Universitatea Politehnica din București

Catedra de Inginerie Chimică și Biochimică

Profesor dr. ing. Gheorghe MARIA

Elemente de Inginerie Metabolică Celulară

• Flux celular = viteze de reacție enzimatice celulare în condiții de creștere staționară (homeostază);

= efectul modificării genomului asupra fluxurilor celulare și producției de metaboliți (vaccinuri, biosinteză industrială, noi enzime modificate, etc.);

2

• Inginerie Metabolică = studiul fluxurilor celulare;

• Scop = modificarea fluxurilor celulare (prin acțiunea asupra enzimelor celulare) pentru obținerea de metaboliți doriți în cantități mai mari;

• Microorganisme celulare:

Celule procariote (mai simple; bacterii, alge);

eucariote (mai complexe; animale, vegetale).

• Procariote perete celular (proteine + oligozaharide);

spațiu periplasmatic (proteine);

citosol apos (RNA, enzime, ioni …..);

membrană plasmatică (proteine + lipide) mezozomi (replicare DNA, sinteză ATP);

nucleu fără membrană (DNA, cromozomi);

filament;

Celule

DNARNAProteineSubstrat (C, N, O, P, microelemente)

DNARNAProteine

3

4

• Eucariote

RER (reticul endoplasmatic rugos) = membrane + vezicule (sinteză proteine, fosfolipide);

nucleu cu membrană (DNA, cromozomi, rRNA, proteine);

corp Golgi = sortare și împachetare proteine cu membrană;

membrană plasmatică(acizi grași, proteine,

carbohidrați);

endocitoză;

exocitoză;

mitocondria cu membrană = sinteză ATP, ciclul Krebs, degradare acizi grași, metabolism Fe/S, etc.;

cloroplaste = conțin clorofilă (fixare CO2, producere ATP, sinteză anumite proteine);

lizozomi = pH acid pentru procese degradative (catabolism) ale proteinelor, lipidelor, fosfolipidelor, DNA, RNA;peroxizomi = degradare acizi grași și aminoacizi;

citosol apos + rețea citoschelet.

; mD dtdV

mc D

ln2 t

• { Proteine + Gene } = Pereche geno conține informația structurii proteinei și participă la sinteza ei. Sinteza P și G se catalizează reciproc pe parcursul ciclului celular;

• Scop ciclu celular dublarea conținutului celular urmată de diviziunea celulară (multiplicare celule):

unde: tc = ciclu celular;

V0 = volum celular inițial;

V0 2 V0 = volum final;

Dm diluția celulară = viteza medie logaritmică de creștere celulară.5

Componenți metabolici celulari:

• Nutrienți, apă, ioni, aminoacizi (AA), proteine, enzime (proteine), proteine ne-enzimatice, fragmente proteice, anticorpi, membrane, DNA, RNA, carbohidrați, lipide (grăsimi), metaboliți secundari (care apar în cursul sintezelor), etc.;

ct

0m

2V

V

dtD dV0

0

; tD V2V

ln cm0

0 ;

6

• Aminoacizi (în număr de 20) = ”cărămizile” proteinelor (lanțuri de aminoacizi) (α-amino + α-carboxil);

• Proteine:primară = secvența liniară de aminoacizi;

cutatprin legături de hidrogen;

elicoidalsecundară = modul regulat de pliere a segmentelor

de lanț

terțiară = structura 3D a lanțului (legături de H+, covalent, electrostatic);

Structură

cuaternară = aranjarea mai multor lanțuri 3D (legături covalente);

7

• Enzimele = proteine care catalizează reacțiile de sinteză / degradare celulară

Activitate

”induced-fit” E și S cuplate perfect doar la apropiere. E își schimbă forma:

”lock-and-key” (cheie-lacăt) E și S au forme complementare, rigide, cuplate perfect (geometrie indusă):

8

9

• Mecanismul catalizei:

– oxidoreducere;– transferaze (transfer grupe funcționale);– hidrolaze (scindări hidrolitice);

• Tipuri de enzime 6 grupe (după tipologia reacțiilor catalizate):

– liaze (leagă apa, amoniu sau CO2 la duble legături);

– izomeraze (izomerizări);

– ligaze (două grupe chimice sunt unite cu energia cedată de ATP);

10

- Mase moleculare mari ~ 104 – 105 Da;

- Enzimemonomere (lanț peptidic);

oligomere (mai multe lanțuri peptidice);

- Enzima are un ”centru activ” care ocupă o mică porțiune din structura enzimei;

• Caracteristici enzime:

- Specificitate de substrat;

- Specificitate de reacție;

- Specificitate stereochimică (ex. hidroliza acidului D-fumaric sau a acidului L-fumaric);

- Unitate enzimatică (1U);

[1U = cantitatea de enzimă ce produce 1 µmol produs / min în condiții optime de reacție specificate]

[Da = Dalton ≈ masa H]

11

- Codificare enzime: EC + 3 grupe de cifre;

- Dependența activității enzimatice:

- Influența temperaturii asupra activității enzimatice:

E + S (ES) Pk1

k-1

k2

(Mecanism reacție enzimatică)

12

- Influența substratului asupra vitezei de reacție:

2maxV

Vmax

S Km

Viteza de

reactie

- Influența pH-lui asupra vitezei de reacție:

[S] mK[S] ]t[t ck

- dtdS v

(cinetica de reacție Michaelis-Menten)

t[E] ck Vmax

kc = turnover - number

13

• Membrana celulară:

– implicate în procese de transfer dinspre/către mediul exterior celular;

– sunt permeabile selectiv;

– permeația se face cu ajutorul unei proteine (permează);

– compusă din proteine, lipide și carbohidrați;

– straturile de lipide pot culisa lateral dar nu și transversal;

– vâscozitatea și flexibilitatea ei depind de temperatură, compușii de fluidificare (ex. colesterol);

apa, gazele, ureea = trec direct;

zaharurile, AA, ionii, etc. = necesită permeaze membranare.

– permeația

14

• Transport membranar:

– pasiv (fără consum de energie):- prin difuzie;- asistat de permeaze;- influențat de pH, temperatură și inhibitori;

– activ (cu consum de ATP):- ex. migrația ionilor (ex. Na+, K+, Ca2+, H+) prin

gradientul dat de hidroliza ATP;- ex. glucoză prin atașare la un ion (ex. Na+, H+);

– molecule mari (bacterii, fragmente celulare):- endocitoză (exterior celulă)

• fagocitoză• pinocitoză• endocitoză mediată

scade dimensiune fragment

- exocitoză (celulă exterior);• mediată de receptori membranari;• selectivă.

15

• Hormonii:

– implicați în procese de semnalare celulară și comunicare inter-celulară;

– distanța de semnalaremare;mică;în interiorul celulei semnalizatoare;

– hormoniirămân cuplați de receptorii membranari:

- prostaglandine;- insulină;

ex.

