ENZIMELE n organismele vii se petrec cu o uimitoare uurin, la temperatura joas i n soluie practic neutr, un numr mare de reacii pe care chimistul nu le poate efectua n laborator dect lucrnd la temperaturi i presiuni ridicate, n prezen de acizi sau de baze tari, de dizolvani neapoi sau de catalizatori heterogeni metalici. Printre aceste reacii se numr att degradri de molecule (hidrolize i oxidri) ct i sinteza de compui cu structur complicat. nelegerea mersului acestor reacii este important, n primul rnd pentru cunoaterea unor fenomene naturale de cea mai mare amploare i rspndire, iar n al doilea rnd pentru interesul practic pe care l prezint. Nu este absurd sperana ca , o dat cunoscut mersul reaciilor din celulele vii, acestea vor putea fi imitate n laborator i n industrie sau chiar dirijate pe ci noi. S-a recunoscut nc de mult c organismele folosesc, pentru realizarea acestor transformri chimice, catalizatori organici, coninui n concentraii mici n celule sau n sucurile secretate de acestea, cum sunt sucurile digestive, laptele, urina etc. S-a dat acestor catalizatori numele de fermeni sau enzime (de la enzyme, literal: "n aluat").

Scurt istoric Reacii enzimatice au fost folosite din timpurile cele mai vechi pentru fabricarea vinului, a oetului, a berii i a brnzei. O cercetare sistematic a lor a fost ntreprins abia n epoca modern. n 1713, Reamur a observat dizolvarea crnii n sucul stomacal al ciorii. De asemenea, fiziologul Spallanzani (1783) a hrnit animale cu buci de carne nvelite n reele de srm i observat dizolvarea crnii in stomac. Stahl, fondatorul teoriei flagisticului, explica fermentaia ca un proces n care una din substanele prezente transmite "micarea sa intern" substanei care fermenteaz (1697). n 1680, van Leeuwenhoeck a observat la microscop celulele drojdiei de bere, dar aceast descoperire nu a fost luat n seam timp de dou secole. Lavoisier (1789) a fcut un bilan de materiale al fermentaiei, artnd c oxigenul, hidrogenul i carbonul din zahr se regsesc n alcoolul i bioxidul de carbon ce iau natere. n cursul sec. al XIX-lea au fost preparate multe extracte de enzime. Astfel, dup ce Kirchoff a observat , n 1820 , c o component glutinoas din bobul de orz ncolit, numit mal, transform cantiti de amidon mult mai mari dect propria sa greutate, ntr-un zahr solubil, maltoza, Dubrunfaut a gsit , n

1

1830, c extractul apos, limpede, de mal are aceeai aciune solubilizant asupra amidonului ca malul nsui. Din acest extract, Payen i Persoz (1833) au izolat, prin precipitarea cu etanol, prima enzim, amilaza (firete foarte impur), sub forma unui material solid alb, amorf, capabil s solubilizeze o cantitate de amidon de 2000 de ori mai mare dect propria sa greutate. n 1830, Robiquet i BoutronChalard au descoperit hidroliza amigdalinei, cu extract de migdale amare, iar n 1837, Liebig i Wohler au izolat enzima respectiv, numind-o emulsin. Printre primele enzime izolate (n stare impur) vom mai meniona: pepsina din sucul gastric (Schwann, 1836); tripsina, din sucul pancreatic (Kuhne, 1848); lipaza (Claude Bernard, 1849); invertaza (Mitscherlich, 1841; Berthelot, 1860); ureaza (Musculus, 1882) etc. Un moment istoric deosebit de important este recunoaterea clar, de ctre Berzelius, n 1835, a caracterului catalitic al reaciilor enzimatice, precum i a rolului esenial pentru viaa animalelor i a plantelor jucat de aceste reacii. n anul 1940, cercettorul american Edward Howell a fcut, n acelai domeniu, o i mai mare descoperire: cercetnd substanele vitale propriu-zise si anume, ENZIMELE, a dovedit c ele sunt purttorii vieii din orice organism viu, fiind deci i materia vie din alimentele noastre (asta atta timp ct nu sunt distruse prin fierbere). Este uimitor cum de tiina nu a preuit corespunztor aceast descoperire extraordinara i cum de nu s-a fcut nici un fel de "publicitate" n favoarea enzimelor, cum fcuse, la vremea lor, pentru vitamine.

Activitatea catalitic a enzimelor Enzimele sunt, precum s-a mai spus, catalizatori organici, produi de celula vie, acionnd asupra anumitor substane numite substraturi. n marea lor majoritate, enzimele catalizeaz reacia unei substane organice cu un compus anorganic liber sau cedat de alt compus organic (ap, acid fosforic, hidrogen, oxigen, etc.). Legile catalizei se aplic firete i la enzime. Enzimele, ca toi catalizatorii, nu catalizeaz dect reacii termodinamic posibile, decurgnd n sensul stabilirii unui echilibru. Reaciile enzimatice prezint ns unele deosebiri caracteristice fa de reaciile catalitice obinuite, omogene sau heterogene. Activitatea enzimelor. Cnd o reacie poate fi catalizat att de o enzim ct i de substane simple (acizi, baze sau ioni metalici) se constat de obicei c reacia enzimatic decurge cu vitez mult mai mare; cu alte cuvinte, reacia enzimatic are o energie de activare mult mai mic. Astfel, s-a stabilit c este necesar o

2

concentraie de ioni de hidrogen de zece milioane de ori mai mare dect de invertaz pentru a hidroliza o anumit cantitate de zaharoz, ntr-un timp dat, la 370C. Temperatura optim a reaciilor enzimatice. Viteza reaciilor enzimatice crete, ca a celor mai multe reacii, ntre molecule covalente, cu temperatura, potrivit cunoscutei reguli a lui Van't Hoff, i anume o urcare a temperaturii cu 10 0C, produce o cretere a vitezei de reacie cu un coeficient 1,5-3. Creterea acesta se observ ns numai la temperaturi relativ joase. O dat depit o anumit temperatur optim, la care viteza este maxim, aceasta scade, iar la temperaturi mai nalte, reacia nceteaz. Fenomenul se explic prin faptul, semnalat mai sus, c la temperaturi mai nalte enzimele sunt inactivate prin denaturarea componentei proteice. Cele mai multe enzime devin complet inactive ntre 50-800C. Temperatura optim nu poate fi ns exact definit, cci ea variaz n limite largi, cu concentraia enzimei, cu concentraia ionilor de hidrogen i cu prezena diferitelor impuriti ale preparatului enzimatic sau ale substratului. Influena pH-ului. Dup cum a artat Sorensen (1909), activitatea enzimelor depinde ntr-o foarte mare msur de concentraia ionilor de hidrogen din soluie (sau mai corect de activitatea termodinamic a ionilor de hidrogen, adic de pH-ul soluiei). Curbele reprezentnd variaia vitezei de reacie cu pH-ul prezint de obicei un maxim pronunat la un anumit pH, n timp ce la valori ale pH-ului diferind cu 1 fa de acest maxim, viteza de reacie prezint valori considerabil mai mici. Din cauza acestei particulariti, este necesar ca n cursul reaciilor enzimatice s se menin pH-ul optim constant, prin folosirea de tampon. Specificitatea enzimelor. O anumit enzim catalizeaz numai un numr mic de reacii i de multe ori o singur reacie, spre deosebire de catalizatorii obinuii anorganici (acizi, baze, catalizatori de hidrogenare etc.) care activeaz practic toate reaciile posibile de un anumit tip. Se disting multe tipuri i grade de specificitate n aciunea enzimelor. n primul rnd trebuie menionat specificitatea stereochimic, care const n aceea c o enzim care catalizeaz reacia unui compus optic activ este fr aciune asupra enantiomerului sau i n general, asupra izomerilor sterici ai acestui compus, supui acelori condiii. Vom mai aminti aici dehidrogenaza lactic din muchi, o enzim care lucreaz n colaborare cu DPN, i care dehidrogeneaz acidul L-lactic la acid piruvic i hidrogeneaz acidul piruvic numai la acid L-lactic, fiind inactiv fa de acidul D-lactic. Din alt punct de vedere se disting ntre o aa-numit specificitate de reacie i o specificitate de substrat a enzimelor. Prima se refer la reactantul anorganic care ia parte la reacie: apa n reaciile de

3

hidroliz, acidul fosforic n reaciile cu fosforoliz, hidrogenul n reaciile catalizate de dehidrogenaze, etc.

Clasificarea enzimelor Se cunosc n prezent cteva sute de enzime dar, avnd n vedere complexitatea proceselor chimice care au loc n organismele vii, nr. enzimelor aprut n natur trebuie s fie mult mai mare. Structura enzimelor este prea puin cunoscut pentru a putea servi ca baz a unei clasificri, de aceea enzimele se clasific dup tipul reaciilor pe care le provoac sau dup substraturile asupra crora acioneaz. Numele enzimelor se formeaz adugndu-se sufixul - az la nr. reaciilor provocate sau substraturilor lor; excepie fac numele istorice al unor enzime cum ar fi emulsina, pepsina, zimaza, etc. n clasificarea adoptat aici, enzimele sunt mprite n cinci clase principale, fiecare divizat n mai multe subclase (dup Hoffmann Ostenhof 1953): 1.Hidrolaze 2.Transferaze 3.Oxido - reductaze 4.Liaze i sintetaze 5.Izomeraze si racemaze La drept vorbind aproape toate reaciile enzimatice sunt reacii de transfer al unor grupe de atomi de la un donor la un acceptor. Astfel hidrolizele sunt reacii de transfer al unor grupe acil, glicozil etc. cedate de substrat ctre ap ca acceptor iar reaciile de oxido-reducere sunt reacii de transfer de hidrogen sau electroni; termenul de transferare se folosete ns n nomenclatura curent mai ales pentru transaminri, transmetilri, transacetilri. Dup o clasificare mai nou (Union of Biochemistry Commission of Enzymes 1961) enzimele sunt mprite n ase clase: 1.oxido-reductaze 2.tranferaze 3.hidrolaze 4.liaze 5.izomeraze 6.ligaze (sintetaze)

4

fiecare divizat la rndul ei n mai multe subclase, fiecare enzim fiind desemnata din patru cifre; ex: 1111(hidrogenaza alcoolului) este o oxido - reductoz (clasa 1), acioneaz asupra grupei CHOH a donorului (subclasa 1) cu DPN sau TPN ca acceptor (subsubclasa 1) i este primul termen din aceast ultim subdiviziune. Deviza enzimelor: a face i a desface continuu substane

Enzimele sunt catalizatori biochimici, specifici vieii, care asigur desfurarea proceselor metabolice (catabolism i anabolism). Sunt solubile, macromoleculare, de natur organic, termolabile, produse de organismul viu, iar activitatea lor specific fa de o anumit substan sau un anumit tip de substane sau substrat i sunt dependente de anumite condiii de mediu: pH, temperatur, prezena unor activatori etc. Enzimele pot fi activatoare sau inhibitoare pentru un anumit proces metabolic, dup cum pot fi i degradatoare ale unor substane (enzime amilolitice, glicolitice, proteolitice etc.), fie n mediul extracelular (exoenzime) cum sunt cele utilizate n industria fermentativ (pepsina, tripsina etc.). Fabricarea enzimelor este dificil i foarte scump, stabilitatea lor este slab i pot fi utilizate o singur dat. Aceste trsturi preau greu de nvins. Cercetrile efectuate de microbiologi i ingineri biotehnologi, au dus la nelegerea faptului c enzimele pot constitui instrumente cu posibiliti deosebite. S-a stabilit c enzimele pot fi produse natural, de diverse microorganisme, de exemplu, de ctre levuri (drojdii. Apoi, pentru o folosire rentabil la scar industrial, dup extragere i purificare, enzimele sunt fixate, fie prin formarea unei legturi chimice ntre unele substraturi naturale (celuloza, agaroza), sintetice (polistiren, poliacrilonitric) sau minerale (argila, sticla poroasa), fie prin adsorbie simpl sau prin includerea n microcapsule cu perei semipermeabili. Stabilizarea i utilizarea continu n reactoare cu substrat fluidizat se poate realiza i prin fixarea enzimelor pe particule magnetice. Fixate astfel, enzimele pot fi reciclate deoarece ele se prezint sub form solid i nu lichid. n timp ce n stare lichid enzimele se denatureaz n 24 ore, n urma fixrii pot funciona cteva luni, fapt care face ca preul de cost s scad sensibil. Dup fixare, enzimele mpreun cu suporii, se introduc n bioreactori de diverse dimensiuni (chiar de zeci de mii de tone)1. Asemenea bioreactori au nceput s produc. De exemplu, n reactori enzimatici se produce lactoza din lactoser (partea lichid care rmne din lapte dup ndeprtarea coagulului format sub aciunea fermenilor; conine albumina i globulinele din lapte, precum i cea mai mare parte din lactoz i sruri minerale; lactoza este un dizaharid compus dintr-o molecul de glucoz i una de galactoz, deci lactoza poate fi utilizat pentru producerea glucozei i galactozei (izomer al glucozei), precum i fructoza din glucoz (transformarea n fructoz intensific dulceaa). n reactorii n care au fost introduse dou tipuri de molecule (reactori bimoleculari): amoniac i acid fumaric, enzima imobilizat, aspartaza, a catalizat acidul aspartic. Reactorii n care sunt introduse enzime cu aciune

