Transcript of Curs Analiza Medicamentului
Metodele controlului
- chimice - controlul proprietilor ; - (separarea componentelor) ;
- identificarea componentelor ; - dozarea componentelor
- biologice - identificarea componentelor ; - (dozarea
componentelor)
Motivele controlului
2
Metode fizice (controlul propriet ilor
fizice)
Controlul proprietilor fizice (f r scanarea unei mrimi)
solubilitatea, punct de topire, punct de fierbere, punct de
picurare, interval de distilare, indice de refracie, putere de
rotaie, studiul formei de cristalizare (polimorfism), vâscozitate
(dinamic, cinematic, intrinsec etc.), …
Controlul proprietilor fizice (cu scanarea cel puin a unei mrimi
fizice sau geometrice) spectrofometrie optic de absorbie (IR,
UV, VIS, AAS),
spectrofotometrie de emisie (Raman, de fluorescen, AES),
difracie de raze X (diferite tehnici), rezonana magnetic
nuclear (NMR), rezonan a electronic de spin (ESR),
spectrometrie de mas (diferite tehnici), metode termice de analiz
(TGA, DTA, DSC), specrofotometrie ORD i CD, …
3
- cromatografie electrocinetic micelar (MEKC)
- distilare molecular, …etc.
Metode fizice i fizico-chimice de control prezentate în Farmacopeea
European
- determinarea poteniometric a pH-lui
- densitate relativ
Metode fizice i fizico-chimice de control prezentate în Farmacopeea
Europeana
- punct de solidificare
- spectrometrie de absorbie atomic (AAS)
- spectrofotometrie de absorbie în infrarou (IR)
- spectrofotometrie de absorbie în ultraviolet i vizibil (UV,
VIS)
- cromatografie pe hârtie
6
Metode fizice i fizico-chimice de control prezentate în Farmacopeea
European
- gazcromatografie (inclusiv tehnica “head space”)
(GC)
- cromatografie lichid (LC, TLC, HPLC etc.)
- cromatografie de excludere steric (gel-filtrare)
- electroforez (gel, capilar) (CE)
- spectrometrie de rezonan magnetic nuclear (NMR)
- analiza termogravimetric (TGA)
- presiune osmotic / osmolalitate
- spectrometrie de fluorescen cu raze X (XRF)
Metode fizice i fizico-chimice de control prezentate în Farmacopeea
European
- conductibilitate electric
- spectrometrie de dicroism circular (CD)
- spectrometrie de mas (MS)
Metode fizice i fizico-chimice de control suplimentare prezentate
în alte lucrri de specialitate
- calorimetrie diferenial cu scanare (DSC) - analiz
termic diferenial (DTA) - rezonan electronic de spin
(ESR , EPR) - difracie de raze X (diferite tehnici,
probe policristaline sau
monocristaline) - spectrometrie Mössbauer - extracie
solid (SPE) - cromatografie fluid supercritic
(SFC) - cromatografie electrocinetic micelar
(MECC) - tehnici analitice cu legare specific competitiv
(RIA ,
DELFIA , ELISA etc.) - tehnici tandem (GC/MS , HPLC/MS ,
HPLC/FTIR etc.)
- metode titrimetrice de dozare specific a
componentelor
- metode titrimetrice de determinare a unor parametri globali
(indice de aciditate, indice de ester, indice de hidroxil, indice
de iod, indice de peroxid, indice de saponificare, substane
nesaponificabile)
- determinarea azotului aminic din amine aromatice
primare
- determinarea azotului prin dezagregare cu acid
sulfuric
- titrare complexonometric
- determinarea apei
- determinarea fenolului în imunoseruri i
vaccinuri
- determinarea proteinelor i acizilor nucleici în vaccinuri cu
polizaharide
- determinarea proteinelor, acizilor nucleici, fosforului, gruprii
O-acetil, hexozaminelor, metilpentozelor, acizilor uronici, ribozei
i acidului sialic în vaccinuri cu polizaharide
- determinarea monoxidului i dioxidului de carbon în
gaze
- determinarea monoxidului i dioxidului de azot în gaze
- determinarea oxigenului i apei în gaze
- determinarea dioxidului de sulf în gaze
- determinarea substanelor oxidante
- determinarea proteinelor totale
Procedee ale controlului farmacognostic
- separarea probei (amestec) în componente individuale
- identificarea componentelor
- calificarea probei i eliberarea buletinului de analiz
controlului analitic
Noiuni definite i utilizate în FR-X, referitoare la
prelevare:
- lot (o cantitate de materie prim, presupus a fi
unitar, din care se obin una sau mai multe serii de
produse)
- serie (totalitatea unitilor de produs obinute în
condiii identice, într-un singur ciclu de operaii)
- recipient (conine unitile de produs care
constituie o serie, ex. flacoane, fiole, folii, tuburi, cutii,
pungi etc.)
- ambalaj (conine recipientele grupate
adecvat)
Prelevarea probelor
Acid acetilsalicilic cristalin Cantitatea
obtinuta: serie
comprimare, includere in “blister” (ex. 10
compr./blist.)
Comprimate grupate intr-un “blister” recipient
gruparea unui numar de “blisrere (ex. 2) intr-o cutie impreuna cu
descrierea produsului
“Blistere” grupate in aceeasi cutie, impreuna cu accesorii (ex.
descrierea produsului). ambalaj
Cantitate: de 4 ori cea necesar din care:
- 2 pri: proba propriu-zis - 2 pri: contraproba
Probele/contraprobele: ambalate, sigilate, etichetate
Condiiile de prelevare sunt stabilite de productor, în conformitate
cu normativele în vigoare
Cantitatea prelevat din uniti: - alese aleator - de 3 ori cea
necesar efecturii analizelor
Numrul de uniti (necesar analizei) din serie: - în corelaie cu
monografia individual - în corelaie cu monografia
general a formei farmaceutice - în corelaie cu monografia
metodei de analiz
Prelevarea probelor dintr-un depozit
- identificarea substanei active (la masa de analiz) - analiza
complet (în laborator de control)
Eticheta probelor/contraprobelor ambalate i sigilate
conine:
- denumirea produsului - denumirea unitii respective - numrul
i data procesului verbal - cantitatea prelevat -
semntura celui care a prelevat proba
Control de laborator
Control la masa de analiz
Cantitatea prelevat:
Cantitatea prelevat:
Eticheta probelor/contraprobelor ambalate i sigilate
conine:
- denumirea produsului - denumirea unitii respective - numrul
i data procesului verbal - cantitatea prelevat -
semntura celui care a prelevat proba
21 Prelevare pentru controlul produselor elaborate în
farmacii
Cantitatea prelevat: De 2 ori cea necesar pentru analiz
- 1 parte : proba propriu-zis - 1 parte :
contraprob
Eticheta probelor/contraprobelor ambalate i sigilate
conine:
- denumirea produsului - denumirea unitii respective - numrul
i data procesului verbal - cantitatea prelevat -
semntura celui care a prelevat proba
simple
substanele solide - examinate fr prelucrare prealabil, pe o suprafa
mat, alb
substanele lichide - examinate în comparaie cu apa sau cu
etaloane de culoare
Etaloane de culoare
- soluie etalon de cobalt (6,5 % CoCl2 în HCl 1 %); - soluie
etalon de fier (5 % FeCl3 în HCl 1 %); - soluie etalon de
cupru (6,5 % CuSO4 în HCl 1%); - soluie etalon cu dicromat de
potasiu (0,55 % K 2Cr2O7
în H2SO4 1 %).
- determinarea componentelor de culori de baz;
- determinarea spectrului de reflexie
Culoarea unei suprafee se poate exprima (cu aproximaie bun) ca un
amestec, realizat în raport corespunztor, de trei culori de baz.
Prin amestecarea celor trei culori de baz se poate obine o
mulime de nuane diferite. Cele trei culori de baz se pot
stabili convenional.
Unul din convenii (sistemul R.G.B.) se bazeaz pe culorile: rou
("Red", 700,0 nm), verde ("Green", 546,1 nm) i albastru ("Blue",
435,8 nm).
Exist i alte sisteme, bazate pe alte nuane de baz, de exemplu
sistemul C.I.E.
