Curs Analiza Medicamentului

458
 Controlul analitic al medicamentelor Analiza medicamentului Generalităţi 

description

curs

Transcript of Curs Analiza Medicamentului

 Metodele controlului
- chimice - controlul proprietilor ; - (separarea componentelor) ; - identificarea componentelor ; - dozarea componentelor
- biologice  - identificarea componentelor ; - (dozarea componentelor)
 Motivele controlului
2
 Metode fizice (controlul propriet  ilor fizice)
Controlul proprietilor fizice (f r scanarea unei mrimi) solubilitatea, punct de topire, punct de fierbere, punct de picurare, interval de distilare, indice de refracie, putere de rotaie, studiul formei de cristalizare (polimorfism), vâscozitate (dinamic, cinematic, intrinsec etc.), … 
Controlul proprietilor fizice (cu scanarea cel puin a unei mrimi fizice sau geometrice)  spectrofometrie optic de absorbie (IR, UV, VIS, AAS),
 spectrofotometrie de emisie (Raman, de fluorescen, AES), difracie de raze X (diferite tehnici), rezonana magnetic
nuclear (NMR), rezonan a electronic de spin (ESR), spectrometrie de mas (diferite tehnici), metode termice de analiz (TGA, DTA, DSC), specrofotometrie ORD i CD, … 
3
- cromatografie electrocinetic micelar (MEKC) 
- distilare molecular, …etc. 
Metode fizice i fizico-chimice de control prezentate în Farmacopeea European 
- determinarea poteniometric a pH-lui
- densitate relativ 
Metode fizice i fizico-chimice de control prezentate în Farmacopeea Europeana
- punct de solidificare
- spectrometrie de absorbie atomic (AAS) 
- spectrofotometrie de absorbie în infrarou (IR) 
- spectrofotometrie de absorbie în ultraviolet i vizibil (UV, VIS) 
- cromatografie pe hârtie
6
Metode fizice i fizico-chimice de control prezentate în Farmacopeea European 
- gazcromatografie (inclusiv tehnica “head space”) (GC) 
- cromatografie lichid (LC, TLC, HPLC etc.) 
- cromatografie de excludere steric (gel-filtrare)
- electroforez (gel, capilar) (CE) 
- spectrometrie de rezonan magnetic nuclear (NMR) 
- analiza termogravimetric (TGA) 
- presiune osmotic / osmolalitate 
- spectrometrie de fluorescen cu raze X (XRF) 
 
Metode fizice i fizico-chimice de control prezentate în Farmacopeea European 
- conductibilitate electric 
- spectrometrie de dicroism circular (CD)
- spectrometrie de mas (MS) 
Metode fizice i fizico-chimice de control suplimentare prezentate în alte lucrri de specialitate 
- calorimetrie diferenial cu scanare (DSC)  - analiz termic diferenial (DTA)  - rezonan electronic de spin (ESR , EPR)  - difracie de raze X (diferite tehnici, probe policristaline sau
monocristaline) - spectrometrie Mössbauer - extracie solid (SPE)  - cromatografie fluid supercritic (SFC)  - cromatografie electrocinetic micelar (MECC)  - tehnici analitice cu legare specific competitiv (RIA ,
DELFIA , ELISA etc.) - tehnici tandem (GC/MS , HPLC/MS , HPLC/FTIR etc.)
 
- metode titrimetrice de dozare specific a componentelor 
- metode titrimetrice de determinare a unor parametri globali (indice de aciditate, indice de ester, indice de hidroxil, indice de iod, indice de peroxid, indice de saponificare, substane nesaponificabile)
- determinarea azotului aminic din amine aromatice primare
- determinarea azotului prin dezagregare cu acid sulfuric
- titrare complexonometric 
- determinarea apei
- determinarea fenolului în imunoseruri i vaccinuri 
 
- determinarea proteinelor i acizilor nucleici în vaccinuri cu polizaharide 
- determinarea proteinelor, acizilor nucleici, fosforului, gruprii O-acetil, hexozaminelor, metilpentozelor, acizilor uronici, ribozei i acidului sialic în vaccinuri cu polizaharide
- determinarea monoxidului i dioxidului de carbon în gaze 
- determinarea monoxidului i dioxidului de azot în gaze  
- determinarea oxigenului i apei în gaze 
- determinarea dioxidului de sulf în gaze
- determinarea substanelor oxidante 
- determinarea proteinelor totale
 
Procedee ale controlului farmacognostic
 
- separarea probei (amestec) în componente individuale
- identificarea componentelor
- calificarea probei i eliberarea buletinului de analiz 
 
controlului analitic
Noiuni definite i utilizate în FR-X, referitoare la prelevare: 
- lot  (o cantitate de materie prim, presupus a fi unitar, din care se obin una sau mai multe serii de produse) 
- serie (totalitatea unitilor de produs obinute în condiii identice, într-un singur ciclu de operaii)
- recipient  (conine unitile de produs care constituie o serie, ex. flacoane, fiole, folii, tuburi, cutii, pungi etc.)
- ambalaj  (conine recipientele grupate adecvat) 
Prelevarea probelor
 
Acid acetilsalicilic cristalin  Cantitatea obtinuta: serie
comprimare, includere in “blister” (ex. 10 compr./blist.) 
Comprimate grupate intr-un “blister”  recipient
gruparea unui numar de “blisrere (ex. 2) intr-o cutie impreuna cu descrierea produsului 
“Blistere” grupate in aceeasi cutie, impreuna cu accesorii (ex. descrierea produsului).  ambalaj
 
Cantitate: de 4 ori cea necesar din care: 
- 2 pri: proba propriu-zis  - 2 pri: contraproba 
Probele/contraprobele: ambalate, sigilate, etichetate
 
Condiiile de prelevare sunt stabilite de productor, în conformitate cu normativele în vigoare
Cantitatea prelevat din uniti:  - alese aleator - de 3 ori cea necesar efecturii analizelor 
Numrul de uniti (necesar analizei) din serie: - în corelaie cu monografia individual  - în corelaie cu monografia general a formei farmaceutice - în corelaie cu monografia metodei de analiz 
Prelevarea probelor dintr-un depozit 
- identificarea substanei active (la masa de analiz) - analiza complet (în laborator de control) 
Eticheta probelor/contraprobelor ambalate i sigilate conine: 
- denumirea produsului - denumirea unitii respective  - numrul i data procesului verbal  - cantitatea prelevat  - semntura celui care a prelevat proba 
Control de laborator
Control la masa de analiz 
Cantitatea prelevat: 
Cantitatea prelevat: 
Eticheta probelor/contraprobelor ambalate i sigilate conine: 
- denumirea produsului - denumirea unitii respective  - numrul i data procesului verbal  - cantitatea prelevat  - semntura celui care a prelevat proba 
 
21 Prelevare pentru controlul produselor elaborate în farmacii
Cantitatea prelevat:  De 2 ori cea necesar pentru analiz  - 1 parte : proba propriu-zis  - 1 parte : contraprob 
Eticheta probelor/contraprobelor ambalate i sigilate conine: 
- denumirea produsului - denumirea unitii respective  - numrul i data procesului verbal  - cantitatea prelevat  - semntura celui care a prelevat proba 
 
simple
substanele solide - examinate fr prelucrare prealabil, pe o suprafa mat, alb 
substanele lichide - examinate în comparaie cu apa sau cu etaloane de culoare
Etaloane de culoare
- soluie etalon de cobalt (6,5 % CoCl2 în HCl 1 %); - soluie etalon de fier (5 % FeCl3 în HCl 1 %); - soluie etalon de cupru (6,5 % CuSO4 în HCl 1%); - soluie etalon cu dicromat de potasiu (0,55 % K 2Cr2O7 
 în H2SO4 1 %).
- determinarea componentelor de culori de baz; 
- determinarea spectrului de reflexie
Culoarea unei suprafee se poate exprima (cu aproximaie bun) ca un amestec, realizat în raport corespunztor, de trei culori de baz. Prin amestecarea celor trei culori de baz se poate obine o mulime de nuane diferite. Cele trei culori de baz se pot stabili convenional.
Unul din convenii (sistemul R.G.B.) se bazeaz pe culorile: rou ("Red", 700,0 nm), verde ("Green", 546,1 nm) i albastru ("Blue", 435,8 nm).
Exist i alte sisteme, bazate pe alte nuane de baz, de exemplu sistemul C.I.E.
 
Expresii convenionale (FR) 
Volum de solvent (ml) necesar pentru dizolvarea a 1 g substan  solid sau 1 ml substan lichid,
la 20  2 oC
uor solubil  de la 1 ml la 10 ml
solubil de la 10 ml la 30 ml
 puin solubil  de la 30 ml la 100 ml
foarte puin solubil  de la 100 ml la 500 ml
greu solubil de la 500 ml la 1000 m
foarte greu solubil de la 1000 ml la 10000 ml
 practic insolubil mai mult de 10000 ml
 
. . . raportul dintre masa unui volum de substan i masa unui
volum egal de ap, la 20 oC ( ) sau la 4 oC ( ) (mrimi
adimensionale)
)C20apã(m
. . . masa unitii de volum din substana examinat. În S.I. se
exprim în kg/m3 ; uniti tolerate: g/cm3 ; kg/l
)C20(volum
Masurarea densitatii (cu picnometru)
Proba lichida m0 = masa picnometrului gol ; mr  = masa picnometrului umplut cu lichidul de referinta (r ) m = masa picnometrului umplut cu proba lichida () ; V = volumul picnometrului dr  = densitatea relativa a lichidului in raport cu lichidul de referinta
0r 
0


0r 
mS = masa picnometrului cu proba solida introdusa
mSR  = masa picnometrului continand proba solida si umplut cu lichidul de referinta
 = densitatea absoluta a probei solide
 
0SR SR 
Densitatea
31 Putere de rotaie (a planului de polarizare al luminii) 
. . . proprietatea substanelor optic active de a roti planul de  polarizare al luminii plan-polarizate. Activitatea optic se datoreaz asimetriei care se poate manifesta la nivelul:
- molecular (în stare solid, în soluie, în stare gazoas);  - supramolecular (în stare cristalin sau în soluii de
compleci intermoleculari) 
Asimetrie la nivel molecular:
- cu un (sau mai muli) atomi cu configuraie spaial "chiral" ("centru de chiralitate") ( în special în cazul atomului Csp3 )
- asimetrie molecular global (fr un centru bine definit de chiralitate)
- asimetrie alenic  - asimetrie spiranic  - asimetrie atropic 
la compui organici 
Putere de rotaie (a planului de polarizare al luminii plan-polarizate) 
Chiralitate molecular cu un singur centru de disimetrie: 
o singur pereche de enentiomeri (relaie obiect-imagine în oglind) 
 