- epinefrină (adrenalină);- histamină;

difuzează în celulă și interacționează în citosol și nucleu:

- steroizi;- tiroxină;

ex.

- vitamina D.

16

• DNA:

– părți constituente ale genelor;– au patru baze posibile:

A = adenină;C = citozină;G = guonină;T = timină;Pi = acid fosforic.

Elicea dublă a unui lanț DNA

Lanț DNArăsucit

Lanț dublu DNA dispus circular

Legături de hidrogen

Bază

Asocierea DNA cu o proteină structurală într-o bacterie

Proteină structurală

Lanț

17

Bază + Deoxiribază + Pi

(monozaharid)

Secvență nucleotide(legături 3’-5’-fosfo-diesterice)

2 lanțuri DNA cuplate prin legături de hidrogen

Cromozomi legați în fibre (perioadă de împerechere – pereche) + Proteină centrală

Operoni = secvență de gene responsabile cu controlul unei anumite expresii genetice

Nucleotid(dNTP)

Lanț DNA

Elice dublăDNA

Nucleozomi(Gene)

Cromozom

Elice dublă DNA + Proteine (5 tipuri)

Histone HP

Nehistone NHP

Operoni

18

Expresie genetică = secvența de reacții catalizate de o genă, implicată în sinteza unei proteine (proteina pereche a genei)

RNA:

= rol în sinteza proteinelor (decodifică informația genetică din DNA);

= structură asemănătoare DNA, doar că în loc de:

• timină uracil (U);

• deoxiriboză riboză (R);

• nucleotide NTP.

19

Ciclul celular:

• Proces de dublare a conținutului celular pe o durată determinată (tc) urmată de diviziunea celulară:

cD dtdV

V0 2 V0 în tc

Dc = viteza medie de creștere celulară (diluție celulară)

20

• Fazele ciclului celular:

G0 Fază inactivă, când nu s-au întrunit condițiile propice de creștere celulară (replicare conținut);

G1 Fază preliminară (”gap”) de ”analiză” a condițiilor de mediu. La sfârșitul fazei G1 există faza G1/S;

S Faza de replicare genom + proteine;

Cei 2 cromozomi care apar (mamă + fiică) = pereche de cromozomi = cromatide (X);

Cromatidele sunt ținute lipite (cei 2 cromozomi identici) de către o proteină (coesină);

G2 Fază de definire și replicare a genomului;

G1/S Momentul în care se ia decizia ireversibilă de replicare a genomului și a conținutului celular. Condiția de decizie este dată de o anumită

raport suprafață exterioară/ volum celular;

masă celulară critică;

21

M Fază de mitoză. Cromozomii sunt aliniați pe o axă și se verifică dacă sunt toți și corect replicați. Cromatidele identice se găsesc la polii opuși axei;

M/F Momentul în care se ia decizia de finish (terminare), adică M = anafază. Coesinele se desprind și sunt distruse. Cromatidele pereche se separă și migrează în sens opus;

F/G0, G1 Celula se divide. Apare iar faza G0 (condiții externe nefavorabile) și apoi, eventual, G1 (condiții externe favorabile);

Controlul ciclului celular este complex și se realizează prin intermediul unor proteine specifice (cicline) care se sintetizează / descompun în funcție de condițiile de mediu.

22

• Sinteza DNA:

dNTP = deoxinucleotide:

dGTP; G = guanină;dTTP; T = timină;dCTP; C = citozină.

dATP; A = adenină;

PPi = acid piro-fosforic;

n (fragmente DNA) + dNTP (n+1)(fragmente DNA) + PPi

5’ 3’ enzimă

(DNA polimerază),Mg2+

- lanț DNA parental = lanț matrice (“template”)

principal (conducător);

secundar;

Celule procariote:

23

- fragmentele DNA parentale sunt citite bucată cu bucată în direcția 3’ 5’ duc la formarea în paralel a:

lanț principal (fiu 5’ 3’); lanț secundar (fiu) din fragmente Okazaki.

- lanț DNA sintetizat începând cu o origine ”ori” (bulă sau ochi de replicare) a cormozomului;

- debutul = polimeraza (”primer”) se leagă la o bucată din lanțul DNA ”ori” (de mărime 250 bp bogată în baze A-T);

24

Replicarea cromozomilor circulari într-o celulă procariotă

(a) Replicarea pornește de la origina “ori” și se propagă bidirecțional de-a lungul cromozomului.

(b) Linia subțire reprezintă cele două lanțuri DNA originare (matrice sau “template”) iar linia groasă lanțurile DNA sintetizate.

(c) Sinteza DNA în furca de replicare. Lanțul principal (conducăto” sau ”leading”) este sintetizat continuu (linie groasă) iar cel secundar (”lagging”) este sintetizat din fragmente Okazaki.

(c)

25

Celule eucariote:

- din cauza complexității și mărimii mai mari a lanțului DNA, replicarea se face:

de la mai multe ”ori” pentru a se asigura replicarea pe durata ciclului celular;

dintr-un ”ori” replicări unități de repliconi (20 – 80 ”ori”) care apoi sunt asamblați;

replicarea este bi-direcțională; distanța dintre ”ori” este de 3 – 3000 kbp;

- suma de cromozomi (gene) = genom.

Sinteza la procariote a genomului este secvențială:

Proteine(Met G) I1 InI2

G1 G2 Gn Gn-1G1

Met G Met G Met G

26

• Sinteza RNA (ribozom):

- codul genetic trebuie citit;înregistrat (mRNA);transcris (tRNA);tradus (translație);folosit în sinteza proteinelor (expresie genetică);

n (fragmente RNA) + NTP (n+1)(fragmente RNA) + PPi

5’ 3’

enzimă

- RNA este de trei tipuri:

rRNA = ribozomial = ”matrice” pentru ribozomi;

mRNA = mesager = ”matrice” de informație pentru gene;

tRNA = de transfer = ”adaptor” al scrierii informației la expresia genetică

- inițiată de o enzimă (primer) legată la capătul genei;

27

inițiere (cu RNA polimerază);

terminare.

- transcrierea informației genetice:

elongație (copiere mRNA a DNA în direcția 5’ 3’);

Cod genetic:

= modul în care secvența de nucleotide genetice este transcrisă în mRNA;= ea este ”tradusă” sub forma secvenței de aminoacizi ce formează proteina;

= informația se transmite sub formă de ”codoni” (tripleți de aminoacizi);

= o ”mutație” genetică schimbă doar o nucleotidă din lanțul DNA (”punct de mutație”);

= de multe ori o mutație în lanțul mRNA transcris nu are efect, deoarece la traducere (translație) secvența trebuie recunoscută (validată) și de către un anti-codon (aflat în tRNA). Deci informația genetică este dublată și în ribozom;

= codul genetic nu este universal dar este similar în majoritatea organismelor.