5

secvenial asigur transformri chimice profunde ale moleculelor substratului conducnd la sinteza dirijat a unor molecule noi, specifice. Imobilizarea enzimelor pe supori insolubili i folosirea acestora n bioreactori, n flux continuu, este n curs s devina o tehnologie larg utilizat n domeniile alimetar i farmaceutic. Aceasta va avea implicaii economice i social-politice dintre cele mai importante, deoarece procedeele enzimatice pot fi competitive sau complementare proceselor chimice clasice (industriei fermentrii). De exemplu, n S.U.A., transformarea amidonului porumbului de ctre glucoamilaze n glucoz - fructoz se realizeaz de acum n staie pilot (amidonul este hidrolizat de -amilaz n dextrine i apoi n maltoz, maltotrioz i glucoz, iar -amilaza elibereaz glucoz i maltoz). Moleculele separate de glucoz n prezena unei glicoizomeraze sunt apoi transformate n fructoz, sub forma unui sirop (cu un coninut ridicat n fructoz) cu o putere de ndulcire superioar zaharozei (care este fomat dintr-o glucoz i fructoz). Acest suc dulce este foarte potrivit n industriile alimentare, n special n fabricarea buturilor rcoritoare (inclusiv Coca-Cola). n prezent, unele cercetri de inginerie genetic ntreprinse de societatea californian Cetus au drept obiectiv gsirea unei biotehnologii de solidificare a siropului prin cristalizarea fructozei. Prin generalizarea acestui procedeu, n 1990, S.U.A. a asigurat o jumtate din consumul intern de zahr, eliberndu-se de necesitatea importului acestui produs. n anii 70, SUA producea anual aproape 3 milioane de tone de zahr din porumb. (n SUA, valoarea total a utilizrii industriale a enzimelor ca valoare adugat, n 1975, s-a ridicat la aproape 500 milioane dolari). S-a menionat c o celul bacterian sintetizeaz circa 2000 enzime, care, de altfel, sunt prezente n orice celul vie. Dar, numrul celor cunoscute este mult mai mic, iar al celor folosite industrial este extrem de redus. Astfel, numrul enzimelor industriale (cu o cifr de afaceri de 200 milioane dolari/an n SUA) atinge doar cifra 10. Dintre acestea, 4 grupe de enzime reprezint 80% din comer i anume: amilazele ( i - amilaza, de origine bacterian; hidrolizeaz polizaharidele - glucoza, maltoza), amiloglucozidazele (origine fungic; hidrolizeaz total amidonul, dextrinele - glucoz, bere, alcool), proteazele (papaina, bromelaina de origine vegetal; tripsina, pepsina, cheagul de origine animal sau fungic, proteaze bacteriene i fungice; hidrolizeaz peptide, amide sau esteri, casein, proteine - peptide sau aminoacizi; limpezirea berii; producerea pinii, produselor de cofetrie, brnzeturilor, medicamentelor) i glucoizomereazele (origine fungic; izomerizarea glucozei n fructoz i producerea siropului cu continut ridicat n fructoz). La aceste enzime, larg folosite, se adaug: pectinaza (origine fungic; fructe - suc de fructe, vin), celulaze (origine fungic; hidrolizeaz biomasa, celuloza - glucoza, alcool), lipaze (origine fungic; hidrolizeaz gliceride - acizi grai, gliceroli), invertaza (levuri; hidrolizeaza zaharoza - glucoza i fructoza - zahr invertit), lactaza ( levuri, fungi; hidrolizeaz lactoza -glucoza, galactoza - siropuri) i pancreatina (extras din pancreas; acioneaz ca o proteaz + o amilaz + o lipaz, reunite; hidrolizeaz legturi peptidice, polizaharidice i gliceridice - glucoz, aminoacizi, acizi grai etc.; utilizri n industria farmaceutic). O ultim enzim, dar cu un mare viitor este amino acilaza, care asigur producerea - aminoacizilor.

6

Pe scurt despre aminoacizi: sunt substane organice din a cror polimerizare rezult proteinele. n structura aminoacizilor intr una sau cteva grupri carboxilice ( -COOH) i una sau cteva grupri aminice (-NH2). Sunt sintetizai de celule pe seama hexozelor, pentozelor sau acizilor cetonici. Unii aminoacizi sunt eseniali pentru organismul animal. Prezena acestora n alimente este indispensabil deoarece organismul nu i sintetizeaz. Asa sunt: lizina, triptofanul, cistina + metionina, histidina, fenilalanina, treonina, leucina + izoleucina, valina. Lizina este aadar un aminoacid esenial, iar n cereale aproape c lipsete (n porumbul obinuit) sau este prezent n cantiti mici (la gru 2,8 g/100g protein). Spre deosebire, o leguminoas, soia are circa 7% protein n bob, iar oul de gin 6,97 g/100 g protein. (Necesarul n 24 de ore al unui om este de 4,2 g/100 g proteine). Din aceast cauz furajarea animalelor impune completarea raiilor cu leguminoase boabe, mai ales cu soia. Este adevrat c lizina poate fi fabricat i prin sintez chimic, dar aceasta nu poate fi utilizat pentru mbogirea cerealelor i alimentaie. Cauza? Sinteza chimic produce un amestec, n pri egale, din doi izomeri optici: L-lizina i D-lizina. Organismul animal asimileaz ns numai L-lizina (levogira), iar cellalt izomer nu. Mai mult D-lizina la o doz mare devine toxic pentru organism. Aceast situaie i inexistena unui procedeu chimic pentru separarea celor dou lizine la scar industrial a fcut ca sinteza chimic a lizinei s nu aib efectele economice scontate. Impasul a fost nlturat prin procedee enzimatice. Astfel, potrivit procedeului pus la punct de INSA, n Frana, ntr-un bioreactor lizina sintetic a fost combinat cu un reactiv X, asupra cruia a acionat o enzim imobilizat. Enzima taie selectiv legtura stabilit ntre L -lizin i reactivul X, dar las neschimbat compusul D - lizin - X. Apoi L - lizina este extras din reactor, n timp ce compusul D - lizin - X este supus cldurii pentru ramificare, n vederea reciclrii. n acest mod D - lizina neutralizabil este transformat n L - lizin. n Europa, singurul productor de lizin este societatea Eurolizina, instalat la Amiens, Frana, care lucreaz dup un brevet japonez. Societatea produce 7500 tone lizin pe an (n perspectiv 11.000 tone). Dup un procedeu similar celui folosit n producerea lizinei, n Japonia se produce L -metionina (levogira), cte 20 tone n fiecare lun Au fost prezentate anterior doar enzimele catalizatoare ale reaciilor de degradare (hidrolazele) care permit utilizarea glucidelor, proteinelor, lipidelor n alimentaie, n medicin, etc. De asemenea, s-a vorbit despre izomeraze care catalizeaz rearanjri n snul moleculei substratului (de exemplu, n glucoz - C6H12O6, aldohexoza, n fructoz - C6H12O6, cetoglucoza), prin oxidoreducere, transferuri intramoleculare .a. Exist ns i enzime care catalizeaz oxidoreducerea - oxidoreductazele (transfera electroni de la un donor la un acceptor), altele care catalizeaz transferul unui grup chimic dintr-o molecul n alta - transferaze, liaze i ligaze. Aceste enzime sunt nc puin folosite, importana lor este ns deosebit dac ne gndim c ele pot cataliza oxidarea, dar mai ales reaciile de sintez a noi molecule plecnd de la molecule mai simple.

7

Ingineria enzimatic exploreaz orizonturi noi n diverse direcii i, ca urmare, a obinut realizri remarcabile n domeniile menionate deja: farmaceutic, alimentaie, chimie. Utilizarea enzimelor este ncurajatoare n activiatatea de reducere a reziduurilor si poluanilor chimici din mediu (apa) i din produsele alimentare. Un rol major l vor avea ns enzimele n energetic: prin tratarea biomasei cu celulaze, amilaze, amiloglucozidaze se realizeaz hidroliza celulozei, polizaharidelor, amidonului i dextrinei n glucoz - alcool etilic - energie, dup cum prin asocierea fotosistemelor vegetale cu hidrogenaza bacterian se poate obine hidrogen - energie. BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE Biotehnologia alimentar se refer la prelucrarea industrial a diferitelor materii prime cu ajutorul microorganismelor i enzimelor proprii sau a unor ageni biologici (microorganime, enzime) adugai n scopul realizrii unor produse sau a ameliorrii unor procese tehnologice. Rolul biotehnologiei este covritor n industria alimentar. n fapt, industria alimentar este o biotehnologie, deoarece materiile prime agroalimentare sunt produse biologice i prin urmare conservarea lor pn la consum, n stare proaspt (cazul fructelor i legumelor) sau pn la industrializare (cazul tuturor produselor agroalimentare) implic controlul activitii enzimatice proprii esuturilor vegetale i animale sau a celor elaborate de microflora de contaminare. Enzimele proprii esuturilor vegetale i animale sunt eseniale n transformrile pe care le ofer produsele agroalimentare: maturarea fructelor i legumelor, cerealelor i finurilor sau diferitelor produse alimentare pe baz de cereale germinate, maturarea brnzeturilor, maturarea crnii. Enzimele pot avea ns i rol deteriorativ cu implicaii n modificarea caracteristicilor senzoriale i valorii nutritive a materiilor prime agroalimentare pn la prelucrarea termic a acestora. De asemenea, rolul microorganismelor este hotrtor, unele dintre ele avnd aciune duntoare, altele avnd rol esenial n obinerea unor produse alimentare datorit aciunii lor fermentative: produse lactate acide, brnzeturi, bere, vin, spirt, pine, salamuri crude, alimente fermentate din cereale i leguminoase. Microorganismele intervin i n fermentarea unor produse vegetale: varza, murturi, msline, castravei, cacao, etc. Biotehnologiile n industria alimentar s-au dezvoltat impresionant prin folosirea enzimelor exogene (industria laptelui, berii, spirtului, amidonului, crnii, sucurilor de fructe, zahrului, panificaiei, etc.) i a culturilor starter (industria berii, laptelui, crnii, panificaiei, etc.) La toate acestea trebuie s avem n vedere obinerea de metabolii secundari (alcool etilic, aceton, acizi organici, aminoacizi, etc.) prin folosirea de microorganisme precum i de biomas alimentar i furajer, etc.

8

Cu ajutorul enzimelor microorganismelor se pot accelera procesele biochimice, se pot perfeciona procesele de producie, se poate mbunti calitatea produselor alimentare i se poate mri gradul de diversificare a produciei alimentare.