33Putere de rotaie (a planului de polarizare al luminii plan-polarizate) 
Omeprazol (amestec racemic)
34Putere de rotaie (a planului de polarizare al luminii plan-polarizate) 
atomul de sulf
Ansamblul de vectori intensitate camp electric-intensitate camp magnetic este chiral
Planul de oscilatie al vectorilor intensitatii de camp electric si magnetic la o radiatie plan-polarizata
Activitate optica: rotatia planului de oscilatie a
vectorului E in jurul directiei de propagare (axa z) → 
Dextrogir (D)
Levogir (L)
Putere de rotaie (a planului de polarizare al luminii polarizate)
Reprezentarea schematic a unui polarimetru 
 
37 Putere de rotaie (a planului de polarizare al luminii) 
Unghiul de rotaie a depinde:
- de lungimea de und a luminii incide ( l ) - de natura substanei chirale ( putere "proprie" de rotaie,
numit i "putere rotatorie specific", [a] ) - de grosimea stratului de material chiral ( d ), traversat de
lumina polarizat  - temperatura materialului chiral
d][
dc][
20
D
20
D
Pentru lichide :
 
38 Putere de rotaie (a planului de polarizare al luminii) 
Unitatea de msur pentru puterea rotatorie specific : 
În uniti SI 
În uniti tolerate 
[a]SI = 5729,578.[a] ; [a] = 0,17453.10-3.[a]SI
Dac în sistemul tolerat concentraia este exprimat în procente (m/V, adic grame /100 ml), atunci relaiile de conversie devin:  
[a]SI = 57,29578.[a] ; [a] = 1,7453.10-2.[a]SI
Unghiul de rotaie a se msoar frecvent la lungimea de
und a radiaiei de rezonan a vaporilor de sodiu (linia “D” a
sodiului, l = 589,3 nm), la temperatura de 20 oC ; în consecin
i rotaia specific se exprim pentru aceste condiii: 20
D][a
 
de msurare  Riboflavin  -115 ~ -135 NaOH 0,05 M
Acetat de prednisolon +112 ~ +119 dioxan
Clorhidrat de noscapin  +38,5 ~ +44,0 HCl 0,1 M
Sulfat de morfin  -107 ~ -110 apa
Digoxin  +10 ~ +13  piridin anhidr 
Tetraciclin  -260 ~ -280 HCl 0,1 M
Putere de rotaie (a planului de polarizare al luminii polarizate) 
Msurarea unghiului de rotaie permite:
 
Presiune osmotic. Soluii izotonice 
 
Presiune osmotic. Soluii izotonice 
Relaia van’t Hoff   (pentru soluii diluate, fa de solvent pur) 
P = R .T.C în care P  este presiunea osmotic ( Pa ) 
R este constanta universal a gazului ideal ( R = 8,311 J/(mol.K) )
C este concentraia de echilibru a solutului ( exprimat în nr. de moli/m3 )
Forma relaiei van’t Hoff , în care apare concentraia molar ( Cm ) a solutului ( exprimat în nr. de moli/dm3 ) este :
P = R .T.Cm .1000
Presiune osmotic. Soluii izotonice 
Hematiile sunt afectate în mod special de diferena de presiune dintre compartimentul intra- i extracelular.
 
44Presiune osmotic. Soluii izotonice 
Toate medicamentele administrate în forma de soluii injectabile sunt izotonizate, fie la faza de condiionare, fie chiar înainte de utilizare, cu componente inerte din punct de vedere farmaceutic (cu NaCl , glucoz etc.) 
La baza calculrii cantitii necesare de compus izotonizant st urmtoarea observaie (practic): o soluie 0,2308 molar a unui solut nedisociat este izotonic cu serul sanguin. Rezult c suma
 presiunilor osmotice ale componentelor dintr-o soluie izotonic este egal cu cea a unei soluii în care concentraia unui solut ne-disociat este 0,2308 mol/litru.
0,2308 2
1q )(C
( Cm )i : concentraia molar a componentei “i” 
 
E x e m p l u
S se calculeze masele de vitamin B1 (mB1 , clorhidrat de tiamin) i clorur de sodiu ( m NaCl ) necesare pentru a prepara 500 ml ( V = 0,5 l ) soluie izotonic, cu concentraia de 2,5 % (m/v) în raport cu clorhidratul de tiamin. 
2 2
1q 1B +
l
1q ;58,45M   NaCl
47Presiune osmotic. Soluii izotonice 
Dac izotonizarea ar fi fost realizat cu glucoz (substant care nu disociaz în ioni la dizolvare în ap) în loc de clorur de sodiu, atunci : 
g8,1144m
E x e m p l u
S se determine masa de clorur de sodiu ( m NaCl ) aflat în 250 ml soluie izotonic cu urmtoarea compoziie impus : 
clorhidrat de morfin . . . . . . . . . . 10 g  
 bromhidrat de scopolamin . . . . . 0,2 g 
clorhidrat de efedrin . . . . . . . . . . 15,0 g 
clorur de sodiu . . . . . . . . . . . . . . . 4 .( m NaCl ) g
ap distilat ad . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ml  
R e z o l v a r e
Mase moleculare :
clorhidrat de morfin : 375,84   bromhidrat de scopolamin : 438,32  cloridrat de efedrin : 201,69  clorura de sodiu: 58,45
Concentraiile molare impuse : 
 
Mase moleculare : clorhidrat de morfin : 375,84  bromhidrat de scopolamin : 438,32 cloridrat de efedrin : 201,69
Concentraiile molare impuse :  clorhidrat de morfin : 0,02661  bromhidrat de scopolamin : 0,00046 clorhidrat de efedrin : 0,07437 
g0,7661m



Deci în 250 ml soluie izotonic, în care concentraiile celorlalte componente sunt impuse, cantitatea de clorura de sodiu este 0,7661 grame.
 
50 Presiune osmotic. Soluii izotonice 
Controlul izotonicitii unei soluii (de exemplu a unei soluii injectabile) în practic se efectueaz prin teste experimentale, iar calculele bazate pe relaiile descrise au utilizare mai puin frecvent.
În vederea controlului izotonicitii unei soluii, se introduce în soluia studiat o hematie uman sau de iepure i se urmrete,  prin observare la microscop, tendina de umflare sau de restrângere a acesteia.
Atenie ! Relaia de calcul din FR -X ( pag. 511 ) este greit ! 
0,90,89858m;0,2308 0,158,4
1,5m  NaCl
analitic al medicamentelor
Metode de separare
- metode de extracie selectiv –  se bazeaz pe dizolvarea selectiv a componentelor din amestecul analizat prin alegerea convenabil a unor solveni potrivii sau a unor condiii de pH adecvate
- metode cromatografice –  se bazeaz pe partiia difereniat a componentelor probei analizate între dou medii nemiscibile (“ faza staionar” i “ faza mobil”), fenomen care determin mobiliti diferite ale componentelor în faza staionar 
 
- metoda Stas –  Otto –  Ogier
- metoda Griffon –  Le Breton
Extr. 3x20 ml Et2OFaza Et2O Faza H2O
Extr. 3x5 ml  NaOH 0,5 M
Faza Et2O Fractia A
Faza H2O (Reziduu)
 Neutralizare cu NaHCO3 10 % Acidulare cu ac. tartric (pH 4-5)
Extr. 3x20 ml CHCl3
Faza CHCl3  Fractia C
10
Faza Et2O Fractia D
 Neutralizare cu H2SO4 dil. + NH4OH 6M (pH 11-14)
14 Extr. 3x20 ml cu amestec CHCl3 si i-PrOH (3 + 1)
Faza Et2O Fractia E
 
Dizolvare la cald in amestec acetona - dimetilacetaldehida
Agitare cu solutie alcoolica de uree. Filtrare Reziduu
compusi de incluziune: uree + alcool cetilic uree + propilenglicol
Filtrat nitrofuranoza glicerina Me-paraben Pr-paraben acetona di-Me-acetaldehida
Et2O
Filtrare
Reziduu
Filtrat
Distilare
Reziduu de distilare
1
2
3
4
5
6
7
8
9
11
12
lungimea de unda 375 nm  13
8
Control metale grele 
Filtrat
 Na2CO3 5 %
Filtrare Filtrat
Reziduu
Mineralizare
Dizolvare
Metodele cromatografice de separare a componentelor unui amestec se bazeaz pe partiia difereniat a componentelor probei analizate între dou medii nemiscibile (faza “staionar” i “ faza mobil”), fenomen care determin mobiliti diferite ale componentelor. 
Mobilitatea diferit a componentelor se manifest prin deplasare cu viteze diferite de-alungul “ suportului cromatografic ” . 
 Suport cromatografic :
- strat subire depus pe un suport plan (TLC) 
- coloan umplut cu faza staionar 
- tub capilar cu suprafaa intern acoperit cu faza staionar 
 
Clasificarea metodelor cromatografice
Criterii de clasificare:
1) dup starea de agregare a fazelor mobil (FM) i staionar (FS) 
2) dup polaritatea fazelor (FM i FS) 
3) dup mecanismul de interaciune a componentelor  probei cu FM i FS 
1) Dup starea de agregare a fazelor 
1.1 Faza mobil gazoas (gazcromatografie, GC)  1.1.1 Faza staionar solid (solid - gaz) 1.1.2 Faza staionar lichid (lichid - gaz)
 
FS polare : silicagel, oxid de aluminiu, celuloz, “Florisil” 
FS nepolare : diferite tipuri de silicagel silanizat
FM polare : metanol, acetonitril, etanol, ap, tetrahidrofuran 
FM nepolare : diclormetan, cloroform, hexan, benzen, toluen
Exemple
Clasificarea metodelor cromatografice
3) Dup mecanismul de interaciune a componentelor cu FM i FS 
3.1 Cromatografie de adsorbie (adsorbia componentelor pe FS solid, polar) 
3.2 Cromatografie de partiie (partiia componentelor între FS i FM , ambele lichide dar nemiscibile)
3.3 Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni (interaciuni ionice între componente i FS –  rin solid) 
3.4 Cromatografie de gel-permeaie (gel-filtrare) (potrivire sau nepotrivire steric a moleculelor componentelor în cavitile unui gel - FS - inert; separare dup criteriul volumelor moleculare)
3.5 Cromatografie de afinitate (interaciuni specifice, de natur  biochimic, între componente i FS: interaciuni de tipul antigen-anticorp, enzim-substrat, enzim-coenzim, enzim-inhibitor)
 
