STUDIUL FAGOCITOZEI

LP. 5 STUDIUL FAGOCITOZEI

OBSERVAREA FAGOCITRII MICROBILOR DE CTRE LEUCOCITE

Generaliti Fagocitoza joac un rol important n procesele de aprare ale organismului, ndeprtnd bacteriile i substanele strine. Celulele capabile de fagocitoz, denumite fagocite, sunt de dou tipuri: macrofage i microfage (neutrofile). Ambele rezult din celule precursoare aflate n mduva osoas, apoi circul n snge cteva zile (macrofagele sunt reprezentate de monocite, iar leucocitele polimorfonucleare cu granulaii neutrofile reprezint circa 60% din globulele albe din snge), dup care trec n esuturi unde i exercit funcia fagocitar.

fagocitele formeaz un adevrat sistem fagocitar n organism, aflat sub control nervos i umoral. Acest sistem are componente mobile (celulele circulante i n special neutrofilele) i componente sesile, reprezentate de macrofage. nglobarea microbilor prin fagocitoz i distrugerea lor ulterioar de ctre lizozomi este faza ultim a luptei organismului cu infeciile.

Principiul lucrriiSngele este incubat la 37C cu o suspensie de microbi, care sunt fagocitai de ctre leucocite. Desfurarea fagocitozei se poate observa prin microscopie n contrast de faz sau microbii se pot observa n citoplasma leucocitelor care i-au fagocitat, dup colorarea unui frotiu sangvin i examinarea prin microscopie n imersie.Materiale:

eprubete i lame, mnui nesterile, hrtie de filtru, renier

snge pe heparin

germeni microbieni (E. coli)

ap distilat

colorant May-Grunwald i Giemsa

Tehnica: 0,5 ml de snge recoltat pe heparin se amestec cu 20 ml suspensie de germeni microbieni ntr-o eprubet de plastic (sau sticl siliconat). amestecul se incubeaz la 37C ntr-o baie de ap, timp de 30 minute, cu agitare lent (18-20 micri pe minut). la sfritul incubrii se pune cte o pictur din amestec pe o lam i se ntinde un frotiu. dup uscare se face colorarea cu metoda May-Grunwald-Giemsa; se acoper lama cu soluie May-Grunwald (n prealabil filtrat) numrndu-se picturile puse (10-15 picturi), se las 2-3 minute se adaug un numr egal de picturi de ap distilat i se las 1 minut. se arunc colorantul i se acoper complet lama cu soluie Giemsa proaspt diluat (3-20 picturi din soluia concentrat la 2-10 ml ap), care se las 15-20 minute. dup ndeprtarea colorantului lama se spal cu ap la robinet, avnd grij ca jetul de ap s cad pe muchia lamei, nu pe suprafa, pentru a nu se ndeprta frotiul. apoi se las lamele s se usuce aezndu-le pe o hrtie de filtru, n poziie apropiat de vertical. lamele sunt examinate la microscop n imersie se vor cuta microbii fagocitai n citoplasma leucocitelor, de asemenea se vor observa diferitele tipuri de celule din snge, ca form, dimensiuni, prezena i forma nucleului, raportul nucleo-citoplasmatic, granulaiile din citoplasma leucocitelor.Tehnica examinrii n imersie Se plaseaz preparatul la microscop. Utilizind obiectivul de 10x se focalizeaz microscopul pe cmpul cel mai potrivit care conine bacterii. Se centreaz bacteriile n cmpul de examinare, manipulnd butoanele laterale ale microscopului.

Se schimb obiectivul la 40x i se refocalizeaz cu mai mult finee. Din nou se centreaz cmpul de examinare.

Se rotete obiectivul la jumtatea distanei ntre 40x i 100x.

Se pune o pictur de ulei de imersie pe lam, n centrul cmpului de examinare.

Se continu rotarea revolverului pn cnd cel de 100x ajunge n pictura de ulei. Sub nici o form nu trebuie ca obiectivul de 40x sa ajung n ulei.

Folosind focalizarea de finee se refocalizeaz imaginea care ne intereseaz.

Se identific forma bacteriilor.

Imediat dup ce s-a terminat vizualizarea, se terge uleiul de pe lam i de pe obiectivul de 100x, cu o crp nmuiat n xylol, toluen sau un substituent de xylol special pentru acest scop.

Aproape toi solvenii organici, n special xylolul i toluenul sunt potenial periculoi, sunt inflamabili i pot ptrunde in organism prin absorbie direct la nivelul pielii sau plmnilor. Expunerea constant la aceti solveni a fost pus n legtur cu afeciuni hepatice i chiar se consider a fi implicate n carcinogenez. Astfel este recomandat utilizarea tuturor solvenilor cu precautie i n spaii bine ventilate.

