабилен при +4 °С

около 12 часов.

5. Проинкубируйте мембрану в течение 30 мин в соответствующем

объеме разведенного коньюгата.

6. Удалите несвязавшийся коньюгат, промывая мембрану 2 раза по

15 мин 2х SSC буфером.

7. Проинкубируйте мембрану с буфером (0,1М Трис-HCI рН 7.6, 10мМ

MgCI2, 10мМ ZnCI2, 0.1% Тритон Х-100) в течение 2 мин.

49

8. Инкубируйте мембрану в соответствующем объеме красящего рас-

твора (0.1 мл (к 0.1 мл буфера (см. п. 7) добавить 0.7 мкл субстрата

1 (НСТ) и 0.35 мкл субстрата 2 (5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфа-

том)) на 1 см2 фильтра).

9. Для прекращения реакции ополосните мембрану дистиллированной

водой.


1) Для экономии раствора инкубацию рекомендуется проводить в полиэтиленовом

пакете, подобранному по размеру мембраны. Инкубацию проводите в темном

месте, что уменьшает образование фона. Образование окраски может начаться

через несколько минут, но обычно реакция занимает от 30 мин до 3 часов в за-

висимости от количества меченой пробы (можно для ускорения образования ок-

раски помещать мембрану на +37 °С, хотя это может приводить к усилению фона).

2) Если получается сильно окрашенный фон на мембране, то можно уменьшить

количество меченой ДНК пробы при гибридизации; увеличить объем буфера

при предгибридизации, чтобы уменьшить вероятность подсыхания фильтра;

можно использовать более сильное разведение коньюгата.

Работа 17. Дот-блот-гибридизация ПЦР-амплифицированной ДНК

1. Исследуемую ДНК обработать соответствующими рестриктазами

согласно рекомендациям производителя.

2. Вымачить нейлоновый фильтр в дистиллированной воде не менее

5 мин.

3. 10–20 мкл ПЦР-амплифицированной ДНК добавить к 300 мкл рас-

твора для денатурации (1,5М NaOH, 0,5 МNaCI). Денатурация при

этом происходит практически мгновенно.

50

4. Каждый образец наносят на отдельный участок мембраны для полу-

чения. При нанесении ДНК на мембрану необходимо учитывать, что

для всасывания образца требуется около 1 мин.

5. Пришить ДНК к фильтру, поместив последний (стороной с ДНК

вверх) на 5 мин под УФ (254 нм).

6. Промыть мембрану 20х SSPE (3М NaCI, 200мМ NaH2PO4xH2O, 20мМ

ЭДТА) три раза по 5 мин.

7. Гибридизовавшийся зонд выявляют соответствующими методами

детекции.

Глава V. Клонирование ДНК в бактериальные системы

Для проведения экспериментов с фрагментами ДНК зачастую возни-

кает необходимость их многократно копирования (клонировать). В класси-

ческой методике клонирования ДНК используется способность клеток

бактерий поглощать и реплицировать короткие кольцевые молекулы ДНК,

известные как плазмиды. Сначала клонируемый фрагмент ДНК вырезается

из исходной ДНК с помощью рестриктазы. Обычно используются два раз-

ных фермента. В качестве переносчика («вектора») служит плазмида с

единственным участком, узнаваемым специфической рестриктазой. Коль-

цевая плазмида линеаризуется с помощью рестрикции и затем смешивает-

ся с изучаемым фрагментом ДНК. Поскольку фрагмент и вектор имеют

одинаковые липкие концы, некоторые из молекул будут гибридизоваться

таким образом, что клонируемый фрагмент окажется интегрированным в

структуру вектора. Затем концы линейной молекулы ковалентно сшивают-

ся с помощью ДНК-лигазы с образовании новой «рекомбинантной» плаз-

миды. При обработке большого количества клеток некоторые из них по-

51

глощают рекомбинантную плазмиду (так называемая трансформация).

Трансформированные клетки реплицируют плазмиду вместе с собствен-

ным геномом. Обычно используют плазмиды, придающие трансформиро-

ванной клетке устойчивость (резистентность) к определенному антибио-

тику. При инкубации популяции клеток в присутствии антибиотика будут

реплицироваться только те клоны, которые содержат плазмиду. Из полу-

ченного клона выделяют плазмиду и после расщепления соответствующей

рестриктазой получают множество копий клонированного фрагмента ДНК.

