Tema 5. TEHNICI DE IZOLARE ŞI CONSERVARE A CULTURILOR PURE

5.1 IZOLAREA CULTURILOR PURE DE MICROORGANISME

Îmbunătăţirea permanentă a lotului de microorganisme din care să se selecţioneze tulpini cu performanţe deosebite, utile în procesele microbiologice industriale, impune izolarea din medii naturale a mai multor culturi reprezentative, care trebuie menţinute şi studiate în laborator sub formă de culturi pure.

Tehnicile de izolare a microorganismelor, indiferent de natura lor, presupun operaţii de prelevare a probelor biologice din medii naturale, inoculare în medii de cultură specifice, şi după cultivare în condiţii optime, izolarea şi studiul coloniilor izolate, replicare pentru obţinerea de culturi pure.

Mediile eterogene din microbiota cărora se prelevează de obicei probele biologice sunt reprezentate de diverse biotopuri naturale (produse alimentare, sol, aer, ape). Numărul de probe care se analizează variază în general în funcţie de obiectivul urmărit, densitatea posibilă a microorganismelor de izolat în mediul analizat şi variaţia densităţii celulelor în habitatul respectiv în funcţie de condiţiile de mediu.

Prin cultură pură se înţelege biomasa de celule rezultate prin reproducere dintr-o singură celulă aflată într-un mediu nutritiv steril cu volum limitat. Astfel, o cultura pură este formată din celule aparţinând unei singure specii sau unei singure tulpini.

În funcţie de principiul realizării lor, metodele de izolare a culturilor pure pot fi clasificate în două grupe mari şi anume:

- metode bazate pe principiul separării fizico-mecanică a celulelor;- metode biologice

La rândul lor fiecare din aceste două grupe cuprinde metode generale, care se pretează a fi utilizate pentru izolarea majorităţii microorganismelor, sau metode de izolare specifice pentru un anumit grup, sau un microorganism individual.

Procedee fizice de izolare a culturilor pure

I. Metode prin răspândire – sunt larg folosite deoarece sunt uşor de executat, având ca principiu răspândirea celulelor, aflate în populaţii eterogene în medii naturale, prin diluare în medii lichide sau răspândire mecanică pe suprafaţa mediilor sterile solidificate.

1. Metoda Koch se bazează pe răspândirea microorganismelor recoltate din medii naturale într-un mediu nutritiv şi fixarea distanţată a celulelor în urma solidificării mediului cu formare prin multiplicare de colonii izolate între ele.Metoda este folosită în special pentru izolarea culturilor pure de drojdii. Mediul de

răspândire este mustul de malţ cu gelatină, repartizat câte 20cm3 în 3 eprubete, fluidificat şi menţinut la 35-40°C. Din proba aleasă pentru izolare se recoltează celulele cu o ansă, care apoi este trecută succesiv în cele 3 eprubete. După inoculare şi uniformizare, conţinutul fiecărei eprubete se repartizează în câte o placă Petri, iar prin solidificarea mediului celulele care rămân fixate în gel vor forma prin multiplicare colonii izolate.

În funcţie de densitatea celulelor recoltate iniţial, în placa a 2-a sau a 3-a pot exista colonii izolate (la o distanţă de cca. 2 cm), iar după studiul caracterelor microscopice ale coloniilor reprezentative se face repicarea în eprubete cu slant agar obţinându-se culturi pure (fig. 1).

Fig. 1. Tehnica de izolare a culturilor pure prin răspândire (metodaKoch)

Caractere coloniale

Bacteriile se cultivă pe mediul de cultură general bulionul de carne lichid sau solidificat cu agar-agar.

La cultivarea pe bulion de carne cu agar dintr-o celulă de bacterie, prin reproducere prin sciziune ia naştere o colonie care devine vizibilă cu ochiul liber după 24-48 h.

Bacteriile formează colonii cu următoarele aspecte:tip S (smooth – neted lucios)tip R (rough – rugos, aspru, cutat)tip M (aspect mucoid).

În secţiune coloniile bacteriene prezintă profil lenticular, crateriform, triunghiular iar perimetrul coloniilor poate fi circular, dantelat sau cu ramificaţii rizoidale (fig. 2).

Culoarea coloniilor bacteriene poate fi albă, alb-crem, galben-auriu, oranj-roşu, albastru.La cultivare pe medii nutritive lichide bacteriile pot da tulburare, sediment în cazul

bacteriilor anaerobe sau facultativ anaerobe sau formează la suprafaţa lichidelor voal caracteristic, fragil sau cutat, gelatinos în cazul bacteriilor aerobe.

Aceste caractere macroscopice servesc la identificarea bacteriilor.

