Hibridizare Acizi Nucleici

7/24/2019 Hibridizare Acizi Nucleici

1/20

OB INERE A SONDELOR DEACIZI NUCLEICI

Manea Andreea SimonaNiculae Adelina tefaniaFacultatea de BiologieUniversitatea Bucure tiMaster GAB

Tehnici moleculare n genetic


2/20

Principiile hibridizrii acizilor nucleici

Hibridizarea= procesul prin care monocatene A!" sau A#" din sursebiologice di$erite re$ormeaz con$igura%ia dublu catenar

Procesul de hibridizare se bazeaz pe &

'principiul complementarit%ii dintre cele catene ale unui duple( A!" sau A#")

' eventuala omologie de secven% dintre cele surse A!"*

ot e!i"ta #ibrizi$

ADN $ ADNARN $ ARNADN $ ARN


3/20


4/20

SCO$ +denti$icarea sau localizarea anumitor $ragmente de acizi nucleici

molecula %IN&'= $ragmentul de A!", A#" sau de protein de identi$icat sau de localizat

molecula SOND'= $ragmentul de A!", A#" sau de protein cu a-utorul cruia, prinhibridizare, este identi$icat sau localizat .+"TA

( ti)uri de #ibridizare

/n solu ie

Pe suport solid = BLO&&IN*


5/20

0(ist 1 categorii principale de blotting &

SOU&HERN BLO&&IN*2dup numele autorului 3 4outhern, 56789

+tehnic molecular ce identi$ic $ragmente de A!" $olosind sonde A!" sau A#"

NOR&HERN BLO&&IN*

+tehnic molecular ce identi$ic $ragmente A#" $olosind sonde A#" sau A!"

,ES&ERN BLO&&IN*+ tehnic molecular ce identi$ic $ragmente proteice $olosind anticorpi speci$ici


6/20

Principalele etape ale unuiproces de hibridizare molecular

pe suport solid1. Sinteza sondei marcate

/n $unc%ie de molecula de A!" %int, de lungimea sondei dorite, precum :i de tipul de marcare,se sintetizeaz o specie molecular de sond A!" sau A#" complementar cu molecula %int*

2. Procesarea ADN int

Moleculele de A!" surs n care se gse:te :i secven%a de A!" %int, trebuie izolate :ipuri$icate* Ulterior, A!" surs se digera cu o endonucleaz de restric%ie, ast$el nc;t secven%a de A!"%int s $ie ob%inut ca molecul d*c* linear*

Amestecul de digestie se supune unei electro$oreze n gel de agaroz, n care se separ diversele$ragmente ob%inute n reac%ia de restric%ie*

3.Denaturarea ADN int

Gelul de agaroz n care se a$l :i moleculele de A!" se introduce n solu%ii de "a


7/20

4. Transferul ADN int pe suport solid

Fragmentele de A!" d*c* lineare separate n gelul de electro$orez se trans$er pe un suportsolid 2h;rtie de nitroceluloz sau membran de n>lon9, dup ce n prealabil se realizeaz o denaturare amoleculelor de A!" prin imersarea gelului n "a


8/20

@aracteristicile generale ale sondelor

Sond- = o secven% de nucleotide, scurt, monocatenar, alctuit din A!" sau dinA#", ce se va lega speci$ic de o secven% %int

Gradul de omologie de secven dintre sond i int va determina stabilitatea hibridului.

s fie marcat pentru a putea permite vizualizarea hibridului molecularsond: int;10 10.000 nucleotide ! de regul se folosesc 1" "0#;s nu con in complementaritate intracatenar.


9/20

Modalit%i de sintez a sondelormoleculare de acizi nucleici

1. Sinteza de sonde prin nic'(translation

1 C

1 C

1 C

1 C

1 C

1 C

1 C 1 C

1 C

1 C

1 C

+ n c u b a r e i n p r e z e n t a ! n a z e i +2 e n d o n u c l e a z a c a r e , i n

p r e z e n t a d e M g i n d u c e $ o r m a r e ad e r u p e r i m o n o ' c a t e n a r e ' n i c D C u r i 9

E

A ! " p o l +2 $ u n c t i e e ( o n u c l e a z i c a8 C ' 1 C 9

A ! " p o l +

2 $ u n c t i e p o l i m e r a z i c a 8 C ' 1 C 9d " T P m a r c a t i

c a t e n a m a r c a t a

p o z i t i a $ i n a l a a n i c D ' u l u i

D e n a t u r a r e + o b t i n e r e d e " o n d e m a r c a t e

A ! " d * c *


10/20

2. Sinteza de sonde marcate uniform folosind primeri randomizai

M a t r i t a

d e n a t u r a r e

a t a s a r e d e p r i m e r ir a n d o m i z a t i

a d a u g a r e ' A ! " p o l + 2 $ r a g m e n t F l e n o G 9' d " T P 2 u n u l m a r c a t 9

a m p l i $ i c a r e

D e n a t u r a r e + o b t i n e r e d e " o n d e m a r c a t e


11/20

3. Sinteza de sonde A)N prin

transcriere in #itro1 C

1 C

v e c t o r p l a s m i d i a ls a u p h a g e m i d

A ! " h e t e r o l o g c l o n a t i n M @ 4

l i n e a r i z a r e c u e n z i m ed e r e s t r i c t i e c a r e p r o d u cc a p e t e d r e p t e

T 1

T 1

T 7

T 7 1 C

1 C 8 C

8 C

a d a u g a r e &' r " T P 2 u n u l m a r c a t 9' s p e r m i d i n a s a u B 4 A H 2 a m p l i $ i c a t r a n s c r i e r e a d e ' , 8 o r i 9' A # " p o l i m e r a z a $ a g i c a 2 T 1 s a u T 7 9

t r a n s c r i p t A # "

T 1 T 78 C

8 C1 C

1 C

T r a t a r e c u ! " a z a +

m o l e c u l e A # "


12/20

*arcarea capetelor ADN

1. *arcarea capetelor 3+ ale ADN d.c.