Expresii convenionale (FR)
Volum de solvent (ml) necesar pentru dizolvarea a 1 g substan
solid sau 1 ml substan lichid,
la 20 2 oC
uor solubil de la 1 ml la 10 ml
solubil de la 10 ml la 30 ml
puin solubil de la 30 ml la 100 ml
foarte puin solubil de la 100 ml la 500 ml
greu solubil de la 500 ml la 1000 m
foarte greu solubil de la 1000 ml la 10000 ml
practic insolubil mai mult de 10000 ml
. . . raportul dintre masa unui volum de substan i masa
unui
volum egal de ap, la 20 oC ( ) sau la 4 oC ( ) (mrimi
adimensionale)
)C20apã(m
. . . masa unitii de volum din substana examinat. În S.I. se
exprim în kg/m3 ; uniti tolerate: g/cm3 ; kg/l
)C20(volum
Masurarea densitatii (cu picnometru)
Proba lichida m0 = masa picnometrului gol ; mr =
masa picnometrului umplut cu lichidul de referinta (r ) m =
masa picnometrului umplut cu proba lichida () ; V = volumul
picnometrului dr = densitatea relativa a lichidului in
raport cu lichidul de referinta
0r
0
r
r
0r
mS = masa picnometrului cu proba solida introdusa
mSR = masa picnometrului continand proba solida si
umplut cu lichidul de referinta
= densitatea absoluta a probei solide
0SR SR
Densitatea
31 Putere de rotaie (a planului de polarizare al
luminii)
. . . proprietatea substanelor optic active de a roti planul de
polarizare al luminii plan-polarizate. Activitatea
optic se datoreaz asimetriei care se poate manifesta la
nivelul:
- molecular (în stare solid, în soluie, în stare gazoas); -
supramolecular (în stare cristalin sau în soluii de
compleci intermoleculari)
Asimetrie la nivel molecular:
- cu un (sau mai muli) atomi cu configuraie spaial "chiral"
("centru de chiralitate") ( în special în cazul atomului
Csp3 )
- asimetrie molecular global (fr un centru bine definit de
chiralitate)
- asimetrie alenic - asimetrie spiranic - asimetrie
atropic
la compui organici
Putere de rotaie (a planului de polarizare al luminii
plan-polarizate)
Chiralitate molecular cu un singur centru de
disimetrie:
o singur pereche de enentiomeri (relaie obiect-imagine în
oglind)
33Putere de rotaie (a planului de polarizare al luminii
plan-polarizate)
Omeprazol (amestec racemic)
34Putere de rotaie (a planului de polarizare al luminii
plan-polarizate)
atomul de sulf
Ansamblul de vectori intensitate camp electric-intensitate camp
magnetic este chiral
Planul de oscilatie al vectorilor intensitatii de camp electric si
magnetic la o radiatie plan-polarizata
Activitate optica: rotatia planului de oscilatie a
vectorului E in jurul directiei de propagare (axa z)
→
Dextrogir (D)
Levogir (L)
Putere de rotaie (a planului de polarizare al luminii
polarizate)
Reprezentarea schematic a unui polarimetru
37 Putere de rotaie (a planului de polarizare al
luminii)
Unghiul de rotaie a depinde:
- de lungimea de und a luminii incide ( l ) - de natura
substanei chirale ( putere "proprie" de rotaie,
numit i "putere rotatorie specific", [a] ) - de grosimea
stratului de material chiral ( d ), traversat de
lumina polarizat - temperatura materialului chiral
d][
dc][
20
D
20
D
Pentru lichide :
38 Putere de rotaie (a planului de polarizare al
luminii)
Unitatea de msur pentru puterea rotatorie specific :
În uniti SI
În uniti tolerate
[a]SI = 5729,578.[a] ; [a] = 0,17453.10-3.[a]SI
Dac în sistemul tolerat concentraia este exprimat în procente (m/V,
adic grame /100 ml), atunci relaiile de conversie devin:
[a]SI = 57,29578.[a] ; [a] = 1,7453.10-2.[a]SI
Unghiul de rotaie a se msoar frecvent la lungimea de
und a radiaiei de rezonan a vaporilor de sodiu (linia
“D” a
sodiului, l = 589,3 nm), la temperatura de 20 oC ; în
consecin
i rotaia specific se exprim pentru aceste condiii: 20
D][a
de msurare Riboflavin -115 ~ -135 NaOH 0,05 M
Acetat de prednisolon +112 ~ +119 dioxan
Clorhidrat de noscapin +38,5 ~ +44,0 HCl 0,1 M
Sulfat de morfin -107 ~ -110 apa
Digoxin +10 ~ +13 piridin anhidr
Tetraciclin -260 ~ -280 HCl 0,1 M
Putere de rotaie (a planului de polarizare al luminii
polarizate)
Msurarea unghiului de rotaie permite:
Presiune osmotic. Soluii izotonice
Presiune osmotic. Soluii izotonice
Relaia van’t Hoff (pentru soluii diluate, fa de solvent
pur)
P = R .T.C în care P este presiunea osmotic ( Pa
)
R este constanta universal a gazului ideal ( R = 8,311 J/(mol.K)
)
C este concentraia de echilibru a solutului ( exprimat în nr. de
moli/m3 )
Forma relaiei van’t Hoff , în care apare concentraia molar (
Cm ) a solutului ( exprimat în nr. de moli/dm3 ) este :
P = R .T.Cm .1000
Presiune osmotic. Soluii izotonice
Hematiile sunt afectate în mod special de diferena de presiune
dintre compartimentul intra- i extracelular.
44Presiune osmotic. Soluii izotonice
Toate medicamentele administrate în forma de soluii injectabile
sunt izotonizate, fie la faza de condiionare, fie chiar înainte de
utilizare, cu componente inerte din punct de vedere farmaceutic (cu
NaCl , glucoz etc.)
La baza calculrii cantitii necesare de compus izotonizant st
urmtoarea observaie (practic): o soluie 0,2308 molar a unui solut
nedisociat este izotonic cu serul sanguin. Rezult c suma
presiunilor osmotice ale componentelor dintr-o soluie
izotonic este egal cu cea a unei soluii în care concentraia unui
solut ne-disociat este 0,2308 mol/litru.
0,2308 2
1q )(C
( Cm )i : concentraia molar a componentei “i”
E x e m p l u
S se calculeze masele de vitamin B1 (mB1 , clorhidrat de
tiamin) i clorur de sodiu ( m NaCl ) necesare pentru a
prepara 500 ml ( V = 0,5 l ) soluie izotonic, cu concentraia de 2,5
% (m/v) în raport cu clorhidratul de tiamin.
2 2
1q 1B +
l
1q ;58,45M NaCl
47Presiune osmotic. Soluii izotonice
Dac izotonizarea ar fi fost realizat cu glucoz (substant care nu
disociaz în ioni la dizolvare în ap) în loc de clorur de sodiu,
atunci :
g8,1144m
E x e m p l u
S se determine masa de clorur de sodiu ( m NaCl ) aflat
în 250 ml soluie izotonic cu urmtoarea compoziie impus
:
clorhidrat de morfin . . . . . . . . . . 10 g
bromhidrat de scopolamin . . . . . 0,2 g
clorhidrat de efedrin . . . . . . . . . . 15,0 g
clorur de sodiu . . . . . . . . . . . . . . . 4 .(
m NaCl ) g
ap distilat ad . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ml
R e z o l v a r e
Mase moleculare :
clorhidrat de morfin : 375,84 bromhidrat de scopolamin
: 438,32 cloridrat de efedrin : 201,69 clorura de
sodiu: 58,45
Concentraiile molare impuse :
Mase moleculare : clorhidrat de morfin : 375,84 bromhidrat de
scopolamin : 438,32 cloridrat de efedrin : 201,69
Concentraiile molare impuse : clorhidrat de morfin : 0,02661
bromhidrat de scopolamin : 0,00046 clorhidrat de efedrin :
0,07437
g0,7661m
Deci în 250 ml soluie izotonic, în care concentraiile celorlalte
componente sunt impuse, cantitatea de clorura de sodiu este 0,7661
grame.
50 Presiune osmotic. Soluii izotonice
Controlul izotonicitii unei soluii (de exemplu a unei soluii
injectabile) în practic se efectueaz prin teste experimentale, iar
calculele bazate pe relaiile descrise au utilizare mai puin
frecvent.
În vederea controlului izotonicitii unei soluii, se introduce în
soluia studiat o hematie uman sau de iepure i se urmrete,
prin observare la microscop, tendina de umflare sau de
restrângere a acesteia.
Atenie ! Relaia de calcul din FR -X ( pag. 511 ) este greit
!
0,90,89858m;0,2308 0,158,4
1,5m NaCl
analitic al medicamentelor
Metode de separare
- metode de extracie selectiv – se bazeaz pe dizolvarea
selectiv a componentelor din amestecul analizat prin alegerea
convenabil a unor solveni potrivii sau a unor condiii de pH
adecvate
- metode cromatografice – se bazeaz pe partiia
difereniat a componentelor probei analizate între dou medii
nemiscibile (“ faza staionar” i “ faza mobil”), fenomen
care determin mobiliti diferite ale componentelor în faza
staionar
- metoda Stas – Otto – Ogier
- metoda Griffon – Le Breton
Extr. 3x20 ml Et2OFaza Et2O Faza H2O
Extr. 3x5 ml NaOH 0,5 M
Faza Et2O Fractia A
Faza H2O (Reziduu)
Neutralizare cu NaHCO3 10 % Acidulare cu ac. tartric (pH
4-5)
Extr. 3x20 ml CHCl3
Faza CHCl3 Fractia C
10
Faza Et2O Fractia D
Neutralizare cu H2SO4 dil. + NH4OH 6M (pH 11-14)
14 Extr. 3x20 ml cu amestec CHCl3 si i-PrOH (3 + 1)
Faza Et2O Fractia E
Dizolvare la cald in amestec acetona - dimetilacetaldehida
Agitare cu solutie alcoolica de uree. Filtrare Reziduu
compusi de incluziune: uree + alcool cetilic uree +
propilenglicol
Filtrat nitrofuranoza glicerina Me-paraben Pr-paraben acetona
di-Me-acetaldehida
Et2O
Filtrare
Reziduu
Filtrat
Distilare
Reziduu de distilare
1
2
3
4
5
6
7
8
9
11
12
lungimea de unda 375 nm 13
8
Control metale grele
Filtrat
Na2CO3 5 %
Filtrare Filtrat
Reziduu
Mineralizare
Dizolvare
Metodele cromatografice de separare a componentelor unui amestec se
bazeaz pe partiia difereniat a componentelor probei analizate între
dou medii nemiscibile (faza “staionar” i “ faza mobil”),
fenomen care determin mobiliti diferite ale
componentelor.
Mobilitatea diferit a componentelor se manifest prin deplasare cu
viteze diferite de-alungul “ suportului cromatografic ”
.
Suport cromatografic :
- strat subire depus pe un suport plan (TLC)
- coloan umplut cu faza staionar
- tub capilar cu suprafaa intern acoperit cu faza
staionar
Clasificarea metodelor cromatografice
Criterii de clasificare:
1) dup starea de agregare a fazelor mobil (FM) i staionar
(FS)
2) dup polaritatea fazelor (FM i FS)
3) dup mecanismul de interaciune a componentelor probei cu FM
i FS
1) Dup starea de agregare a fazelor
1.1 Faza mobil gazoas (gazcromatografie, GC) 1.1.1 Faza
staionar solid (solid - gaz) 1.1.2 Faza staionar lichid (lichid -
gaz)
FS polare : silicagel, oxid de aluminiu, celuloz,
“Florisil”
FS nepolare : diferite tipuri de silicagel silanizat
FM polare : metanol, acetonitril, etanol, ap,
tetrahidrofuran
FM nepolare : diclormetan, cloroform, hexan, benzen, toluen
Exemple
Clasificarea metodelor cromatografice
3) Dup mecanismul de interaciune a componentelor cu FM i
FS
3.1 Cromatografie de adsorbie (adsorbia componentelor pe FS
solid, polar)
3.2 Cromatografie de partiie (partiia componentelor între FS i
FM , ambele lichide dar nemiscibile)
3.3 Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni (interaciuni
ionice între componente i FS – rin solid)
3.4 Cromatografie de gel-permeaie (gel-filtrare) (potrivire
sau nepotrivire steric a moleculelor componentelor în cavitile unui
gel - FS - inert; separare dup criteriul volumelor
moleculare)
3.5 Cromatografie de afinitate (interaciuni specifice, de
natur biochimic, între componente i FS: interaciuni de tipul
antigen-anticorp, enzim-substrat, enzim-coenzim,
enzim-inhibitor)
64I s t o r i c
F riedlieb Ferdinand Runge (1795 - 1867) farmacist i chimist -
separri pe hârtie de filtru "Der Bildungstrieb der Stoffe"
(1855)
Mikhail Semenovich Tswett (1872 - 1919) botanist
rus în 1903: separarea componentelor din extract de frunze
verzi
FS: Al2O3 si CaCO3 (umplutur polar) FM: eter de
petrol (eluent nepolar)
propune (1906) termenul de "Cromatografie"
Zechmeister (1936): apare prima carte care
trateaz cromatogarfia
Egon Stahl (1956): bazele cromatografiei în strat subire (TLC)
; în 1975 firma "Merck" lanseaz plci cromatografice de
performan
Martin & James : bazele teoretice ale cromatografiei ;
separarea acizilor grai
Martin & Singe - în 1952 -
premiu Nobel
Cs. Horvath ~ 1960 - cromatografia lichida de performan
înalt (HPLC)
Friedlieb Fredinand Runge (1795 - 1867) Mikhail Semenovich Tswett
în 1911
(1872 - 1919)
66
Placa memorial cu inscripia:
“Între 1901 – 1906 în aceast cldire a descoperit Dr.