1.3. CULTURI STARTER DE MICROORGANISME

Microorganismele sunt utilizate n industria alimentar pentru:

- Obinerea de celule (culturi starter = culturi pure) care la rndul lor sunt folosite pentru fermentareaproduselor lactate acide sau brnzeturi, la fabricarea produselor de carne (salamuri crude uscate), produse tradiionale vegetale, produse lactate acide, pine etc. n acest produsele se consum fie mpreun cu celulele respective fie dup ndeprtarea celulelor cum este cazul buturilor de tipul berii, vinului.

- Obinerea de biomas care poate fi utilizat ca ingredient de fermentare (drojdia de panificaie) sau dembogire a unor produse alimentare cu proteine, respectiv ca furaje proteice pentru psri, pete, porcine. n ceea ce privete metodele de cultivare ale microorganismelor se folosesc metode periodice (discontinui) i metode continui, n ambele cazuri fiind necesar optimizarea procesului. Metoda periodic de cultivare a microorganismelor prevede alimentarea continu a aparatului de cultivare cu substane nutritive i nlturarea culturii de microorganisme. n acest fel, se creeaz condiii optime de acumulare a cantitii necesare de biomas sau a metaboliilor. La cultivarea periodic concentraia substanelor nutritive scade, iar cea a celulelor i metaboliilor crete, fapt care conduce la modificarea cineticii creterii microorganismelor. La metoda periodic trebuie s avem n vedere dou situaii i anume: - cnd substratul este inhibitor pentru producia de biomas i metabolii; - cnd produsul este inhibitor. Prima situaie se ntlnete la obinerea biomasei de drojdie de panificaie, represiunea catabolic de ctre glucide antreneaz i o producie de alcool etilic, producie ce trebuie evitat prin dou soluii i anume: evitarea excesului de substrat i lucru cu cultura n pat i respectiv plasarea unui detector de alcool n efluentul de gaz (CO2) care permite s se cunoasc ce aport de substrat trebuie furnizat. A doua situaie se ntlnete la producia de culturi lactice a cror dezvoltare este nsoit de acumularea de acid lactic (bacterii lactice homofermentative) sau acid lactic i acetic (bacterii lactice heterofermentative).

9

Soluia care se impune n acest caz este o dializ a culturii sau centrifugarea substratului cu celule, celulele fiind apoi reciclate. Dac dezvoltarea culturii are loc fr acumularea de metabolii, alimentarea cu substrat se poate face la un debit constant, dar la o concentraie cresctoare a acestuia, respectiv la o concentraie constant a substratului dar la un debit programat exponenial. Metoda continu, n care caz are loc alimentarea constant a aparatului de cultivare a microorganismelor cu substane nutritive i eliminarea nentrerupt a biomasei sau metaboliilor. Aceast metod poate fi realizat prin cultivarea de suprafa sau de adncime a microorganismelor. La fermentarea continu se are n vedere natura catalizatorului (imobilizat sau nu; sistem eterogen sau nu; celule incluse, adsorbite, grefate prin covalen); gradul de reciclare al celulelor microbiene; gradul de amestecare a fluidelor n reactorul cu funcionare continu. Creterea concentraiei de celule se poate realiza prin: folosirea tehnicilor de membran sau centrifugarea; folosirea de celule imobilizate; reciclarea celulelor.

1.3.1. Microorganisme utilizate n industria alimentar

BACTERIILE utilizate n industria alimentar aparin urmtoarelor genuri:

Genul Streptococcus Acest gen cuprinde specii de bacterii sub form de coci sferici sau ovali cu < 2 , grupate n diplo sau form de lanuri. Sunt Gram pozitive, facultativ anaerobe, neciliate, nesporulate, unele specii fiind capsulate. Importani pentru industria alimentar sunt: Streptococii mezofili : Streptococcus lactis (Lactococcus lactis subsp. lactis), Str. cremoris (Lactococcus lactis subsp. cremoris), Str. diacetilactis (Lactococcus lactis subsp. diacetilactis); Streptococii termofili: Str. thermophilus. Aceti streptococi lactici sunt homofermentativi, produc acid lactic L(+) i prezint urmtoarele activiti: - activitate fermentativ: fermenteaz lactoza i glucoza; - activitate proteolitic; - produc diacetil i acetoin din acid citric (n principal Str. diacetilactis). Fermentarea lactozei de ctre streptococii lactici se face prin transformarea iniial a acesteia n glucoz i galactoz 6P prin intermediul fosfo- -galactozidazei. n continuare, glucoza este apoi fermentat pe

10

calea hexozo difosfatului n acid lactic, iar galactoza - 6P este utilizat pe calea tagatozei n vederea producerii unei cantiti suplimentare de acid lactic (fig. 1.11.).

Figura 1.11. Calea tagatozei de degradare a lactozei de ctre streptococii lactici Fermentarea glucozei de ctre streptococii lactici poate fi fcut pe cale homofermentativ cu producerea n principal de acid lactic i pe cale heterofermentativ, n condiile n care glucoza este limitat, calea heterofermentativ fiind calea ribulozei 5P cu formare de acid acetic, etanol i acid lactic (fig. 1.12.).

Figura 1.12. Calea homo i heterofermentativ de degradare a glucozei de ctre bacteriile lactice Fermentarea acidului citric cu formare de diacetil, acetoin i 2,3 butilenglicol este artat n figura 1.13. Acelai mecanism l folosesc i leuconostocii.

11

Figura 1.13. Transformarea citratului de ctre Str. lactis subsp. diacetilactis i Leuconostoc

Genul Leuconostoc Acest gen cuprinde bacterii cu form sferic, lenticular, grupate n perechi sau lanuri, imobile, asporogene, Gram negative, facultativ anaerobe. Pentru dezvoltare, leuconostocii au nevoie de vitamine (acid nicotinic, tiamin, biotin) i zaharuri fermentescibile. Nu sunt proteolitici i nu reduc azotaii. Specii de Leuconostoc formeaz polimeri (dextran). Se dezvolt bine la 20 - 30C. Genul Leuconostoc cuprinde speciile: Leuconostoc cremoris (citrovorum); Leuconostoc lactis; Leuconostoc dextranicum; Leuconostoc mezenteroides. Aceste specii sunt heterofermentative i se dezvolt greu n laptele fr adaos de stimulatori. n produsele lactate, leuconostocii au dou funcii de baz: - produc compui de arom (diacetil, acetoin); - produc ochiuri de fermentare prin formare de CO2 n unele tipuri de brnzeturi (Edam, Goude, Tilsit). Ambele funcii sunt realizate prin metabolismul citratului, dar leuconostocii produc CO2 i din lactoz. Leuconostocii intervin deci n metabolismul glucidelor i al citratului. Metabolismul glucidelor Fermentarea glucidelor de ctre leuconostoci se face pe calea

fosfocetohexozelor, dintr-un mol de hexoz regenerndu-se cte un mol de ATP. Genele care codific

12

etapele iniiale ale fermentrii lactozei (ca de altfel i ale metabolizrii citratului, producerii de proteaze) sunt localizate n plasmide. Metabolismul citratului Metabolismul citratului de ctre leuconostoci este acelai ca i la streptococi cu meniunea c leuconostocii produc diacetil i acetoin la pH sczut. Acetoina se poate forma pe dou ci: - prin decarboxilarea acetolactatului; - din diacetil prin intermediul diacetil reductazei, ntr-o reacie care necesit NADH sau NADPH. Aceast ultim cale este redus sau chiar lipsete n cazul lui Str. diacetilactis, din cauza capacitii limitate a acestuia de a produce acetil - CoA, unul din precursorii diacetilului.

Leuconostocii (ca de altfel i lactobacilii) pot produce la unele brnzeturi unele defecte i anume: - crparea pastei la brnza Cheddar ( defect numit Blit opennes);

- apariia timpurie de gaze la brnza Goude (Str. diacetilactis poate produce i el defectul de plutire acoagulului, la brnza Cottage). Aceste defecte se datoreaz formrii de CO2. Pentru a se preveni defectul de plutire a coagulului, brnza Cottage se fabric cu o cultur care nu conine Str. diacetilactis, adugndu-se apoi n brnza obinut o cultur de Leuconostoc citrovorum cultivat pe lapte cu adaos de citrat sau o cultur concentrat de Leuconostoc citrovorum. n afar de industria laptelui, leuconostocii se utilizeaz i pentru: - fermentarea unor produse vegetale (varz, castravei, msline) intervenind n cadrul microflorei spontane sau sub form de culturi concentrate; - fermentarea malolactic a vinurilor; - producia de dextran. n industria laptelui se folosesc culturi lactice care conin streptococi acidifiani (Str. lactis i Str. cremoris), precum i bacterii productoare de arom i unele specii de Leuconostoc i Str. diacetilactis, ultimul fiind aromatizant i acidifiant. Genul Pediococcus. Acest gen aparine familiei Streptococaceae i cuprinde bacterii sub form de coci perechi sau tetrade. Metabolismul acestor bacterii este predominant fermentativ, homolactic. Se produce acid lactic racemic (DL) din glucoz, fructoz, manoz. Sorbitolul i amidonul nu sunt fermentai. Multe specii sunt catalaz-negative, dar se ntlnesc i specii care au activitate catalazic independent de hem.

Principalele criterii de difereniere ntre diferitele specii de pediococi sunt menionate n tabelul 3.8:

13

Culturi starter P. pentosaceus P. acidilacti P. pentosaceus P. pentosaceus

Temperatura de incubare, C 26,7 26,7 29,4 29,4

Durata, ore 20 38 13 28

pH-ul 5,00 5,65 5,00 5,40

P. acidilacti, n culturi starter, este utilizat pentru obinerea de produse din carne fermentate la temperaturi mai ridicate, deoarece are o dezvoltare bun la 42-52C, producnd rapid acidul lactic i deci scade efectiv pH-ul, produsul obinut avnd gust acrior. Atunci cnd se utilizeaz la fermentarea unor produse de carne la temperatura de 16-27C, producia de acid lactic este mai lent i implicit se pot dezvolta i microorganismele care contamineaz carnea, durata de fermentaie fiind mai mare. P. pentosaceus produce o fermentaie rapid cnd substratul conine un glucid fermentescibil, temperatura de fermentare fiind cuprins ntre 15-27C. Din tabelul de mai sus rezult c P. pentosaceus este mai eficace n ceea ce privete producia de acid lactic att la 26,7C ct i 29,4C n comparaie cu P. acidilactici. Avnd n vedere c pediococii produc acid lactic i bacteriocine, ei exercit o aciune inhibitoare fa de microorganismele patogene i cele de alterare (stafilocici, salmonele, Cl. botulinum, bacili, enterobacterii gram negative, drojdii). n produsele de carne fermentate, pediococii pot scade pH-ul de la 5,6 la 4,5-5,2 ceea ce face ca proteinele s fie aduse aproape de punctul izoelectric fapt ce favorizeaz sinereza i deci uscarea produsului. Acidul lactic produs contribuie la denaturarea proteinelor din carne ceea ce contribuie la realizarea unei texturi ferme a produsului finit. Genul Lactobacillus. Acest gen aparine familiei Lactobacillaceae. Aceast familie cuprinde bacterii sub form de bastonae de lungimi i grosimi variabile, precum i cocobacili scuri, aezai obinuit n lanuri n faza de nmulire logaritmic. Sunt asporogene, imobile, Gram pozitive, anaerobe sau facultativ anaerobe. n general sunt catalaz -negative citocrom-oxidaz - negative, nu reduc azotaii, nu lichefiaz gelatina. Au activitate proteolitic i lipolitic redus. Glucidele cele mai bine fermentate sunt: lactoza, maltoza, zaharoza (mai ales n faza de dezvoltare), apoi hexozele (glucoza, fructoza, galactoza).

14

Pentru dezvoltare necesit substane minerale i toate vitaminele din grupul B. Se dezvolt bine n mediu cu pH 5,5-5,8, dar i la pH 5. Se pot dezvolta n limite largi de temperatur (5-53C), dar temperatura optim este cuprins ntre 30 i 45C. n funcie de temperatura optim de dezvoltare lactobacilii pot fi:

- termofili: L. lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, temperatura optim fiind 37 - 45C; - mezofili: L. casei, L. plantarum, L. brevis etc.; temperatura optim de dezvoltare fiind 26 - 30C.