@ T T A A P 8 C @ T T A A P 8 C

E c o # +

E P d A T P1

E F l e n o A ! " p o l i m e r a z a

I/n cazul digestiei A!" cu enzime de restric%ie ce produc capete netede, acestea pot $imarcate prin nlocuirea nucleotidei de la capul 1C


13/20

2. *arcarea capetelor 3+ ale ADN m.c.

@ G @ < =1 C

@ G @ < =1 C

G

@ G @ < =1 C

T

@ G @ < =1 C

A

@ G @ < = 1 C@

T e r m i n a lt r a n s $ e r a z a

E M gE E

E @ oE E

d G T P

d A T P

d T T P

d @ T P


14/20

Sisteme de marcare a sondelor moleculare

1. *arcare radioacti#: [32P]sau [35S]

2. *arcare neradioacti#

Imetode directe de marcare neradioacti#: molecula reporter este detectabildirect :i se leag direct de sond, ast$el c hibrizii pot $i vizualiza%i direct) nasemenea situa%ii, moleculele reporter sunt de obicei reprezentate de $luorocromi2e(& analogi ai nucleotidelor cupla%i cu $luorescein9*

Imetode indirecte de marcare neradioacti#& sonda con%ine o molecul reporterintrodus chimic sau enzimatic, care va deveni detectabil prin citochimie dea$initate 2n aceste situa%ii, se $olose:te, $ie biotina cuplat cu avidin sau custreptavidin, $ie digo(igenina cuplat cu anticorpi'antidigo(igenin9*


15/20

ADN microarra.reprezint o tehnologie comple( utilizat n biologiamolecular i medicin pentru a monitoriza simultan nivelul de e(presie a mai multorgene* /n prezent, ADN microarra.are multiple aplica ii&

Is identi$ice gene a cror e(presie se schimb ca rspuns la patogeni sau alte organismeprin compararea e(presiei genei din celuleleJ esuturile in$ectate cu cele din celuleJ esuturi

nein$ectate)Is compare e(presia genelor din pro$ilele tumorale de la pacien ii bolnavi de cancer*

Un microarra> reprezint o colec ie de spoturi microscopice situate pe osupra$a solid* Fiecare spot con ine picomoli de secven e A!" speci$ice, cunoscute sub numele de sonde 2reporteriJoligomeri9* Acestea pot $i secven e genice sau alte elemente

A!" care sunt utilizate pentru a hibridiza cu probe 2numite int9*

*icroarra-


16/20

tape

https&JJ*>outube*comJatchKv=L"sThM"-hM
https://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhMhttps://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM


17/20


18/20

AP/0A 00

P)AT0

Microarra.3 utilizat in studii privind trans$ormarile maligne) testareainciden ei unor marDeri particulari n tumori*

+nvestigarea anomaliilor structurale genomice :i implicit identi$icarea unor gene

ampli$icate sau deletate, cu aplica%ii n&' Patologia neuropsihiatric ce asociaz tulburri cognitive :i de comportament&o Autism*o 4indroame de microdele%ieJmicroduplica%ie*o !izabilit%i intelectuale nencadrabile n sindroame genetice bine de$inite*' "eoplazii hematologice*

latform- utilizat-& Agilent ' un ansamblu de echipamente 2Agilent Bioanal>zer:i vorte( destinat pregtirii cipurilor, microcentri$ugi, cuptor de hibridizare, AgilentMicroarra> @ 4canner ith 4urescan, computere :i programe specializate destinatedes$:urarii e(perimentelor, e(trac%iei :i analizei datelor9 pentru aplica%ii de tipul&hibridizarea genomic comparativ bazata pe microarra> 2a@G9, analiz de e(presiegenic :i studiul modi$icarilor epigenetice la nivel genomic*

Metode de /alidare a rezultatelor$F+4 :i real'time P@# cantitativ

INCD 01ictor Babe23


19/20

0/0)A50

http:$$%%%.bio.davidson.edu$courses$genomics$chip$chip.html

http:$$%%%.ivb.ro$genetica$&irectii'(0de'(0cercetare)v1.pdf

https:$$en.%i*ipedia.org$%i*i$&+,)microarra-

https:$$commons.%i*imedia.org$%i*i$ile:&+,)microarra-.svg

https:$$%%%.-outube.com$%atch/v+s2h3+45h3

assu 2.6 7toica 8.6 9suta* .6 3u at .6 (0016 Genetica microorganismelori inginerie genetic microbian. +ote de curs i laborator6 ditura


20/20

Hibridizare Acizi Nucleici

Documents

Transcript of Hibridizare Acizi Nucleici