28

Sinteza proteinelor:

mRNAcodon

transcriere

proteină

mărire lanț proteic

rRNA+ enzimă

citește verifică

anti-codon(t-RNA)

t-RNA

29

- mRNA este tradus (translație) de către ribozomi (uzina de proteine);

- citirea este activă (pentru sinteză proteine, 5’ 3’);

controlată (finalizată prin control);

Sinteza proteinelor:

- necesită energie celulară (ATP) pentru legarea fiecărui aminoacid:

amoniacid + ATP + tRNA aminoacil-tRNA + AMP + PPi

- fiecare aminoacil-tRNA = anti-codon;

- Ribozomul (rRNA + proteine)

citește codonul;

cuplează anti-codonulprin legături de H;

sintetizează o peptidă;

astfel se adaugă codon-după-codon de-a lungul mRNA.

de n-ori

30

Sinteza proteinelor:

- traducerea informației genetice se face cuinițiere;

elongație;

terminare (stop);

- la eucariote procesul este asemănător dar sunt implicate mai multe componente:

• inițiere;• control;

• terminare;

- proteinele astfel sintetizate suntîmpachetate;

transportate la locul țintă (difuziune controlată);

31

Sinteză anticorpi (vezi și notele de curs):

- asamblarea mai multor gene (recombinare somatică) care duce la sinteza de fragmente poli-peptidice și cuplarea lor;

- unii există din momentul nașterii;

- alții sunt sintetizați în momentul îmbolnăvirii.

Tehnici de modificare genetică

a) Enzime de restricție:

­ permit secționarea DNA în anumite zone;

­ apoi capetele fragmentelor sunt blocate în vederea legării ulterioare în DNA recombinat;

­ fragmentele DNA sunt separate prin electroforeză de gel (plasmide DNA) și formează harta de restricție, care este o hartă a zonelor de secționare.

32

b) Hibridizare nucleică:­ două lanțuri DNA desperechiate (sub influența temperaturii)

sunt recombinate (hibridizate) în scopul formării unui nou lanț DNA dublu (stabil) și eventual modificat;

­ metoda permite analiza DNA.

c) Clonarea genelor:

­ gena nou obținută se poate replica autonom (fragmentele DNA inițiale nu se puteau auto-replica);

­ legarea mai multor lanțuri (fragmente DNA) printr-o tehnică de legare cu ajutorul unor vectori de clonare viruși;

plasmide DNA (fragmente);

­ DNA recombinat se introduce într-o celulă gazdă și rezultă o celulă (bacterie) de interes care este separată, purificată și multiplicată;

­ se pot obține bănci de DNA recombinat (pentru sinteza anumitor proteine, gene rezistente la antibiotic, etc.) sau bacterii cu calități dorite.

33

d) Virușii:

­ sunt frecvent folosiți în modificări genetice;

­ particule mici mic ”genom” DNA (sau RNA);

înveliș protector (capsidă);

­ se replică doar prin ”infecția” unei celule gazdă;

­ după replicare virușii părăsesc gazda (fără să o distrugă);

interferă cu genomul gazdă modificându-l (bacteriofagi);

pot rămâne în celula gazdă: dezvoltări necontrolate (cancer); moartea celulei;

Exemple: - dezvoltări necontrolate sunt date de ”virusul DNA tumoral”;

- modificări DNA ”retrovirus” (ex. HIV).

34

e) Secvența DNA (diverse metode de determinare)

f) Tehnica PCR (”Polymerase Chain Reaction”):

­ metodă de amplificare DNA sau a unei secvențe DNA;

­ este folosită pentru clonarea DNA, obținerea de mutații, determinarea secvenței DNA, diagnosticarea medicală, etc.

Metabolismul celular

­ Metabolism = transformarea nutrienților și energiei în organismul viu;

­ Metabolism Catabolism (distructiv)

Intermediari, molecule mici, oligomeri + Energie + (ATP) + CO2

Anabolism (constructiv)

Moleculele mici sunt asamblate după regulile organismului gazdă, cu consum de energie

Componente celulare

35

­ Nutriția Autotrofă(self-

susținută)

= în plante, alge verzi, bacterii:

Macromolecule

CO2 + H2OMolecule

organice mici

energie

(lumină)

= se asimilează materia și energia produsă de autotrofe

Hetrotrofă(celelalte

organisme)

- ingestie alimente;- digestie = hidrolize enzimatice;- absorbție nutrienți;- transport nutrienți (C, N, ….) la celule;- absorbție celulară.

Metabolismul uman

­ Etapele metabolismului uman:

36

Alimentele conținProteine Aminoacizi

Polizaharide Mono- + Oligo-zaharide

Grăsimi Acizi grași + Glicerină

Ingestia + Digestia + Absorbția + Transportul:

Dezmembrare în molecule mici de 2-4 atomi de C și subproduși

Absorbția celulară:

(ex. molecule mici: acetil-CoA, acid piruvic, aminoacizi)

(ex. subproduși: reziduuri, NH3, acid uric, etc.)

GlucozaGlicoliză

Acid piruvic Acetil-CoA

NADH

Ciclu Krebs ATP, CO2

37

Ciclu Krebs

NADH, H2O

CO2

Energie (ATP) (fosforilare oxidativă)+ O2

Acizi grași + Glicerină Acetil-CoA Ciclu Krebs

38

Metabolismul zaharidelor GlicolizaGlicogenezaMetabolism glicogen

39

+ NADH

Glicoliza

metabolism anaerob al glucozei; are loc în citosol;

rezultă multă energie (ATP) și agent reducător NADH.

CO2 + H2O(mitocondrie, ciclu Krebs)

GLC PYR+ CoA+ NAD+

Acizi grași

Acetil-CoA

Etanol(drojdii)

+ CO2 + NAD+

Acid lactic(mușchi)

+ NAD+

40

Glucogeneza

sinteza glucozei din precursori ne-carbohidrați;

reacția consumă multă energie (ATP), ( ADP) (anabolism) și GTP ( GDP);

are loc în celulele hepatice (citosol) în condiții de scădere a GLC în sânge:

Acid piruvic Glucoză

Metabolism glicogen (polimerizarea glucozei în vederea stocării ei în ficat)

glicogen = material de stocare energie la animale;

n Glucoză + Pi + ATP Glicogen

enzimă

41

Metabolismul grăsimilor (acizi grași/trigliceride și colesterol)

sunt componente membranare care modifică proprietățile proteinelor;

sunt rezerve energetice;

acizii grași sunt codificați în funcție de numărul de atomi de C și numărul de legături duble;

ex.: acid palmitic (C16:0)acid oleic (C18:1)

suntmesageri celulari secundari.

hormoni;

la dezagregarea glicogenului se degajă energie (ATP);

controlul este dublu

alostericlegare enzimă ES1, …. de către S = ATP

hormonal

adrenalină (glicoliză) (degradare glicogen)

insulină (sinteză glicogen)

42

Degradarea acizilor grași (-oxidare)

când este nevoie să se producă energie (ATP)

are loc în citosol (procariote);

mitocondrie (eucariote);

Acetil-CoA Ciclul Krebsintră în

Acizi grași

Energie(ATP)

