UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR

Determinarea acizilor amari din hamei

Analiza de acizi amari din bere i hamei prin metoda HPLC/MSBerea reprezint una dintre cele mai larg consumate bauturi din lume. Producia anual la nivel mondial, msurat n sute de milioane de hectolitri, este o mrturie a popularitii sale. In toat lumea 20000 de feluri de bere sunt mbuteliate n 180 de feluri, de la normal, slab alcoolizat, pils, amar, crem de bere i bere neagr. Dei exist multe tipuri diferite de bere, toate au n comun o caracteristic de bazgust, amrciune. Gustul amar al berii deriv din acizii prezeni n sectorul hameiului care sufer izomerizare n timpul procesului de preparare. n contrast cu procesele tradiionale vechi, tehnici moderne de bere pot utiliza produsele din hamei, cum ar fi extrase pentru a realiza volume mai mari de producie. Expunerea prelungit a berii la aer este corelat cu reducerea gustului amar.Berea a aprut acum cca. 6000 de ani. Vine cel mai probabil de la pine care s-a udat i a nceput s fermenteze, de unde a aprut procesul de fermentare.Se pare ca berea era asemntoare unei grsimi groase de culoare intunecat, fara s conin o cantitate mare de alcool, nsa foarte hrnitoare. Datorit gustului deosebit, ea ocupa un loc important in dieta oamenilor din acea vreme. Arheologii de la Universitatea Cambridge au interprins un studiu al proceselor de pregtire a berii i cerealelor in Egiptul antic. Obiectul de studiu a fost gsit in mormintele in care s-au pstrat ramaie de mancare i bere. Calitatea acestora depinde de zahrul necesar pentru fermentaie.Berea este o butur alcoolic obinut din 4 produse naturale: drojdia de bere, mal, hamei i ap. Aceasta are aproximativ 5% alcool; aa-numita bere fr alcool are ntre 0 i 0,5% alcool.In zilele noastre pentru uurarea procesului seminele se pun la uscat, astfel inct se obine malul. Malul se fierbe, se strecoar i se adaug drojdie. Potrivit reetei tradiionale, pentru obinerea unei drojdii naturale se prepar un aluat din fain de grau, iar aluatul se punea la copt pan cnd mijlocul se intrea. Dup care, bucile din aluatul copt se puneau intr-un decoct de mal pentru pregtirea berii.Hameiul este floarea de Humulus lupulus, un agent de stabilitate n bere. Acizii de hamei au un efect antibiotic slab contra bacteriei gram-positive care favorizeaz activitatea exclusiv a drojdiei de bere n fermentarea berii. Aroma dat de hamei, depinde de varietate i utilizare; hameiul fiert cu berea ("hamei amrui") produce o amrciune n timp ce hameiul adugat mai trziu d un fel de "arom de hamei" (ultimele 10 minute din fierbere) i "arom de hamei" (ultimele 3 minute din fierbere sau mai puin) cu un grad de amrciune mai sczut. Adugarea hameiului dup fierbere, un proces cunoscut ca i "adugarea hameiului uscat" adaug puin amrciune. Hameiul nefiert d doar o amrciune slab. Impactul amrciunii dup o anumit cantitate de hamei este specificat n uniti de amrciune.

Inflorescena de hamei este de tip ament, popular denumit con. Conurile de hamei sunt o materie prim important la fabricarea berii, fiind un agent de stabilitate n bere. Acizii de hamei au un efect antibiotic slab contra bacteriei gram-pozitive care favorizeaz activitatea exclusiv a drojdiei de bere n fermentarea berii.Conurile de hamei conin: substane azotate (aminoacizi, albuminoide, polipeptide), glucide, fibre, tanin, substane amare (acizi amari i rini), uleiuri volatile (mircen, humulen, canben, etc), sruri minerale, flavonoizi (xanatohumol), glicozizi flavonici (ai cvercetolului, ai camferolului), rezine, colin, fitoestrogeni, glicerin, lipide.

Cele mai bine reprezentate substane active din conurile uscate sunt: substanele azotate- cca. 15%, substanele amare -cam 11%, taninul- 5%, substanele estrogenice -cca. 1,5 %, rinile- 1,2%, uleiurile volatile -aproximativ 1%.

Acizii amari sunt alctuii din humilon i lupulon. Humulonul, pe parcursul nclzirii soluiilor n care se extrage trece n izohumulon. Acizii amari au efect antiseptic, iar berii i imprim spuma, gustul i aroma specific.