64I s t o r i c
F riedlieb Ferdinand Runge (1795 - 1867) farmacist i chimist - separri pe hârtie de filtru  "Der Bildungstrieb der Stoffe" (1855) 
 Mikhail Semenovich Tswett  (1872 - 1919) botanist rus în 1903: separarea componentelor din extract de frunze verzi
FS: Al2O3 si CaCO3 (umplutur polar)  FM: eter de petrol (eluent nepolar)
 propune (1906) termenul de "Cromatografie"  
 Zechmeister  (1936): apare prima carte care trateaz cromatogarfia 
Egon Stahl (1956): bazele cromatografiei în strat subire (TLC) ; în 1975 firma "Merck" lanseaz plci cromatografice de performan 
 Martin & James : bazele teoretice ale cromatografiei ; separarea acizilor grai 
 Martin & Singe - în 1952 - premiu Nobel  
Cs. Horvath ~ 1960 - cromatografia lichida de performan înalt (HPLC) 
 
Friedlieb Fredinand Runge (1795 - 1867) Mikhail Semenovich Tswett în 1911
(1872 - 1919)
66
 
Placa memorial cu inscripia: 
“Între 1901 –  1906 în aceast cldire a descoperit Dr. Mikhail S. Tswett cromatografia” 
semntura: “Chimistii analiti polonezi” 
Separare cromatografic realizat de M.S. Tswett  
 Noiune important : timp / volum de retenie 
   U   m   p    l  u    t  u   r   a   :    C   a    C    O    3
   E    l  u   e   n
   t  :   e
Caracterizarea mobilitii cromatografice a componentelor 
- prin distana (xi) parcurs de componenta " i " într-un interval de timp dat (comun pentru toate componente) - în special la cromatografia în strat subire 
- prin timpul necesar (ti - timp de retenie al componentei " i ") pentru  parcurgerea lungimii L a sistemului cromatografic - în special la cromatografia în coloan 
Literatura de specialitate contine numeroase valori R F , R M si hR F 
 pentru substante farmaceutice, masurate in conditii de executie specificate.
 
   
 

71
Mobilitatea cromatografic este exprimat prin valorile R F sau R M
R F este, prin definiie, mrime pozitiv, subunitar, adimensional 
R M are domeniul valorilor (- ∞ , + ∞) (adimensional) 
R M a fost propus de Bate-Smith E. C. i Westall R. G. C. în 1950
Caracterizarea mobilitii cromatografice a componentelor 
 
72Caracterizarea mobilitii cromatografice a componentelor 
- prin distana (xi) parcurs de componenta " i " într-un interval de timp dat (comun pentru toate componente) - în special la cromatografia în strat subire  
 
 
 
 Naproxen (0,5 %) ; R f = 0,42 Diclofenac (0,5 %) ; R f = 0,30
Acid acetilsalicilic (0,5 %) ; R f = 0,12 Tolmetin (1 %) ; R f = 0,05
START (0 mm)
FRONT (70 mm) FS: ADAMANT UV 254 FM: CHCl3 / acetat de etil (1 : 1 v/v) Volum aplicat: 1 ml
Separarea TLC a unor analgezice
 
START (0 mm)
FRONT (73 mm)
Tiopental (1 %) ; R f = 0,65
Hexobarbital (5 %) ; R f = 0,41
Pentobarbital (1 %) ; R f = 0,26
Fenobarbital (1 %) ; R f = 0,18
FS: ADAMANT UV 254 FM: CHCl3 / acetona (95 : 5 v/v) Volum aplicat: 1 ml
Separarea TLC a unor barbiturice
 
Reprezentarea tipica a unei cromatograme
 
Forma unui "peak" cromatografic: curb de distribuie tip Gauss.
2

tt
2
1
iivi
0
e)m,σ,f(Q(t)C  
0,5e
e
 
 
82Performana de separare a unui sistem cromatografic
Valoare mare pentru Ni înseamn eficien bun de separare a sistemului pentru componenta " i " (în timpul parcurgerii lungimii L a sistemului, componenta " i "este implicat într -un numr mare de echilibre de partiie) 
2
inti
i
2
 bi
i
2
i
i
2
5,0i
i
2
i
Eficiena intrinsec (independent de natura componentelor) a unui sistem cromatografic se exprim prin numrul limit de talere teoretice (N)
it   Nlim N

Ex. - în gazcromatografie “ N ” este de ordinul 100.000  - în HPLC numarul “ N “ este de ordinul 10.000 
“ N ” depinde de : 
 
Dependena “ N ” de viteza liniar de deplasare ( u ) a FM :
ecuaia v a n D e e m t e r
uC u
B A
constante caracteristice sistemului cromatografic
A : depinde de factorii geometrici ; [ cm ] B : determinat de difuzie ; [ cm2/s ] C : determinat de transferul
componentelor între FM i FS ; [ s ] 
CB2AH
C
86 Cromatografie în faz gazoas ( gazcromatografie ) 
FS - solid ( mai rar ) sau lichid ( mai frecvent )  FM - gaz ( hidrogen, heliu, neon, argon, azot )
În GC se realizeaz : 
Variante :
- coloan cu umplutur ( scop analitic sau preparativ )  - coloan capilar ( scop analitic )
Temperatura : 80 –  250 oC ( la controlul medicamentelor )
Regim de lucru :
- la temperatura constant în timp ( regim izoterm )  - la temperatura variabil în timp ( regim cu programare de
temperatur ) 
Evenimente realizate în coloan : 
- separarea componentelor fr descompunerea termic a acestora ( eveniment tipic )
- descompunerea termic (piroliza) probei în condiii strict controlate i reproductibile, urmat de decelarea produilor de piroliz ( "amprent de piroliz" ) 
 
88Cromatografie în faza gazoas ( gazcromatografie ) 
 
 
Indici de retenie 
- identitatea chimic a componentei respective  - natura FS - debitul de gaz purttor   - temperatura coloanei cromatografice - caracteristicile geometrice ale coloanei i umpluturii 
Scop : a se defini mrimi alternative, care . . .
- s depind semnificativ de identitatea chimic a componentei respective, . . . dar . . .
- s depind în msur minim de ceilali factori 
indici de retenie în locul timpilor de retenie 
 
Indici de retenie 
- indice liniar de retenie ( J ) 
- - - - etc - - -
Indice Kováts
Observaie : în seria omoloag a n-alcanilor, logaritmul timpilor de retentie redui ai membrilor seriei variaz liniar cu numrul atomilor de carbon ( n ) din molecula alcanului, dac msurrile sunt fcute în condiii identice de lucru 
S-a impus (arbitrar) : indicele Kováts al unui n-alcan, cu " n " atomi de carbon în molecul, s aib valoarea: 
Iz = 100.n 
Kováts Ervin [email protected] 
95
Relatia dintre timpul de retentie si numarul atomilor de carbon in molecula n-alcanilor
Cromatografie în faza gazoas ( indici de retentie ) 
 
96
Relatia dintre timpul de retentie si numarul atomilor de carbon in molecula n-alcanilor
(1) Coloana polara SCOT 06
(2) Coloana nepolara SCOT 09
(3) Coloana polara SCOT 06
(cu Carbowax 20M/KOH)
(cu Apiezon L/KOH)
Indice Kováts
Într-o coloan gazcromatografic se injecteaz un amestec care conine n-heptan (C7H16), n-octan (C8H18), n-nonan (C9H20), n-decan (C10H22), fenacetin. În condiiile separrii indicele
 Kováts al fenacetinei este 1250. Semnalul cromatografic al fenacetinei este situat . . .
a) . . . înaintea "picului" heptanului  b) . . . între "picurile" heptanului i octanului  c) . . . între "picurile" octanului i nonanului  d) . . . între "picurile" nonanului i decanului  e) . . . dup "picul" decanului 
R spuns : e
Stimulant al SNC  Coloan (Apiezon-L/KOH) ; 150 oC 
SCOT03  SCOT04 SCOT05 
 
Stimulant al SNC 
Tranilcipromin  1852  1915  1248  1271 
 Nicotin  1876  1926  1353  1392 
Clorfentermin  1916  1950  1380  1422 
Modalin  1969  2015  1473  1499 
Cipenamin  1976  2022  1419  1456 
Fendimetrazin  2009  2057  1475  1505 
 N-metilefedrin  2022  2108  1405  1437 
Efedrin  2072  2179  1358  1400 
Pseudoefedrin  2191  2217  1362  1398 
Fenilpropanolamin  2212  2295  1339  1369 
 
Indice liniar de retenie 
Notaiile corespund celor din relaia de definiie a indicelui Kováts.
Exemple de valori ( I ) i ( J ) 
I J
322 K 340 K 359 K 322 K 340 K 359 K
1,2-dimetil-  butan
Benzen 636,8 640,3 644,9 6,256 6,299 6,348
3-metil-hexan 676,5 676,0 676,4 6,667 6,672 6,688
Toluen 746,9 752,8 755,8 7,347 7,415 7,459
3-metil-heptan 772,0 772,6 773,0 7,613 7,629 7,646
z tt
tt J
Indici de retenie  Exerciiu 
Într-o coloan gazcromatografic se injecteaz un amestec care conine metan (CH4), n-nonan (C9H20), n-decan (C10H22), i tri-n-
 propilamin. Componentele se elueaz la urmtorii timpi de retenie : nonan la 1,8 minute , decan la 6,6 minute , tri-n-propilamina la 3,4 minute , metan (component neretardat) la 0,2 minute. Identificai domeniile de valori în care se incadreaz indicele Kováts (I) i indicele de retenie liniar (J) pentru tri-n- propilamin. 
a) I < 800 i J < 8,250  b) I : între 800 - 900 i J = 8,533 
c) I : între 900 - 1000 i J = 9,333 d) I : între 1000 - 1100 i J = 8,250 
e) I > 1100 i J = 8,533 R spuns : c
 
104 Cromatografie în faza gazoas ( gazcromatografie ) 
Indicii de retenie depind într -o oarecare msur de temperatura coloanei. Dependena de temperatura coloanei a indicelui de retenie Kováts, pentru o component oarecare, este descris frecvent cu ecuaia Antoine.
CT
B AIT + +
 
 
SI –  substanta de interes IN –  ingredienti SD –  semnal detector
 
 
SI –  substanta de interes IN –  ingredienti EI –  etalon intern SD –  semnal detector
* PEI