Acetil-CoA + Acil-CoA (acid gras cu 2 atomi de C mai puțin)

NADH

lipază

-oxidare

Exemplu: 1 mol (16:0) (35 + 96) ATP

direct ciclu Krebs

43

Sinteza acizilor grași (din Acetil-CoA)

condensarea succesivă a Acetil-CoA;

necesită consum de energie (anabolism) ATP, cât și agent NADPH;

are loc în citosol (cu Acetil-CoA din mitocondrie);

(C16:0) + 14 NADP+ + 8 CoA + 6 H2O + 7 ADP + 7 Pi

8 (Acetil-CoA) + 7 ATP + 14 NADPH + H+

controlul este dublu

alosteric(E+nS, S = ATP/palmitol-CoA/acid citric);

hormonal adrenalină

44

Metabolismul grăsimilor (trigliceridelor)

+ Energie,

ATP, NADH

Acizi grași+

Glicerină

Acetil-CoA+

Acil-CoA

Grăsime

Degradare

(-oxidare)Acizi grași

GlicerinăGlicoliză

Metabolismul colesterolului

steroid cu 27 atomi de C;

componentă a membranei celulară;

Acetil-CoA Colesterol

reglare nivel colesterol prin acțiunea asupra uneia dintre enzimele de sinteză.

45

Colesterolul

Acizi biliari

Vitamina D

Hormoni steroizi

Acizi biliari

produși în ficat;

”detergenți” ai intestinelor, ajută digestia;

preiau lipidele din alimente.

Vitamina Dnecesită radiație UV (lumină) pentru a fi sintetizată;

rol în dezvoltarea scheletului osos.

Hormoni steroizi rol în reglări procese celulare, semnalare.

46

Respirația celulară (ciclul Krebs + fotosinteza)

procesul de transformare a glucozei în energie (ATP) via acid piruvic;

GLC(Glucoza)

PYR(CH3CO-COOH)

CO2 + H2O + Energie(ATP, NADH)

CH3COOH

are loc încitosol (procariote);

mitocondrie (eucariote);

punctul de pornire și de terminare al ciclului Krebs este Acetil-CoA (2 atomi de C);

47

GLC

PYR

Alanină

Proteine

CH3COOH + 2 H2O

Acetil-CoA CoA + 2 CO2 + 8 H+ +

+ 12 ATPKrebs

CH3COOH + 2 H2O 2 CO2 + 8 H+ + Energie

8 stagii: oxidări, izomerizări, hidratări, hidrogenări, dehidrogenări;

produse din: Acetil-CoA + H2O

SH-CoA

CO2

3 NADH + H+

FADH2

ATP

per global: 1 mol GLC 38 ATP glicoliză

ciclul Krebs

48

glicoliza = trecerea glucozei în acid piruvic;

controlul ciclului Krebs

feedback (-) enzime, produși: ATP, acid citric, NADH, SH-CoA;

feedback (+) prin substrat: NAD+, Acetil-CoA, ADP, acid piruvic.

Fosforilarea oxidativăîn mitocondrie (eucariote)

în membrana plasmatică (procariote)

înmagazinarea energiei produse în ciclul Krebs și reoxidarea NADH și FADH2:

ADP + Pi+ H+ ATP + H2O

NADH + H+ + ½ O2 NAD+ + H2O

FADH2 + H+ + O2 FAD+ + H2O

49

Respirația celulară

respirația celulară = oxidarea nutrienților la CO2 și H2O cu eliberare de energie (ATP);

la eucariote se petrece în citosol (glicoliză) sau mitocondrie (oxidare acid piruvic);

se consumă agent reducător NADH, FADH2 care este regenerat la glicoliză.

implică două procese

glicoliză:

oxidare:

GLC PYR + NADH + FADH2

+ NAD+

PYR+ NADH

ATP + CO2 + H2O + NAD+

50

Fotosinteza

fotosinteza = proces de sinteză a hidraților de carbon din CO2 și H2O sub acțiunea luminii (fixare carbon);

ADP, NADP+ ATP, NADPH (la lumină)

H2O + CO2 (CH2O) + O2 ( la întuneric)energie

(ATP)(NADPH)

Fructoză

stocare energie (plante)

Amidon + Sucroză

51

are loc în cloroplastele celulelor vegetale și în membrana unor bacterii;

pigmenții (clorofila, carotenoide, etc.) optimizează procesul realizând un fotosistem;

fotosistemul

complex ”antenă” (absorbant de lumină și generator de electroni);

centru de reacție de fotosinteză;

reglare multiplă

transmitere energie;

temperatură;

etc.

procesul are loc în două etape:

a) reacții la lumină, cu producere de ATP și NADPH;

b) reacții la întuneric (ciclul Calvin) ce convertesc CO2 la carbohidrați, cu consum de ATP și NADPH;

reacția globală: CO2 (aer) + ATP CO2 (celular) + AMP + 2 Pi

52

Metabolismul aminoacizilor (ciclul acidului uric)

ciclul N în natură;

fixare:

(nitrificare)

(anabolică)

NO3- (precipitații)

N2 (aer) NH3 asimilare

biosinteză (bacterii)

Nucleotide

Porfirine

Amoniacizi

DNA, RNA

Polizaharide

Proteine

Fosfolipide

Biosinteză

degradare: procese inverse

(denitrificare)

(catabolică)

53

fixarea N2 din atmosferă se face de către bacteriile din sol, cu consum energetic:

N2 + 8 e- + 16 ATP + 16 H2O 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi + 8 H+

dintre cei 20 de aminoacizi prezenți în proteine, nu pot fi sintetizați toți în același organism;

aminoaciziiesențiali (trebuie ingerați din alimente);

ne-esențiali (pot fi produși în organism);

în funcție de procesele metabolice la care participă, cei 20 de aminoacizi se grupează în 6 grupe:

• glutamat;

• aspartam;

• serină;

• acid piruvic;

• aromatici;

• histidină;

degradarea aminoacizilor este reglată alosteric

(GTP, ATP inhibitori)

54

excesul de N (aminoacizi) nu poate fi stocat;

eliminarea se face direct (microorganisme, NH3) sau indirect (ciclul acidului uric) cu consum energetic:

(uree)

NH4+ + HCO3

- + H2O + 3 ATP + Acid aspartic

Acid uric + 2 ADP + AMP + 2 Pi + PPi + Acid fumaric

legat în ciclul Krebs

excesul de NH3 și acidul uric în sânge boală (gută)

55

Formalizare reacții biochimice

asemănătoare celor chimice;

viteza de reacție:

(specia j)dt

dn

V1

v j

jR

dt

dn

V11

v

v j

ijij

j

i

RR

(specia i)

ij = coeficient stoichiometric al speciei j în reacția i

matricea stoichiometrică:

......

........................

......

......