Fig. 2. Caracterile coloniale ale microorganismelor

2. Metode scarificate. În plăci Petri sterile se repartizează mediul de cultură adecvat (Bulion de carne agarizat -BCA sau mus t de mal ţ agar iza t MMA). Cu ajutorul anse i se recoltează celule din mediul natural, apoi cu ansa încărcată cu celule se trasează striuri diferite pe suprafaţa mediului solidificat, astfel încât prin drumul cât mai sinuos parcurs de fir, într-o zonă a plăcii celulele să rămână ataşate de mediu şi prin termostatare 48-72 ore să se dezvolte şi să formeze colonii izolate. Se realizează apoi studiul morfologic al coloniilor reprezentative şi culturile care interesează sunt repicate în eprubete cu mediu steril obţinându-se astfel culturi pure (fig. 3, 4).

Fig. 3. Obţinerea culturilor pure prin răspândire pe suprafaţa mediului cu geloză

Fig. 4. Metoda scarificată de izolare a culturilor pure

3. Metoda în strii. Se aplică în cazul contaminării cu microorganisme străine a culturilor pure în timpul conservării acestora. Este similară cu metoda scarificată, în schimb drept mediu de răspândire se foloseşte mediul înclinat din 2-3 eprubete, în care se realizează transferul succesiv de celule, prin trasarea de striuri la suprafaţa mediului.4. Metoda Drigalski. În trei plăci Petri sterile se toarnă mediu nutritiv cu agar (stratul de mediu să fie de 0,5-1 cm grosime) şi se lasă să se solidifice. După menţinerea plăcilor în termostat 1-2 ore pentru zvântarea suprafeţei mediului, în prima placă cu o pipetă se scurge o picătură din suspensia în care se află microorganismele şi cu spat u l a Dri g al sk i aceasta se răspândeşte uniform pe suprafaţa mediului. Celulele ataşate de spatulă sunt apoi răspândite prin aceeaşi tehnică în următoarele 2 plăci Petri, realizând astfel răspândirea celulelor pe suprafaţa mediului. Prin termostatare are loc dezvoltarea de colonii izolate din care prin repicare în eprubetă cu slant-agar se pot obţine culturi pure.5. Metoda de răspândire în plăci, se aplică în special pentru izolarea culturilor pure de mucegai. O cantitate redusă din proba biologică cu microbiotă eterogenă, din care urmează să se realizeze izolarea, se introduce într-o eprubetă cu mediu agarizat fluidificat şi temperat la 42°C. După omogenizare conţinutul eprubetei se repartizează într-o placă Petri. Apoi, în aceeaşi eprubetă se adaugă mediu nutritiv steril, pentru antrenarea eventualilor spori sau fragmente hifale rămase ataşate de pereţii eprubetei, şi conţinutul se repartizează într-o altă placă Petri sterilă, operaţia continuând de 3-5 ori. În ultimele plăci pot apărea colonii perfect izolate sau chiar o colonie unică, din care prin repicare pe slant-agar se obţine cultura pură.

II. Metodele de diluare presupun diluarea probei în ser fiziologicsteril prin tehnica diluţiilor decimale, astfel încât numărul de celule într-o micropicătură din ultima diluţie să fie redus.

Metoda Lindner este folosită pentru izolarea culturilor pure de drojdii, este o metodă precisă deoarece se realizează sub control microscopic. După realizarea de diluţii corespunzătoare, încât într-o picătură să se afle o singură celulă, cu ajutorul unei peniţe topografice se plasează 9 picături pe suprafaţa unei lamele sterile. Lamela se plasează, cu picăturile în jos, pe o lamă cu excavaţie şi se studiază la microscop fiecare picătură. Se marchează apoi picătura care conţine o singură celula aparţinând drojdiei ce interesează, apoi se desprinde lamela şi cu ajutorul unei benzi sterile de hârtie se absoarbe picătura marcată. Banda se introduce apoi într-o eprubetă cu must de malţ lichid, iar prin termostatare se asigură condiţii de multiplicare a celulei, care prin reproducere va da o cultură pură.

Metoda Naumov este o metodă specifică pentru izolarea culturilor pure de mucegai. Din proba biologică se recoltează cu ansa o cantitate redusă de substrat, ce conţine celule specifice ale mucegaiului de izolat (spori, filamente hifale), care apoi se diluează în apă sterilă. Dintr-o diluţie convenabilă se aplică distanţat micropicături pe capacul interior al unei plăci Petri, peste care se adaugă în picături mediu agariz fluidificat (42-45°C), şi după 2- 3 zile de termostatare la 25-28°C, odată cu apariţia vizibilă a miceliului, se selectează, din picătura cu colonie unică, cultura pură dorită.