 
Prin folosirea unui etalon intern, ales adecvat, se pot compensa unele erori (pierderi) de analiz, efectuate la operaiile de prelucrare prealabil a probei (operaii de extracii, purificri, diluri, derivatizri, concentrri etc.). 
Cerine pentru un etalon intern bun: 
- s prezinte proprieti asemntoare cu componentele de interes din prob (s fie afectate de aceleai tipuri de erori la operaiile de  prelucrare premergtoare injectrii în coloana gazcromatografic) 
- s nu interacioneze chimic cu nici una din componentele probei în condiiile de prelucrare i separare gazcromatografic 
- s genereze "peak" cromatografic separat clar de "peak"-urile tuturor componentelor din prob. 
Caz particular de utilizare a unui etalon intern: metoda adaosurilor
Cromatografie în faza gazoas ( gazcromatografie )  Modaliti de analiz cantitativ (etalon intern) 
108
c) Metoda adaosurilor  
Se recomand în acele cazuri în care prezena unei componente (de interes sau nu) modific sensibilitatea de detectare a unei componente de interes ("efect de matrice") sau eficiena operaiilor de prelucrare prealabil a  probei.
Esena metodei : Se adaug probei cantiti cunoscute din componenta de interes, afectat de efectul de matrice i se injecteaz amestecurile în coloana GC. Se reprezint grafic semnalul detectorului (aria), asociat cu componenta de interes dependen liniar.
Se extrapoleaz dreapta pân ce intersecteaz axa pe care sunt reprezentate cantitile adugate. Acest punct de intersecie se gsete pe semiaxa negativ a axei cantitilor adugate. Cantitatea corespunztoare segmentului definit de punctul de intersecie i originea axelor este egal cu cantitatea de component de interes prezent în proba original. 
Cromatografie în faza gazoas ( gazcromatografie ) 
Modaliti de analiz cantitativ  109
 
110
Condiie necesar :  posibilitatea msurrii unui semnal de detector care se datoreaz exclusiv componentei de interes ("peak"-ul componentei de interes s fie separat satisfctor de "peak"-urile altor componente din  prob) (EM=efect de matrice). 
Modaliti de analiz cantitativ (metoda adaosurilor) 
 
Derivatizare : transformarea chimic, în condiii controlate, a componentelor probei înainte de injectarea probei în gazcromatograf
Motivaia: 
 
Tipuri de reacii implicate (mai frecvent) : 
- silanizri 
- acilri cu derivai ai acizilor carboxilici ( pe gruparea -NH2 , -NH- sau – OH )
- acilri cu acizi boronici 
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC 
a) cu clor-trimetil-silan (CTMS) i hexametil -disilazan (HMDS)
Grupe funcionale afectate: -OH , -NH2 , -NHR , -SH
CTMS se utilizeaz în combinaie cu HMDS i cu piridin, în  N,N-dimetilformamid (DMFA) sau dimetilsulfoxid (DMSO). Separat, nici CTMS, nici HMDS nu are eficiena de silanizare corespunztoare. 
Derivatizare prin trimetilsilanizare
(CTMS) (HMDS)
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC 
Derivatizare prin trimetilsilanizare
b) cu t-butil-dimetil-clorsilan  Grupe funcionale afectate: -OH , -NH2 , -NHR , -SH
Volumul mare al gruprii t-Bu-di-Me-silil permite uneori silanizarea difereniat a grupelor -OH .
R-OH +
[imidazol]
Derivatizare prin trimetilsilanizare
Exemplu :
- grupele -OH secundare din poziia 3 i gruparea -OH primar din  poziia 21 se silanizeaz rapid i cantitativ ; 
- gruparea -OH ( 20b ) se silanizeaz extrem de greu din cauza împie-   dicrii sterice ; 
 
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC 
Derivatizare prin trimetilsilanizare
BSA este un agent de silanizare eficient pentru gruprile  
-OH i -NH2 
 
Derivatizare prin trimetilsilanizare
+ R-OH   R-O-Si(CH3)3  +
e) cu (izopropeniloxi )-trimetil-silan (I POTMS)
- IPOTMS este un reactiv asimilat mai recent în GC
- IPOTMS este folosit cu succes mai ales pentru silanizarea acizilor carboxilici, alcoolilor alifatici i fenolilor  
- atât agentul (IPOTMS) cât i produsul secundar de reacie sunt volatili  se recomand pentru silanizarea compuilor hidroxilici volatili (excesul de
IPOTMS i acetona format se îndeprteaz uor) 
 
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC 
Derivatizare prin trimetilsilanizare
- TMSDMA este utilizat mai ales pentru silanizarea aminelor i aminoacizilor  
 
Derivatizare prin trimetilsilanizare
TMSIM este utilizat mai ales pentru derivatizarea grupelor -OH. Particulariti: 
- în absena catalizatorului, TMSIM nu reacioneaz cu grupri aminice bazice  
- în prezena BSA sau TCMS agentul TMSIM devine extrem de eficient chiar i în cazul grupelor -OH cu împiedicare steric (din acest motiv se folosete pentru derivatizarea total a hidroxisteroizilor i a altor compui polihidroxilici)  
 
Derivatizare prin dimetilsilanizare
- scade pericolul descompunerii termice a componentelor din prob;  
- la temperaturi mai mici crete puterea de separare a coloanei GC 
Particulariti:
 
Derivatizare prin dimetilsilanizare
a) N,O-bis-(dimetilsilil)-acetamid (DBSA) 
 
Proprietile derivailor (clormetil)-dimetilsilil:
- prezena atomului de clor în compusul derivatizat  detectare la sensibilitate foarte mare, prin captur de electroni (ECD) 
- (clormetil)-dimetilsilil-derivaii au timpi de retenie considerabil mai mari decât derivaii trimetilsilanizai corespunztori separare GC mai bun a componentelor din prob 
Reactiv : cloro-(clormetil)-dimetilsilan în combinaie cu bis-(clormetil)- tetrametil-disilazan, în piridin sau în N,N-dimetil-formamid drept solvent
 
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC 
Derivatizare prin esterificare (acilri pe atomul de oxigen) 
a) cu cloruri acide (reacie Schotten - Baumann) 
 
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC 
Derivatizare prin esterificare (acilri pe atomul de oxigen) 
b) cu halogenuri de bor
( BF  3 , BCl 3 )
BX3 + 3R-OH B(OR)3 + 3HX
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC 
Derivatizare prin esterificare (acilri pe atomul de oxigen) 
d) cu acizi alchilboronici  
 
 
Derivatizare prin esterificare (acilri pe atomul de oxigen) 
Compuii ciclici (alchilboronai) - proprieti GC excelente:
- sunt stabili fa de agenii de acetilare, de trimetilsilanizare i de metilare   - reaciile de alchilboronare decurg la temperatura camerei   - raportul molar de utilizare a reactivului de derivatizare este 1 : 1 (sau un mic
exces de acid alchilboronic) - reacia decurge în câteva minute 
Reactivi folosii frecvent : 
 
129 Cromatografie în faza gazoas ( gazcromatografie ) 
Tehnici i reactivi de derivatizare în GC Derivatizare prin transformare în O-alchiloxime
Reactivi: O-alchil- -hidroxilamine
Procedeul se utilizeaz pentru derivatizarea cetosteroizilor i a derivailor de prostaglandine 
 
 
131
Column: 4 m x 2 mm I.D. glass SF: 3 % SE-30 , Chromosorb W HP 100/120 T: 160 oC to 260 oC ( 6 oC/min ) Carrier gas: N2 Detector: FID
Anaesthetics (GC-packed column)
132Separation of TMS-derivatives of steroids (capillary GC)
Column: 25 m x 0.22 mm SF: CP-Sil 5 (0.12 mm) T: 100 oC to 210 oC in 25 min
then 1.5 oC/min to 265 oC Carrier gas: He Detector: FID
1) androsterone ; 2) etiocolanolone ; 3) dehydro-epiandrosterone ; 4) dS-androstene-3b, 17b- diol ; 5) 11-keto-etiocolanolone; 6) oestradiol ; 7) 11-hydroxy androsterone ; 8) 11-hydroxy- etiocolanolone ; 9) epiprednonalone ; 10) 16-a-OH-dehydro-epiandrosterone ; 11) allopregna- nediol ; 12) pregnanediol ; 13) pregnanetriol ; 14) 16-keto-androstenediol ; 15) dS-androste- ne-3b,16a, 17b-triol ; 16) & 17) by-products ; 18) 17-keto-pregnanetriol ; 19) 16a-OH-preg- nenolone ; 20) pregnene-3b, 17a, 20a-triol ; 21) tetrahydrocortisone ; 22) tetrahydrodioctyl-  phtalate ; 23) tetrahydrocorticosterone ; 24) tetrahydrocortisol ; 25) allotetrahydrocortisol ;
26) a-cortolone ; 27) b-cortolone ; 28) choloesterol ; 29) a-cortol ; 30) methyldesoxycholate (I.S.)
 
133
FS - solid (mai rar) sau lichid (mai frecvent)  FM - lichid (solvent unic sau amestec de solveni) 
În cromatografia lichid se realizeaz :
- separarea (analitic sau preparativ) a componentelor unei probe 
- identificarea calitativ a componentelor pe baza mobilitii cro- matografice (timp de retenie, valoare R F sau R M etc.)
- determinarea cantitativ a componentelor din prob 
Variante : 
- FS în forma de strat subire, întins pe un support plan (TLC)  - coloan cu umplutur (scop analitic sau preparativ) 
Regim de lucru :
- cu compoziie constant în timp a FM ( regim "izocratic" )  - cu compoziia variabil în timp a FM ( regim cu "gradient" ) 
Cromatografie cu faza mobil lichid 
 
134
. . . este tehnica citat frecvent în Farmacopeea Român i în cele ale altor ri (inclusiv Farmacopeea European). 
Avantaje :
lucru - dotarea cu tehnica TLC nu presupune efort financiar deosebit
Stratul subire (FS): 
 
135
Tipul de interaciuni cu FS (i cu FM) în care sunt implicate componentele probei :
- adsorbie pe suprafaa solid a FS (cromatografie de adsorbie);
- partiia între dou faze lichide nemiscibile (cromatografie de partiie);
- potrivire / nepotrivire steric a moleculelor componentelor cu cavitile FS (cromatografie de gel- permeaie / cromatografie de gel-filtrare / cromatografie de excludere steric);
- interaciuni ionice (cromatografie cu rini schimbtoare de ioni);  
- interaciuni specifice de tip biochimic (cromatografie de afinitate)
Cromatografie cu faza mobil lichid 
 
Identificarea / vizualizarea componentelor pe placa cromatografic :
- prin mrimile R F i R M (vezi la partea general a metodelor cromatografice);
- prin rzuirea spotului, urmat de extracia componentei i identificarea prin metode fizico-chimice (ex. IR);
- prin stropirea plcii cu reactivi de culoare, universale sau specifice componentelor;
- prin modificarea fluorescenei stratului subire ( ex. plci cu indicativul F254 )
. . . etc. . . .
 