Odat ce uleiul de cedru este pus pe lam, obiectivele de 10x i de 40x nu vor mai fi folosite pn dup ndeprtarea uleiului. Uleiul distorsioneaz orice imagine vizualizat la magnificaii mai mici. Astfel uleiul se folosete doar cnd este necesar i atunci cnd nu se mai lucreaz cu magnificaii mici. Pentru utilizarea din nou a obiectivelor mici, uleiul se cur de pe lam i aceasta este lsat la uscat. Deci microscopia cu imersie este utilizat doar cnd este neaparat nevoie i numai dup ce preparatul a fost atent examinat la magnificatii mari, uscate (40x).EVIDENIEREA LIZOZOMILOR I A FAGOCITOZEI PRIN MICROSCOPIE DE FLUORESCENGeneraliti Lizozomii au rol n digerarea materialelor ptrunse n celul prin fagocitoz (aa numita funcie de heterofagie a lizozomilor). Lizozomii primari fuzioneaz cu veziculele de fagocitoz (numite fagozomi) formndu-se fagolizozomi sau lizozomi secundari. ori de cte ori se produc necroze celulare ntr-un esut, n zona cu necroze se aglomereaz celule macrofage care fagociteaz resturile celulelor moarte; n macrofage fcndu-i apariia fagolizozomii. lizozomii au proprietatea de a acumula n interior colorani fluoresceni de tipul acridin-oranjului, n consecin fagolisosomii din macrofage se pot observa prin microscopie de fluorescen, sub forma unor particule fluorescente n citoplasm. necroze celulare apar n mod normal n dezvoltarea unui embrion, avnd rol de ndeprtare a unor esuturi care nu se vor gsi n organism dup natere. De exemplu, membrana interdigital prezent la embrionul uman ntr-o anumit faz a dezvoltrii sale se necrozeaz i este digerat de macrofage. Necrozele celulare pot s fie induse de factori fizici sau ageni chimici i n cazul acesta dup natere individul poate prezenta anomalii congenitale.Principiul lucrriin embrionul de gin se induc necroze n diferite organe prin tratament cu ciclofosfamid. n zonele cu necroze se aglomereaz macrofage care fagociteaz resturile celulelor moarte. Dup administrare de acridin-oranj, acest colorant fluorescent este acumulat n lizozomii din macrofage, care se observ la microscopul de fluorescen. Pentru observare se vor folosi mugurii membrelor.Tehnica: se pun la incubat (n termostat la 37C) ou de gin; dup 48 de ore de incubare se aspir ntr-o sering 1,5-2 ml de albu de ou prin acul introdus ntr-un orificiu practicat la polul mai ascuit al oului se plaseaz apoi o bucat de leucoplast pe partea superioar a oului i prin ea se realizeaz o deschidere cu diametrul de 2 cm, cu o foarfec sau cu un disc abraziv antrenat de un motor dup ndeprtarea cojii oului se observ aria vascular a embrionului n oule fecundate; cele nefecundate se ndeprteaz marginea deschiderii se acoper cu cear i apoi se plaseaz deasupra o lam de sticl nclzit, astfel ca prin topirea uoar a cerii s se nchid etan deschiderea; se acoper cu cear i orificiul prin care s-a extras albuul. se plaseaz oul n termostat la 37C pentru 72 ore, apoi se ndeprteaz lama de sticl i se pipeteaz deasupra embrionului 150 mg ciclofosfamid dizolvat n 0,5 ml ser fiziologic. se acoper cu lama de sticl, se las la termostat nc 24 ore, apoi se ndeprteaz lama de sticl i se plaseaz deasupra embrionului 0,5 ml soluie acridin-oranj (1:10000 n ser fiziologic). dup 30-60 minute se scoate embrionul, se aeaz ntr-o cutie Petri cu ser fiziologic. se ndeprteaz mugurii membrelor cu o pens fin, se plaseaz fiecare mugure pe o lam i se acoper cu lamela. se examineaz la un microscop cu fluorescen.

Preparatul examinat: laba embrionului de gin, colorat cu acridin-oranjDe studiat: n celule macrofage care au fagocitat resturile celulelor necrozate prin tratament cu ciclofosfamid se observ fagolisosomii ca particule sferice fluorescente ce apar galbene strlucitoare pe fondul ntunecat. Particulele se afl n citoplasma celulelor macrofage, iar dimensiunile lor sau intensitatea fluorescenei sunt variabile. Se poate distinge conturul celulei macrofage i uneori i nucleul ce apare ntunecat n citoplasma uor fluorescent.