Taninul contribuie la culoarea i la limpezimea berii, prin faptul c este uor tinctorial i precipit proteinele.cizii amari sunt considerai a fi caracteristica primar de calitate a hameiului, deoarece sunt o msur a potenialului amar.Consumul specific mediu de hamei, exprimat n g/hl de bere este foarte variabil n

funcie de sortul de bere si de coninutul conurilor n acizi amari fiind de aproximativ 150g conuri uscate pentru un hl de bere. n prezent consumul specific se exprim mai exact n g acizi alfa/hl de bere si se apreciaz c cca. 40% din producia mondial de bere utilizeaz 5,5-5,6 g acizi alfa/hl de bere, pentru care este necesar o cantitate cca. 7300 t acizi alfa/an. Pentru urmtorii 10 ani se estimeaz reducerea consumului specific la 5 g acizi alfa/hl, ceea ce la un coninut mediu de 7,8% acizi alfa ar fi suficiente 60000 ha hamei.

Compusii chimici din rsina de hamei, care au gust amar (acizii si mai puin acizii ) trec n timpul brasajului n substane solubile denumite izo--acizi,cu o amreal mai mare dect a acizilor , iar acizii nu se mai gsesc n bere dect n urme. Izomerizarea acizilor n timpul fierberii mustului de bere este una dintre cele mai importante reacii din chimia hameiului.O cromatografie n faz invers a fost folosita pentru a separa acizii alfa din hamei din produsele lor izomerizate din bere,iar spectrometrul de mas MS a fost apoi utilizate pentru a determina coninutul de acid amar.Cromatografia lichid de nalta performan (HPLC) Aceast tehnic a devenii cea mai performant n analiza chimic, biomedical i diagnostic laborator. Este utilizat pentru separarea i detecia unor compui biologic activi (hormoni, vitamine, proteine, lipide, etc), instabili termic, n concentraii extrem de mici, cu o viteza i precizie mult mrite n raport cu metodele clasice. Figura de mai jos prezint schematic prile componente ale unui cromatograf de lichide de nalt performan (HPLC): una sau dou pompe (2) ataate la un rezervor (1) de unde preiau eluentul, un injector de introducere a proba (3), coloana de separare (4) ataata la un detector (5) care identific componentele pe baza unei proprieti (de obicei absorbia n UV sau VIS in ordinea ieirii din coloan i un nregistrator (6) care vizualizeaz cromatograma.

Componentele unui cromatograf de lichide de malta performan (HPLC)Separarea poate avea scop analitic i atunci are loc pe o coloan de oel de dimensiuni mici (25 x 4 mm) sau preparativ, pe coloane de dimensiuni mai mari (30 cm x 10 mm). Proba este injectata in coloana HPLC care este ataat la pompe care mpinge solventul cu o presiune mare (aprox. 40 mPa sau 100Barr). Debitul de curgere depinde de aceast presiune i este de obicei cuprins intre 0,5 i 2 ml/min. Uneori, pentru o separare mai performant, eluia se poate face cu amestecuri de solvent a caror concentraie variaz n timp (gradient) i aceasta necesit utilizarea a dou pompe i a unei camere de amestecare.

Atunci cnd separarea are ca scop preparativ se colecteaz pe rnd componentele amestecului si se verific puritatea lor prin CSS sau printr-o alt separare HPLC.

Faza staionar. In funcie de umplutura coloanelor exist HPLC:

cu faz normal (NP-HPLC) n care faza staionar este polar: silicagel, alumina, celuloza, Ca(OH)2, MgC03 sau

cu faz invers (RP-HPLC) n care faza staionar devine nepolar, prin legare chimica deoctadecilsilan ODS = C18 sau octasilan C8.Mecanismul pe baza cruia are loc separarea n aceste cazuri este diferit: dac pentru sistemele NP-HPLC, separarea are la baz adsorbia diferit a componentelor amestecului pe faza staiona. Pentru sistemele RP-HPLC procesul de separare are la baz repartiia componentelor amestecului intre faza staionar nepolar i eluentul polar.Tipul fazei mobile (eluentul) este dependent de natura fazei staionare. Astfel in sistemele NP- HPLC unde faza staionar este polar se folosesc elueni nepolari (eter de petrol, hexan puri sau in amestec cu aceton 1-15%) iar unde faza staionar este nepolar (RP-HPLC) se folosesc amestecuri de solveni polari, cum sunt: acetonitrihil, metanolul, acetatul de etil, apa. In funcie de tipul probei de analizat se alege unul din aceste sisteme:

dac proba este preponderent nepolar se recomand utilizarea sistemului NP-HPLC unde coloana conine faz staionar polar cu afinitate diferit pentru moleculele nepolare, care vor fi primei eluate, cu solventul preponderent nepolar.

dac proba este preponderent polar se recomand utilizarea sistemului RP-HPLC cu faza staionai nepolar i afinitate diferit pentru moleculele polare, ce vor fi eluate primele, cu solveni polari.

Astfel, ordinea de eluie (caracterizat de tR - timpul de retenie a probei pe coloan, exprimat m minute) a componentelor amestecului depinde de sistemul utilizat:

NP-HPLC (eluent nepolar): tR comp.nepolare