137
Cromatografie cu faza mobil lichid  Cromatografie în strat subire (Thin Layer Chromatography - TLC)
TLC cu presiune (Overpressure Thin Layer Chromatography - OPTLC)
Eluentul trece prin stratul subire a FS datorit  presiunii de aprox. 25 atm.
- realizarea mult mai rapid a separrii 
- separri mult mai performante comparativ cu TLC obinuit 
 
 
139
Faza staionar :  - solid (mai rar) sau lichid (mai frecvent)  - deseori fixat chimic de un suport inert 
Faza mobil : - lichid  - presiune: 80 - 300 atm - debit FM: 0,8 - 2,0 ml/min.
Date tipice ale coloanelor HPLC :  - lungime 15 - 25 cm - diametru interior: 3 –  5 mm - diametrul particulelor : 5 - 20 m
Performan : uneori comparabile cu cea a GC
Natura FS :  - faza staionar polar = HPLC cu faza direct (DP)  - faza staionar nepolar  = HPLC cu faza invers (RP) 
Cromatografie cu faza mobil lichid 
Cromatografia lichid de performan, la presiune înalt  (High Performance Liquid Chromatography - HPLC)
 
( Horváth Csaba - printele metodei analitice HPLC )
1966 –  realizarea tehnicii HPLC
Horváth Csaba (1930 - 2004)
 
 
0
Rezoluie
t 0,5;i  reprezint limea "peak"-lui nr. " i " la semi-înlime (exprimata ca interval de timp)
t0  –  timpul de retenie al componentei neretardate
 
Derivatizarea componentelor din prob 
- obinerea diastereoizomerilor unei perechi de enantiomeri în vederea rezolvrii unui amestec racemic în antipozi optici 
- introducerea unui cromofor cu scopul detectrii optice a unei componente
 
 
- H2O
- SO2
- HCl
+ H2N-R
Faza staionar în HPLC : silicagel sau material polimer (purttor)
cu suprafaa derivatizat. În urma derivatizrii  suprafa cu
proprieti modificate (hidrofobicitate / hidrofilicitate modificat) 
 
148
Gruparea Si-NH-R este stabil la hidroliz îns cea mai stabil grupare este Si-O-Si-R . Faza staionar modificat în aceast manier, utilizat cel mai frecvent, este aceea în care R este un rest octadecilic:
Si-O-Si(CH3)2-(CH2)17-CH3 Aceast faz staionar este foarte nepolar. 
Alte grupri legate de support : 
Cromatografie cu faza mobil lichid 
Octadecil -(CH2)17-CH3  Aminopropil -(CH2)3-NH2 
Octil -(CH2)7-CH3  Alchilamino -(CH2)n-NH2 
Hexil -(CH2)5-CH3   Nitro -NO2 
Dimetilsilil -Si(CH3)2   Nitril -CN
Trimetilsilil -Si(CH3)3  Alchilnitril -(CH2)n-CN
Ciclohexil -C6H11  Propionitril -CH2-CH2-CN
Fenil -C6H5  Oxipropionitril -O-CH2-CH2-CN
-CH(OH)-CH(OH)- Amino -NH2 
- copolimer stiren - divinilbenzen ;
- agaroz ; silicat de magneziu ; grafit poros ; 
- gel de hidroxi-metacrilat ; sticl poroas ; hidroxiapatit ; 
- grafit cu suprafaa procesat chimic 
. . . etc. . . .
 
150
Faze mobile utilizate în HPLC Seria eluotrop a solvenilor (ordinea cresctoare a polaritii) utilizai frecvent în HPLC : 
HPLCCromatografie cu faza mobil lichid 
Solvent Miscibil cu
Vâscozitate la 20 oC (cP)
Hexan nu 190 0,31
Izooctan nu 190 0,50
Cloroform nu 245 0,57
Diclormetan nu 233 0,44
Tetrahidrofuran da 212 0,55
Dietil-eter nu 218 0,23
 
Vâscozitate la 20 oC (cP)
Acetat de etil slab 256 0,45
Aceton  da 330 0,30
1,4-dioxan da 215 1,32
Acetonitril da 190 0,37
2-propanol da 190 2,30
Metanol da 190 0,60
Ap  da 190 1,00
Acid acetic da - 1,22
Faze mobile utilizate în HPLC Seria eluotrop a solvenilor (continuare) 
 
1) Amoxicilin  2) Benzilpenicilin  3) Feneticilin (sarea de sodiu)  4) Flucloxacilin (sarea de potasiu) 
 
 
NH
C
O
O
Faza staionar : C18 (5 m, pori de 10 nm)
Faza mobil : (A) tampon fosfat cu pH 7,0  (B) acetonitril : ap (9 : 1 ; v/v) 
Detectare : 275 nm ; Debit : 1 ml/minut
timp (min)
A (% v/v)
B (% v/v)
30-50 20 80
52-65 70 30
NH
C
O
O
 
157




Controlul puritii Esomepromazolului prin HPLC chiral
 
Rezoluia chiral a Ibuprofenului 
 
Separarea enantiomerilor Clortalidonei
 
163Separarea enantiomerilor Naproxenului dintr-un amestec neechimolar (R : S = 3 : 7)
 
Rezoluia enantiomerilor  Bendrofluometazidei
 
 
Gel Permeation Chromatography (GPC) - sortarea mecanic a moleculelor din prob dup dimensiunile lor în soluie 
Utilizare : mai ales pentru separarea componentelor cu molecule mari (oligomeri, macromolecule): proteine (anticorpi, toxine, enzime), peptide, oligo- i polizaharide etc. 
Mecanism de interaciune cu FS : în cazul ideal interaciunile fizico- chimice dintre FS i componentele probei sunt neglijabile 
Singurul factor de separare: potrivirea / nepotrivirea unor molecule în cavitile FS 
Molecule mai voluminoase mobilitate cromatografic  mai mare
Cromatografie cu faza mobil lichid 
Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
V0 - volum interstiial  VT - volum liber total
(accesibil moleculelor)
168
Într-o prim aproximaie: volumul molecular este proporional cu masa molecular relativ ; din acest motiv se afirm c în croma- tografia de gel- permeaie componentele sunt separate în funcie de masa molecular relativ a lor
Derularea separrii se poate exprima prin timpul de retenie sau prin volumul de retenie. În GPC deseori se utilizeaz volumul de retenie (volumul de FM care a prsit coloana pân în momentul ieirii unei componente din coloan). Dac componentele probei nu sunt implicate în interaciuni specifice cu FS (separarea are loc strict dup criterii de  potrivire steric), atunci se verific relaia : 
Cromatografie cu faza mobil lichid 
Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
VT > V > V0
în care V este volumul de retenie al componentei care are masa
molecular relativ egal cu
169
Între moleculele probei, unele au volumul (masa molecular relativ M) suficient de mare pentru ca s nu se potriveasc în nici una dintre cavitile gelului. Toate moleculele care au volumul molecular egal cu –  sau mai mare decât –  acest prag, elueaz la volumul de eluie
egal cu V0.  Între moleculele probei, unele au volumul (masa molecular relativ m) suficient de mic pentru ca s se potriveasca în toate cavitile gelului. Toate moleculele care au volumul molecular egal cu  –  sau
mai mic decât –  acest prag, elueaz la volumul de eluie egal cu VT.  Dac o component (notat prin X) are volumul de retenie mai mare decât VT , înseamn c aceasta este implicat în interaciuni specifice cu faza staionar (fenomen nedorit în cromatografia de gel-filtrare).
Cromatografie cu faza mobil lichid 
Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
În cazul în care separarea are loc strict dup criterii sterice, un anumit gel (cu o anumit extindere a dimensiunilor cavitilor ) poate separa molecule cu volum molecular (i implicit cu mas molecu- lar) cuprins între o limit superioar (LS) i o limit inferioar (LI) 
Cromatografie cu faza mobil lichid 
VT > V
Cromatografia de gel- permeaie se utilizeaz i pentru determinarea masei moleculare a unor molecule mari, cazuri în care alte metode nu pot fi utilizate
Migrarea unei componente se caracterizeaz prin capacitatea de reinere
(K ) sau prin coeficientul de distribuie al coloanei [ (K d) ] , date
referitoare la componenta în cauz (având masa molecular ) :
0 V
T V
0 VVμ
 pori V
0 VVμ
μ)d (K ;
0 V
0 VVμ
(K d) reprezint fraciunea din volumul fazei staionare care este
disponibil pentru componenta cu masa molecular relativ .
Cromatografie cu faza mobil lichid 
Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
172
În practic este greu de determinat volumul fazei staionare V pori . Din acest motiv este mai convenabil utilizarea constantei (K av)  (constanta de "disponibilitate" –  " availability constant " –  referitoare la componentele cu masa molecular relativ m).
0 V
col V
0 V
μ V

Vcol reprezint volumul interior al coloanei, volum egal cu suma volumelor spaiului interstiial, porilor i miezului solid: 
Vcol = Vsolid + V pori + V0
(K av) reprezint fraciunea din volumul umpluturii colanei, disponibil componentei cu masa molecular relativ .
Cromatografie cu faza mobil lichid  Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
 
de celuloz, copolimeri (stiren - divinilbenzen), polimeri
(poliacrilamid, alcool polivinilic, polistiren, polimetacrilat),
dextran, proteine globulare, silicagel hidratat etc.
În cazul unui gel dat, raportul μ
) d
(K 
μ )
componentelor care nu manifest interaciuni specifice cu gelul
(numai interaciuni sterice), se verific inegalitatea 0 < (K av) < 1
Pentru gelurile comerciale se dau curbele de selectivitate (dependena constantei K av de lg ).
Cromatografie cu faza mobil lichid  Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
 
4: adenilat kinaza (32.000);
5: citocrom C (12.400)
Cromatografia de gel-permeaie (gel-filtrare)
Purificarea crotaminei din veninul de arpe (200 mg de venin de Crotalus durissus
terrificus)
Gel: Sephadex G-100 (2,5x85 cm); Faza mobil: tampon formiat de amoniu (pH 3,0)
1: convulxin; 2: gyroxin; 3: crotoxin; 4: crotamin 
 
Separarea proteinelor prin cromatografie de gel-filtrare 1. IgM de oarece 
(M = 900 kDa); 2. Tiroglobulin bovin
(M = 670 kDa); 3. b-amilaz din cartofi
(M = 200 kDa); 4. Seralbumin bovin
(M = 67 kDa); 5. Albumin aviar
(M = 45 kDa) 6. Ribonuclez bovin
(M = 13,7 kDa); 7. Azid de sodiu
(M = 0,067 kDa)Gel: Dextran (coloana ZORBAX FG-250
 
Relaia dintre logaritmului masei moleculare i volumul de eluie la cromatografia de gel- permeaie. 
Curbele individuale sunt trasate cu fracii de polistiren având mase moleculare diferite.
 