RS2R1R

S22221

S11211

SR

R = linii reacții

S = coloane specii

56

Determinarea coeficienților stoichiometrici în regim de creștere celulară staționară

Substraturi Produși metabolici

Biomasă Intermediari de reacție

0 Xg X P SK

1 ii ,metji

Q

1 ii ,macroji

M

1 iiji

N

1 iiji

(pentru reacția

celulară j)

Scrisă în formă matricială rezultă:

0 X GX P B S A metmacro

unde sunt matrici stoichiometrice ce conțin coeficienți stoi- chiometrici, în j reacții pentru substraturi, produși metabolici, constituenți de biomasă și intermediari de proces. În aceste matrici rândurile reprezintă reacțiile iar coloanele reprezintă metaboliții.

G , ,B ,A

Numărul de măsurători experimentale face ca sistemul de ecuații să fie sub-determinat (există mai multe necunoscute decât ecuații).

57

Număr de reacții = O (105 – 106)

Număr de compuși = O (104) dintre care doar o mică parte sunt măsurabili

Studiu de caz: Glicoliza în Escherichia coli

5

6

43

21

78

58

ProdusMol per 100 moli glucoză

fermentată

Formate 2.4

Acetate 36.5

Lactate 79.5

Succinate 10.7

Ethanol 49.8

CO2 88.0

H2 75.0

Măsurători experimentale (cultură de Escherichia coli)

Reacții specifice:

1 – ½ GLC + PEP + NADH = 0

(coeficienți stoichiometrici reactanți 0)

(PEP = fosfoenolpyruvate)

2 – PEP – CO2 – 2 NADH + Succinate = 0

3 – PEP + PYR + ATP = 0 (PYR = acid piruvic = pyruvate)

4 – PYR – NADH + Lactate = 0

59

5 – PYR + Acetyl-CoA + Formate = 0

6 – Formate + CO2 + H2 = 0

7 – Acetyl-CoA + Acetate + ATP = 0

8 – Acetyl-CoA – 2 NADH + Ethanol = 0

0 X G P B S A met

A B P G Xmet 0

0

0

0

0

0

0

0

0

X

X

X

X

X

20100

01100

00000

00110

10010

01011

20001

10001

P

P

P

P

P

P

P

1000000

0100000

0011010

0001000

0000100

0000000

0000011

0000000

S

0

0

0

0

0

0

021

NADH

ATP

AcCoA

PYR

PEP

Et

Ac

2H

For

Lac

2CO

Succ

GLC

cunoscute determinateexperimental

necunoscute(rezultă)

60

Determinarea vitezelor de reacție (fluxuri metabolice) în regim staționar

0 Xg X P SK

1 ii ,metji

Q

1 ii ,macroji

M

1 iiji

N

1 iiji

aplicare operator derivată pentru reacția j:

t

0 t

Xg

t

X

t

P

t

S K

1 i

i ,metji

Q

1 i

i ,macroji

M

1 i

iji

N

1 i

iji

0 vg v v vK

1 ijji

Q

1 ijji

M

1 ijji

N

1 ijji

= vitezele reacțiilor j (j = 1, ……, J; J = numărul total al reacțiilor din schemă)

jv

cazuri în care specia i nu este implicată în reacția j

0 g 0, 0, 0, jijijiji

matricea se scrie sub forma: ]r ,r ,r ,r[ v metmacroPS

61

0 v G v v B v A metT

macroT

PT

ST

v calculul necunoscute se face prin mai multe metode (sistem liniarsub-determinat):

0

v2vv2v

vv

vvv

vvv

vvv

v

2-0001-02-1

01000100

1-1-010000

0001-1-100

000001-1-1

v

v

v

v

v

8421

73

875

543

321

NADH

ATP

AcCoA

PYR

PEP

se determină acele fluxuri necunoscute.

Exemple: 1GLC v2

1 v

262CO vv v

pentru a crește gradul de informație se folosește și bilanțul atomic elementar

62

Exemplu: Cultivarea aerobă a drojdiei Saccharomyces cerevisiae pe glucoză (sursă de carbon) și sare de amoniu (sursă de azot)

Biomasa (X) = CH1.83O0.56N0.17

1 + Yxe + Yxc – Yxs – Yxo – YxN = 0

1X + YxeCH3O0.5 + YxcCO2 + YxwH2O – YxsCH2O – YxoO2 – YxNNH3 = 0 (etanol brut) (GLC, glucoză)

X EtOH CO2 H2O GLC O2 NH3

(C)

(H)

(O)

(N)

1000000.17

021120.50.56

3022031.83

0010111

E

Bilanțul atomic sau matricea compoziției elementare ( ):E

în acest fel crește numărul de ecuații și se reduce incertitudinea la calculul v ( r ) și concentrațiilor celulare (X)

0 Y E se determină (Y) necunoscuți;

63

Bioreactoare cu culturi celulare

– concentrație substrat (sursă de C și energie) exprimată în g/L;

– concentrație celulară () exprimată în g/L (determinată prin metoda densității optice sau altele, ex. turbidimetre, numărare celule, etc.);

– bioreactor continuu = chemostat;

– determinarea fluxurilor metabolice se face în regim staționar;

– MCA = metabolic control analysis = determină coeficienții de senzitivitate ai stărilor staționare (concentrații, fluxuri) în raport cu variabilele sau parametrii din mediul extern.

64

Exemple de stoichiometrie în reacții metabolice(în Saccharomyces cerevisiae )

1,000 1,0001,000

• Blueprint encoding sequence of proteins

• Catalysis of metabolic reaction• Players in bio-reaction

• Uptake of nutrients from Env.• Catabolism• Production of Energy (ATP, NADH, NADPH)• Synthesis of Building Blocks (amino acids, nucleic acids, lipids, carbohydrates)• Bioreactions

DNA Array 1,000 D-electrophoresis 100 MFA 10

Physiological Data 10-100

65

Molecular composition of Bacterium

66

Elementar Composition of Microorganisms

Microorganisms % C % H % O % ash% N

Yeast (Lab. strain) 38 6 35 9 12

(Brew. strain) 46 7 33 10 4.3

C. glutamicum 48 7 26 11 6

Elementar Composition Balance of the Cell

α CHlOm + NH3 + O2 CHaObNc + CHpOqNr + H2O + CO2

CHlOm: elemental composition of carbon source (l, m: constants)

CHaObNc : elemental composition of the cell (a, b, c: constants)

CHpOqNr : elemental composition of the extracellular product (p, q, r: constants) Quiz 1: Make elemental composition balance

α, , , , , : time variant parameters

67

Answer 1: 1 C:

H: 2pa 3 l

O: 2qb 2 m

N: rc

Quiz 2: Change above equations to matrix and vector form

α CHlOm + NH3 + O2 CHaObNc + CHpOqNr + H2O + CO2

Answer 2:

c

b

a

1

00r010

21q20m

02p03l

101001

C

H

ON

68

Quiz 3: How to determine all the reaction rates?