Mikhail S. Tswett cromatografia”
semntura: “Chimistii analiti polonezi”
Separare cromatografic realizat de M.S.
Tswett
Noiune important : timp / volum de retenie
U m p
l u t u
r a : C
a C O
3
E l u e
n
t : e
Caracterizarea mobilitii cromatografice a componentelor
- prin distana (xi) parcurs de componenta " i " într-un
interval de timp dat (comun pentru toate componente) - în special
la cromatografia în strat subire
- prin timpul necesar (ti - timp de retenie al componentei " i
") pentru parcurgerea lungimii L a sistemului cromatografic -
în special la cromatografia în coloan
Literatura de specialitate contine numeroase valori R F ,
R M si hR F
pentru substante farmaceutice, masurate in conditii de
executie specificate.
71
Mobilitatea cromatografic este exprimat prin
valorile R F sau R M
R F este, prin definiie, mrime pozitiv, subunitar,
adimensional
R M are domeniul valorilor (- ∞ , +
∞) (adimensional)
R M a fost propus de Bate-Smith E. C. i Westall
R. G. C. în 1950
Caracterizarea mobilitii cromatografice a componentelor
72Caracterizarea mobilitii cromatografice a
componentelor
- prin distana (xi) parcurs de componenta " i " într-un
interval de timp dat (comun pentru toate componente) - în special
la cromatografia în strat subire
Naproxen (0,5 %) ; R f = 0,42 Diclofenac (0,5 %) ;
R f = 0,30
Acid acetilsalicilic (0,5 %) ; R f = 0,12 Tolmetin (1 %) ;
R f = 0,05
START (0 mm)
FRONT (70 mm) FS: ADAMANT UV 254 FM: CHCl3 / acetat de etil (1
: 1 v/v) Volum aplicat: 1 ml
Separarea TLC a unor analgezice
START (0 mm)
FRONT (73 mm)
Tiopental (1 %) ; R f = 0,65
Hexobarbital (5 %) ; R f = 0,41
Pentobarbital (1 %) ; R f = 0,26
Fenobarbital (1 %) ; R f = 0,18
FS: ADAMANT UV 254 FM: CHCl3 / acetona (95 : 5 v/v) Volum
aplicat: 1 ml
Separarea TLC a unor barbiturice
Reprezentarea tipica a unei cromatograme
Forma unui "peak" cromatografic: curb de distribuie tip
Gauss.
2
iσ
tt
2
1
iivi
0
e)m,σ,f(Q(t)C
0,5e
e
82Performana de separare a unui sistem cromatografic
Valoare mare pentru Ni înseamn eficien bun de separare a
sistemului pentru componenta " i " (în timpul parcurgerii lungimii
L a sistemului, componenta " i "este implicat într -un numr
mare de echilibre de partiie)
2
inti
i
2
bi
i
2
i
i
2
5,0i
i
2
i
Eficiena intrinsec (independent de natura componentelor) a unui
sistem cromatografic se exprim prin numrul limit de talere
teoretice (N)
it Nlim N
Ex. - în gazcromatografie “ N ” este de ordinul 100.000 - în
HPLC numarul “ N “ este de ordinul 10.000
“ N ” depinde de :
Dependena “ N ” de viteza liniar de deplasare ( u ) a FM :
ecuaia v a n D e e m t e r
uC u
B A
constante caracteristice sistemului cromatografic
A : depinde de factorii geometrici ; [ cm ] B :
determinat de difuzie ; [ cm2/s ] C : determinat de
transferul
componentelor între FM i FS ; [ s ]
CB2AH
C
86 Cromatografie în faz gazoas ( gazcromatografie )
FS - solid ( mai rar ) sau lichid ( mai frecvent ) FM - gaz (
hidrogen, heliu, neon, argon, azot )
În GC se realizeaz :
Variante :
- coloan cu umplutur ( scop analitic sau preparativ ) -
coloan capilar ( scop analitic )
Temperatura : 80 – 250 oC ( la controlul
medicamentelor )
Regim de lucru :
- la temperatura constant în timp ( regim izoterm ) - la
temperatura variabil în timp ( regim cu programare de
temperatur )
Evenimente realizate în coloan :
- separarea componentelor fr descompunerea termic a acestora (
eveniment tipic )
- descompunerea termic (piroliza) probei în condiii strict
controlate i reproductibile, urmat de decelarea produilor
de piroliz ( "amprent de piroliz" )
88Cromatografie în faza gazoas ( gazcromatografie )
Indici de retenie
- identitatea chimic a componentei respective - natura
FS - debitul de gaz purttor - temperatura coloanei
cromatografice - caracteristicile geometrice ale coloanei i
umpluturii
Scop : a se defini mrimi alternative, care . . .
- s depind semnificativ de identitatea chimic a componentei
respective, . . . dar . . .
- s depind în msur minim de ceilali factori
indici de retenie în locul timpilor de retenie
Indici de retenie
- indice liniar de retenie ( J )
- - - - etc - - -
Indice Kováts
Observaie : în seria omoloag a n-alcanilor, logaritmul timpilor de
retentie redui ai membrilor seriei variaz liniar cu numrul atomilor
de carbon ( n ) din molecula alcanului, dac msurrile sunt fcute în
condiii identice de lucru
S-a impus (arbitrar) : indicele Kováts al unui
n-alcan, cu " n " atomi de carbon în molecul, s aib
valoarea:
Iz = 100.n
Kováts Ervin ervin.kovats@epfl.ch
95
Relatia dintre timpul de retentie si numarul atomilor de carbon in
molecula n-alcanilor
Cromatografie în faza gazoas ( indici de retentie )
96
Relatia dintre timpul de retentie si numarul atomilor de carbon in
molecula n-alcanilor
(1) Coloana polara SCOT 06
(2) Coloana nepolara SCOT 09
(3) Coloana polara SCOT 06
(cu Carbowax 20M/KOH)
(cu Apiezon L/KOH)
Indice Kováts
Într-o coloan gazcromatografic se injecteaz un amestec care conine
n-heptan (C7H16), n-octan (C8H18), n-nonan (C9H20), n-decan
(C10H22), fenacetin. În condiiile separrii indicele
Kováts al fenacetinei este 1250. Semnalul cromatografic
al fenacetinei este situat . . .
a) . . . înaintea "picului" heptanului b) . . .
între "picurile" heptanului i octanului c) . . . între
"picurile" octanului i nonanului d) . . . între
"picurile" nonanului i decanului e) . . . dup "picul"
decanului
R spuns : e
Stimulant al SNC Coloan (Apiezon-L/KOH) ; 150 oC
SCOT03 SCOT04 SCOT05
Stimulant al SNC
Tranilcipromin 1852 1915 1248
1271
Nicotin 1876 1926 1353
1392
Clorfentermin 1916 1950 1380
1422
Modalin 1969 2015 1473 1499
Cipenamin 1976 2022 1419 1456
Fendimetrazin 2009 2057 1475
1505
N-metilefedrin 2022 2108 1405
1437
Efedrin 2072 2179 1358 1400
Pseudoefedrin 2191 2217 1362
1398
Fenilpropanolamin 2212 2295 1339
1369
Indice liniar de retenie
Notaiile corespund celor din relaia de definiie a indicelui
Kováts.
Exemple de valori ( I ) i ( J )
I J
322 K 340 K 359 K 322 K 340 K 359 K
1,2-dimetil- butan
Benzen 636,8 640,3 644,9 6,256 6,299 6,348
3-metil-hexan 676,5 676,0 676,4 6,667 6,672 6,688
Toluen 746,9 752,8 755,8 7,347 7,415 7,459
3-metil-heptan 772,0 772,6 773,0 7,613 7,629 7,646
z tt
tt J
Indici de retenie Exerciiu
Într-o coloan gazcromatografic se injecteaz un amestec care conine
metan (CH4), n-nonan (C9H20), n-decan (C10H22), i tri-n-
propilamin. Componentele se elueaz la urmtorii timpi de
retenie : nonan la 1,8 minute , decan la 6,6 minute ,
tri-n-propilamina la 3,4 minute , metan (component neretardat) la
0,2 minute. Identificai domeniile de valori în care se incadreaz
indicele Kováts (I) i indicele de retenie liniar (J)
pentru tri-n- propilamin.
a) I < 800 i J < 8,250 b) I : între 800 - 900
i J = 8,533
c) I : între 900 - 1000 i J = 9,333 d) I : între 1000 -
1100 i J = 8,250
e) I > 1100 i J = 8,533 R spuns : c
104 Cromatografie în faza gazoas ( gazcromatografie )
Indicii de retenie depind într -o oarecare msur de temperatura
coloanei. Dependena de temperatura coloanei a indicelui de
retenie Kováts, pentru o component oarecare, este descris
frecvent cu ecuaia Antoine.