1. Dextran-50 (43,5 kDa)
2. Dextran-25 (21,4 kDa)
3. Dextran-12 (9,98 kDa)
4. Dextran-5 (44,4 kDa)
5. Dextran-1 (1,08 kDa)
179
Cromatograma unei probe de dextran având componente cu grade diferite de policondensare (molecule coninând un numr variabili de meri). Masa molecular medie a amestecului este 1000 Da. Separarea este realizat pe un gel de tipul “Sephadex peptid HR” (T. Anderson i colaboratorii:
 J . Chromatography  1985:326, 33)
Cromatografie cu faza mobil lichid 
. . . este o tehnic performant de separare a compuilor anorganici sau organici care, în condiiile de lucru, manifest caracter ionic (posed sarcin electric). 
Mecanism de interaciune : 
- interaciuni electrostatice între speciile ionice din prob i gruprile ionizate legate pe suprafaa particulelor de rin 
- echilibre de schimb ionic - efect salin primar i interaciuni de solvatare 
Faza staionar : 
 
- dup natura speciilor ionice schimbate 
- cationii (schimb cationi; grupele ionizabile, legate chimic de rin, au sarcina electric negativ)
- anionii (schimb anioni; grupele ionizabile, legate chimic de rin, au sarcina electric pozitiv) 
- dup tria acid (bazic) a gruprilor ionice legate de rin 
- cationit / anionit tare - cationit / anionit slab
• Un cationit este în " forma H " dac ionul reinut pe suprafaa lui (prin inter - aciuni electrostatice cu gruprile legate chimic de rin) este protonul, H +. Dac acest ion este dislocat din vecintatea grupelor legate de rin cu ali ioni, de exemplu cu Na+, atunci cationitul este în " forma Na ".
• Un anionit este în " forma OH " dac ionul reinut pe suprafaa lui (prin in-
teraciuni electrostatice cu gruprile legate chimic de rin) este ionul OH - . Dac
acest ion este dislocat din vecintatea grupelor legate de rin cu ali ioni, de
exemplu cu Cl - , atunci anionitul este în " forma Cl ".
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni 
 
Ionii (A) imobilizai în
funcie de preferina
grupelor de funcionale
în funcie de condiiile
chimice din faza lichid
(pH, trie ionic, etc.)
 
184
Ionii Na+, prezeni în soluie, disloc protonul din gruparea sulfonic a rinii i sunt fixai,  prin fore electrostatice, în sfera de solvatare a anionului sulfonat. Protonul trece în soluie în forma disociat (electrolit tare).  Procesul este reversibil.
Echilibrul nu este deplasat pre- dominant într-un anume sens.
Dac în urma dislocrii proto- nului, acesta trece în soluie în forma de electrolit slab (con- centraia de H+ mic), atunci echilibrul este deplasat spre " forma Na " a rinii. 
Exemplu : Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni 
 
185
Dac rina aflat în "forma Na" este plasat într -o soluie cu concentraie destul de mare a ionilor de K + (electrolit tare), atunci ionii Na+ din sfera de solvatare a anionului sulfo-nat  pot fi dislocai (proces reversibil) de ionii de K +. Rina aflat în "forma K" sau în "forma Na" se  poate transforma din nou în "forma H" dac este introdus într-un mediu cu concentraia suficient de mare a ionilor H+  (nu în ap distilat, deoarece aici concen-traie ionilor H+ este mic, de ordinul de mrime 10-7  mol/l la 22 oC).
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni  Exemplu :
 
186
Gruparea ionizabil activ, legat chimic de rina de tip cationit, poate fi alta decât sulfonic, de exemplu poate fi grupare carboxilic. Având în vedere faptul c acizii carboxilici sunt acizi mai slabi decât acizii sulfonici (acizii carboxilici disociaz în msur mai mic decât acizii sulfonici), în " formele H " protonul din sfera de solvatare a gruprii sulfonice este disociat în msura mai mare decât protonul din sfera de solvatare a gruprii carboxilice.
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni 
 
187
Exemplu :
Un anionit este capabil s schimbe anionul reinut în sfera de solva-tare a grupei active (un cation cu sarcina electric pozitiv) cu un alt anion, aflat la concentraie suficient de mare în mediul cu care rina este în contact.
Anioniii au gruparea ac- tiv cu caracter bazic (în funcie de tria bazic a grupei active, anionitul
 poate fi tare sau slab).
Rinile schimbtoare de ioni rein ionii în mod di- fereniat. 
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni 
 
Cationit Structura rinii  Gruparea ionogen 
Amberlit IR-100 Amberlit IR-105
Zeo-Carb 225 copolimer stiren - DVB -SO2OH
Amberlit IR-50 polimer de acid metacrilic -COOH
Zeo-Carb 216 fenolic  -OH ; -COOH
Sephadex SE-25 Sephadex CM-50
 
nucleu aromatic
Sephadex DEAE A-25 Dextran -O-CH2-CH2-N(C2H5)2 
Câteva rini schimbtoare de ioni ( II ) 
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni 
 
190
Schema unei instalaii simple  pentru separare cu coloan umplut cu rin schimbtoare de ioni. 
Montajul asigur acoperirea în permanen a rinii cu eluent.
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni 
 
Instalatie de cromatografie ionica
192 Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni 
Izolarea acizilor slabi (organici) dintr-un amestec ( I )
Acizii slabi (organici, R-COOH), datorit gradului de ionizare redus, sunt reinui din soluii apoase sau alcoolice numai pe rini anionice puternic  bazice, de pe care se elueaz cu soluia unui acid puternic ( X
-  H+ , de exemplu acid clorhidric în etanol sau acid acetic ), cu grad de
ionizare avansat.
 
 
Izolarea bazelor organice dintr-un amestec ( I )
 
Izolarea bazelor organice dintr-un amestec ( II )
Bazele organice mai pot fi eluate cu soluii diluate de hidroxid de sodiu sau cu amoniac în solveni organici (ex. alcooli).
Exemplu : izolarea alcaloizilor din produse vegetale
 
196
 
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni 
 
Separarea amestecurilor de alcaloizi (amestec de morfin i codein)
 
 
Proiectia Fischer   a moleculei de glucoza
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni 
 
Determinarea efedrinei (sulfat) dintr-un sirop 
 
densitate de sarcina
1  2  3
AcO-  OH-  F-
1  2  3
Cl-  NO3  NO2
1  2  3
 NO3  SO4  SO3
 
densitate de sarcina
1  2  3
K +  Na+  Li+ 
1  2  3
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni 
 
Cationit
Ordinea de elutie acizilor si bazelor de pe un anionit respectiv de pe un cationit
Cromatografie pe rini schimbtoare de ioni 
 
 
- descompunerea spectral a unei radiaii emise de proba  - modificarea spectrului unei radiaii electromagnetice ca urmare a
trecerii acesteia prin prob 
- spectrometrie de rotaie optic (ORD) - spectrometrie de dicroism circular (CD)
Mecanismul de generare a spectrelor la nivel molecular / atomic :
- tranziii electronice între strile staionare (cuantificate) ale moleculelor sau ale atomilor
- tranziii între strile staionare de vibraie ale moleculelor  
 
Modul de manifestare a interaciunii radiaiei cu proba : 
- absorbie  - emisie - fluorescen 
Domeniul spectral implicat :
- ultraviolet (UV) : 200 - 380 nm - vizibil (VIS) : 380 - 800 nm - infrarou apropiat (NIR) : 800 - 2500 nm - infrarou mijlociu (IR) : 2500 - 50000 nm - infrarou îndeprtat (FIR) : 50000 - 1000000 nm
UV-A : 320 –  400 nm
UV-B : 280 –  320 nm
UV-C : 100 –  280 nm
210
Corelarea între modul de manifestare al interaciunii radiaiei cu proba i mecanismul de generare a
semnalului optic util
Absorbie  Emisie Fluorescen  Efect Raman
Rotaie optic 
UV
ultraviolet i vizibil 
Msurarea variabilelor de energie ale unei radiaii monocromatice la trecerea acesteia printr-un strat de prob, în funcie o variabil de und a radiaiei 
Variabile de und : 
- frecven ( f ) ( Hz )
λ 
 
Moduri de reprezentare a spectrelor de absorbie ( I )  
 
Reprezentare potrivit pentru determinri cantitative
 
Reprezentare utilizat pentru cataloage de spectre in vederea identificrii compusilor
 
Spectrofotometru monofascicol
(unor) componente chimice. Componentele chimice, care sunt
prezente în prob dar nu prezint interes spectrofotometric
(formeaz numai mediul în care se gsete substana de interes),
constituie "matricea" probei. Pentru a scade automat spectrul
matricei (deseori spectrul solventului) din spectrul amestecului,
se utilizeaz spectrofotometre cu fascicol dublu. 
 
   t  r   u
   i  c   o
220
Relaii cantitative între variabilele de energie i datele de interes analitic 
Fie - A(l) - absorbana unei probe la lungimea de und l ; - d - grosimea probei (stratul de material prin care a
trecut radiaia) ;  - c - concentraia molar a speciei chimice care
absoarbe la lungimea de und  l ;
atunci, în condiii ideale se verific relaia ( Bouguer - Lambert - Beer )
)(dc )(
 
Conform relaiei Bouguer - Lambert - Beer , absorbana este direct  proporional cu concentraia molar a speciei chimice rspunztoare de absorbia optic. 
Coeficientul e(l) se numete coeficient de absorbie molar (sau absorbtivitate molar ) i este o caracteristic a speciei chimice care cauzeaz absorbia optic ( depinde de l ).
Relaia Bouguer - Lambert - Beer  ( BLB) se verific cu urmtoarele condiii : 
- concentraia molar s nu fie prea mare ( c < 10-2 mol/l ) ;
- radiaia difuz în spectrofotometru s fie neglijabil ; 
- speciile chimice rspunztoare de absorbie optic, sau matricea (solventul) s nu fie implicate în echilibre chimice, dependente de concentraii. 
 