Orla Jensen a mprit genul Lactobacillus n urmtoarele grupe:

1. grupa Thermobacterium care cuprinde lactobacili homofermentativi termofili: L. lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, L. delbrueckii; L. leichmanii; 2. grupa Streptobacterium - care cuprinde lactobacilii homofermentativi mezofili: L. casei, L, plantarum; 3. grupa: Betabacterium - care cuprinde lactobacili heterofermentativi, ce contamineaz frecvent brnzeturile: L fermenti, L. buchneri, L. brevis, L. viridiscens.

Streptobacteriile la rndul lor, au fost clasificate de ctre unii autori n neacidorezistente i acidorezistente. Lactobacilii neacidorezisteni produc compui aromatici (diacetil, acetoin). Se prezint sub form de bastonae de lungimi variabile i rar formeaz lanuri . Se pot dezvolta la 2 - 15C. Nu se dezvolt la pH < 5,6. Se utilizeaz n culturi starter la fermentarea salamurilor crude cu pH = 5,6 - 6,1, produsele avnd o durat mare de maturare, iar gustul final fiind slab acrior dulceag. Lactobacilii acidorezisteni au form de bastonae scurte care formeaz lanuri. Se dezvolt bine la pH 5,0. Activitatea metabolic a lactobacililor n produsele alimentare fermentate se refer la metabolismul lactozei, galactozei i glucozei. Zaharoza este fermentat numai dup hidroliza acesteia n glucoz i fructoz. Metabolismul lactozei Pentru a se dezvolta n lapte, lactobacilii homofermentativi hidrolizeaz lactoza cu ajutorul -galactozidazei i/sau - D - fosfogalactozid - galactohidrolazei, aa cum arat n schema din figura 1.14.

15

Figura 1.14. Transformarea lactozei n glucoz i galactoz respectiv glucoza i galactoza 6P de ctre lactobacilii homofermentativi

- D - galactozid - galactohidrolaza este utilizat de Lb. casei iar - galactozidaza este utilizat de majoritatea lactob dei acetia din urm au i activitate - D - fosfogalactozid - galactohidrolazic, ns mai redus. L. bulgaricus are -galactozidaz activ la pH = 7,0 i este activat de Mg2+, Mn2+ i Fe2+. n cele mai multe cazuri, lactobacilii folosesc mai mult glucoza ca surs de energie n comparaie cu lactoza i galactoza. Unii lactobacili elibereaz n mediu galactoz care se acumuleaz. Metabolismul hexozelor Dup hidroliza lactozei n celulele lactobacililor homofermentativi, hexozele rezultate sunt metabolizate pe calea Embden - Meyerhof. Lactobacilii heterofermentativi fermenteaz hexozele pe calea hexozomonofosfatului, aceti lactobacili neavnd aldolaz i triozofosfat izomeraz care sunt enzime cheie n calea Embden - Meyerhof. Aceasta este de fapt i diferena dintre cele dou grupe de microorganisme, adic lactobacilii homofermentativi posed att aldolaz ct i triozofosfatizomeraz, n timp ce lactobacilii heterofermentativi nu posed aceste enzime. Galactoza, rezultat din lactoz, pentru a fi fermentat trebuie mai nti s fie transformat ntr-un derivat fosforilat al glucozei (glucozo-6P), care apoi sufer transformri pe calea Embden - Meyerhof (fig. 1.15.).

16

Figura 1.15. Transformarea galactozei n glucoz-6P de ctre lactobacili

Activitatea proteolitic. Activitatea proteolitic a lactobacililor contribuie att la textura ct i la aroma unor produse alimentare (produse lactate, produse vegetale fermentate, produse din carne fermentate etc.), dar i la eliberarea unor aminoacizi care stimuleaz creterea i activitatea altor bacterii lactice folosite n culturile starter n amestec cu lactobacilii. Se consider c activitatea endoproteinazic a lactobacililor este asociat cu membrana celulelor, iar activitatea exopeptidazic este localizat intracelular. Enzimele din membrana celulelor produc hidroliza parial a macromoleculelor proteice, din care se formeaz peptide suficient de mici pentru a fi transportate n interiorul celulelor unde se continu degradarea lor pn la aminoacizi, necesari creterii (figura 1.16.). Activitatea proteolitic a lactobacililor este optim la pH 5,2 - 5,8 i temperatura de 45 - 50C. La temperaturi mai mari de 55C activitatea proteolitic este mult redus datorit termodenaturrii enzimei iar la 70C/1min enzimele sunt complet inactivate. n cazul laptelui, proteinazele extracelulare ale L. bulgaricus sunt active fa de -cazein, apoi n ordine descresctoare i fa de i cazein.

Figura 1.16. Aciunea endoproteinazelor extracelulare i a exopetidazelor intracelulare n cazul lactobacililor

Producerea de compui de arom i H2O2 Principala contribuie a lactobacililor este producia de acid lactic. n cazul produselor lactate acide, dei speciile de lactobacili implicate sunt homofermentative, acestea ns produc i ali metabolii, printre care produi volatili ca: acetaldehida, diacetil i alcool. In cantitate mai mare fiind produs acetaldehida. n plus, L. casei produce diacetil din citrat, mai ales atunci cnd laptele se suplimenteaz cu citrat (L. casei nu este ns un productor major de diacetil). Anumii lactobacili produc H2O2 care se acumuleaz n mediul i jeneaz dezvoltarea altora. Acumularea H2O2 n mediul de cultur este posibil pentru ca lactobacilii sunt catalaz negativi. Incapacitatea lactobacililor

17

de a distruge metabolic H2O2 explic de ce acetia nu se dezvolt bine n condiii puternic aerobe, oxigenul fiind toxic pentru lactobacili care nu posed superoxiddismutaz, enzim care se constituie ca un sistem de protecie fa de toxicitatea oxigenului, cum este cazul altor bacterii. Aciunea lactobacililor este mbuntit prin interaciuni cu alte bacterii lactice. De exemplu, cultura mixt format din L. bulgaricus i Str. thermophilus este adecvat pentru fabricarea iaurtului, deoarece cultura mixt produce mai rapid acid lactic. Interaciunea dintre cele dou bacterii lactice este benefic din urmtoarele motive:- L.

bulgaricus produce aminoacizi liberi, n particular histidin, care stimuleaz producia de acid lactic

a lui Str. thermophilus;- Str. - Str.

thermophilus, pe de alt parte, produce acid formic, care stimuleaz activitatea lui L. bulgaricus; thermophilus, dei produce o cantitate suficient i de CO2 care stimuleaz dezvoltarea lui L.

bulgaricus, totui dezvoltarea acestuia este mai redus, deoarece Str. thermophilus utilizeaz mai rapid anumite substane nutritive eseniale pentru dezvoltarea lui L. bulgaricus. n plus, lactobacilii, n general, sunt sensibili chiar la niveluri foarte reduse de antibiotice, n comparaie cu Str. thermophilus ( de aici i necesitatea ca laptele s nu conin urme de antibiotice). Utilizarea culturilor de lactobacili:

n industria laptelui se utilizeaz Lactobacillus lactis i Lactobacillus bulgaricus, singuri sau n

amestec la fabricarea iaurtului, chefirului, cumsului, brnzei Ementhal, brnzeturilor italiene. Lactobacillus helveticus este i el implicat n unele din aceste produse. Lactobacillus acidophilus este folosit la fabricarea laptelui acidofil, laptelui acidofil nefermentat i a altor produse acidofile. Lactobacillus casei se utilizeaz pentru obinerea produsului yakult.

n industria crnii intereseaz Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus i n special

Lactobacillus plantarum care se caracterizeaz prin faptul c nu produce CO2 la fermentarea glucozei dar produce CO2 din gluconat. Riboza este fermentat la acid lactic i acid acetic. Posed activitate aldolazic, glucozo - 6P - dehidrogenazic. Prin fermentaie lactic se produce acid lactic racemic (DL). Lactobacillus plantarum este facultativ anaerob, nu produce NH3 din arginin. Poate acidifica laptele i are temperatura optim de dezvoltare la 30 - 35C. Nu necesit pantotenat, tiamin, niacin pentru dezvoltare. Lactobacillus plantarum ca i Lactobacillus sake pot descompune acidul gluconic cu formare de acid acetic ceea ce este dezavantajos n cazul salamurilor la care se folosete glucono - delta - lactona ca acidifiant chimic. Lactobacillus plantarum poate reduce NaNO3 dac pH-ul mediului este mai mare de 6,0 i nu exist zaharuri fermentescibile n mediul de cultur. Lactobacillus sake i Lactobacillus curvatus produc H2O2 n prezena O2 atmosferic. Cei doi lactobacili se ntlnesc frecvent n salamurile crude fr adaos de culturi starter (sunt componeni ai microflorei spontane a compoziiei de carne).

18

Alte utilizri Lactobacilii intereseaz i n fermentarea mslinelor, verzii, castraveilor,

gogonelelor, n producerea spirtului i drojdiei presate n vederea acidifierii plmezilor, la fermentarea unor produse fermentate din cereale (brag, cvas), la fabricarea acidului lactic prin fermentare etc.

Genul Micrococcus i Staphylococcus Microorganismele din genurile Micrococcus i Staphylococcus aparin familiei Micrococaceae care cuprinde bacterii sub form de coci. Se pot dezvolta n medii care conin 15% NaCl. Pentru industria crnii intereseaz anumite specii de micrococi i stafilococi care sunt folosite pentru: - capacitatea lor de a reduce azotaii la azotii (contribuie la formarea culorii crnii srate n prezen de azotai); - activitatea lor catalazic; - activitatea de acidificare, proteolitic i lipolitic. Dintre speciile de micrococci intereseaz Micrococcus aurantiacus i Micrococcus varians. Pentru industria laptelui, micrococii formeaz partea principal a populaiei nelactice din laptele crud i respectiv brnzeturile fabricate din laptele crud. Din brnza Cheddar fabricat din lapte crud a fost izolat Micrococcus freundenreichii, care a fost ulterior utilizat sub form de cultur pur n scopul accelerrii formrii aromei brnzei fabricate din lapte pasteurizat datorit activitii proteolitice i lipolitice. Tot n scopul maturrii unor brnzeturi cu past presat s-a utilizat un preparat enzimatic i anume Rulactina ce conine o metal-proteaz cu activitate strict endoproteinazic obinut din Micrococcus caseolyticus. Din genul Staphylococcus intereseaz speciile de stafilococi coagulaz-negativi, nepatogeni cum ar fi: Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xilosus, Staphylococcus simulans. Combinaiile de micrococi i stafilococi sunt eficace pentru activitatea azotat-reductazic i catalazic. n aceste combinaii, Staphylococcus carnosus acioneaz mai bine dect micrococii n formarea culorii, reducnd azotaii la azotii i respectiv azotiii la oxid de azot, chiar n condiii de aciditate ridicat a substratului. Aroma produselor la care este utilizat cultura starter de Staphylococcus carnosus este superioar. Genul Streptomyces Specii din genul Streptomyces pot altera alimentele, producnd mirosuri i gusturi dezagreabile, altele (puine la numr) sunt patogene. Streptomyces griseus senso Htter este ns inofensiv i a fost folosit pentru capacitatea sa de a reduce azotatul la azotit, putndu-se dezvolta bine n substraturi care conin ~ 8% NaCl i care au pH = 5,8-8,5. Temperatura optim de dezvoltare este la 30C. Este catalaz pozitiv avnd capacitate proteolitic dar

19

nu i lipolitic. Poate fi asociat cu micrococii i/sau lactobacilii. n salamurile crude se inoculeaz la nivel de 5103 /g compoziie.