CT
B AIT + +
SI – substanta de interes
IN – ingredienti SD – semnal
detector
SI – substanta de interes
IN – ingredienti EI – etalon intern
SD – semnal detector
* PEI
Prin folosirea unui etalon intern, ales adecvat, se pot compensa
unele erori (pierderi) de analiz, efectuate la operaiile de
prelucrare prealabil a probei (operaii de extracii, purificri,
diluri, derivatizri, concentrri etc.).
Cerine pentru un etalon intern bun:
- s prezinte proprieti asemntoare cu componentele de interes din
prob (s fie afectate de aceleai tipuri de erori la operaiile de
prelucrare premergtoare injectrii în coloana
gazcromatografic)
- s nu interacioneze chimic cu nici una din componentele probei în
condiiile de prelucrare i separare gazcromatografic
- s genereze "peak" cromatografic separat clar de "peak"-urile
tuturor componentelor din prob.
Caz particular de utilizare a unui etalon intern: metoda
adaosurilor
Cromatografie în faza gazoas ( gazcromatografie ) Modaliti de
analiz cantitativ (etalon intern)
108
c) Metoda adaosurilor
Se recomand în acele cazuri în care prezena unei componente (de
interes sau nu) modific sensibilitatea de detectare a unei
componente de interes ("efect de matrice") sau eficiena operaiilor
de prelucrare prealabil a probei.
Esena metodei : Se adaug probei cantiti cunoscute din componenta de
interes, afectat de efectul de matrice i se injecteaz amestecurile
în coloana GC. Se reprezint grafic semnalul detectorului (aria),
asociat cu componenta de interes dependen liniar.
Se extrapoleaz dreapta pân ce intersecteaz axa pe care sunt
reprezentate cantitile adugate. Acest punct de intersecie se gsete
pe semiaxa negativ a axei cantitilor adugate. Cantitatea
corespunztoare segmentului definit de punctul de intersecie i
originea axelor este egal cu cantitatea de component de interes
prezent în proba original.
Cromatografie în faza gazoas ( gazcromatografie )
Modaliti de analiz cantitativ 109
110
Condiie necesar : posibilitatea msurrii unui semnal de
detector care se datoreaz exclusiv componentei de interes
("peak"-ul componentei de interes s fie separat satisfctor de
"peak"-urile altor componente din prob) (EM=efect de
matrice).
Modaliti de analiz cantitativ (metoda adaosurilor)
Derivatizare : transformarea chimic, în condiii controlate, a
componentelor probei înainte de injectarea probei în
gazcromatograf
Motivaia:
Tipuri de reacii implicate (mai frecvent) :
- silanizri
- acilri cu derivai ai acizilor carboxilici ( pe gruparea
-NH2 , -NH- sau – OH )
- acilri cu acizi boronici
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC
a) cu clor-trimetil-silan (CTMS) i hexametil -disilazan
(HMDS)
Grupe funcionale afectate: -OH , -NH2 , -NHR , -SH
CTMS se utilizeaz în combinaie cu HMDS i cu piridin, în
N,N-dimetilformamid (DMFA) sau dimetilsulfoxid (DMSO).
Separat, nici CTMS, nici HMDS nu are eficiena de silanizare
corespunztoare.
Derivatizare prin trimetilsilanizare
(CTMS) (HMDS)
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin trimetilsilanizare
b) cu t-butil-dimetil-clorsilan Grupe funcionale afectate:
-OH , -NH2 , -NHR , -SH
Volumul mare al gruprii t-Bu-di-Me-silil permite uneori silanizarea
difereniat a grupelor -OH .
R-OH +
[imidazol]
Derivatizare prin trimetilsilanizare
Exemplu :
- grupele -OH secundare din poziia 3 i gruparea -OH primar din
poziia 21 se silanizeaz rapid i cantitativ ;
- gruparea -OH ( 20b ) se silanizeaz extrem de greu din cauza
împie- dicrii sterice ;
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin trimetilsilanizare
BSA este un agent de silanizare eficient pentru gruprile
-OH i -NH2
Derivatizare prin trimetilsilanizare
+ R-OH R-O-Si(CH3)3 +
e) cu (izopropeniloxi )-trimetil-silan (I POTMS)
- IPOTMS este un reactiv asimilat mai recent în GC
- IPOTMS este folosit cu succes mai ales pentru silanizarea
acizilor carboxilici, alcoolilor alifatici i
fenolilor
- atât agentul (IPOTMS) cât i produsul secundar de reacie sunt
volatili se recomand pentru silanizarea compuilor hidroxilici
volatili (excesul de
IPOTMS i acetona format se îndeprteaz uor)
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin trimetilsilanizare
- TMSDMA este utilizat mai ales pentru silanizarea aminelor i
aminoacizilor
Derivatizare prin trimetilsilanizare
TMSIM este utilizat mai ales pentru derivatizarea grupelor -OH.
Particulariti:
- în absena catalizatorului, TMSIM nu reacioneaz cu grupri aminice
bazice
- în prezena BSA sau TCMS agentul TMSIM devine extrem de eficient
chiar i în cazul grupelor -OH cu împiedicare steric (din acest
motiv se folosete pentru derivatizarea total a hidroxisteroizilor i
a altor compui polihidroxilici)
Derivatizare prin dimetilsilanizare
- scade pericolul descompunerii termice a componentelor din prob;
- la temperaturi mai mici crete puterea de separare a coloanei
GC
Particulariti:
Derivatizare prin dimetilsilanizare
a) N,O-bis-(dimetilsilil)-acetamid (DBSA)
Proprietile derivailor (clormetil)-dimetilsilil:
- prezena atomului de clor în compusul derivatizat
detectare la sensibilitate foarte mare, prin captur de electroni
(ECD)
- (clormetil)-dimetilsilil-derivaii au timpi de retenie
considerabil mai mari decât derivaii trimetilsilanizai
corespunztori separare GC mai bun a componentelor din
prob
Reactiv : cloro-(clormetil)-dimetilsilan în combinaie cu
bis-(clormetil)- tetrametil-disilazan, în piridin sau în
N,N-dimetil-formamid drept solvent
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin esterificare (acilri pe atomul de
oxigen)
a) cu cloruri acide (reacie Schotten - Baumann)
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin esterificare (acilri pe atomul de
oxigen)
b) cu halogenuri de bor
( BF 3 , BCl 3 )
BX3 + 3R-OH B(OR)3 + 3HX
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC
Derivatizare prin esterificare (acilri pe atomul de
oxigen)
d) cu acizi alchilboronici
Derivatizare prin esterificare (acilri pe atomul de
oxigen)
Compuii ciclici (alchilboronai) - proprieti GC
excelente:
- sunt stabili fa de agenii de acetilare, de trimetilsilanizare i
de metilare - reaciile de alchilboronare decurg la
temperatura camerei - raportul molar de utilizare a
reactivului de derivatizare este 1 : 1 (sau un mic
exces de acid alchilboronic) - reacia decurge în câteva
minute
Reactivi folosii frecvent :
129 Cromatografie în faza gazoas ( gazcromatografie )
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC Derivatizare prin
transformare în O-alchiloxime
Reactivi: O-alchil- -hidroxilamine
Procedeul se utilizeaz pentru derivatizarea cetosteroizilor i a
derivailor de prostaglandine
131
Column: 4 m x 2 mm I.D. glass SF: 3 % SE-30 , Chromosorb W HP
100/120 T: 160 oC to 260 oC ( 6 oC/min ) Carrier gas: N2 Detector:
FID
Anaesthetics (GC-packed column)
132Separation of TMS-derivatives of steroids (capillary GC)
Column: 25 m x 0.22 mm SF: CP-Sil 5 (0.12 mm) T: 100 oC to 210 oC
in 25 min
then 1.5 oC/min to 265 oC Carrier gas: He Detector: FID
1) androsterone ; 2) etiocolanolone ; 3) dehydro-epiandrosterone ;
4) dS-androstene-3b, 17b- diol ; 5) 11-keto-etiocolanolone; 6)
oestradiol ; 7) 11-hydroxy androsterone ; 8) 11-hydroxy-
etiocolanolone ; 9) epiprednonalone ; 10)
16-a-OH-dehydro-epiandrosterone ; 11) allopregna- nediol ; 12)
pregnanediol ; 13) pregnanetriol ; 14) 16-keto-androstenediol ; 15)
dS-androste- ne-3b,16a, 17b-triol ; 16) & 17) by-products ; 18)
17-keto-pregnanetriol ; 19) 16a-OH-preg- nenolone ; 20)
pregnene-3b, 17a, 20a-triol ; 21) tetrahydrocortisone ; 22)
tetrahydrodioctyl- phtalate ; 23) tetrahydrocorticosterone ;
24) tetrahydrocortisol ; 25) allotetrahydrocortisol ;
26) a-cortolone ; 27) b-cortolone ; 28) choloesterol ; 29) a-cortol
; 30) methyldesoxycholate (I.S.)
133
FS - solid (mai rar) sau lichid (mai frecvent) FM -
lichid (solvent unic sau amestec de solveni)
În cromatografia lichid se realizeaz :
- separarea (analitic sau preparativ) a componentelor unei
probe
- identificarea calitativ a componentelor pe baza mobilitii cro-
matografice (timp de retenie, valoare R F sau
R M etc.)
- determinarea cantitativ a componentelor din prob
Variante :
- FS în forma de strat subire, întins pe un support plan
(TLC) - coloan cu umplutur (scop analitic sau
preparativ)
Regim de lucru :
- cu compoziie constant în timp a FM ( regim "izocratic" ) -
cu compoziia variabil în timp a FM ( regim cu "gradient"
)
Cromatografie cu faza mobil lichid
134
. . . este tehnica citat frecvent în Farmacopeea Român i în cele
ale altor ri (inclusiv Farmacopeea European).
Avantaje :
lucru - dotarea cu tehnica TLC nu presupune efort financiar
deosebit
Stratul subire (FS):
135
Tipul de interaciuni cu FS (i cu FM) în care sunt implicate
componentele probei :
- adsorbie pe suprafaa solid a FS (cromatografie de
adsorbie);
- partiia între dou faze lichide nemiscibile (cromatografie de
partiie);
- potrivire / nepotrivire steric a moleculelor componentelor
cu cavitile FS (cromatografie de gel- permeaie / cromatografie
de gel-filtrare / cromatografie de excludere steric);
- interaciuni ionice (cromatografie cu rini schimbtoare de ioni);
- interaciuni specifice de tip biochimic (cromatografie de
afinitate)
Cromatografie cu faza mobil lichid
Identificarea / vizualizarea componentelor pe placa cromatografic
:
- prin mrimile R F i R M (vezi la partea
general a metodelor cromatografice);
- prin rzuirea spotului, urmat de extracia componentei i
identificarea prin metode fizico-chimice (ex. IR);
- prin stropirea plcii cu reactivi de culoare, universale sau
specifice componentelor;
- prin modificarea fluorescenei stratului subire ( ex. plci cu
indicativul F254 )
. . . etc. . . .