Для выделения определенных фрагментов ДНК и последующего их

соединения с другими фрагментами для получения новых комбинаций ге-

нов используются ферменты, которые специфически разрезают и вновь

сшивают молекулы ДНК. Наиболее важной группой ферментов являются

эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), катализирующие специфиче-

ское расщепление двунитевой ДНК. Известно большое число рестриктаз.

Для их обозначения используются сокращенные названия микроорганиз-

мов – продуцентов (например, EcoRI – эндонуклеаза, выделенная из

Escherichia coli). Этот фермент расщепляет ДНК по палиндромной после-

довательности, т. е. короткому сегменту ДНК, в котором обе цепи при счи-

тывании в направлении 5'→3' имеют одинаковую последовательность.

Для EcoRl это последовательность 5'-GAATTC-3'. Гомодимер EcoRI рас-

щепляет фосфодиэфирные связи обеих цепей между G и А. Это приводит к

образованию комплементарных «липких» концов (ААТТ), которые удер-

живаются вместе за счет спаривания оснований. Их, однако, можно легко

отделить друг от друга путем небольшого нагревания. При охлаждении

липкие концы гибридизуются вновь в правильной ориентации.

Кроме того, существуют рестриктазы, образующие фрагменты с ту-

пыми концами (Sma I, EcoR V и др.).

Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами,

зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.

52

1. Сшивка фрагментов с липкими концами. Этот метод является са-

мым распространенным и популярным. В результате обработки ДНК рест-

риктазами, образующими липкие концы. Эти комплементарные друг другу

участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, и

поэтому их называют комплементарными или липкими концами. Спарива-

ние оснований происходит только между комплементарными последова-

тельностями, образовавшимися под действием одной и той же рестрикта-

зы, за счет образования водородных связей между однонитиевыми участ-

ками комплементарных нуклеотидов. Также места расщепления можно со-

единить с помощью ДНК-лигазы.

Рис. 15. Схема проведения рестрикции с образованием липких концов

и последующим лигированием

2. Сшивка фрагментов с тупыми концами. Тупые концы также мо-

гут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые

концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях.

В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффек-

тивность ниже, чем при сшивке по липким концам. Для этого используют

фермент-концевую трансферазу, которая присоединяет нуклеотиды к 3'-

концам цепей ДНК. Если к 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro

53

фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы

достроить одноцепочечные oligo(dA)-сегменты определенной длины, а к

концам другого фрагмента – oligo(dT)-сегменты примерно такой же длины,

то при смешении полученных таким образом фрагментов происходит спа-

ривание за счет образования водородных связей между oligo(dА)- и

oligo(dT)-последовательностями. Для ковалентного соединения двух фраг-

ментов используется ДНК-лигаза.

3. Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами. В си-

туации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндо-

нуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные

друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или «пе-

реходники»). Линкеры – это химически синтезированные олигонуклеоти-

ды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Суще-

ствуют линкеры «тупой конец – липкий конец». При необходимости лип-

кие концы можно превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением

липких концов с помощью фермента – эндонуклеазы S1, которая разруша-

ет только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы «застраивают», то

есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых липких концах синте-

зируют вторую нить.

Плазмиды – это внехромосомные автономно реплицирующиеся дву-

цепочечные кольцевые молекулы ДНК. Плазмиды встречаются практиче-

ски у всех бактерий и выполняют ряд функций: обеспечивают их собст-

венный перенос из одной клетки в другую (F-плазмиды); несут гены ус-

тойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы ге-

нов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов (плазмиды де-

градации). Есть плазмиды, в которых не обнаружены гены, выполняющие

какие-то определенные функции (критические плазмиды; от англ. cryptic –

скрытый, латентный). Размеры плазмид варьируют от менее 1 до более

500 т.п.н. Каждая из них содержит сайт начала репликации (ori), без кото-

54

рого репликация плазмиды в клетке-хозяине невозможна. Некоторые

плазмиды представлены в клетке 10–100 копиями; они называются высо-

кокопийными. Низкокопийные плазмиды присутствую в клетке в числе 1–

4 копий.