Genul Propionibacterium Bacterile din genul Propionibacterium fac parte din familiaPropionibacteriaceae. Bacteriile propionice fermenteaz carbohidraii, piruvatul/lactatul. Bacteriile propionice tip lapte sunt: Propionibacterium freundreichii (cu subspeciile freundreichii, globosum i shermani), Propionibacterium theonii, acidipropionici i jensenii. Principalii produi de fermentaie a bacteriilor propionice sunt CO2, cantiti mari de acid propionic i acetic i cantiti mici de acid izovalerianic, formic, succinic, lactic. Toate speciile produc acid lactic din glucoz. Se dezvolt foarte bine la 30-37C i la pH = 7,0. Producerea de propionat, acetat i CO2 Lactatul (respectiv piruvatul) este transformat n propionat prin reacia: 3CH3-CHOH-COOH 2CH3-CH2-COOH + CH3-COOH + CO2 + H2O

Propionatul, acetatul i CO2 se formeaz n proporie de 2/1/1. Diferitele tulpini de bacterii propionice se deosebesc ntre ele prin raportul acid propionic /acid acetic format, o influen n acest sens avnd i aciditatea substratului, cantitatea de lactat i adaosul de carbonat i succinat. Producerea de prolin Prolina este considerat ca principalul component care confer arom dulceag brnzeturilor de tip vaier, prezena prolinei fiind asociat cu dezvoltarea bacteriilor propionice la maturarea brnzeturilor de tip vaier. Se consider c exist trei ci pentru producerea de prolin: - proteoliza general; - hidroliza peptidelor care conin prolin; - biosinteza prolinei. La prima cale se ia n considerare producerea de prolin prin hidroliza cazeinei. La a doua cale se ia n considerare formarea de prolin din hidrolizatul cazeinic cu optim de pH la 5,5-6,0). La a treia cale se are n vedere biosinteza prolinei din arginin i mai puin din acid glutamic, dar calea de biosintez este nesemnificativ n raport cu cea de-a doua cale menionat. n orice caz, concentraia de prolin din interiorul celulelor este mai mic dect cea a prolinei din mediul de cultur . prin aciunea

peptidazelor (Propionibacterium shermanii posed imidopeptidaz i proliniminopeptidaz intracelulare

20

Eliberarea prolinei din peptide coincide cu eliberarea enzimelor celulare n mediu. Bacteriile propionice singure hidrolizeaz ncet cazeina, dar producerea de prolin n brnzeturi este sporit prin dezvoltarea anterioar sau concomitent a bacteriilor lactice. Viteza formrii prolinei la valorile pH i concentraia de NaCl atins n brnza vaier este temporar ncetinit, dar maturarea prelungit anuleaz efectele de inhibare ale pH-ului i concentraia de NaCl. Se consider c ionii de cupru ar inhiba producerea de prolin pe unele ci, aceast inhibare parial fiind benefic, deoarece permite evoluarea altor procese de aromatizare. Producerea de diacetil i acetoin Bacteriile propionice pot produce diacetil i acetoin, cantitile formate fiind mai mari la 21C dect la 32 - 37C. Producia de diacetil este urmat de reducerea acestuia la acetoin i 2,3 butilenglicol. Cantitatea de diacetil crete prin adaos de citrat, piruvat sau glucoz n mediu de cultur. n culturile mixte de Str. lactis i bacterii propionice, producia de diacetil se intensific ca o consecin a scderii pH-ului de ctre streptococi. Bacteriile propionice produc i alte substane care contribuie la aroma brnzeturilor: aldehid acetic, aldehid propionic, alcool etilic, alcool propilic, dimetilsulfur, acid izovalerianic. Alte activiti metabolice Bacteriile propionice pot avea i activitate proteolitic i lipolitic. Bacteriile propionice pot contribui ntr-o msur mai mic la activitatea proteolitic din brnza vaier prin enzimele proteinazice (~12 enzime) i peptidazice (~ 7 enzime), dar activitatea proteolitic a bacteriilor propionice este inferioar bacteriilor lactice (L. bulgaricus, L. helveticus, Str. thermophilus). Bacteriile propionice pot contribui i la lipoliza trigliceridelor, elibernd acizi grai cu lan lung, dar aceast activitate lipolitic este nesemnificativ.

DROJDIILE, ciuperci unicelulare care se nmulesc prin nmugurire, mai rar prin sciziparitate i care formeaz ascospori (sunt i drojdii care nu formeaz spori, acestea denumindu-se drojdii/false torule i micoderme), sunt ageni tipici ai fermentaiei alcoolice. Se prezint sub form de celule rotunde sau ovoide (Saccharomyces cerevisiae), eliptice (Saccharomyces elipsoideus), foarte alungite (Saccharomyces pasteurianus), de forma unei lmi (Saccharomyces apiculans), de forma unei sticle (Saccharomyces ludwigii) sau sub form de cilindru (Pichia). Dintre drojdii intereseaz (n sens util) cele aparinnd familiei Saccharomycetaceae, genul Saccharomyces care cuprinde drojdii alcooligene folosite n industria berii, vinului, pinii, spirtului, genul Kluyveromices care fermenteaz lactoza, genul Debaryomices care se utilizeaz n industria crnii. Mai intereseaz drojdiile familiei Cryptococcaceae (genurile Candida, Torulopsis) care se folosesc ca ageni de fermentare i productori de biomas.

21

Utilizri ale drojdiilor 1. Utilizarea pentru fermentarea alcoolic. Pentru fermentaia alcoolic se folosesc drojdiile adevrate care aparin genului Saccharomyces (Meyen) Ress i care se caracterizeaz prin aceea c nu formeaz micelii tipic, produc 1 - 4 spori, iar puterea de fermentare depete puterea de respiraie. Sunt adaptate la condiii de anaerobioz i prin urmare nu formeaz voaluri la suprafa. Dup modul de comportare n timpul fermentaiei drojdiile pot fi: de fermentaie superioar care se ridic n cantiti mari la suprafaa lichidului de fermentare sub forma unui strat gros de spum care se pstreaz astfel pn la sfritul fermentrii. Dup sedimentare aceste drojdii rar dau un precipitat dens. Au optim de temperatur la 28 - 30C i fermenteaz 1/3 din rafinoz. n categoria drojdiilor de fermentare superioar se ncadreaz cele care produc fermentarea alcoolic n cazul obinerii alcoolului etilic, pinii i unele sue pentru bere (Saccharomyces cerevisiae);

de fermentaie inferioar care se dezvolt n lichidul fermentat, nu se ridic la suprafa n spum,

dar formeaz flocoane i se sedimenteaz repede. Au optim la temperatura de 8 - 12C i fermenteaz complet rafinoza. Drojdiile de fermentare inferioar se folosesc la obinerea berii, vinului, cidrului (Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces vini, Saccharomyces uvarum). Fermentaia alcoolic produs de drojdii este influenat de: - concentraia zahrului fermentescibil din mediu; - temperatur ; - coninutul n alcool din substrat; - felul drojdiei. Concentraia favorabil de zahr fermentescibil este de 10-15%. Fermentaia alcoolic se desfoar lent la pH 4-4,5, n mediu alcalin sensul fermentaiei fiind schimbat. Viteza maxim de fermentare este la 30C, dar n practic se realizeaz la 428C. Alcoolul pe msura acumulrii n mediu devine toxic pentru drojdii. Exist drojdii care se dezvolt la 16-18% alcool (Saccharomyces chevalieri Guilliermond, Saccharomyces oviformis), ns n cele mai multe cazuri fermentaia se oprete la 12-14% (Saccharomyces uvarum, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces vini, Saccharomyces cerevisiae). Odat cu creterea temperaturii de fermentare se mrete toxicitatea alcoolului. Fermentaia alcoolic este un proces anaerob. Prin trecerea la aerobioz, drojdiile se nmulesc rapid i produc biomas. Fermentarea alcoolic nu este o fermentaie pur. Se mai formeaz glicerin (8% din totalul zaharurilor existente n mediu), acid lactic, acid acetic, substane acetoinice (acetil metil carbinol = acetoin i

22

diacetil), acid malic, acid succinic, acid propionic, acid citramalic, acid dimetilgliceric, alcooli superiori: izobutilic, izoamilic, amilic, care provin din aminoacizii rezultai la degradarea substanelor pectice din musturi i plmezi. Aceti alcooli superiori se formeaz prin reacii de dezaminare i decarboxilare ale aminoacizilor leucin, izoleucin i valin. Fermentaia alcoolic se aplic la: obinerea alcoolului din produse amidonoase (cartofi, porumb, secar), produse care conin

zaharoz (sfecl, melas), produse care conin lactoz (zer), produse care conin glucoz (hidrolizate celulozice, leii sulfitice); obinerea berii i vinului, cidrului inclusiv cvas din pine, rom, whisky; obinerea de buturi fermentate pe baz de cereale i leguminoase; obinerea unor tipuri de produse lactate (chefir); obinerea de buturi fermentate pe baz de zer.

2. Utilizarea pentru obinerea de biomas (s-a menionat anterior); 3. Utilizarea n industria crnii, n care caz se folosete drojdia Debaromyces hansenii care este tolerant la NaCl, nu reduce NaNO3 i necesit oxigen atmosferic pentru dezvoltare. Se dezvolt bine n straturile periferice ale salamurilor neafumate sau puin afumate. Aceast drojdie are capacitatea de a consuma oxigenul din past i de a distruge peroxizii produi de bacteriile lactice. De regul, Debaromyces hansenii se folosete n combinaie cu Staphylococcus carnosus i Lactobacillus plantarum sau Staphylococcus xilosus i Lactobacillus sake. Se consider c prin folosirea drojdiei menionate produsele capt o arom cu totul deosebit. 4. Utilizarea n industria laptelui La fabricarea brnzeturilor, drojdiile se dezvolt la suprafaa brnzeturilor dar i n interiorul brnzeturilor cu past moale sau cu mucegai n past n timpul presrii, zvntrii i maturrii, avnd urmtoarele aciuni pozitive: consum lactatul i n acest fel contribuie la neutralizarea pastei, mbuntind prin aceasta

consistena i favoriznd implantarea bacteriilor; produc factori de cretere pentru dezvoltarea bacteriilor; produc o pelicul de acoperire la anumite tipuri de brnzeturi; produc proteoliz i lipoliz i prin urmare contribuie la consistena i aroma brnzei respective; produc compui volatili de arom.

23

Dintre drojdii, Candida hansei a fost cultivat n asociaie cu lactobacili i Str. thermophilus, favoriznd oxidarea lactatului, scderea potenialului de oxidoreducere i producerea de factori de cretere, precum i dezvoltarea culturilor starter n care este asociat. Drojdia Candida lipolitica este uneori folosit la fabricarea brnzeturilor cu mucegai n past, datorit faptului c prin lipazele coninute realizeaz o hidroliz a lipidelor din brnz, fapt ce favorizeaz utilizarea acizilor grai de ctre Penicillium n reaciile de -oxidare. Drojdia Torulopsis candida gsit pe brnzeturi se dezvolt bine n medii acide i suport concentraii de NaCl pn la 10%. Drojdia Candida kefir i alte drojdii din granula de chefir realizeaz fermentaia alcoolic n produsul lactat acid dietetic chefir. Kluyveromices lactis i Kluyveromices fragilis se utilizeaz la obinerea de lactaz care are multe utilizri. Kluyveromices lactis i Kluyveromices fragilis se utilizeaz la obinerea de biomas prin cultivare aerob pe zer (procedeul Bell - Frana). Kluyveromices fragilis i Candida pseudotropicalis se utilizeaz pentru obinerea alcoolului etilic din zer (procedeul Carbery - Irlanda). MUCEGAIURILE Pentru industria alimentar intereseaz clasa Phycomycetes cu urmtoarele genuri: Genul Mucor i Rhizopus aparinnd familiei Mucoraceae. Aceste mucegaiuri care se ntlnesc pentru diferite produse vegetale i alimentare, sub form de colonii pufoase, au o aciune fermentativ net. Speciile de Mucor i Rhizopus se folosesc pentru: - obinerea unor produse alimentare fermentate n Orientul ndeprtat, pe baz de cereale i leguminoase;-

n producia de spirt prin zaharificarea amidonului (procedeul Amilo care folosete Amylomyces rouxi Mucor rouxianus);