137
Cromatografie cu faza mobil lichid Cromatografie în strat
subire (Thin Layer Chromatography - TLC)
TLC cu presiune (Overpressure Thin Layer Chromatography -
OPTLC)
Eluentul trece prin stratul subire a FS datorit presiunii de
aprox. 25 atm.
- realizarea mult mai rapid a separrii
- separri mult mai performante comparativ cu TLC
obinuit
139
Faza staionar : - solid (mai rar) sau lichid (mai
frecvent) - deseori fixat chimic de un suport
inert
Faza mobil : - lichid - presiune: 80 - 300 atm - debit FM:
0,8 - 2,0 ml/min.
Date tipice ale coloanelor HPLC : - lungime 15 - 25 cm -
diametru interior: 3 – 5 mm - diametrul
particulelor : 5 - 20 m
Performan : uneori comparabile cu cea a GC
Natura FS : - faza staionar polar = HPLC cu faza direct
(DP) - faza staionar nepolar = HPLC cu faza invers
(RP)
Cromatografie cu faza mobil lichid
Cromatografia lichid de performan, la presiune înalt (High
Performance Liquid Chromatography - HPLC)
( Horváth Csaba - printele metodei analitice HPLC )
1966 – realizarea tehnicii HPLC
Horváth Csaba (1930 - 2004)
0
Rezoluie
t 0,5;i reprezint limea "peak"-lui nr. " i " la
semi-înlime (exprimata ca interval de timp)
t0 – timpul de retenie al componentei
neretardate
Derivatizarea componentelor din prob
- obinerea diastereoizomerilor unei perechi de enantiomeri în
vederea rezolvrii unui amestec racemic în antipozi
optici
- introducerea unui cromofor cu scopul detectrii optice a unei
componente
- H2O
- SO2
- HCl
+ H2N-R
Faza staionar în HPLC : silicagel sau material polimer
(purttor)
cu suprafaa derivatizat. În urma derivatizrii suprafa
cu
proprieti modificate (hidrofobicitate / hidrofilicitate
modificat)
148
Gruparea Si-NH-R este stabil la hidroliz îns cea mai stabil
grupare este Si-O-Si-R . Faza staionar modificat în aceast manier,
utilizat cel mai frecvent, este aceea în care R este un rest
octadecilic:
Si-O-Si(CH3)2-(CH2)17-CH3 Aceast faz staionar este foarte
nepolar.
Alte grupri legate de support :
Cromatografie cu faza mobil lichid
Octadecil -(CH2)17-CH3 Aminopropil -(CH2)3-NH2
Octil -(CH2)7-CH3 Alchilamino -(CH2)n-NH2
Hexil -(CH2)5-CH3 Nitro -NO2
Dimetilsilil -Si(CH3)2 Nitril -CN
Trimetilsilil -Si(CH3)3 Alchilnitril -(CH2)n-CN
Ciclohexil -C6H11 Propionitril -CH2-CH2-CN
Fenil -C6H5 Oxipropionitril -O-CH2-CH2-CN
-CH(OH)-CH(OH)- Amino -NH2
- copolimer stiren - divinilbenzen ;
- agaroz ; silicat de magneziu ; grafit poros ;
- gel de hidroxi-metacrilat ; sticl poroas ; hidroxiapatit
;
- grafit cu suprafaa procesat chimic
. . . etc. . . .
150
Faze mobile utilizate în HPLC Seria eluotrop a solvenilor (ordinea
cresctoare a polaritii) utilizai frecvent în HPLC :
HPLCCromatografie cu faza mobil lichid
Solvent Miscibil cu
Vâscozitate la 20 oC (cP)
Hexan nu 190 0,31
Izooctan nu 190 0,50
Cloroform nu 245 0,57
Diclormetan nu 233 0,44
Tetrahidrofuran da 212 0,55
Dietil-eter nu 218 0,23
Vâscozitate la 20 oC (cP)
Acetat de etil slab 256 0,45
Aceton da 330 0,30
1,4-dioxan da 215 1,32
Acetonitril da 190 0,37
2-propanol da 190 2,30
Metanol da 190 0,60
Ap da 190 1,00
Acid acetic da - 1,22
Faze mobile utilizate în HPLC Seria eluotrop a solvenilor
(continuare)
1) Amoxicilin 2) Benzilpenicilin 3) Feneticilin (sarea
de sodiu) 4) Flucloxacilin (sarea de potasiu)
NH
C
O
O
Faza staionar : C18 (5 m, pori de 10 nm)
Faza mobil : (A) tampon fosfat cu pH 7,0 (B) acetonitril : ap
(9 : 1 ; v/v)
Detectare : 275 nm ; Debit : 1 ml/minut
timp (min)
A (% v/v)
B (% v/v)
30-50 20 80
52-65 70 30
NH
C
O
O
157
Controlul puritii Esomepromazolului prin HPLC chiral
Rezoluia chiral a Ibuprofenului
Separarea enantiomerilor Clortalidonei
163Separarea enantiomerilor Naproxenului dintr-un amestec
neechimolar (R : S = 3 : 7)
Rezoluia enantiomerilor Bendrofluometazidei
Gel Permeation Chromatography (GPC) - sortarea mecanic a
moleculelor din prob dup dimensiunile lor în soluie
Utilizare : mai ales pentru separarea componentelor cu molecule
mari (oligomeri, macromolecule): proteine (anticorpi, toxine,
enzime), peptide, oligo- i polizaharide etc.
Mecanism de interaciune cu FS : în cazul ideal interaciunile
fizico- chimice dintre FS i componentele probei sunt
neglijabile
Singurul factor de separare: potrivirea / nepotrivirea unor
molecule în cavitile FS
Molecule mai voluminoase mobilitate cromatografic mai
mare
Cromatografie cu faza mobil lichid
Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
V0 - volum interstiial VT - volum liber total
(accesibil moleculelor)
168
Într-o prim aproximaie: volumul molecular este proporional cu masa
molecular relativ ; din acest motiv se afirm c în croma- tografia
de gel- permeaie componentele sunt separate în funcie de masa
molecular relativ a lor
Derularea separrii se poate exprima prin timpul de retenie sau prin
volumul de retenie. În GPC deseori se utilizeaz volumul de retenie
(volumul de FM care a prsit coloana pân în momentul ieirii unei
componente din coloan). Dac componentele probei nu sunt implicate
în interaciuni specifice cu FS (separarea are loc strict dup
criterii de potrivire steric), atunci se verific relaia
:
Cromatografie cu faza mobil lichid
Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
VT > V > V0
în care V este volumul de retenie al componentei care are
masa
molecular relativ egal cu
169
Între moleculele probei, unele au volumul (masa molecular relativ
M) suficient de mare pentru ca s nu se potriveasc în nici una
dintre cavitile gelului. Toate moleculele care au volumul molecular
egal cu – sau mai mare
decât – acest prag, elueaz la volumul de
eluie
egal cu V0. Între moleculele probei, unele au volumul (masa
molecular relativ m) suficient de mic pentru ca s se potriveasca în
toate cavitile gelului. Toate moleculele care au volumul molecular
egal cu – sau
mai mic decât – acest prag, elueaz la volumul de
eluie egal cu VT. Dac o component (notat prin X) are volumul
de retenie mai mare decât VT , înseamn c aceasta este implicat în
interaciuni specifice cu faza staionar (fenomen nedorit în
cromatografia de gel-filtrare).
Cromatografie cu faza mobil lichid
Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
În cazul în care separarea are loc strict dup criterii sterice, un
anumit gel (cu o anumit extindere a dimensiunilor cavitilor )
poate separa molecule cu volum molecular (i implicit cu mas molecu-
lar) cuprins între o limit superioar (LS) i o limit inferioar
(LI)
Cromatografie cu faza mobil lichid
VT > V
Cromatografia de gel- permeaie se utilizeaz i pentru
determinarea masei moleculare a unor molecule mari, cazuri în care
alte metode nu pot fi utilizate
Migrarea unei componente se caracterizeaz prin capacitatea de
reinere
(K ) sau prin coeficientul de distribuie al coloanei [
(K d) ] , date
referitoare la componenta în cauz (având masa molecular ) :
0 V
T V
0 VVμ
pori V
0 VVμ
μ)d (K ;
0 V
0 VVμ
(K d) reprezint fraciunea din volumul fazei staionare
care este
disponibil pentru componenta cu masa molecular relativ .
Cromatografie cu faza mobil lichid
Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
172
În practic este greu de determinat volumul fazei staionare
V pori . Din acest motiv este mai convenabil utilizarea
constantei (K av) (constanta de
"disponibilitate" – " availability constant
" – referitoare la componentele cu masa molecular
relativ m).
0 V
col V
0 V
μ V
Vcol reprezint volumul interior al coloanei, volum egal cu
suma volumelor spaiului interstiial, porilor i miezului
solid:
Vcol = Vsolid + V pori + V0
(K av) reprezint fraciunea din volumul umpluturii
colanei, disponibil componentei cu masa molecular relativ .
Cromatografie cu faza mobil lichid Cromatografia de
gel-permeaie (gel-filtrare)
de celuloz, copolimeri (stiren - divinilbenzen), polimeri
(poliacrilamid, alcool polivinilic, polistiren,
polimetacrilat),
dextran, proteine globulare, silicagel hidratat etc.
În cazul unui gel dat, raportul μ
) d
(K
μ )
componentelor care nu manifest interaciuni specifice cu gelul
(numai interaciuni sterice), se verific inegalitatea 0 <
(K av) < 1
Pentru gelurile comerciale se dau curbele de selectivitate
(dependena constantei K av de lg ).