Рис. 16. Плазмидный вектор pGEM-T. Слева обозначен сайт рестрикции

с указанием рестриктаз

Как автономно реплицирующиеся генетические элементы плазмиды

обладают всеми основными свойствами, которые позволяю использовать

их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК: 1) небольшой раз-

мер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК в Е. coli значи-

тельно снижается при длине плазмиды более 15 т.п.н.; 2) наличие уникаль-

ного сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка; 3)

наличие одного или более селективных генетических маркеров для иден-

тификации реципиентных клеток, несущих рекомбинантную ДНК.

Полученную рекомбинантную плазмиду необходимо ввести в клет-

ку-хозяина (как правило, Е. coli). Этот процесс называется трансформацией.

Обычные бактериальные клетки практически не подвергаются трансфор-

мации, т. к. проникновению ДНК внутрь клетки мешает клеточная стенка и

мембрана. Бактериальные клетки, способные трансформироваться, назы-

ваются компетентными.

55

Рис. 17. Схема трансформации бактериальной клетки плазмидным

вектором

Для высокой эффективности введения рекомбинантной ДНК бакте-

риальные клетки могут обрабатываться специальным раствором солей, по-

сле чего клеточная стенка и мембрана становится проницаемой для не-

больших плазмид. Еще одним методом введения ДНК в бактерию является

обработка клеток «холодовым шоком». Другим способом трансформации

является электропорация.

56

Работа 18. Приготовление компетентных клеток

1. Рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной средой без ан-

тибиотика. Выращивать при 37 oС 10–12 часов.

2. Несколько колоний (10–12) диаметром ~2–3 мм поместить в колбу с

40 мл жидкой среды (2% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт,

10мМ NaCI, 10 мМ KCI).

3. Выращивать бактерии при постоянном помешивании (200–300 rpm)

при 37 oС до оптической плотности OD600 = 0.6.

Все дальнейшие манипуляции проводить на холоде!!!

4. В 50 мл пробирку поместить 30 мл культуры, охладить на льду в те-

чение 10–15 мин.

5. Центрифугировать на 2 000 rpm при 4 oC 10 мин, тщательно удалить

жидкость.

6. Осадок бактерий суспензировать в 10 мл буфера (10 мМ HEPES рН 6.7,

55мМ MgCI2, 15 мМ CaCI, 250мМ KCI). Охладить на льду 10–15 мин.

7. Центрифугировать на 2 000 rpm при 4 oC 10 мин, тщательно удалить

жидкость.

8. Ресуспензировать осадок в 2 мл буфере (см. п. 6), добавить DMSO до

3.5 %. Охладить на льду 10–15 мин.

9. Разаликвотировать по 100 мкл в охлажденные 2 мл пробирки. Замо-

розить в жидком азоте. Хранить в жидком азоте или на –70 oС.


1) Рост при 37 oС приводит к резкой (с острым максимумом) зависимости компе-

тентности от плотности клеток. При 18 oС высокая компетентность достигается в

широком интервале.

57

2) PIPES в составе TB можно заменить на HEPES или BES. Это приведёт к неболь-

шому увеличению компетентности.

3) DMSO токсичен для бактерий в высокой концентрации (это позволяет не заботит-

ся о его стерильности), поэтому он добавляется к клеткам в два этапа при посто-

янном перемешивании.

4) Замораживание в жидком азоте повышает компетентность в 4–5 раз.

Работа 19. Трансформация бактериальных клеток методом «холодового шока»

1) Приготовить свежий раствор пДНК (плазмидная ДНК) с концентра-

цией 50 нг/мкл.

a) Необходимо измерить концентрацию вектора и пДНК. Протести-

ровать различные соотношения вектор : пДНК для нахождения

оптимального значения. Для этого, в двух пробирках приготовить

смесь вектор : пДНК в соотношениях 1 : 1 и 1 : 3. Следующее со-

отношение позволяет рассчитать молярное отношение к молеку-

лярной массе для вектора и фрагменту ДНК, который использует-

ся для встраивания в вектор.

b) Рассчитав подходящее соотношение вектор : вставка, поставить

реакцию лигирования:

вектор – 100 нг, вставка – 50 нг, 10х буфер (50мM Трис-HCI (pH 7.8 при 25 °C); 10мM MgCI2; 10мM ДTT; 1мM ATФ; 25 мкг/мл БСА) – 1 мкл, Т4 ДНК-лигаза – 1 ед., деионизованная вода – до 10 мкл.