- n producia de enzime, n principal amilolitice i proteolitice. Din clasa Ascomycetes intereseaz ordinul Plectascales cu genurile Aspergillus i Penicillium. Mucegaiurile din genul Aspergillus se utilizeaz n: - producia de unc n SUA i Spania (mai puin); - obinerea de produse fermentate tradiionale n Orientul ndeprtat (ceva mai mult); - obinerea de enzime: amilaze, proteaze, enzime pectolitice. Mucegaiurile din genul Penicillium se utilizeaz n:-

industria brnzeturilor cu mucegai la suprafa i n past (Penicillium camemberti i Penicillium roqueforti);

-

industria crnii cu mucegaiuri de acoperire (Penicillium nalgiovensis i Penicillium exposus);

24

- obinerea de enzime amilolitice, proteolitice, pectolitice. n industria crnii, culturile de spori de mucegai se utilizeaz pentru maturarea unor unci, care se nsmneaz cu spori de Penicillium netoxicogen, n special P. nalgiovensis, P. exposum, i P. chrysogenum, respectiv Country curred ham i Jambon Serano, care se nsmneaz cu spori de Aspergillus glaucus i a unor tipuri de salamuri crude fabricate n Romnia, Italia, Ungaria, Elveia, Spania, Frana, Bulgaria; Austria, Belgia, Germania (i mai puin n SUA, Israel, Iugoslavia, Polonia). n cazul salamurilor crude afumate/neafumate, mucegaiurile de acoperire contribuie la: - reglarea eliminrii apei din produs i a schimbului de gaze; - formarea aromei; - mbuntirea aspectului comercial al produsului. Aroma este mai evident la salamurile cu diametru mai mic. Produsele pot fi livrate cu mucegaiul de acoperire intact sau dup periere. Culoarea miceliului rmas este dependent de varietatea mucegaiului folosit: alb-ivorie (preferabil n Italia); gri (preferabil n Ungaria); alb-mat (preferabil n Romnia). Prin utilizarea culturilor pure de mucegai se suprim apariia la suprafaa salamurilor a mucegaiurilor toxicogene, n special a celor productoare de aflatoxine precum i a mucegaiurilor de ptare care produc spoturi de culoare verde sau neagr. Penicillium nalgiovensis Se utilizeaz spori de Penicillium nalgiovensis pentru salamurile crude cu miceliu alb la suprafa. Sporii, n suspensie, se pulverizeaz la suprafaa produselor. Dup 3-4 zile de la nsmnare se formeaz micelii, iar dup 5-6 zile de la nsmnare apar corpii de fructificaie purttori de conidii. Temperatura optim de dezvoltare a mucegaiului este de 22-23C. Penicillium nalgiovensis folosete ca substrat nutritiv glucidele dar are i activitate proteolitic i lipolitic. Nu are activitate celulazic i nu produce micotoxine. Penicillium expansum se dezvolt bine la 22C i umiditatea relativ a aerului este de ~ 82% pentru sporulare i ~ 88% pentru germinare. Dezvoltarea bun este la = 92-95%. Sporii pulverizai la suprafaa batoanelor formeaz un miceliu pufos n circa 8 zile de la nsmnare, maturizarea deplin avnd loc dup 30 zile de la nsmnare. Penicillum expansum nu produce micotoxine dac substratul conine proteine cu sulf (cazul pastei salamurilor crude). n industria laptelui culturile de spori de mucegai se utilizeaz, aa cum deja s-a menionat, la fabricarea brnzeturilor cu mucegai n past ct i cu mucegai la suprafa (brnzeturi cu past moale). Pentru brnzeturile cu mucegai n past (Brnza Roquefort, Gorgonzola, Stilton, Gammelost) se utilizeaz spori de Penicillium roquefort. Pentru brnzeturile de tip Camembert se utilizeaz sporii de la dou specii de Penicillium: P. camemberti i P. caseicolum.

25

Mucegaiurile dezvoltate n/pe aceste brnzeturi au rol fundamental n: - formarea aromei i gustului; - formarea consistenei;-

definitivarea aspectului, procesele care intervin n formarea aromei i consistenei fiind proteoliza, lipoliza i -oxidarea acizilor grai.

Suspensiile de spori se pot aduga/folosi: - n laptele destinat brnzeturilor sau amestecarea cu coagulul obinut n cazul brnzei cu mucegai n past;-

n laptele destinat fabricrii brnzei, sau pulverizare la suprafaa brnzei formate n cazul brnzeturilor cu mucegai la suprafa. Mucegaiurile mai importante pentru industria laptelui sunt:

Penicillium roqueforti Thom se dezvolt bine la 20-25C i pH 4,5-7,5. Tolereaz concentraii de 5-8% NaCl. Are activitate proteolitic, lipolitic i de -oxidare a acizilor grai. Activitatea mucegaiului este stnjenit de prezena acidului propionic n brnz, la concentraii mari de 30% CO2 n aerul depozitului. Pentru intensificarea formrii aromei se recomand ca lipidele din lapte s fie n prealabil lipolizate cu esteraz pregastric, astfel ca pe msur ce mucegaiul sporuleaz, acizii grai liberi s fie -oxidai pn la metilcetone. P. roqueforti se dezvolt n canalele i golurile practicate n pasta brnzei, sporii formai avnd culoare verde nchis care confer brnzei un aspect marmorat. Penicillium camemberti i Penicillium caseicolum Sporii acestor mucegaiuri se utilizeaz n producia brnzeturilor de tip Camembert incluznd Camembert, Brie, Neufchatel, Coulommier, Garr de lEst, Olivet. Penicillium camemberti Thom (Penicillium album) se utilizeaz la brnzeturile tip Camembert cu past mai untoas, mai parfumat, de culoare gri - alburie. Penicillium caseicolum Bainer (Penicillium candidum) se utilizeaz la brnzeturile de tip Camembert cu pasta mai compact, o arom mai delicat, mai discret i de culoare alb - imaculat. La nsmnare prin pulverizare de spori la suprafa a brnzeturilor cu umiditate ~ 55-60% se formeaz miceliile de mucegai care consum din aciditatea pastei, consecina fiind creterea pH-ului ncepnd cu a 12 - a zi, iar dup 27 de zile pH-ul rmne constant. Mucegaiurile din genul Penicillium au activitate endoproteinazic fa de - i cazein, dar au i activitate exopeptidazic important, fiind demonstrat faptul c att P. roqueforti ct i P. camemberti sintetizeaz 2 endopeptidaze (o metal proteinaz i o aspartil proteinaz) precum i dou exopeptidaze cu aciune carboxi- i aminopeptidazic, activitatea celor dou grupe de enzime fiind relativ echivalent n stratul de suprafa al brnzeturilor.

26

Unele specii de Penicillium camemberti pot produce o micotoxin (acidul ciclopiazonic, dar activitatea toxicogen a mucegaiului este aproape nul la temperatura tehnologic de maturare a brnzei (14-16C). La brnza Camembert se pot utiliza i spori de Geotricum candidum care se introduc n lapte. Geotricum reduce pericolul formrii peptidelor amare, inhib dezvoltarea lui Penicillium, consum acidul lactic i deci contribuie la neutralizarea pastei, avnd i aciune protolitic i lipolitic. Brnza Camembert obinut din lapte pasteurizat cu adaos de Geotricum candidum are o arom asemntoare cu cea a brnzei Camembert tradiionale, adic fabricat din lapte crud. 1.3.2. Culturi starter Culturile starter sunt definite ca acele culturi care se obin plecnd de la o cultur pur stoc i care prin trecere prin culturi intermediare (pasaje) devin apte de a fi folosite pentru producia unor alimente fermentate. Culturile starter pot fi formate numai dintr-un singur microorganism sau din mai multe microorganisme. Culturile starter de microorganisme sunt utilizate n vederea: dirijrii unor procese biochimice prin care se asigur produsului un anumit grad de inocuitate

(inclusiv capacitatea de conservare); asigurrii unor nsuiri senzoriale; asigurrii, n unele cazuri, i a unor nsuiri nutritive.

La folosirea culturilor starter n industria alimentar trebuie s se aib n vedere urmtoarele: s conin un anumit numr de microorganisme viabile (g/ml) i un numr ct mai redus de

germeni nedorii; produii metabolici, primari i secundari, s nu prezinte pericol pentru sntatea oamenilor; s nu conin i s nu produc antibiotice care se utilizeaz n scop terapeutic la oameni; s aib o anumit (anumite) activiti specifice: de producere a acidului lactic, de reducere a

azotului etc; microorganismele existente n cultur s fie declarate cu numele tiinific ntreg; speciile (suele) noi care se introduc n producie, trebuie s fie nregistrate la MS i s fie

depozitate n colecii cu nomenclator; nainte de utilizare n producie s fie testate din punct de vedere al inocuitii n conformitate cu legislaia n vigoare; suele declarate a fi sigure trebuie controlate la intervale regulate de ctre institute specializate, n

ceea ce privete puritatea lor;

27

speciile, care pe baza noilor cunotine tiinifice au fost recunoscute ca avnd potenial patogen

sau toxicogen, trebuie s fie supuse unui control riguros pentru fiecare su, realizndu-se studii de toxicitate pe termen lung, de carcinogenitate i mutagenitate. Toate cele menionate trebuie s se constituie ca o obligativitate absolut deoarece: culturile starter se pot consuma n stare vie, odat cu produsul alimentar, aa cum este cazul

produselor lactate acide, brnzeturilor, salamurilor i crnailor cruzi, a unor sortimente de bere, a unor produse vegetale: varz murat, castravei murai, gogonele murate, msline verzi; culturile starter se pot consuma dup distrugerea lor, rmnnd n produsul alimentar att ele ct i

produii lor de metabolism, aa cum este cazul brnzei proaspete de vaci i a iaurtului care au fost pasteurizate, brnzeturilor topite, produselor de panificaie etc.; produii de metabolism ai culturilor starter se consum odat cu produsele alimentare, ns

microorganismele sunt eliminate n cea mai mare parte, aa cum este cazul berii, vinului, alcoolului, oetului, acidului citric, acidului lactic etc. Culturi starter de bacterii lactice Culturile starter de bacterii lactice sunt folosite n diferite domenii: industria laptelui, crnii, produselor vegetale murate, industria vinului, industria panificaiei, industria sucurilor de fructe i legume fermentate etc. Folosirea culturilor starter de bacterii lactice asigur produselor alimentare n care se introduc un anumit grad de inocuitate. Aceast asigurare este realizat deoarece bacteriile lactice produc:

acizi organici, n principal acid lactic, dar i acid acetic, alcool, CO2; substane bacteriocine eliberate n mediul de cultur;

peroxizi organici (H2O2).n plus, bacteriile lactice intr n competiie cu microorganismele patogene i cele de alterare n ceea ce privete consumul de substane nutritive, iar datorit i acidifierii mediului, consecin a acumulrii acizilor organici, bacteriile patogene i de alterare sunt inhibate n dezvoltarea lor. Dintre bacteriile patogene sunt inhibate stafilococii, salmonelele, Listeria monocytogenes, Cl. botulinum etc. Datorit aciditii se inhib i dezvoltarea microflorei cu activitate proteolitic i decarboxilazic, deci se formeaz cantiti mai reduse de amine biogene, iar n cazul crnurilor srate n prezen de azotii, datorit aciditii se favorizeaz descompunerea mai complet a azotiilor, deci scade producia de nitrozamine, mai ales la produsele care se supun coacerii i prjirii.