 
224
La concentraii mai mari decât 10-2 mol/l , relaia Kortüm  descrie mai fidel dependena absorbanei de concentraie ; A(l) propor ional cu expresia urmtoare :
22 ]2)λ (n[
+

Relaii cantitative între variabile de energie i datele de interes analitic 
În relaia de mai sus n(l) este indicele de refracie al probei la lungimea de und l.
 
225Relaii cantitative între variabile de energie i datele de interes analitic 
Relaia BLB deseori este utilizat în una din urmtoarele forme : 
%Cd)(A)(A;Cd)()(A   %1
A(l) este absorbana msurat la lungimea de und l ;
e l) este absorbtivitatea molar a speciei absorbante la lungimea de und l ;
este absorbia specific a speciei absorbante la lungimea de und l ;
d este grosimea de strat traversat de radiaia electromagnetic ; 
C este concentraia molar în prob a speciei absorbante ; 
C% este concentraia procentual (m/V) a speciei absorbante 
)(A  %1 cm1   l
 
226Relaii cantitative între variabile de energie i datele de interes analitic 
Uniti de msur (tolerate, utilizate în practica spectrofotometric): 
cmg
dl
cmgram
în care:
 
Combinaii de mrimi utilizate în controlul analitic al medicamentelor
Raportul valorilor de absorban, msurate în spectrul unei specii chimice la dou lungimi de und diferite l1 i l2 , nu depinde (conform relaiei BLB) de concentraia speciei chimice absorbante, deci se poate utiliza pentru stabilirea identitii chimice a componentei respective : 
)d(stratdegrosimeadenici),c(,ieconcentratdedepindenu )(A
l l
Diferena valorilor de absorban, msurate în spectrul unei specii chimice la dou lungimi de und diferite l1 i l2 , este direct proporional (conform relaiei BLB) cu concentraia speciei absorbante, deci se poate utiliza pentru determinarea cantitativ a speciei chimice respective 
)]()([dc)(A)(A 2121   lelell
 
229
În practica analitic se recurge la msurarea absorbanei la lungimi de und diferite i utilizarea unei expresii de corectare în cazurile în care benzile de absorbie a dou (sau mai multe) specii chimice se suprapun într-o msur considerabil 
Analiza spectrofotometric a amestecurilor 

231Analiza spectrofotometric a amestecurilor 
 Morton i colaborrii au propus o metod spectrofotometric,  practicat în domeniul ultraviolet, pentru determinarea vitaminei A (în form de alcool) dup saponificarea prealabil a formelor esterificate (ex. acetat). La determinarea din soluii uleioase (pe  baza de ulei din ficat de pete), absorbia uleiului interfer cu cea a vitaminei A; din acest motiv autorii recomand citirea absorbanei la trei lungimi de und diferite (325 nm , 310 nm i 334 nm) i calcularea unei valori corectate de absorban, A(cor), conform relaiei de mai jos.
A(cor) = 6,815.A(325 nm) - 2,555.A(310 nm) - 4,260.A(334 nm)
 
232
În 1966 E. Farkas a propus, pentru controlul puritii tolazolinei, raportul absorbanelor msurate la 257 nm i 250 nm. Pentru o soluie de tolazolin nedescompus, acest raport trebuie s aib valoarea 0,55. 
55,0 )nm250(A
Drept test de puritate (substan nedescompus) pentru soluia etanolic de tolazolin V. Georgescu-Parazina i A.
Cosmin au propus urmtorul raport de absorbane. 
53,1 )nm5,263(A
)nm257(A 51,1  
- - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - -
Analiza amestecurilor f r separarea chimic a componentelor
 
C1 , C2 , . . . , Cn , . . . , C N
Conform relaiei BLB rezult : 
1n n0   ),2,1; N,,2,1n(;C)(dA)(A
),,2,1; N,,2,1n(;)C()(d)(A netnn   Llll   e  
net


“pn” reprezint ponderea soluiei etalon nr. “n” în determinarea valorii absorbanei amestecului (probei)
În practic L > N + 1 pentru a minimiza efectul erorilor de msurare asupra rezultatului final al analizei
sistem de ecuaii supradeter - minat, care se rezolv cu metoda celor mai mici ptrate 
Raportul  exprim 
concentraia componentei “n”
net
n
)(C
C
 
  ) N,,2,1n(;)(A)(A) p,A(F 2
 
ll+L
Concentraiile componentelor din prob se calculeaz astfel :  
Cn = pn.(Cet)n  ; ( n = 1 , 2 , . . . , N )
 
Analiza amestecurilor f r separarea chimic a componentelor
Dup rezolvarea sistemului de ecuaii în raport cu A0 i  pn (n = 1 , 2 , . . . , N) se recalculeaz absorbanele probei la cele L valori de lungime de und : 
Potrivirea valorilor de absorban msurate ale
 probei cu cele recalculate, se exprim prin ptratul coeficientului de corelare (r 2) :
0 < r 2 < 1
 
Amestec (prob)  Acid salicilic Cafein  Paracetamol 0,4878 0,0901 0,2097 1,7715
0,4454 0,0550 0,2906 1,4761
0,4140 0,0534 0,3975 1,1169
0,3987 0,0727 0,5080 0,7877
0,4016 0,1147 0,5879 0,5607
0,4105 0,1816 0,6014 0,4452
0,4051 0,2720 0,5265 0,3848
0,3741 0,3750 0,3788 0,3136
0,3246 0,4646 0,2008 0,2338
0,2793 0,5171 0,0747 0,1551
0,2391 0,4998 0,0257 0,0860
0,1952 0,4214 0,0149 0,0423
0,1401 0,2929 0,0130 0,0288
0,0882 0,1658 0,0111 0,0242
0,0553 0,0840 0,0107 0,0226
0,0352 0,0377 0,0086 0,0197
0,0282 0,0202 0,0098 0,0209
 
Concentraii în soluii (mg/l)  C1 ; C2 ; C3 20,02 10,03 20,03
Exemplu
L = 17 ; N = 3
13591,3 p03468,8 p62596,2 p99028,0A48990,7
53587,1 p62596,2 p71985,1 p71305,0A86970,3
04982,1 p99028,0 p71305,0 p31281,1A71800,3
72240,4 p48990,7 p86970,3 p71800,3A0000,17
l paracetamol/mg030,402,2020133,0)C( pC
)(A l   )(A l
244
CARTER, G.T., SCHIESSWOHL, R.E., BURKE, H., YANG, R. J. Pharma. Sci., (1982) 71: p. 383
)λ ,(λ R  )(λ ε
)(λ ε 21I
)(λ ε 21I

2I1I21II
2S1S21IS
2121I
Supresarea contributiei ingredientilor
indiferent de concentraia ansamblului de ingredieni, în timp ce . . .
AS(246,8 nm) –  0,9467.AS(243,8 nm) ≠ 0
Se observ din spectre c : 
 
0.0000
0.0200
0.0400
0.0600
0.0800
0.1000
0.1200
0.1400
0.1600
0.1800
0.2000
  y   =   s   e   m   n   a
   l    c   o   r  e   c
   t  a    t    (   d   =
Supresarea contributiei ingredientilor
Semnal optic 
Cantitate (mg/comprimat) 
Semnal optic 
Cantitate (mg/comprimat) 
Semnal optic 
Cantitate (mg/comprimat) 
Rezultatele analizei produsului “MEDOSTATIN” 
Spectrul ingredientilor A0(l)
Exemplu: determinarea prin spectrofotometrie a Diazepamului si a Bromurii de Otiloniu in amestec 
NN
CC
OO
Cl
Bromura de Otiloniu
B. Morelli : Fresenius’Anal. Chem., 1997:357, 1179
 
 A.Y.E. Sayed, N.A.E. Salem : Analytical Sciences  2005:21, 595
Determinarea
Spectre de absorbtie
V. David, Iulia Gabriela David, V. Dumitrescu
In spectrul derivat al
Eferalganului la 243,5 nm
numai Paracetamolul (1) la
determina concentratia
determina concentratia
Paracetamolului (1)

contin componentele unice X , Y , Z etc. la concentratii molare
cunoscute sunt :
et Y
et X
Absorbanta unui amestec de componente X , Y , Z etc., la lungimea de unda l, este :
Metoda “First Derivative Ratio Spectrophotometry” 
F. Salinas, J.J. Berzas, A. Espinosa
Talanta, 1990:37,347




++
C)(d)(A
C)(d)(A
C)(d)(A
(*)
 
Se observa :
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
(*)




+
 
   
 
 N.K. Vipul, M. Rajshree : Anal. Sci., 2007:23, 445
Atorvastatin :  reduce in special colesterolemia serica
Fenofibrat :  reduce in special concentratia trigliceridelor serice
 
260Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry” 
 
261Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry” 
 
262Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry” 
 
263Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry” 
 
264Determinarea smultana a Atorvastatinei si Fenobibratului cu metoda “Ratio Derivative Spectrophotometry” 
 
 
Într-o soluie componentele chimice X i Y, prezente în momentul preparrii soluiei, interacioneaz chimic în diferite rapoarte stoechiometrice i prin  procese de echilibru formeaz M compui chimici noi  :
a b   a b
a b   a b
a b   a b
a b   a b
a b   a b
Scopul urmrit este determinarea numrului de echilibre chimice independente din sistem
Importana în controlul medicamentului:
numeroase substane active for - meaz compleci de transfer de sarcin (compleci moleculari) fie cu substanele active ale altor medicamente, fie cu unii ingredieni este afectat
 biodisponibilitatea medicamen- tului
Se vor nota în continuare :
eX , eY  absorbtivitatea molar a speciilor X respectiv Y ;  CX concentraia analitic (iniial) a componentei X ; CY  concentraia analitic (iniial) a componentei Y ;  [X] , [Y] concentraiile de echilibru ale speciilor X respectiv Y ; [(XY)m] concentraia de echilibru a speciei XamYbm 
Determinarea numrului de echilibre chimice independente 
CX = [X] + a1 .[(XY)1] + a2
.[(XY)2] + . . . + am .[(XY)m] + . . . +
.[(XY)2] + . . . + bm .[(XY)m] + . . . +
 