Cromatografie cu faza mobil lichid Cromatografia de
gel-permeaie (gel-filtrare)
4: adenilat kinaza (32.000);
5: citocrom C (12.400)
Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
Purificarea crotaminei din veninul de arpe (200 mg de venin de
Crotalus durissus
terrificus)
Gel: Sephadex G-100 (2,5x85 cm); Faza mobil: tampon formiat de
amoniu (pH 3,0)
1: convulxin; 2: gyroxin; 3: crotoxin; 4: crotamin
Separarea proteinelor prin cromatografie de gel-filtrare 1. IgM de
oarece
(M = 900 kDa); 2. Tiroglobulin bovin
(M = 670 kDa); 3. b-amilaz din cartofi
(M = 200 kDa); 4. Seralbumin bovin
(M = 67 kDa); 5. Albumin aviar
(M = 45 kDa) 6. Ribonuclez bovin
(M = 13,7 kDa); 7. Azid de sodiu
(M = 0,067 kDa)Gel: Dextran (coloana ZORBAX FG-250
Relaia dintre logaritmului masei moleculare i volumul de eluie la
cromatografia de gel- permeaie.
Curbele individuale sunt trasate cu fracii de polistiren având mase
moleculare diferite.
1. Dextran-50 (43,5 kDa)
2. Dextran-25 (21,4 kDa)
3. Dextran-12 (9,98 kDa)
4. Dextran-5 (44,4 kDa)
5. Dextran-1 (1,08 kDa)
179
Cromatograma unei probe de dextran având componente cu grade
diferite de policondensare (molecule coninând un numr variabili de
meri). Masa molecular medie a amestecului este 1000 Da. Separarea
este realizat pe un gel de tipul “Sephadex peptid HR” (T.
Anderson i colaboratorii:
J . Chromatography 1985:326, 33)
Cromatografie cu faza mobil lichid
. . . este o tehnic performant de separare a compuilor anorganici
sau organici care, în condiiile de lucru, manifest caracter ionic
(posed sarcin electric).
Mecanism de interaciune :
- interaciuni electrostatice între speciile ionice din prob i
gruprile ionizate legate pe suprafaa particulelor de
rin
- echilibre de schimb ionic - efect salin primar i interaciuni de
solvatare
Faza staionar :
- dup natura speciilor ionice schimbate
- cationii (schimb cationi; grupele ionizabile, legate chimic de
rin, au sarcina electric negativ)
- anionii (schimb anioni; grupele ionizabile, legate chimic de rin,
au sarcina electric pozitiv)
- dup tria acid (bazic) a gruprilor ionice legate de
rin
- cationit / anionit tare - cationit / anionit slab
• Un cationit este în " forma H " dac ionul reinut pe
suprafaa lui (prin inter - aciuni electrostatice cu gruprile
legate chimic de rin) este protonul, H +. Dac acest ion este
dislocat din vecintatea grupelor legate de rin cu ali ioni, de
exemplu cu Na+, atunci cationitul este în " forma Na ".
• Un anionit este în " forma OH " dac ionul reinut pe
suprafaa lui (prin in-
teraciuni electrostatice cu gruprile legate chimic de rin) este
ionul OH - . Dac
acest ion este dislocat din vecintatea grupelor legate de rin cu
ali ioni, de
exemplu cu Cl - , atunci anionitul este în " forma Cl ".
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni
Ionii (A) imobilizai în
funcie de preferina
grupelor de funcionale
în funcie de condiiile
chimice din faza lichid
(pH, trie ionic, etc.)
184
Ionii Na+, prezeni în soluie, disloc protonul din gruparea sulfonic
a rinii i sunt fixai, prin fore electrostatice, în sfera de
solvatare a anionului sulfonat. Protonul trece în soluie în forma
disociat (electrolit tare). Procesul este reversibil.
Echilibrul nu este deplasat pre- dominant într-un anume sens.
Dac în urma dislocrii proto- nului, acesta trece în soluie în forma
de electrolit slab (con- centraia de H+ mic), atunci
echilibrul este deplasat spre " forma Na " a rinii.
Exemplu : Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni
185
Dac rina aflat în "forma Na" este plasat într -o soluie cu
concentraie destul de mare a ionilor de K + (electrolit
tare), atunci ionii Na+ din sfera de solvatare a anionului
sulfo-nat pot fi dislocai (proces reversibil) de ionii de
K +. Rina aflat în "forma K" sau în "forma Na" se poate
transforma din nou în "forma H" dac este introdus într-un mediu cu
concentraia suficient de mare a ionilor H+ (nu în ap
distilat, deoarece aici concen-traie ionilor H+ este mic, de
ordinul de mrime 10-7 mol/l la 22 oC).
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni Exemplu :
186
Gruparea ionizabil activ, legat chimic de rina de tip cationit,
poate fi alta decât sulfonic, de exemplu poate fi grupare
carboxilic. Având în vedere faptul c acizii carboxilici sunt acizi
mai slabi decât acizii sulfonici (acizii carboxilici disociaz în
msur mai mic decât acizii sulfonici), în " formele H " protonul din
sfera de solvatare a gruprii sulfonice este disociat în msura mai
mare decât protonul din sfera de solvatare a gruprii
carboxilice.
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni
187
Exemplu :
Un anionit este capabil s schimbe anionul reinut în sfera de
solva-tare a grupei active (un cation cu sarcina electric pozitiv)
cu un alt anion, aflat la concentraie suficient de mare în mediul
cu care rina este în contact.
Anioniii au gruparea ac- tiv cu caracter bazic (în funcie de tria
bazic a grupei active, anionitul
poate fi tare sau slab).
Rinile schimbtoare de ioni rein ionii în mod di-
fereniat.
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni
Cationit Structura rinii Gruparea ionogen
Amberlit IR-100 Amberlit IR-105
Zeo-Carb 225 copolimer stiren - DVB -SO2OH
Amberlit IR-50 polimer de acid metacrilic -COOH
Zeo-Carb 216 fenolic -OH ; -COOH
Sephadex SE-25 Sephadex CM-50
nucleu aromatic
Sephadex DEAE A-25 Dextran -O-CH2-CH2-N(C2H5)2
Câteva rini schimbtoare de ioni ( II )
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni
190
Schema unei instalaii simple pentru separare cu coloan umplut
cu rin schimbtoare de ioni.
Montajul asigur acoperirea în permanen a rinii cu eluent.
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni
Instalatie de cromatografie ionica
192 Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni
Izolarea acizilor slabi (organici) dintr-un amestec ( I
)
Acizii slabi (organici, R-COOH), datorit gradului de ionizare
redus, sunt reinui din soluii apoase sau alcoolice numai pe rini
anionice puternic bazice, de pe care se elueaz cu soluia unui
acid puternic ( X
- H+ , de exemplu acid clorhidric în etanol sau acid
acetic ), cu grad de
ionizare avansat.
Izolarea bazelor organice dintr-un amestec ( I )
Izolarea bazelor organice dintr-un amestec ( II )
Bazele organice mai pot fi eluate cu soluii diluate de hidroxid de
sodiu sau cu amoniac în solveni organici (ex. alcooli).
Exemplu : izolarea alcaloizilor din produse vegetale
196
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni
Separarea amestecurilor de alcaloizi (amestec de morfin i
codein)
Proiectia Fischer a moleculei de glucoza
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni
Determinarea efedrinei (sulfat) dintr-un sirop
densitate de sarcina
1 2 3
AcO- OH- F-
1 2 3
Cl- NO3 NO2
1 2 3
NO3 SO4 SO3
densitate de sarcina
1 2 3
K + Na+ Li+
1 2 3
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni
Cationit
Ordinea de elutie acizilor si bazelor de pe un anionit respectiv de
pe un cationit
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni
- descompunerea spectral a unei radiaii emise de proba -
modificarea spectrului unei radiaii electromagnetice ca urmare
a
trecerii acesteia prin prob
- spectrometrie de rotaie optic (ORD) - spectrometrie de dicroism
circular (CD)
Mecanismul de generare a spectrelor la nivel molecular / atomic
:
- tranziii electronice între strile staionare (cuantificate) ale
moleculelor sau ale atomilor
- tranziii între strile staionare de vibraie ale
moleculelor
Modul de manifestare a interaciunii radiaiei cu proba :
- absorbie - emisie - fluorescen
Domeniul spectral implicat :
- ultraviolet (UV) : 200 - 380 nm - vizibil (VIS) : 380 - 800 nm -
infrarou apropiat (NIR) : 800 - 2500 nm - infrarou mijlociu (IR) :
2500 - 50000 nm - infrarou îndeprtat (FIR) : 50000 - 1000000
nm
UV-A : 320 – 400 nm
UV-B : 280 – 320 nm
UV-C : 100 – 280 nm
210
Corelarea între modul de manifestare al interaciunii radiaiei cu
proba i mecanismul de generare a
semnalului optic util
Absorbie Emisie Fluorescen Efect Raman
Rotaie optic
UV
ultraviolet i vizibil
Msurarea variabilelor de energie ale unei radiaii monocromatice la
trecerea acesteia printr-un strat de prob, în funcie o variabil de
und a radiaiei
Variabile de und :
- frecven ( f ) ( Hz )
λ
Moduri de reprezentare a spectrelor de absorbie ( I )
Reprezentare potrivit pentru determinri cantitative
Reprezentare utilizat pentru cataloage de spectre in vederea
identificrii compusilor
Spectrofotometru monofascicol
(unor) componente chimice. Componentele chimice, care sunt
prezente în prob dar nu prezint interes spectrofotometric
(formeaz numai mediul în care se gsete substana de interes),
constituie "matricea" probei. Pentru a scade automat spectrul
matricei (deseori spectrul solventului) din spectrul
amestecului,
se utilizeaz spectrofotometre cu fascicol dublu.
t r u
i c o
220
Relaii cantitative între variabilele de energie i datele de
interes analitic
Fie - A(l) - absorbana unei probe la lungimea de und l ;
- d - grosimea probei (stratul de material prin care a
trecut radiaia) ; - c - concentraia molar a speciei chimice
care
absoarbe la lungimea de und l ;
atunci, în condiii ideale se verific relaia ( Bouguer -
Lambert - Beer )
)(dc )(
Conform relaiei Bouguer - Lambert - Beer , absorbana este
direct proporional cu concentraia molar a speciei chimice
rspunztoare de absorbia optic.