α CHlOm + NH3 + O2 CHaObNc + CHpOqNr + H2O + CO2

(S)

Answer 3:

mc r r A

m-1

c rA r

C

H

ONMoli Substrat

Moli NH3

3NH

S

R

R

c

b

a

1

000010

000001

00r010

21q20m

02p03l

101001

A rc rm

69

Elementar Composition Balance of the Cell

α CHlOm + NH3 + O2 CHaObNc + CHpOqNr + H2O + CO2

C - source Cell Product

RS RNH3 RO RCell RP RH RC

Reaction rate (mol/h):

RS: substrate consumption (uptake) rate

RNH3: ammonia consumption (uptake) rate

RO: oxygen consumption (uptake) rate

Rcell: cell growth rate

RP: product formation rate

RC: CO2 production rate

Stoichiometric Relation:

Ex.: cellS R:R 1:

2O

2COQ R

R R

RQ = respiratory quotient

α, , …, : six unknown reactionrate

How to know all the reaction rate?

(1) Measure some reaction rate.

(2) Determine other reaction rate with Linear Constraints.

70

1 C:

H: 2pa 3 l

O: 2qb 2 m

N: rc

Two more reaction rates are necessary!

Rcell , RNH3: for example should be measured.

Metabolic Coupling

ATP and NAD+

ATP: energy currency metabolite in the cell

NADH: electron transport

NADPH: electron transport

71

Metabolic Coupling

72

Metabolic Coupling

73

Metabolic Coupling

74

Energy Generation (1)

Direct formation of ATP from substrate level

ATP + Pi ATP + H2O

Ex.: Pyruvate kinase

PEP + ADP PYR + ATP

Energy Generation (2)

Oxidative phosphorylation:

2 NADH + O2 NAD + 2 H2O(2 electrons, 4 protons)

2(P/O)(ADP + Pi + H+) 2(P/O)(ATP + H2O)

P/O: Oxidative phosphorylation ratio

Ideally (P/O): 3 (Actually 1-2)

Electron Transport Chain and Oxidative Phosphorylation in

Eukaryotes

75

ATP Consumption in Biosynthesis

α CHlOm + NH3 + O2 CHaObNc + CHpOqNr + H2O + CO2

C - source Cell Product

(S) (O) (X) (P)

1/YATP (ATP) 1/YATP (ADP)

YATP : gram cell produced per mole ATP consumed

mATP : consumption of ATP for cell maintenance

Many yields:

1

ConsumedSubstrate

Produced Cell YX/S

1

Consumed O

Produced Cell Y

2X/O

ConsumedSubstrate

Produced Product YP/S

76

Metabolic Map of Saccharomyces cerevisiae

77

Figure - A metabolic pathway of glycolysis

[GLC]

[G6P]

[F6P]

[F1,6BP]

[G3P]

[1,3PG]

[3PG]

[PEP]

[PYR]

Question 1:

Figure shows a metabolic pathway of glycolysis. Make one stoichiometric equation, summarizing up from glucose to pyruvate. Answer number of correct equation:

1. GLC + 2ADP + 2NAD = 2PYR +2ATP + 2NADH

2. GLC + ADP + NAD = 2PYR +ATP + NADH

3. GLC + NAD = 2PYR + NADH

Stoichiometric equation of each metabolic reaction:

GLC + ATP = G6P + ADP

G6P = F6P

F6P + ATP = F1,6BP + ADP

F1,6BP = 2(G3P)

(G3P) + NAD = (1,3PG) + NADH

(1,3PG) + ADP = (3PG) + ATP

(3PG) = PEP

PEP + ADP = PYR + ATP

78

Answer question 1:

1. GLC + 2ADP + 2NAD = 2PYR +2ATP + 2NADH

GLC + ATP = G6P + ADP

G6P = F6P

F6P + ATP = F1,6BP + ADP

F1,6BP = 2(G3P)

2(G3P) + 2NAD = 2(1,3PG) + 2NADH

2(1,3PG) + 2ADP = 2(3PG) + 2ATP

2(3PG) = 2PEP

2PEP + 2ADP = 2PYR + 2ATP

GLC + (4-2)ADP + 2NAD = 2PYR +2ATP + (4-2)NADH

Correct answer: (1)

79

Metabolic Reactions in Saccharomyces cerevisiae

Glycolysis:

R1: GLC_ext GLCt

R2: GLC + ATP G6P

R3: G6P F6P

R4: F6P + ATP F1,6P

R5: F1,6P DHAP + GA3P

R6: GA3P DHAP

R7: GA3P PEP + ATP + NADH

R8: PEP PYR + ATP

Penotose phosphate pathway:

R9: G6P 2/3F6P + 1/3GAP + + CO2 + 2NADPH

TCA cycle:

R10: PYR AcCoA + CO2 + NADH

R11: AcCoA + OXA CIT

R12: CIT IZOCIT

R13: CIT KG + CO2 + NADH

R14: KG SUC + ATP + CO2 + NADH

R15: SUC FUMARATE + FADH

R16: FUMARATE MALATE

R17: MALATE OXA + NADH

Ethanol Synthesis:

R18: PYR ACALD + CO2

80

Metabolic Reactions in Saccharomyces cerevisiae

Acetate Synthesis:

R21: ACALD ACETATE

R22: ACETATE ACETATE_ext

Glycerol Synthesis:

R23: DHAP + NADH GLYCEROL3P

R24: GLYCEROL3P GLYCEROL

R25: GLYCEROL GLYCEROL_ext

R26: 2G6P TREHALOSE

R20: ETOH ETOH_ext

R19: ACALD + NADH ETOH

Ethanol Synthesis (continued):

Oxidative Phosphorelation:

R27: NADH 3 ATP

R28: FADH 2 ATP (Excess ATP)

R29: ATP excess(Cell growth)

R30:

Cell

(1/6)GK + NH3 + (MW/YATP) ATP

81

Macroscopic Stoichiometry (over all reaction)

Glycolysis (R1-R8): GLC_ext 2PYR + 2ATP + 2NADH

TCA cycle (R10-R17): PYR 3CO2 + FADH + 4NADH

Glycolisis (R1-R8) + TCA cycle (R10-R17) + Oxidative phosphorylation (R27-R28):

GLC_ext 6CO2 + 38ATP (1)

(2)GLC_ext 2CO2 + 2ETOH_ext + 2ATP

Ethanol synthesis (R1-R8) + (R18-R20):

GLC_ext 2CO2 + 2ACETATE_ext + 10ATP (3)

Acetate synthesis (R1-R8) + (R18, R21, R2):

GLC_ext + 2ATP + 2NADH 2GLYCEROL_ext (4)

Glycerol synthesis (R1-R6, R23-R25):

(5)2GLC_ext + 2ATP TREHALOSE Trehalose synthesis:

82

2ATP excess Maintenance: (6)

(7)(1/6)GLC + NH3 + (MW/YATP)ATP Cell Cell growth:

Fluxurile metabolice (FBA):

fenotip al GMO (organism modificat genetic);

condițiile de mediu (sunt variabile).