O altă metodă, care se pretează cel mai bine pentru izolarea culturilor pure de mucegai, constă în

inundarea suprafeţei mediului solidificat (MMA, în plăci Petri) cu aproximativ 2 cm3 dintr-o suspensie diluată de spori, care se menţine în contact cu mediul câteva minute, apoi se scurge din placă. Sporii fungici care au rămas în contact cu mediul vor forma colonii izolate, din care după studiul caracterelor morfologice, prin repicare în eprubete cu slant-agar, se vor izola culturi pure.

Izolarea culturilor pure cu ajutorul micromanipulatorului. Prin intermediul manipulatorului (aparat prevăzut cu tuburi capilare) pot fi izolate celulele dorite aflate în preparate microscopice. Utilizarea micromanipulatorului este de asemenea utilă pentru recoltarea

de ascospori din celule ascogene şi în studii de inginerie genetică (conjugare, fusiune protoplaşti).

Izolarea culturilor pure prin metode biologice

Metodele de izolare se bazează pe proprietăţile şi particularităţile fiziologice specifice ale microorganismelor ce urmează a fi izolate, prin care se diferenţiază net de microorganismele însoţitoare aflate în microbiota eterogenă din acelaşi biotop.

Metoda Burri asigură separarea microorganismelor în funcţie de necesarul de oxigen pentru desfăşurarea funcţiilor vitale (tipul respirator). După inoculare şi omogenizare în mediu cu agar (fluidificat şi temperat la 42-45°C) mediul se transferă într-un tub de sticlă (0,8×25 cm) şi se solidifică în poziţie verticală formând un tub de mediu drept. Drept medii de cultură se recomandă utilizarea de medii speciale (carne-ficat-agar, tripticază-glucoză-extract de drojdie), care conţin glucoză. Pentru inoculare se poate utiliza şi tehnica de răspândire a celulelor, în strii, în profunzimea tubului de gel (fig.5).

a bFig. 5 - Dezvoltarea microorganismelor în funcţie de particularităţile fiziologice (tipul

respirator); b - Tehnica de inoculare a microorganismelor în masa de mediu cu geloză

Prin termostatare, în funcţie de accesul oxigenului din aer, separarea microorganismelor se realizează în mod natural (după tipul respirator) (fig.5):

- microorganismele aerobe - la suprafaţa mediului drept;- microorganismele facultativ anaerobe - pe toată înălţimea tubului de mediu;- microorganismele microaerofile – pe ultima 1/3 din înălţimea mediului.- microorganismele strict anaerobe - pe mai mult de 2/3 din înălţimea tubului.

2. Folosirea mediilor selective, medii cu o compoziţie care favorizează dezvoltarea unui grup restrâns de microorganisme aparţinând aceluiaşi gen sau aceleiaşi specii. De cele mai multe ori, selectivitatea mediului este asigurată prin utilizarea unor substanţe chimice cu efect inhibitor asupra populaţiei eterogene din care trebuie separat microorganismul dorit. De exemplu, pentru izolarea streptomicetelor (agenţi utilizaţi pentru obţinerea în condiţii industriale a unor antibiotice şi enzime), bacterii filamentoase, prezente în concentraţie mare în sol în populaţii microbiene abundente şi extrem de diverse, selectivitatea mediilor se poate asigura prin una din următoarele metodele:

• utilizarea unor medii de cultură selective, care să conţină surse de carbon şi azot preferate, medii pe care streptomicetele să se dezvolte foarte bine comparativ cu eubacteriile şi fungii. În acest caz, mediile recomandate sunt acelea care conţin amidon şi glicerol drept surse de carbon, arginină sau azotaţi ca surse de azot. Combinaţia amidon-azotat este foarte favorabilă pentru izolarea streptomicetelor, deoarece acestea asimilează foarte bine azotatul comparativ cu alte bacterii;

• folosirea unor substanţe selective cu efect antifungic (actidionă 50- 100 μg×cm-3

;

pimaricină + nistatină 10-15 μm×cm-3

), sau antibacterian (polimixină 5μg×cm-3;

penicilină 1μg×cm-3). Astfel, mediul cu amidon- cazeină şi rifamicină (50μg×cm-3) poate fi utilizat cu succes pentru izolarea unui număr mare de tulpini de Streptomyces diastaticus,

cu efect inhibitor asupra altor microorganisme. De asemenea prin adăugarea de roz bengal (35μg×cm-3), în mediul cu amidon-cazeină-azotat, a fost inhibată creşterea bacteriilor, încetinită dezvoltarea fungilor, iar streptomicetele s-au dezvoltat normal.