Coeficientul e(l) se numete coeficient de absorbie molar (sau
absorbtivitate molar ) i este o caracteristic a speciei
chimice care cauzeaz absorbia optic ( depinde de l ).
Relaia Bouguer - Lambert - Beer ( BLB) se
verific cu urmtoarele condiii :
- concentraia molar s nu fie prea mare ( c < 10-2 mol/l )
;
- radiaia difuz în spectrofotometru s fie neglijabil ;
- speciile chimice rspunztoare de absorbie optic, sau matricea
(solventul) s nu fie implicate în echilibre chimice, dependente de
concentraii.
224
La concentraii mai mari decât 10-2 mol/l ,
relaia Kortüm descrie mai fidel dependena absorbanei de
concentraie ; A(l) propor ional cu expresia urmtoare
:
22 ]2)λ (n[
+
Relaii cantitative între variabile de energie i datele de
interes analitic
În relaia de mai sus n(l) este indicele de refracie al probei la
lungimea de und l.
225Relaii cantitative între variabile de energie i datele de
interes analitic
Relaia BLB deseori este utilizat în una din urmtoarele
forme :
%Cd)(A)(A;Cd)()(A %1
A(l) este absorbana msurat la lungimea de und l ;
e l) este absorbtivitatea molar a speciei absorbante la
lungimea de und l ;
este absorbia specific a speciei absorbante la lungimea de
und l ;
d este grosimea de strat traversat de radiaia electromagnetic
;
C este concentraia molar în prob a speciei absorbante
;
C% este concentraia procentual (m/V) a speciei
absorbante
)(A %1 cm1 l
226Relaii cantitative între variabile de energie i datele de
interes analitic
Uniti de msur (tolerate, utilizate în practica
spectrofotometric):
cmg
dl
cmgram
în care:
Combinaii de mrimi utilizate în controlul analitic al
medicamentelor
Raportul valorilor de absorban, msurate în spectrul unei specii
chimice la dou lungimi de und diferite l1 i l2 , nu
depinde (conform relaiei BLB) de concentraia speciei chimice
absorbante, deci se poate utiliza pentru stabilirea identitii
chimice a componentei respective :
)d(stratdegrosimeadenici),c(,ieconcentratdedepindenu )(A
l l
Diferena valorilor de absorban, msurate în spectrul unei specii
chimice la dou lungimi de und diferite l1 i l2 , este
direct proporional (conform relaiei BLB) cu concentraia
speciei absorbante, deci se poate utiliza pentru determinarea
cantitativ a speciei chimice respective
)]()([dc)(A)(A 2121 lelell
229
În practica analitic se recurge la msurarea absorbanei la lungimi
de und diferite i utilizarea unei expresii de corectare în cazurile
în care benzile de absorbie a dou (sau mai multe) specii chimice se
suprapun într-o msur considerabil
Analiza spectrofotometric a amestecurilor
231Analiza spectrofotometric a amestecurilor
Morton i colaborrii au propus o metod spectrofotometric,
practicat în domeniul ultraviolet, pentru determinarea
vitaminei A (în form de alcool) dup saponificarea prealabil a
formelor esterificate (ex. acetat). La determinarea din soluii
uleioase (pe baza de ulei din ficat de pete), absorbia
uleiului interfer cu cea a vitaminei A; din acest motiv autorii
recomand citirea absorbanei la trei lungimi de und diferite (325 nm
, 310 nm i 334 nm) i calcularea unei valori corectate de absorban,
A(cor), conform relaiei de mai jos.
A(cor) = 6,815.A(325 nm) - 2,555.A(310 nm) - 4,260.A(334
nm)
232
În 1966 E. Farkas a propus, pentru controlul puritii
tolazolinei, raportul absorbanelor msurate la 257 nm i 250 nm.
Pentru o soluie de tolazolin nedescompus, acest raport trebuie s
aib valoarea 0,55.
55,0 )nm250(A
Drept test de puritate (substan nedescompus) pentru soluia etanolic
de tolazolin V. Georgescu-Parazina i A.
Cosmin au propus urmtorul raport de absorbane.
53,1 )nm5,263(A
)nm257(A 51,1
- - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - -
Analiza amestecurilor f r separarea chimic a
componentelor
C1 , C2 , . . . , Cn , . . . , C N
Conform relaiei BLB rezult :
1n n0 ),2,1; N,,2,1n(;C)(dA)(A
),,2,1; N,,2,1n(;)C()(d)(A netnn Llll e
net
“pn” reprezint ponderea soluiei etalon nr. “n” în determinarea
valorii absorbanei amestecului (probei)
În practic L > N + 1 pentru a minimiza efectul erorilor de
msurare asupra rezultatului final al analizei
sistem de ecuaii supradeter - minat, care se rezolv cu metoda
celor mai mici ptrate
Raportul exprim
concentraia componentei “n”
net
n
)(C
C
) N,,2,1n(;)(A)(A) p,A(F 2
ll+L
Concentraiile componentelor din prob se calculeaz astfel :
Cn = pn.(Cet)n ; ( n = 1 , 2 , . . . , N )
Analiza amestecurilor f r separarea chimic a
componentelor
Dup rezolvarea sistemului de ecuaii în raport cu A0 i
pn (n = 1 , 2 , . . . , N) se recalculeaz absorbanele
probei la cele L valori de lungime de und :
Potrivirea valorilor de absorban msurate ale
probei cu cele recalculate, se exprim prin ptratul
coeficientului de corelare (r 2) :
0 < r 2 < 1
Amestec (prob) Acid salicilic Cafein Paracetamol 0,4878
0,0901 0,2097 1,7715
0,4454 0,0550 0,2906 1,4761
0,4140 0,0534 0,3975 1,1169
0,3987 0,0727 0,5080 0,7877
0,4016 0,1147 0,5879 0,5607
0,4105 0,1816 0,6014 0,4452
0,4051 0,2720 0,5265 0,3848
0,3741 0,3750 0,3788 0,3136
0,3246 0,4646 0,2008 0,2338
0,2793 0,5171 0,0747 0,1551
0,2391 0,4998 0,0257 0,0860
0,1952 0,4214 0,0149 0,0423
0,1401 0,2929 0,0130 0,0288
0,0882 0,1658 0,0111 0,0242
0,0553 0,0840 0,0107 0,0226
0,0352 0,0377 0,0086 0,0197
0,0282 0,0202 0,0098 0,0209
Concentraii în soluii (mg/l) C1 ; C2 ; C3 20,02
10,03 20,03
Exemplu
L = 17 ; N = 3
13591,3 p03468,8 p62596,2 p99028,0A48990,7
53587,1 p62596,2 p71985,1 p71305,0A86970,3
04982,1 p99028,0 p71305,0 p31281,1A71800,3
72240,4 p48990,7 p86970,3 p71800,3A0000,17
l paracetamol/mg030,402,2020133,0)C( pC
)(A l )(A l
244
CARTER, G.T., SCHIESSWOHL, R.E., BURKE, H., YANG, R. J. Pharma.
Sci., (1982) 71: p. 383
)λ ,(λ R )(λ ε
)(λ ε 21I
)(λ ε 21I
2I1I21II
2S1S21IS
2121I
Supresarea contributiei ingredientilor
indiferent de concentraia ansamblului de ingredieni, în timp ce . .
.
AS(246,8 nm) – 0,9467.AS(243,8 nm) ≠ 0
Se observ din spectre c :
0.0000
0.0200
0.0400
0.0600
0.0800
0.1000
0.1200
0.1400
0.1600
0.1800
0.2000
y = s e
m n a
l c o
r e c
t a t
( d =
Supresarea contributiei ingredientilor
Semnal optic
Cantitate (mg/comprimat)
Semnal optic
Cantitate (mg/comprimat)
Semnal optic
Cantitate (mg/comprimat)
Rezultatele analizei produsului “MEDOSTATIN”
Spectrul ingredientilor A0(l)
Exemplu: determinarea prin spectrofotometrie a Diazepamului si
a Bromurii de Otiloniu in amestec
NN
CC
OO
Cl
Bromura de Otiloniu
B. Morelli : Fresenius’Anal. Chem., 1997:357, 1179
A.Y.E. Sayed, N.A.E. Salem : Analytical Sciences
2005:21, 595
Determinarea
Spectre de absorbtie
V. David, Iulia Gabriela David, V. Dumitrescu
In spectrul derivat al
Eferalganului la 243,5 nm
numai Paracetamolul (1) la
determina concentratia
determina concentratia
Paracetamolului (1)
contin componentele unice X , Y , Z etc. la concentratii
molare
cunoscute sunt :
et Y
et X
Absorbanta unui amestec de componente X , Y , Z etc., la lungimea
de unda l, este :
Metoda “First Derivative Ratio Spectrophotometry”
F. Salinas, J.J. Berzas, A. Espinosa
Talanta, 1990:37,347
++
C)(d)(A
C)(d)(A
C)(d)(A
(*)
Se observa :
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
(*)
+
N.K. Vipul, M. Rajshree : Anal. Sci., 2007:23, 445
Atorvastatin : reduce in special colesterolemia serica
Fenofibrat : reduce in special concentratia trigliceridelor
serice
260Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului cu
metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
261Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului cu
metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
262Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului cu
metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
263Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului cu
metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
264Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului cu
metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry”
Într-o soluie componentele chimice X i Y, prezente în momentul
preparrii soluiei, interacioneaz chimic în diferite rapoarte
stoechiometrice i prin procese de echilibru formeaz M compui
chimici noi :
a b a b
a b a b
a b a b
a b a b
a b a b
Scopul urmrit este determinarea numrului de echilibre chimice
independente din sistem
Importana în controlul medicamentului:
numeroase substane active for - meaz compleci de transfer de
sarcin (compleci moleculari) fie cu substanele active ale altor
medicamente, fie cu unii ingredieni este afectat
biodisponibilitatea medicamen- tului
Se vor nota în continuare :
eX , eY absorbtivitatea molar a speciilor X respectiv Y
; CX concentraia analitic (iniial) a componentei X ; CY
concentraia analitic (iniial) a componentei Y ; [X] , [Y]
concentraiile de echilibru ale speciilor X respectiv Y ; [(XY)m]
concentraia de echilibru a speciei XamYbm
Determinarea numrului de echilibre chimice independente
CX = [X] + a1 .[(XY)1] + a2
.[(XY)2] + . . . + am .[(XY)m] + . . . +
.[(XY)2] + . . . + bm .[(XY)m] + . . . +
Determinarea numrului de echilibre chimice independente
A(l) = d.{eX(l).[X] + eY(l).[Y] + e1(l).[(XY)1] + . . . +
eM(l).[(XY)M]}
Dup exprimarea concentraiilor de echilibru [X] i [Y] în funcie de
concentraiile analitice cX i cY , rezult:
A(l) = d.{eX(l).(CX - a1.[(XY)1] - . . . - am.[(XY)m] - . . .