масса вектора (нг) ⋅ размер вставки (kb)

размер вектора (kb)

вставка

вектормасса вставки (нг)=

58

c) Реакцию лигирования проводить при температуре 16 оС в течение

30–40 мин.

2) Оттаять во льду 0.5 M β-меркаптоэтанол и аликвоту компетентных

клеток.

3) К аликвоте компетентных клеток добавить: 4 мкл 0.5M

β-меркаптоэтанола и 2 мкл пДНК;

4) Инкубировать смесь при 0 oC 20–60 мин.

5) Быстро, но без встряхивания, перенести клетки на 42 oC. Инкубиро-

вать 30 с.

6) Быстро перенести в лед на 2 мин.

7) После охлаждения к аликвоте клеток добавить 400 мкл буфера

(2% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10мМ NaCI, 10мМ KCI).

8) Выращивать, перемешивая горизонтально на бактериальном шейке-

ре при 37 oС 30 мин.

9) Высеять 50 мкл клеток на чашку с антибиотиком (добавить 100 мкл

0.1М IPTG и 20 мкл xGal (50 мг/мл)). Инкубировать 10–12 часов при

37 оС.

10) Проанализировать состояние колоний. Белые колонии, как прави-

ло, представлены трансформированными клетками, несущими ре-

комбинантную плазмиду. Голубой цвет колонии указывает на при-

сутствие в них клеток, в которых присутствует вектор без вставки

ДНК.

11) Рассчитать компетентность клеток: если выросло «N» колоний, то

компетентность = N × 106 [колоний/мкг].


1) При тепловом шоке температура может быть в интервале 40–50 оС.

2) Если тепловой шок заменить замораживанием в жидком азоте и оттаиванием до

комнатной температуры, то компетентность повысится в ~10 раз.

59

Работа 20. Выделение плазмидной ДНК (лизис щелочью)

1. 1.5 мл культуры клеток поместить в 1.7 мл пробирку, центрифугиро-вать 30 с при 10 000 rpm, полностью удалить супернатант (при необ-ходимости повторить).

2. Ресуспензировать осадок в 200 мкл раствора (25мМ Трис- HCI рН 8.0, 50мМ глюкоза, 10мМ ЭДТА), перемешать на вортеке. Инкубировать при комнатной температуре 5 мин.

3. К суспензии добавить 400 мкл раствора (0.2Н NaOH, 1% ДСН), резко вылить, сразу же резко встряхнуть, перевернуть ~5 раз. Инкубиро-вать при 0 oС 5 мин (не больше!!!).

4. Прибавить 200 мкл холодного 10М AcONH4, ~5 раз перевернуть. Инкубировать при 0 oС 5 мин.

5. Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm 5 мин.

6. Супернатант перенести в пробирку с 500 мкл изопропанола, сме-шать. Инкубировать при комнатной температуре 10 мин.

7. Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm 5 мин.

8. К осадку прилить 100 мкл 2М AcONH4, перемешать на вортексе 20 с. Инкубировать при комнатной температуре 5 мин.

9. Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm 5 мин., перенести супернатант в пробирку со 100 мкл изопропанола. Инкубировать при комнатной температуре 10 мин.

10. Центрифугировать при комнатной температуре при 12 000 rpm 10 мин, сполоснуть осадок 70 % этанолом, подсушить. При необхо-димости обработать РНКазой.

11. Растворить осадок в 25 мкл (H20 или TE буфера).

60


1) При щелочной денатурации ДНК нужно постараться как можно меньше раз-дробить геномную ДНК, иначе возникнут проблемы с ее осаждением в даль-нейшем.

2) Превышение времени денатурации приводит к тому, что плазмида денатури-рует необратимо – одно кольцо сдвинется относительно другого так далеко, что достигнет локально устойчивого состояния. Необратимо денатурирован-ные плазмиды можно использовать для сиквенса, они не режутся рестрикта-зами и обладают аномальной подвижностью на электрофорезе.