variază în funcție de

[ Rcell , RET , ….., RCO2 ]

[ a, b, c, d, e, f, g ]

Linear combination of Eqs. (1) – (7):

mATP2COTREGLYACEETcellGLC grfReRdRcRbRaR r

Global Substrate (Glucose) Consumption

83

Modele cinetice ale proceselor enzimatice

= procesele metabolice sunt extrem de complexe O (104) componenți și Oº(105-106) reacții;

= procesele care au loc sunt de: – sinteză;

– degradare (apoptoză);

– întreținere;

– liză;

– mobilitate;

– etc.;

= procesele enzimatice sunt catalizate de o enzimă și pot avea un activator (A) și un inhibitor (I) al activității acesteia;

= controlul lor este deci complex;

= enzimele au un situs (centru) activ iar legăturile cu substratul sunt de tip Van der Waals, de hidrogen, electrostatice;

= reacția E + S trece printr-un complex activat;

84

= reacția este foarte specifică: P ES ES S E *activat

Substrat (S) Produs (P)Enzimă

(E)

= enzimele acționeazăin-vivo (în celula vie) ducând la modificări fiziologice (reglabile);

in-vitro (cu enzime imobilizate pe un suport);

= ca orice catalizator, enzimele măresc viteza de reacție, scad energia de activare dar nu deplasează (modifică) echilibrul biochimic;

= reacțiile biochimice pot în acest fel să aibă loc la temperatura și pH-ul dorite, strict controlate (de către organismul viu);

= enzimele acționează cu o mare specificitate, de regulă pentru o singură reacție;

= enzimele acționează prin ”recunoașterea” fiecărui substrat pe care îl leagă formând un complex activat;

= procesele cu enzime imobilizate ridică probleme suplimentare de transfer/transport de masă (cu influență asupra cineticii aparente) deși enzima este mai stabilă;

85

= procesele enzimaticefără inhibiție;

cu inhibițieprin substrat (S);

prin produs (P);

printr-o substanță străină (I);

complexă.

= procesele enzimaticecu co-enzimă (co-reactant);

cu promotor/activator;

fără co-enzimă;

= activitatea enzimei este foarte sensibilă la temperatură;

pH;

inhibitor;

= fiecare enzimă prezintă un domeniu optim de temperatură și pH la care activitatea sa este maximă.

86

În cazul conversiei unui substrat S într-un produs P, forma generală a curbei va fi dată de:

Pentru a determina viteza de reacție trebuie generată o curbă ce ilustrează variația concentrației substratului sau a produsului în funcție de timp.

ktminS0SminSS e C-C C-C

-kt0PmaxP0PP e-1 C- C C-C

• descreșterea exponențială de ordin I a concentrației de substrat:

• sau de creșterea exponențială de ordin I a concentrației de produs:

Modele cinetice enzimatice

CS0= concentrația inițială a substratului (S);

Csmin= concentrația minimă de substrat la timpul t → ;

CS = concentrația de substrat la timpul t;CP0

= concentrația inițială de produs la timpul t = 0;Cpmax

= concentrația minimă de substrat la timpul t → ;CP = concentrația de produs la timpul t.

În care:

Variația concentrațiilor substratului și produsului în timp

87

Viteza reacției este dată de panta corespunzătoare curbei obținute, și anume:

kdt

dP

dt

dS- v

Viteza de reacție scade în timp datorită următoarelor cauze:

• enzima devine instabilă pe parcursul desfășurării reacției;

• gradul de inhibiție al enzimei descrește cu descreșterea substratului;

• reacția reversibilă devine determinantă pe măsură ce se acumulează produsul;

• produsul reacției inhibă enzima;

• orice combinație a factorilor enumerați mai sus.

Curba obținută pentru reacțiile enzimatice nu poate fi comparată cu modelele standard ale reacțiilor chimice omogene. Prin urmare a fost necesară o altă abordare, a fost introdus ca termen de măsurare a vitezei de reacție viteza inițială.

88

La începutul unei reacții enzimatice:

C C0StS

0 CtP

P S • gradul de conversie este destul de mic și astfel concentrația substratului poate fi considerată constantă și egală cu cea inițială:

• cantitatea de produs acumulată este foarte mică:

• se poate considera că reacția inversă este neglijabilă;

• posibilele efecte inhibitoare ale produsului sau cele determinate de activitatea enzimatică sunt nesemnificative;

• se poate consideră că enzima rămâne stabilă în stadiile incipiente ale reacției;

Pentru a obține vitezele inițiale se trasează o tangentă la curba obținută anterior care să fie cât mai aproape de origine (vezi figura următoare). Panta acestei drepte trasate (adică viteza inițială) se obține prin regresie liniară:

89

De cele mai multe ori, forma curbei variază în funcție de: pH, temperatură, tărie ionică, polaritate, tipul substratului, concentrațiile enzimei și a coenzimei, etc.

Pentru a determina viteza unei reacții, cercetătorii se bazează de prea multe ori pe măsurătorile obținute, măsurători care nu caracterizează întotdeauna procesul pentru toate condițiile studiate. Din acest motiv, pentru a obține o analiză cinetică corectă, este esențial ca vitezele de reacție să fie determinate din regiunea inițială a curbei.

În caz contrar există riscul ca, prin alegerea unui moment de timp nepotrivit pentru derivare, să nu se obțină o relație liniară între viteză și concentrația enzimei (aceasta fiind o cerință necesară în analiza cinetică enzimatică).

Determinarea vitezei inițiale a unei reacții enzimatice

90

Pentru ca reacția să fie cinetic controlată de către enzimă, viteza reacției trebuie să fie direct proporțională cu concentrația acesteia:

Dependența vitezei inițiale a reacției de concentrația enzimei din amestecul

de reacție

În concluzie, pentru a colecta date valide din punct de vedere cinetic, trebuie să se țină cont de următoarele aspecte:

• enzima trebuie să fie stabilă pe durata măsurătorilor utilizate în calculul vitezelor inițiale;

• vitezele inițiale sunt utilizate ca viteze de reacție;

• viteza de reacție trebuie să fie proporțională cu concentrația enzimei.