-
- aM.[(XY)M] ) + eY(l).(CY - b1.[(XY)1] - . . . -
- bm.[(XY)m] - . . . - bM.[(XY)M] ) + e1(l).[(XY)1] + . . . +
269 Determinarea numrului de echilibre chimice
independente
În cazul în care componentele iniiale X i Y nu ar fi implicate în
nici un echilibru chimic, absorbana soluiei, A*(l), s-ar compune
aditiv numai din contribuiile acestor dou componente.
A*(l) = d.(eX(l).CX + eY(l).CY)
Diferena dintre absorbana de echilibru a sistemului i absorbana
A*(l) este absorbana de exces Aex(l) ; aceasta se poate
atribui modificrilor din sistem cauzate de echilibrele
chimice.
Aex(l) = A(l) – A*(l) =
A(l) – d.(eX(l).CX + eY(l).CY)
Aex(l) = d
.S [(XY)m].(em(l) – eX(l).am – eY(l).bm) m
= 1
M
270
Se prepar s = 1 , 2 , . . . , S soluii care se deosebesc prin
valorile de concentraii
analitice CX i CY . Se msoar pentru fiecare soluie, la
acelai set de lungimi de
und l1 , l2 , . . . , lL convenabil ales,
absorbana de exces As ex(l) ; (s = 1 ,
2 , . . . S). Se impune ca atât numrul S al
soluiilor preparate cât i numrul L de
lungimi de und s fie mai mare decât numrul de echilibre M
prognostizat. Valorile As
ex(l) ; (s = 1 , 2 , . . . S) , (l1 , l2 , . .
. , lL) obinute se organizeaz într -o matrice :
Determinarea numrului de echilibre chimice independente
e xA Prin determinarea rangului matricii se poate preciza
numrul M al speciilor chimice care coexist în soluie ca urmare a
echilibrelor, în afara speciilor X i Y, deci numrul speciilor
ale
Soluie stoc X
s(l)
Amestecare
A(l) = d .{eX(l).[X] + eY(l).[Y] + eXY(l).[XaYb]}
Se va admite, c eY(l) este neglijabil în domeniu spectral
investigat ; în acest caz rezult :
A(l) = d .{eX(l).[X] + eXY(l).[XaYb]}
CX = [X] + a.[XaYb]
Dac în domeniul spectral exist cel putin o lungime de und
(l*)
pentru care eXY(l*) = a.eX(l*) = e(l*) atunci rezult
:
A(l*) = d .{eX(l*).[X] + a.eX(l*).[XaYb]}=
= d .{e(l*).[X] + a.e(l*).[XaYb]}=
= d . e(l*) .{ [X] + a.[XaYb]} = d
. e(l*).CX
274Punct izosbestic
Exemplu : componenta Y (a crei absorbie este neglijabil) poate fi
protonul ( H+ ) ; de exemplu echilibrul protolitic al
eugenolului (protonul nu absoarbe în ultraviolet)
Apariia unui punct izosbestic poate fi cauzat nu numai de un
echilibru, dar i de un proces ireversibil, cu condiia ca în sistem
s se desfoare un singur proces
Spectrele suprapuse, înregistrate în momentele diferite ale desfu-
rrii procesului, pot prezenta punct izosbestic cu condiia s
existe
o lungime de und (l*) pentru care eX(l*) = eY(l)
1,4-dihidro-2,6-dimetil-4-(2-nitrofenil)- -3,5-piridin-carboxilat
de dimetil
264 274 284 294 304 314 324 334 344 354
lungime de unda (nm)
A b s z
o r b a
n t a
( d =
1 c m
)
2 8 9
n m
Fototransformarea acetatului de retinil (iradiere:
300 – 400 nm)
( metoda variaiei continue )
Concentraiile speciilor X i Y în una din soluiile preparate :
YX
Fraciile molare ale substanelor dizolvate în amestecul obinut
sunt:
Concentraiile molare CX i CY se exprim în funcie de
variabila introdus (x) astfel:
CX = C.x ; CY = C.(1-x)
280
Concentraiile molare de echilibru ale speciilor prezente, X , Y
i XaYb , satisfac relaiile :
[X] = CX – a.[XaYb] =
C.x – a.[XaYb]
[Y] = CY – b.[XaYb] =
C.(1 – x) – b.[ XaYb]
[X]a.[Y]b = K .[XaYb]
Metoda variaiei continue
Dac se prepar o serie de soluii de lucru amestecând volume
diferite
(VX)i i (VY)i , (i = 1 , 2 , . . . , S) ale soluiilor
stoc, astfel încât la
fiecare soluie de lucru suma volumelor amestecate s fie
aceeai,
(VX)i + (VY)i = V ; i = 1 , 2 , . . . , S, atunci
valorile xi i concentraiile
Fie x0 valoarea variabilelei x pentru care concentraia de
echilibru
[XaYb] are valoare maxim ( [XaYb]0 = max ) . . .
. . . atunci în soluia respectiv concentraiile de echilibru
corespun-
zatoare ale celorlalte specii se vor nota [X]0 i [Y]0 , iar
derivata
concentraiei [XaY b] în raport cu variabila x , pentru x = x0
, este nul.
Metoda variaiei continue
0
x1
x
b a
282
Dac la amestecarea celor dou soluii stoc componentele X i Y ar
coexista fr a participa la echilibru, atunci absorbana (msurat la
lungimea de und l) soluiei de lucru (caracterizat de valoarea “ x
” a variabilei de echilibru) ar fi A*(l,x) :
Metoda variaiei continue
A*(l,x) = d .{eX(l).C.x + eY(l).C.(1-x)} +
Asolv(l)
Dac componentele X i Y interacioneaz chimic i se realizeaz starea
de echilibru, atunci absorbana soluiei de lucru este A(l,x):
A(l,x) = d .{eX(l).[X] + eY(l).[Y] + eXaYb
.[XaYb]} + Asolv(l)
.[XaYb] –
pentru x = x0
în domeniul spectral ultraviolet (UV) i vizibil
(VIS)
Mecanismul cuantic de producere a spectrelor de absorbie - tranziii
de electroni din strile staionare inferioare (fundamental) în
strile staionare superioare.
Domeniul de lungimi de und: - ultraviolet de vid : l < 200
nm ; - ultraviolet (UV) : 200 - 380 nm ; - vizibil (VIS) : 380 -
800 nm.
Absorbia - la probele aflate în starea condensat - se prezint în
forma de benzi mai mult sau mai puin largi.
Lungimea de und a maximului benzii de absorbie este cu atât mai
mare cu cât este mai mic diferena de energie între strile staionare
(fundamental i excitat) implicate (conform relaiei Max
Plank ).
Intensitatea absorbiei, deci i valoarea coeficientului molar de
absorbie
În cazul moleculelor substanelor organice, cele mai frecvente
tipuri de tranziii electronice moleculare sunt:
- tranziii de tipul - * se realizeaz de pe un orbital
molecular de legtur pe un orbital molecular de
antilegtur * ;
- tranziii de tipul * se realizeaz de pe un orbital molecular
de legtur pe un orbital molecular de antilegtur
* ;
- tranziii de tipul n - * se realizeaz de pe un orbital
molecular de nelegtur n pe un orbital molecular de
antilegtur * ;
- tranziii de tipul n - * se realizeaz de pe un orbital
molecular de nelegtur n pe un orbital molecular de
antilegtur *.
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS
288
Tranziiile * sunt caracteristice moleculelor nesaturate care
posed, pe lâng legturi , i legturi chimice de tip (în
special la alchene, poliene, hidrocarburi aromatice, dar i la
molecule nesatura- te în care un heteroatom este implicat într-o
legtur ).
Energia tranziiilor de acest tip este mai mic decât în cazul
tranziiei *, deci banda de absorbie produs apare la lungimi de und
mai mari (accesibile spectrofotometrelor obinuite).
Extinderea conjugrii electronilor în starea fundamental,
depla- seaz maximul benzii de absorbie spre lungimi de und mai mari
("deplasare batocrom").
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS ( IV
)
Reprezentarea simplificat a unei tranziii *
289
Tranziiile n - * sunt caracteristice moleculelor saturate care
conin un heteroa- tom cu electroni neimplicai în legtur chimic în
starea fundamental a moleculei (alcoolii saturai, eterii saturai,
aminele saturate, derivaii halogenai saturai). Benzile de absorbie
asociate cu acest tip de tranziie apar în domeniul ultraviolet, la
lungimii de und mici. Maximul de absorbie se deplaseaz batocrom
odat cu accentuarea electronegativitii heteroatomului.
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS
Tranziiile n - * sunt caracteristice moleculelor
nesaturate care posed heteroatom cu electroni neimplicai în legtur
chimic. Aceste tranziii produc în general benzi de absorbie
intense, la valori relativ mari ale lungimii de und, domeniu
accesibil uor de spectrofotometrele obinuite, motiv pentru care
aceste tranziii au cel mai
însemnat rol analitic. Extinderea conjugrii n - sau în
starea fundamental a moleculei cauzeaz deplasarea batocrom a benzii
de absorbie.
Reprezentarea simplificat a unei tranziii p - *
Factorii care influeneaz poziia i intensitatea benzilor
:
- conjugarea electronic în starea fundamental a moleculei determin
intensificarea absobiei i deplasarea batocrom a maximului benzii de
absorbie ;
- pH - ul mediului poate influena atât poziia cât i intensitatea
benzilor de absorbie în cazul în care molecula absorbant este
implicat în echilibre protolitice ;
- mediul influeneaz poziia maximului benzii de absorbie prin
solvatarea difereniat a moleculei în starea fundamental i starea
excitat (solvatocromie) ;
- într-o oarecare msura temperatura poate influenta poziia i/sau
intensitatea benzii de absorbie (termocromism).
Efect hipsocrom Efect batocrom
Influe