Работа 21. Выделение плазмидной ДНК методом фенол-

хлороформной экстракции (экспресс-метод)

1. Перенести колонию клеток в пробирку. Добавить 25 мкл STE буфе-

ра (10мМ Трис-HCI рН 8.0, 10мМ NaCI, 1мМ ЭДТА).

2. Перемешать на вортексе и добавить 25 мкл смеси фенол : хлоро-

форм : изопропанол в соотношении 25 : 24 : 1.

3. Перемешать полученную смесь на вортексе 1 минуту. Центрифуги-

ровать при 12 000 rpm 20 с.

4. Супернатант перенести в новую пробирку. Центрифугировать при

12 000 rpm 10 мин.

5. Супернатант можно использовать для ПЦР-анализа.


1) Для более качественной очистки пДНК можно использовать осаждение 96 %

спиртом после п. 5.

61

Работа 22. Определение вставки ДНК в трансформированных клетках

методом рестрикции

1. Рестрикцию вставки ДНК можно проводить любой рестриктазой,

имеющей по одному сайту рестрикции с каждой стороны от вставки,

например, EcoR I.

2. Собрать смесь для рестрикции:

10х ПЦР буфер для EcoR I – 1,5 мкл. Плазмидная ДНК – 1 мкг. Фермент EcoR I – 1 ед. Деионизованная вода – до 15 мкл.

3. Инкубировать смесь при 37 оС 30 мин. Инактивировать фермент нагре-

ванием до 65 оС на 20 мин.

Работа 23. Идентификация вставки ДНК в трансформированных

клетках методом ПЦР

1. При определении вставки можно использовать как секвенирующие

праймеры М13, так и специфические праймеры для ДНК вставки.

2. В случае использования специфических праймеров для вставки ДНК,

программа и параметры амплификации используются соответствую-

щие.

3. Если использовать праймеры М13, то программа для амплификации

следующая:

1) Денатурация при 95 оооС 3 мин.

2) Денатурация цикла при 95 оС 30 с.

3) Отжиг праймеров при 50 оС 30 с.

4) Элонгация цепи при 72 оС 40 с.

5) Повторить цикл амплификации с п. 2. по п. 4. 30 раз.

6) Финальная элонгация при 72 оС 3 мин.

62

Рекомендуемая литература:

1. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / под ред.

Н.К. Янковского. – М. : Мир, 2002. – 588 с.

2. Попечителев Е.П. Аналитические исследования в медицине, биологии и

экологии / Е.П. Попечителев, О.Н. Старцева. – М. : Высш. шк., 2003. –

279 с.

3. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии / В.Н. Рыбчин. – СПб. :

Изд-во СПбГТУ, 1999. – 519с.

4. Ленинджер А. Основы биохимии / А. Ленинджер. – М. : Мир, 1985.

5. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии / Ю.Б. Филиппович. – М. : Высш.

шк., 1993.

6. Албертс Б. Молекулярная биология клетки / Б. Альбертс и др. – М. :

Мир, 1995.

7. Медицинские лабораторные технологии. Справочник / под ред.

А.И. Карпищенко. – СПб. : Интерм., 1999.

8. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / под ред.

Н.К. Янковского. – М. : Мир, 2002.

9. С. Колеман. Наглядная биохимия / С. Колеман, М. Рем. – М. : Мир,

2002.

10. Н.А. Кузьмина. Основы биотехнологии // http://www.biotechnolog.ru/,

2005.

11. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / под ред. С. Хер-

рингтона. – М. : Мир, 1999.

12. http://www.molbiol.ru/

63

Учебное издание

Еприцев Александр Трофимович, Попов Василий Николаевич, Федорин Дмитрий Николаевич

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

Учебно-методическое пособие для вузов

Редактор И.Г. Валынкина

Подписано в печать 21.08.08. Формат 60×84/16. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 50 экз. Заказ 977.

Издательско-полиграфический центр

Воронежского государственного университета. 394000, г. Воронеж, пл. им. Ленина, 10. Тел. 208-298, 598-026 (факс)

http://www.ppc.vsu.ru; e-mail: [email protected]

Отпечатано в типографии Издательско-полиграфического центра Воронежского государственного университета.

394000, г. Воронеж, ул. Пушкинская, 3. Тел. 204-133.

Tehnica Izolare Adn Rusa (Buna)

Documents

Transcript of Tehnica Izolare Adn Rusa (Buna)