91

Cinetică enzimatică cu inhibiție de substrat (modelul Michaelis-Menten)

Cea mai simplă și mai veche descriere cantitativă cinetică a procesului enzimatic este modelul Michaelis-Menten (M-M):

(S = substrat, E = enzima, P = produs, ES = complex activat)

S + E (ES) P + Ek1

k-1

k2

Pentru a deduce expresia cinetică M-M a reacției enzimatice se aplică teoria stării staţionare care consideră că, în orice moment, vitezele de formare şi de scindare ale complexului ES sunt egale, astfel încât:

• pentru o perioadă scurtă de timp, concentraţia complexului poate fi

considerată ca fiind constantă: ;0dt

d(ES)

92

0dt

d(ES)

• pentru perioade mai mari de timp, concentraţia complexului ES se modifică deoarece reacţia progresează şi concentraţia substratului scade, dar viteza modificării concentrației ES va fi întotdeauna mult mai mică decât viteza reacţiei enzimatice;

• în acest fel, postulându-se că specia ES se află la cvasi-staționaritate,

, și obținerea produsului (P) este etapa determinantă de viteză

se obține: )ES(EEE t0

)ES(kESkdt

dS11

)ES()kk(ESk0dt

d(ES)211

21

1

kk

ESk(ES)

0t 0SS

0)ES( 0

(ES)

P

So

Eo

0 Timp

93

)ES(kESkdt

dS11

21

12010

21

100 kk

ESkkEkE

kk

ESkE)ES(EE

ESkkEkEkEkE 1201021

Skkk

kkEE

121

210

Substituind în ipoteza de cvasi-staționaritate rezultă:dt

dS

)ES(k)ES(kESkdt

dS211

Skkk

kkE

kk

Skk

kk

SEkk)ES(k

dt

dS

121

210

21

21

21

212

Sk

kkESk

Sk)kk(

ESkk

dt

dS

1

21

02

121

021

94

SK

SV

dt

dSr

M

maxS

unde:

1

21M k

kkK

; (KM = constanta Michaelis-Menten,1913)

02max EkV ; (k2 = turnover-number, specific fiecărei enzime)

Alte forme ale ecuației Michaelis-Menten

01

21pS ES

k

kkrr

021

21pS ES

kk

kkrr

0

1

1

2pS ES

Skk

krr

95

Cazurile limită ale ecuației M-M:

MK S M

maxS K

SVr

MK S constant maxS Vr

MM K 10 S K 1.0 Sr ecuația M-M cu abatere de maxim 10%

Semnificația fizică a KM:

(echilibru prima reacție)ES

)ES(K

k

keq

1

1

ES

)ES(

kk

k

K

1

21

1

M

12 k k (echilibru rapid)

liberă enzimă

legată enzimă

MK

S

E

)ES(

96

Dacă: SKM ½ E este legată și ½ E este liberă

SKM toată enzima este legatăDacă:

MK toată enzima este liberăDacă:

Valori tipice pentru KM :

Enzimă Substrat KM (mol/L)

maltază maltoză 0.1

sucrază sucroză 0.01

fosfatază glicerol-fosfat 0.001

dehidrogenază acid piruvic 0.0001

complex BOD-organic 100 (g/m3)

complex NH4+ 0.55 (g/m3)

complex NO2- 1.4 (g/m3)

complex NO3- 0.1 (g/m3)

97

Determinarea parametrilor cinetici ai ecuației Michaelis-Menten din date experimentale

(curbe cinetice S(t))

a) Metode aproximative

a1) Diagrama Lineweaver-Burk

0S

1

Sr

1

MK

1

maxV

1

SK

SVr

M

maxS

maxmax

M

max

M

S V

1

S

1

V

K

SV

SK

r

1

98

a2) Diagrama Eadie

00

S

ES

r

0

S

E

r

M

2

K

k

2k

0

SM2

0

S

ES

rKk

E

r

SE k S V )SK(r 02maxMS

SE k SrKr 02SMS

Kr SE k Sr MS 02S 0E S

Valori tipice ale constantelor M-M:

k1 = 105 – 109 L/mol · s

k-1 = 10 – 104 1/s

k2 = 1 – 106 1/s

KM = 10-6 – 10-1 mol/L

99

Alte metode grafice de evaluare a constantelor M-M:

• metoda Eisenthal;

• metoda Cornish-Bowden;

• metoda Dixon;

• etc.

b) Metoda exactă - Regresia neliniară

2n

1 u

P S,

1 imodel ,u ,iexp u, i,Mmax CC Min arg K̂ ,V̂

100

Mecanismele inhibiției enzimatice

Reacție fără inhibiție Reacție cu inhibitor competitiv

Reacție cu inhibitor incompetitiv Reacție cu inhibitor necompetitiv

101

Modele cinetice enzimatice cu inhibiție

Inhibiție competitivă

S + E (ES) P + Ek1

k-1

k2

I + E (EI)Ki

1

i

i k

k

K

1

1

21S k

kkK

I = I0 (concentrație inhibitor)

)ES(kdt

dPr 2P

EIESE E0

02max Ek V S

KI

1K

SVr

IS

maxP

; ;

Inhibiție ne-competitivă (non-competitive)

E + S (ES) E + Pk1

k-1

k2

+ Ik3 k-3 + Ik4 k-4

EI (ESI)k5

k-5

• inhibitorul se leagă la un situs distinct de cel al substratului, numit situs de legare;

• are loc la concentrații foarte mici ale S ;

• Vmax nu este atins niciodată, nici chiar la concentrații foarte mari ale substratului;

0Pmax Ek V

SKKI

1

SVr

SI

maxP

• inhibitorul reduce rp prin blocarea centrilor activi; 102

103

• cinetica M-M cu dublu substrat:)SK()SK(

SSVrr

22M11M

21maxPS

Inhibiție incompetitivă (un-competitive)

E + S (ES) P + Ek1

k-1

k2

+ Iki k-i

(ESI)

IS

maxP

KI

1SK

SVr

• asemănătoare catalizei chimice (A* + B*) cu reacție pe suprafață.

• are loc la concentrații foarte mari ale substratului (S);

104

Inhibiție alosterică

nS + E (ESn) nP + Ek1

k-1

kcat

nnS

nmax

PSSK

SVrr

0catmax Ek V

Activare alosterică

Inhibiție alosterică

105

Influența temperaturii și pH-ului asupra vitezei de reacție și activității enzimatice

a) Dezactivarea enzimei

• enzima se dezactivează în timp datorită schimbărilor structurale conformaționale după ecuația:

dk dt

dE tdk

0 e E E

SK

SeEk

SK

ESkr

M

tdk02

M

2S

b) Sterilizarea enzimei

• sterilizarea este similară dezactivării naturale dar are ca efect încetarea viabilității organismului sau a celulei;

• sterilizarea se face sub influența căldurii, radiației sau a compușilor chimici;

106

• sterilizarea este un proces stocastic, aproximat printr-o cinetică de ordin unu:

X k r dd

(X = concentrația de biomasă activă)

)tk ( exp XX d0

• timpul necesar reducerii populației de celule cu un factor de 10 este:

dd

0d k

10ln

k

XXlnt

)tk( exp1.0 X

Xd

0

dd tk1.0 nl dd tk01 nl

dd k

10lnt

Demo:

107

Concentrațiile metaboliților la nivel celular:

]G[0 ,cytA VN

Număr de molecule (copy number) G/celulă

NA = 6,023 x 1023 = numărul lui Avogadro

Vcyt, 0 = volumul celulei (citosol)

Exemplu: în Escherichia coli : Vcyt, 0 = 1,66 x 10-1 L și există un

copy-number genă G:

)L/mol(10 nM 11066,110023,6

1]G[ 9-

1523