Determinarea numrului de echilibre chimice independente 
A(l) = d.{eX(l).[X] + eY(l).[Y] + e1(l).[(XY)1] + . . . + eM(l).[(XY)M]}
Dup exprimarea concentraiilor de echilibru [X] i [Y] în funcie de concentraiile analitice cX i cY , rezult: 
A(l) = d.{eX(l).(CX - a1.[(XY)1] - . . . - am.[(XY)m] - . . . -
- aM.[(XY)M] ) + eY(l).(CY - b1.[(XY)1] - . . . -
- bm.[(XY)m] - . . . - bM.[(XY)M] ) + e1(l).[(XY)1] + . . . +
269 Determinarea numrului de echilibre chimice independente 
În cazul în care componentele iniiale X i Y nu ar fi implicate în nici un echilibru chimic, absorbana soluiei, A*(l), s-ar compune aditiv numai din contribuiile acestor dou componente. 
A*(l) = d.(eX(l).CX + eY(l).CY) 
Diferena dintre absorbana de echilibru a sistemului i absorbana A*(l) este absorbana de exces Aex(l) ; aceasta se poate atribui modificrilor din sistem cauzate de echilibrele chimice.
Aex(l) = A(l) –  A*(l) = A(l) –  d.(eX(l).CX + eY(l).CY) 
Aex(l) = d .S [(XY)m].(em(l) – eX(l).am – eY(l).bm) m = 1
M
 
270
Se prepar s = 1 , 2 , . . . , S soluii care se deosebesc prin valorile de concentraii
analitice CX i CY . Se msoar pentru fiecare soluie, la acelai set de lungimi de
und l1 , l2 , . . . , lL convenabil ales, absorbana de exces As ex(l) ; (s = 1 , 
2 , . . . S). Se impune ca atât numrul S al soluiilor preparate cât i numrul L de
lungimi de und s fie mai mare decât numrul de echilibre M prognostizat. Valorile   As
ex(l) ; (s = 1 , 2 , . . . S) , (l1 , l2 , . . . , lL) obinute se organizeaz într -o matrice :
Determinarea numrului de echilibre chimice independente 

 
 

 
 






e xA Prin determinarea rangului matricii se  poate preciza numrul M al speciilor chimice care coexist în soluie ca urmare a echilibrelor, în afara speciilor X i Y, deci numrul speciilor ale
 
Soluie stoc X 
s(l) 
Amestecare
 
A(l) = d  .{eX(l).[X] + eY(l).[Y] + eXY(l).[XaYb]}
Se va admite, c eY(l) este neglijabil în domeniu spectral investigat ; în acest caz rezult : 
A(l) = d  .{eX(l).[X] + eXY(l).[XaYb]}
CX = [X] + a.[XaYb]
Dac în domeniul spectral exist cel putin o lungime de und (l*)
 pentru care eXY(l*) = a.eX(l*) = e(l*) atunci rezult : 
A(l*) = d  .{eX(l*).[X] + a.eX(l*).[XaYb]}=
= d  .{e(l*).[X] + a.e(l*).[XaYb]}=
= d  .  e(l*) .{ [X] + a.[XaYb]} = d 
.  e(l*).CX
274Punct izosbestic 
Exemplu : componenta Y (a crei absorbie este neglijabil) poate fi  protonul ( H+ ) ; de exemplu echilibrul protolitic al eugenolului (protonul nu absoarbe în ultraviolet)
Apariia unui punct izosbestic poate fi cauzat nu numai de un echilibru, dar i de un proces ireversibil, cu condiia ca în sistem s se desfoare un singur proces 
Spectrele suprapuse, înregistrate în momentele diferite ale desfu- rrii procesului, pot prezenta punct izosbestic cu condiia s existe
o lungime de und (l*) pentru care eX(l*) = eY(l)
 
1,4-dihidro-2,6-dimetil-4-(2-nitrofenil)- -3,5-piridin-carboxilat de dimetil
 
264 274 284 294 304 314 324 334 344 354
lungime de unda (nm)
   A    b   s   z   o   r   b   a   n    t  a    (   d   =    1   c   m    )
   2    8    9   n   m
Fototransformarea acetatului de retinil (iradiere: 300 –  400 nm)
 
( metoda variaiei continue ) 
 
Concentraiile speciilor X i Y în una din soluiile preparate :  
YX
Fraciile molare ale substanelor dizolvate în amestecul obinut sunt:
Concentraiile molare CX i CY se exprim în funcie de variabila introdus (x) astfel: 
CX = C.x ; CY = C.(1-x) 
280
Concentraiile molare de echilibru ale speciilor prezente, X , Y i  XaYb , satisfac relaiile :
[X] = CX  –  a.[XaYb] = C.x –  a.[XaYb]
[Y] = CY  –  b.[XaYb] = C.(1 –  x) –  b.[ XaYb]
[X]a.[Y]b = K .[XaYb]
Metoda variaiei continue 
Dac se prepar o serie de soluii de lucru amestecând volume diferite
(VX)i i (VY)i , (i = 1 , 2 , . . . , S) ale soluiilor stoc, astfel încât la
fiecare soluie de lucru suma volumelor amestecate s fie aceeai,
(VX)i + (VY)i = V ; i = 1 , 2 , . . . , S, atunci valorile xi i concentraiile
 
Fie x0 valoarea variabilelei x pentru care concentraia de echilibru
[XaYb] are valoare maxim ( [XaYb]0 = max ) . . .
. . . atunci în soluia respectiv concentraiile de echilibru corespun-
zatoare ale celorlalte specii se vor nota [X]0 i [Y]0 , iar derivata
concentraiei [XaY b] în raport cu variabila x , pentru x = x0 , este nul. 
Metoda variaiei continue 
0
x1
x
b a
 
282
Dac la amestecarea celor dou soluii stoc componentele X i Y ar coexista fr a participa la echilibru, atunci absorbana (msurat la lungimea de und l) soluiei de lucru (caracterizat de valoarea “ x ”  a variabilei de echilibru) ar fi A*(l,x) :
Metoda variaiei continue 
A*(l,x) = d  .{eX(l).C.x + eY(l).C.(1-x)} + Asolv(l) 
Dac componentele X i Y interacioneaz chimic i se realizeaz starea de echilibru, atunci absorbana soluiei de lucru este A(l,x):
A(l,x) = d  .{eX(l).[X] + eY(l).[Y] + eXaYb
.[XaYb]} + Asolv(l) 
.[XaYb] –  
 pentru x = x0 
 
 în domeniul spectral ultraviolet (UV) i vizibil (VIS) 
 
Mecanismul cuantic de producere a spectrelor de absorbie - tranziii de electroni din strile staionare inferioare (fundamental) în strile staionare superioare. 
Domeniul de lungimi de und: - ultraviolet de vid : l < 200 nm ; - ultraviolet (UV) : 200 - 380 nm ; - vizibil (VIS) : 380 - 800 nm.
Absorbia - la probele aflate în starea condensat - se prezint în forma de  benzi mai mult sau mai puin largi. 
Lungimea de und a maximului benzii de absorbie este cu atât mai mare cu cât este mai mic diferena de energie între strile staionare (fundamental i excitat) implicate (conform relaiei Max Plank ).
Intensitatea absorbiei, deci i valoarea coeficientului molar de absorbie
 
 
În cazul moleculelor substanelor organice, cele mai frecvente tipuri de tranziii electronice moleculare sunt: 
- tranziii de tipul  - * se realizeaz de pe un orbital molecular de legtur   pe un orbital molecular de antilegtur * ;
- tranziii de tipul * se realizeaz de pe un orbital molecular de legtur   pe un orbital molecular de antilegtur * ;
- tranziii de tipul n - * se realizeaz de pe un orbital molecular de nelegtur n  pe un orbital molecular de antilegtur * ;
- tranziii de tipul n - * se realizeaz de pe un orbital molecular de nelegtur n  pe un orbital molecular de antilegtur *.
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS 
 
288
Tranziiile * sunt caracteristice moleculelor nesaturate care  posed, pe lâng legturi , i legturi chimice de tip  (în special la alchene, poliene, hidrocarburi aromatice, dar i la molecule nesatura- te în care un heteroatom este implicat într-o legtur ).
Energia tranziiilor de acest tip este mai mic decât în cazul tranziiei *, deci banda de absorbie produs apare la lungimi de und mai mari (accesibile spectrofotometrelor obinuite).
Extinderea conjugrii electronilor  în starea fundamental, depla- seaz maximul benzii de absorbie spre lungimi de und mai mari ("deplasare batocrom").
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS ( IV ) 
Reprezentarea simplificat a unei tranziii *
 
289
Tranziiile n - * sunt caracteristice moleculelor saturate care conin un heteroa- tom cu electroni neimplicai în legtur chimic în starea fundamental a moleculei (alcoolii saturai, eterii saturai, aminele saturate, derivaii halogenai saturai). Benzile de absorbie asociate cu acest tip de tranziie apar în domeniul ultraviolet, la lungimii de und mici. Maximul de absorbie se deplaseaz batocrom odat cu accentuarea electronegativitii heteroatomului.  
Aspecte calitative ale spectrofotometriei în UV-VIS 
Tranziiile n - * sunt caracteristice moleculelor nesaturate care posed heteroatom cu electroni neimplicai în legtur chimic. Aceste tranziii produc în general benzi de absorbie intense, la valori relativ mari ale lungimii de und, domeniu accesibil uor de spectrofotometrele obinuite, motiv pentru care aceste tranziii au cel mai
însemnat rol analitic. Extinderea conjugrii n -  sau  în starea fundamental a moleculei cauzeaz deplasarea batocrom a benzii de absorbie.  
Reprezentarea simplificat a unei tranziii p - *
 
Factorii care influeneaz poziia i intensitatea benzilor : 
- conjugarea electronic în starea fundamental a moleculei determin intensificarea absobiei i deplasarea batocrom a maximului benzii de absorbie ; 
- pH - ul mediului poate influena atât poziia cât i intensitatea  benzilor de absorbie în cazul în care molecula absorbant este implicat în echilibre protolitice ; 
- mediul influeneaz poziia maximului benzii de absorbie  prin solvatarea difereniat a moleculei în starea fundamental i starea excitat (solvatocromie) ;
- într-o oarecare msura temperatura poate influenta poziia i/sau intensitatea benzii de absorbie (termocromism).
 
Efect hipsocrom Efect batocrom
Influe