28

Culturile starter de bacterii lactice folosite ca atare sau sub form de produse lactate dietetice acide sunt benefice pentru sntatea oamenilor deoarece: aciditatea lactic favorizeaz aciunea pepsinei ce produce hidroliza proteinelor, respectiv

coagularea cazeinei laptelui care este n continuare degradat de tripsina pancreatic; aciditatea mediului intestinal blocheaz dezvoltarea microflorei cu activitate patogen i

favorizeaz implantarea bifidobacteriilor cu consecine pozitive pentru organismul uman (vezi capitolul probiotice). n legtur cu bacteriocinele, n continuare se fac urmtoarele precizri: bacteriocinele sunt secretate de bacteriile Gram negative; bacteriocinele sunt proteine i activitatea lor dispare prin hidroliza lor de ctre proteaze; bacteriocinele au aciune bactericid, dar nizina este i bacteriostatic. Multe bacteriocine sunt

bacteriostatice la aplicarea lor n produsele alimentare; bacteriocinele sunt excretate n mediu n cea mai mare parte; o mic parte rmn n celulele

bacteriene; bacteriocinele difer de antibiotice prin natura speciilor i suelor productoare, modalitile de

producere i natura lor chimic; bacteriocinele secretate de bacteriile lactice din culturile starter sau de protecie au un spectru de

aciune relativ limitat n raport cu mai multe specii sau mai multe sue ale aceleiai specii. bacteriocinele sunt sensibile la aciunea enzimelor proteolitice metabolice, ceea ce nseamn c

ingerarea de produse ce conin bacteriocine nu modific microbiota tractului intestinal i nu va conduce la riscuri n ceea ce privete folosirea de antibiotice comune;

- bacteriocinele sunt stabile la cldur, deci rezist n laptele pasteurizat la 63C/30s minimum saula 72C/15 s; rezistena lor termic se datoreaz structurii moleculare simple (excepie face helveticina J care are o structur proteic mai elaborat); bacteriocinele sunt stabile la pH neutru sau acid, ceea ce nseamn c sunt adaptate la condiiile de

mediu ale bacteriilor productoare;

- eficacitatea bacteriocinelor n produsele fermentate este limitat de condiiile de conducere afermentaiei (temperatur, pH, aw) Culturi starter utilizate in industria laptelui La obinerea culturilor starter trebuie s avem n vedere n mod deosebit urmtoarele:

29

-

mediul de cultur (laptele); tratamentul termic aplicat laptelui; condiiile de incubare; interaciunile dintre speciile/tulpinile din cultura starter; eventualele infectri cu bacteriofagi; instabilitatea culturilor starter de bacterii lactice.

De la nceput, facem precizarea c prin cultur starter nelegem culturile obinute din cultura pur stoc (inoculum) prin diferite pasaje. Culturile starter sunt folosite la fabricarea unor produse lactate acide, smntn, unt, brnzeturi. Culturile starter de bacterii lactice utilizate n industria laptelui pot fi clasificate n mezofile i termofile. Culturile starter mezofile, care la rndul lor, pot fi clasificate n: a) Culturi starter singulare (single strain starter) care conin numai Str. lactis subsp. lactis i respectiv Str. lactis subsp. cremoris (Lactococcus lactis i Lactococcus cremoris) ambii homofermentaticvi care produc acid lactic (L+) n proporie de 0,8%. Folosirea acestor culturi starter singulare a aprut ca o necesitate de a se evita formarea ochiurilor de fermentare la unele brnzeturi, ochiuri formate n urma producerii de CO2 de ctre bacteriile aromatizante. Culturile starter singulare mezofile prezint urmtoarele avantaje:

-

se poate utiliza continuu aceeai cultur cu activitate relativ constant i previzibil; nu este necesar alternarea culturilor, eliminndu-se riscul deprecierii acestora de ctre fagi, se folosesc cantiti mai mici de inoculum pentru obinerea de cultur primar i secundar; influenele compoziionale sezoniere ale laptelui sunt mai reduse; se creeaz condiii de realizare a unei producii standardizate de produse lactate de calitate

superioar; cultura poate fi controlat i supravegheat din punct de vedere al caracteristicilor sale

(sensibilitate la fagi, producerea de acid lactic, compatibilitatea ei, aglutinarea i eventual lisogenia). Culturile starter singulare mezofile prezint ns urmtoarele dezavantaje:

30

-

pot fi depreciate de tulpinile productoare de bacteriocine; pot fi depreciate de fagi, deci sunt predispuse la liz fagic; pot suferi pierderi de plasmide i deci pot pierde una sau mai multe din funciile lor.

b) Culturi starter multiple mezofile sunt acele culturi care se bazeaz pe folosirea a 5-6 tulpini selecionate, nenrudite pe plan fagic i cultivate separat pn la stadiul de cultur primar sau chiar pn la stadiul de cultur starter de producie cnd se amestec ntre ele. n aceste condiii, tulpinile nu se dezvolt mpreun dect cel mult timp de 10 generaii, ceea ce face ca nici o tulpin s nu devin dominant. Asemenea culturi pot fi folosite mai multe luni n ir fr a-i pierde capacitatea de acidifiere. c) Culturi starter mezofile mixte Aceste culturi sunt formate, de regul, din dou tipuri de bacterii lactice:

- bacterii lactice acidifiante: Str. lactis sau Str. cremoris; - bacterii lactice productoare de arom: Str. diacetilactis (Lactococcus lactis var. diacetilactis) sauspecii de leuconostoci. Dup tipul bacteriilor aromatizante culturile starter mixte mezofile pot fi clasificate n urmtoarele grupe:

culturi starter mixte tip L care conin numai specii din genul Leuconostoc: Leuconostoc cremoris(citrovorum), Leuconostoc dextranicum i/sau Leuconostoc lactis care sunt toi heterofermentativi i produc acid lactic D(-);

culturi starter mixte de tip D care conin Str. lactis biov. diacetilactis ca singur specieproductoare de arom;

culturi starter mixte tip LD care conin att specii de leuconostoci ct i Str. lactis subsp.diacetilactis ca productori de arom. La folosirea culturilor starter mixte trebuie s avem n vedere c:

-

streptococii acidifiani mezofili homofermentativi produc acid lactic din lactoz;

- leuconostocii, cei heterofermentativi, i Str. lactis subsp. diacetilactis (homofermentativ) producdiacetil i acetoin din citrat, dar produc i acid lactic, acetic prin fermentarea lactozei i glucozei; Culturi starter termofile

Culturile starter termofile pot fi:

31

acidifiante: Lactobacillus acidophilus; acidifiante/aromatizante care la rndul lor pot fi constituite din unul sau mai multe specii delactobacili i dintr-o specie de streptococi. n aceast direcie amintim:

- cultura starter termofil pentru iaurt: Lactobacillus bulgaricus i Str. therrmophilus; - cultura starter termofil pentru brnzeturi: Lactobacillus bulgaricus + Lactobacillus lactis +Lactobacillus helveticus + Str. thermophilus. Aceast cultur starter se folosete la fabricarea brnzeturilor cu past tare i semitare, deci la care se practic nclzirea a doua a bobului de coagul. Utilizarea culturilor starter termofile este benefic deoarece: produc acid lactic deci scad pH-ul laptelui i determin coagularea acestuia (cazul iaurtului); la

brnzeturi acidifierea favorizeaz eliminarea zerului din coagul; au activitate proteolitic i prin urmare contribuie la ameliorarea proprietilor reologice i la

aroma produselor fermentate; ca urmare a activitii proteolitice rezult i aminoacizi din proteine care stimuleaz dezvoltarea celorlalte bacterii din culturile starter termofile; produc i compui de arom, dar n principal aldehid acetic, aceton, precum i urme de

acetoin;

produc i substane cu caracter filant care influeneaz vscozitatea produsului (Str. thermophilusn cultura pentru iaurt);

produc o serie de bacteriocine (Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacilluscasei etc.);

produc H2O2 (Lactobacillus bulgaricus).Avnd n vedere cantitile mari de iaurt ce se fabric pe plan mondial, este necesar s cunoatem factorii care influeneaz performana optim a culturilor pentru iaurt. Aceti factori se refer la:

temperatura de incubare care este de 41 - 42C (apropiat de temperatura optim de dezvoltare alui Lactobacillus bulgaricus ). Dup 3 ore de incubare se ajunge la ~ 500 mil bacterii/g, raportul dintre L. bulgaricus i Str. thermophilus fiind 1/1;

tratamentul laptelui - pasteurizarea influeneaz pozitiv dezvoltarea lui L. bulgaricus prin:modificarea structurii proteinelor; eliminarea parial a oxigenului i realizarea unei microaerofilii propice; distrugerea inhibitorilor din lapte; formarea de acid formic care favorizeaz dezvoltarea culturii;

32

disponibilitatea substratului Laptele este un bun substrat dar trebuie artat c Lactobacillusbulgaricus are preferin fa de glucoz i deci ar trebui ca lactoza s fie prehidrolizat la galactozidaza;

metabolii produi n mediu. Lactobacillus bulgaricus produce H2O2 n mediul de cultur i deciadausul de catalaz va stimula producia de acid lactic de ctre Str. thermophilus care este mai sensibil la H2O2 dect Lactobacillus bulgaricus. Laptele destinat iaurtului nu trebuie s fie agitat prea mult ca s nu includ aer (oxigen) care ar strica condiiile de microaerofilie pentru L. bulgaricus i ar deveni toxic pentru Str. thermophilus. Lactobacillus bulgaricus se apr de aciunea oxigenului prin intermediul manganului intracelular care nlocuiete aciunea superoxiddismutazei;

interaciunile dintre bacterii din cultura pur (inoculum) sau cultura starter. ntre cele doumicroorganisme exist un sinergism deosebit. Lactobacillus bulgaricus produce aminoacizi din cazein care sunt necesari dezvoltrii lui Str. thermophilus care, la rndul su, favorizeaz dezvoltarea lui L. bulgaricus prin producerea de acid formic i CO2;

calitatea laptelui ca substrat de fermentare. Acesta nu trebuie s conin antibiotice, substaneconservante, dezinfectante i s provin de la animale sntoase cu maximum 400000 leucocite/ml.

Controlul culturilor starter de bacterii lactice

Controlul culturilor starter implic urmtoarele determinri: examenul microscopic care trebuie s arate raportul dintre coci i bacili, raport care trebuie s se

situeze n limitele 1/1-1,5/1; activitatea acidifiant care se urmrete prin determinarea aciditii titrabile atunci cnd cultura se

afl n faz logaritmic. n acest fel se pot pune n eviden culturile rapide i lente (fast and slow);

rezistena la aciditate, inndu-se seama c Lactobacillus bulgaricus rezist pn la ~ 1,7%aciditate iar Str. thermophilus pn la 0,8%. Rezistena la aciditate se urmrete prin determinarea supravieuitorilor dup ce n mediul de cultur se atinge o aciditate critic;

rezistena la rcire care este important pentru produsele lactate ce se congeleaz (iaurt, ngheatade iaurt). Rezistena la rcire se urmrete la 6 - 9C i apoi la -18C sau - 25C ;

producerea de substane filante care const n msurarea vscozitii pe o prob inoculat de laptecu 12% s.u., cu adaos de CaCl2 0,012%, incubat 4 ore/37C pn ce se atinge un pH de 4,2 - 4,3. Se pot depista n acest fel culturile filante;

33

activitatea proteolitic se poate urmri pe o cultur pstrat la 4C la care se determin tirozina sauaminoacizii liberi prin metoda formol titrimetric; activitatea lipolitic se poate determina prin msurarea indicelui de aciditate din grsimea culturii

(lapte);

proprietile senzoriale se determin la culturile de 24 - 48 ore la 20C (se pot determina isubstanele de arom respectiv diacetilul, acetaldehida, acetoina).

CULTURI STARTER CONCENTRATE DE MICROORGANISME

Definiie Culturile starter concentrate sunt definite ca acele culturi dezvoltate n condiii controlate, concentrate ntr-un volum mic i conservate prin congelare sau uscare n vederea depozitrii i transportului. Culturile concentrate pot fi de bacterii, drojdii, spori de mucegai. n ceea ce privete culturile starter concentrate de bacterii cele mai des utilizate sunt culturile de bacterii lactice. Pe lng acestea se folosesc i alte culturi de bacterii concentrate: micrococi, pediococi, stafilococi, streptomicii, bacterii propionice, etc. Culturile concentrate de bacterii pot fi utilizate pentru: obinerea culturilor starter de producie (maiele de producie); obinerea produselor fermentate prin utilizare direct n lapte, compoziii carnate etc.

Indiferent de domeniul de utilizare, culturile starter concentrate pot fi obinute prin dou procedee: procedeul de cultivare periodic; procedeul de cultivare continu.