3. Termorezistenţa diferită a principalelor forme sub care pot exista microorganismele poate reprezenta de asemenea un criteriu de separare a bacteriilor sporulate. Astfel, Bacillus subtilis agent utilizat în procese industriale de biosinteză a enzimelor de tipul amilazelor şi proteazelor, poate fi separat din microbiota eterogenă a diverselor biotopuri naturale (sol,apă, fân, produse alimentare) prin pasteurizarea probelor la 80°C/10 minute, când sunt distruse toate formele vegetative ale microorganismelor, precum şi sporii, în timp ce endosporii bacteriilor rezistenţi la pasteurizare, sunt izolaţi şi în condiţii favorabile de mediu dau naştere la culturi pure.

4. Un alt procedeu de izolare pe baza proprietăţilor fiziologice specifice constă în cultivarea în condiţii restrictive de mediu, prin stabilirea unor regimuri de pH şi temperatură optime pentru dezvoltarea unui singur microorganism sau a unui grup restrâns de microorganisme şi defavorabile pentru celelalte microorganisme însoţitoare prezente în acelaşi biotop.

VERIFICAREA PURITĂŢII CULTURILOR PURE IZOLATE

Verificarea purităţii culturilor izolate prin una din tehnicile descrise se face analizând caracterele morfologice prin studiul următoarelor caractere:

• macroscopice (culturale) - prin inoculări pe mediu nutritiv solidificat în plăci Petri, când prin controlul vizual al culturii se urmăreşte uniformitatea creşterii şi prezenţa indicatorilor morfologici caracteristici speciei izolate;• microscopice - în preparate microscopice se apreciază puritatea culturii pe baza cunoştinţelor referitoare la morfologia celulelor şi unele particularităţi specifice privind structuri de reproducere.Tulpinile izolate în număr mare din medii naturale sunt iniţial păstrate în laborator sub

denumirea de izolate şi după ce sunt studiate din punct de vedere morfologic şi fiziologic capătă identitate şi sunt definite ca tulpini ce aparţin unor specii şi genuri distincte.

Cea mai simplă şi sigură metodă de verificare a purităţii culturii izolate constă în recoltarea celulelor, realizarea unei suspensii în ser fiziologic steril, diluarea suspensiei şi inoculare în mediu nutritiv cu agar, în plăci Petri. După termostatare corespunzătoare se studiază coloniile dezvoltate în placă şi se verifică dacă indicatorii morfologici coincid cu cei ai culturii iniţiale. În cazul confirmării purităţii cultura se repică în cel puţin 2 exemplare şi se conservă în condiţii corespunzătoare care să asigure menţinerea viabilităţii, purităţii şi stabilităţii.

CONSERVAREA CULTURILOR PURE

Stabilitatea microorganismelor utilizate în scopuri ştiinţifice şi practice se poate realiza prin conservarea în timp a stării de viabilitate (a caracteristicilor morfologice şi biochimice ale microorganismelor în culturi pure), utilizând metode diverse de conservare bazate pe încetinirea proceselor metabolice ale celulelor vii.

Microorganismele îşi conservă caracterele fiziologice, în perioade de timp variabile, în funcţie de: specie; calitatea mediului; metoda de conservare; gradul de deshidratare a mediului; perioada după care este necesară repicarea culturii pe mediu proaspăt şi obţinerea de subculturi în condiţii care să evite contaminarea.

Dintre tehnicile aplicate pentru conservarea culturilor pure de microorganisme menţionăm:

- repicarea periodică la intervale scurte de timp;- privarea culturilor de accesul oxigenului;

- menţinerea culturilor la temperaturi scăzute;- păstrarea celulelor în medii cu umiditate redusă.

Metodele de conservare aplicate, specifice fiecărui microorganism, trebuie să permită menţinerea viabilităţii şi a potenţialului productiv pe o perioadă îndelungată. Indiferent de metoda aplicată cultura supusă conservării trebuie să fie pură din punct de vedere genetic.

Alegerea metodei cea mai adecvată de conservare se face în funcţie de tulpinile ce urmează a fi conservate, mijloacele tehnice disponibile şi investiţiile necesare. Literatura de specialitate oferă date privind cele mai adecvate metode de conservare a principalelor grupe de microorganisme şi în particular pentru genurile şi speciile cu importanţă industrială.

Aprecierea viabilităţii celulelor conservate prin diverse metode se realizează după reactivarea acestora prin cultivare pe medii de cultură bogate din punct de vedere nutritiv şi aprecierea cantitativă sau uneori calitativă a prezenţei celulelor viabile.

Controlul presupune stabilirea procentului de celule care şi-au menţinut viabilitatea după o perioadă de conservare prin metoda aleasă, în raport cu numărul total de celule supuse conservării.

Procentul de celule afectate prin conservare, care nu şi-au pierdut viabilitatea dar suferit modificări ale proprietăţilor biochimice se calculează prin diferenţa dintre numărul de celule care s-au dezvoltat în mediu nutritiv bogat şi numărul de celule care au crescut pe mediu sintetic (minimal).