Tehnologia de obinere a culturilor starter concentrate Tehnologia de obinere include urmtoarele operaii de baz: inocularea mediului de cultur cu microorganismul din cultura stoc; incubare pentru multiplicare la nivel maxim; concentrarea mediului mpreun cu celulele sau separarea celulelor, de regul prin centrifugare i

resuspendare ntr-un lichid adecvat, conservare prin congelare i uscare;

34

depozitare n stare congelat i uscat.

n tehnologia de obinere a culturilor starter concentrate trebuie ales un mediu de cultur care s asigure toate substanele pentru dezvoltarea (multiplicarea) culturii, realizndu-se un control riguros al temperaturii i meninerii pH-ului la valori optime. Pentru eventuala neutralizare a aciditii se utilizeaz hidroxid de amoniu i/sau hidroxid de calciu. Conservarea prin congelare a concentratului de microorganisme se face n dou moduri:

- sub form lichid, n care caz, concentratul de bacterii se suspend ntr-un antigel solubil n ap(alcooli polihidrici) care se utilizeaz n proporie de 40-50% fa de concentrat. Congelarea se face la -40C (de fapt se realizeaz o subrcire). Acest gen de conservare prezint urmtoarele avantaje: se mpiedic aciunea duntoare a gheii asupra celulelor de bacterii; manipularea concentratului este mai uoar; concentratul se poate nclzi pn la temperatura de utilizare chiar n timpul manipulrii fr ca

celulele s-i piard viabilitatea i activitatea;

- congelarea n azot lichid (-196C) n care caz concentratul se amestec cu un agent crioprotector:10% glicerol, 7,5% lactoz n cazul bacteriilor lactice. Pentru culturile starter concentrate de pediococi s-a propus ca la concentrat s se adauge ageni de stabilizare cum ar fi: glicerolul, lapte praf degresat, extract de mal, metalglicerofosfai alcalini, glutamat monosodic, acid glutamic, cistin i/sau dextran. Amestecul respectiv se introduce n pungi de plastic care se congeleaz n azot lichid. Depozitarea culturilor starter concentrate se poate face:

a) la temperaturi de 20-40C; b) la temperatura de -196C (n azot lichid); - conservarea prin reducerea coninutului de ap se face prin liofilizare, n care caz concentratulde bacterii se amestec cu un suport adecvat (lapte praf degresat, lactoproteine pulbere lactoz, zaharoz) dup care se liofilizeaz. La liofilizare (faza de desicare secundar) temperatura produsului nu trebuie s depeasc 40-45C. Dup liofilizare se face ambalarea sub vid sau n atmosfer de gaz inert.

Depozitarea produselor liofilizate trebuie s se fac la temperaturi sczute (-18C). Culturile starter concentrate trebuie s conin ntre 2,51010 - 5,51010 celule viabile-active/ g sau ml. Utilizarea culturilor starter concentrate de bacterii lactice n industria laptelui

35

Culturile starter concentrate de bacterii lactice care se folosesc n industria laptelui sunt acelea destinate: pentru brnza Cheddar, brnzeturi tip italian i elveian; pentru brnza de vaci, smntn, lapte btut, iaurt.

Avantajele i dezavantajele folosirii culturilor starter de bacterii lactice n industria laptelui sunt artate n tabelul de mai jos. Avantajele i dezavantajele folosirii culturilor starter de bacterii acterii lactice:

Activitatea

culturilor

poate

fi

Necesit spaii de depozitare la temperaturi

controlat i supravegheat nainte de sczute att la productor ct i la cumprtor expediere Se elimin operaiile de ntreinere pentru pstrare pn la folosire Concentrarea nu este posibil la toate Depozitarea n stare congelat sau uscat, n

i de preparare a maielelor intermediare culturile starter (primar, secundar, teriar) munc Se pot stabili uor sistemele de Se face economie la fora de funcie de timp, poate conduce la micorarea drastic a numrului de celule viabile Culturile pot s fie influenate negativ n

rotaie n vederea evitrii infeciei cu ceea ce privete unele plasmide ce codific anumite bacteriofagi Se obin produse de calitate mai Se scurteaz acidifierii, procesele deoarece se constant tehnologice ale fabricrii produselor prin accelerarea suprim faza de dezvoltare logaritmic n laptele de fabricaie funciuni

36

Culturi starter concentrate de bacterii propionice pentru industria laptelui Mediul de cultur pentru realizarea culturilor starter concentrate de bacterii propionice poate fi laptele degresat cu adaos de 1% tripticaz, 1% extract de drojdie ca surs de vitamine i factori suplimentari de cretere 1% lactat de sodiu; 0,025% KH2PO4; 0,0005% MnSO4. Mediul de cultur se ajusteaz la pH = 7,0 i se sterilizeaz. Incubarea mediului de cultur inoculat cu bacterii propionice din cultura stoc se face la 32C/3 zile. Dac mediul de cultur coninnd bacterii propionice dezvoltate dup incubare se utilizeaz ca o cultur (maia) de producie, atunci dezvoltarea bacteriilor propionice se oprete nainte de coagularea laptelui, deoarece n stare de coagul, cultura starter se repartizeaz greu n laptele destinat fabricrii brnzeturilor. Celelalte operaii de obinere a culturii starter concentrate de bacterii propionice sunt aceleai ca cele descrise la celelalte tipuri de culturi starter concentrate. Depozitarea culturilor starter concentrate de bacterii propionice se face la 5C n care caz celulele i pstreaz viabilitatea i activitatea 8 sptmni. Depozitarea la 25C poate fi fcut pentru cel mult 2 sptmni. Culturile starter concentrate se adaug direct n laptele destinat fabricrii brnzeturilor (deci nu se mai folosesc obinerea de culturi intermediare). X

FOLOSIREA ENZIMELOR I MICROORGANISMELOR LA FABRICAREA LAPTELUI Industria laptelui utilizeaz o important cantitate de enzime, n special n producerea de brnzeturi, iar bacteriile lactice sub form de culturi starter de producie sau culturi starter concentrate stau la baza obinerii produselor lactate fermentate (produsele lactate acide dietetice, produse probiotice),

37

inclusiv a brnzeturilor. La unele din produsele menionate se pot utiliza, de asemenea, culturi de bacterii propionice i alte bacterii precum i drojdii sau mucegaiuri. Enzimele laptelui Enzimele proprii laptelui sunt acelea care i au originea n structurile celulare ale glandei mamare i cele de origine sanguin. Cunoaterea enzimelor proprii laptelui este important deoarece :

- unele dintre ele sunt implicate n aroma i stabilitatea laptelui i a produselor lactate (lipaza,xantinoxidaza, proteaza, fosfataza)

- alte enzime sunt foflosite n diagnosticarea bolilor glandei mamare (catalaza, superoxiddismutaza) - unle enzime intervin n maturarea brnzeturilor fabricate din laptele nepasteurizat (proteazaalcalin, proteaza acid, esterazele), respectiv cele care rezist pasteurizrii (plasmina sau proteaza alcalin) Enzimele laptelui pot fi localizate n : fraciunea solubil, fraciunea micelar (cazeina), membrana globulelor de grsime, materialul celular. Localizarea enzimelor indic originea lor n organismul animal (de ex. celulele secretoare ale glandei mamare, sngele). Proteaza alcalin (plasma sanguin) Aparine serin proteazelor i prezint o activitate enzimatic de tip tripsinic. Aceast enzim este asociat cu micelele de cazein. Are activitate maxim la 370C i la pH = 7,5 - 8. Proteaza alcalin are o termorezisten relativ ridicat : la 700C / 10 min. se pstreaz 20% din activitatea enzimatic. Rezist i la tratament UHT (1320C / 2s). Inactivarea complet are loc la 1420C /16s. Este o enzim de origine sanguin care ajunge din plasma sanguin, via epiteliumul glandei mamare. Enzima se gsete n lapte att sub form activ (0,14 - 0,72 mg. / l ), ct i sub form inactiv (plasminogen) n concentraie de 2,7 3,7 ori mai mare. Proteaza alcalin degradeaz preferenial - cazeina din care se formeaz 1, 2, 3 - cazeine, precum i proteozo - peptone. Degradeaz i s2 - cazeina. Proteaza alcalin poate hidroliza i s1 cazeina, conducnd la produse cu 4 legturi peptidice de tipul arginina - x, i la produse cu 7 legturi peptidice de tipul Liz -x. Se elibereaz astfel 15 peptide, cele hidrofobe fiind insolubile la pH = 4,6. k - cazeina este cea mai rezistent la aciunea proteazei alcaline. Datorit faptului c att plasmina ct i plasminogenul sunt legate de cazein i datorit faptului c c rezist n mare msur pasteurizrii, enzima va rmne n coagulul de brnz i va participa la maturarea brnzeturilor, aciunea sa crescnd o dat cu creterea pH-ului brnzei.

38

Acest lucru este vizibil n cazul brnzei Camembert, unde aciunea enzimei se intensific la sfritul maturrii, deoarece mucegaiul P. camemberti consum acidul lactic i provoac ridicarea pHului la 6,5 - 7, cnd activitatea palsminei este optim. Activitatea enzimei n brnz va fi influenat i de concentraia n NaCl, temperatura de maturare i umiditatea brnzei. Deoarece plasmina rezist tratamentului UHT (1420C / 3s), ea va produce un defect important n laptele concentrat sterilizat UHT, gelificarea fiind consecina modificrii suprafeei micelelor de cazein, ceea ce conduce la asocierea lor n agregate cu formare de gel. Fosfataza alacalin Se gsete n lapte n stare liber, dar n cea mai mare parte asociat cu membrana globulelor de grsime. Descompune majoritatea fosfomonoesterilor, inclusiv esterul fosfoserinic din cazein, dar aceast descompunere este limitat din cauza pH-ului laptelui i aciunii inhibitoare exercitate de -lactoglobulin. Fosfataza alcalin este folosit ca enzim de diagnosticare a eficienei de pasteurizare i pentru controlul gradului de agitare al laptelui (agitarea laptelui conduce la eliberarea enzimei din membrana globulelor de grsime). Lipoproteinlipaza Este o enzim asociat cu membrana globulelor de grsime, ea fiind activat de cofactori termostabili i inhibat de un inhibitor. Lipoproteinlipaza produce rncezirea lipolitic spontan a laptelui, momentul apariiei rncezirii fiind determinat de concentraia laptelui n enzim, raportul activator / inhibitor i de factorii care promoveaz eliberarea enzimei din membrana globulelor de grsime. Laptele de la sfritul perioadei da lactaie conine mai mult proteinlipaz. Lipoproteinlipaza are afinitate mai mare pentru acizii grai cu lan lung din structura trigliceridelor sau fosfolipidelor. Avnd caracter hidrofil - lipofil, acioneaz bine la interfaa emulsiilor de tipul U / A (cazul laptelui, smntnii). Poate contribui la maturarea brnzeturilor n condiiile fabricrii acestora din lapte crud sau termizat (630C / 30s). Esterazele Cele din laptele de vac au temperatura optim la 370C i pH-ul optim la 8,0. Esterazele din lapte au caracter lipofil i au specificitate mai mare fa de acizii cu lan scurt din structura trigliceridelor. Acioneaz mai bine n emulsie de tipul A / U (unt). Pot participa la maturarea brnzeturilor cu mucegai la suprafa (P. camemberti), dac acestea sunt obinute din laptele crud sau termizat.

39

Proteaza acid Cea din lapte prezint activitate maxim la pH = 3,5 - 4,0 i la 500C i degradeaz preferenial -cazeina, comparabil cu chimozima. Enzima poate contribui la maturarea brnzeturilor dac se folosete lapte nepasteurizat sau termizat (630C - 650C / 30s). Peptidaza n lapte s-a pus n eviden o dipeptidaz care hidrolizeaz peptidele L-L la pH alcalin (glicil-Lmetionina i L-alanil-L-metionina). Peptidele care conin D-aminoacizi nu sunt hidrolizate. Condiiile de activitate sunt: temperatura de 45 - 500C i pH = 7,8 - 8,3. Enzima poate interveni