Metode si tehnici de biologie celulara si
moleculara utilizate in cercetarea
biomedicala
Curs 2
Dr. Florin Iordache
Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 2013Investete n oameni!Axa prioritar 1: Educaia i formarea n sprijinul creterii economice i dezvoltrii societii bazate pe cunoatereDomeniul major de intervenie 1.2: Calitate n nvmntul superiorTitlul proiectului: Aplicarea metodologiilor de cercetare stiintifica in domeniul stiintelor medicale si promovarea culturii antreprenoriale pentru
facilitarea insertiei pe piata muncii a studentilor medicinisti din ciclul de studii universitare de licenta.
Numrul de identificare al contractului: POSDRU/156/1.2/G/141745Beneficiar: Universitatea de Medicin i Farmacie Carol Davila din Bucureti
Culturi de celule Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a
apoptozei
Citometrie in flux Analiza ciclului celular Metode de dozarea a proteinelor Electroforeza, ELISA, Western blot Tehnici de imunohistochimie simpla si dubla Tehnica PCR si Real-Time PCR Variante si aplicatii ale tehnicii PCR: MS-PCR, SNP-PCR, PCR-
RFLP,
Microarray Secventiere genica Transfectie si clonare
Cuprins
Western blot (imunoblot)
Metoda ce imbina tehnicile de electroforeza cu cele imunologicepentru identificarea si cuantificarea proteinelor dintr-un amestecEtape1. Prepararea probelor2. Electroforeza probelor3. Transferul proteinelor pe membrana de nitroceluloza4. Incubarea proteinelor cu Anticorpi specifici
Western blot (imunoblot)1. Prepararea probelorLiza celulara- culturi de celule: RIPA (25mM TrisHCl pH 7.6, 150mM NaCl, 1%
NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS), mecanic in azotlichid, sonicare
- Tesuturi: mecanic, sonicare, apoi chimicDeterminarea concentratiei proteinelor (BCA, Bradford, Lowry)- Pe gel se va incarca o cantitate egala de proteina- Inainte de incarcarea probelor in gel acestea se amesteca cu
loading buffer ce contine SDS (5-10 min, 95-100oC)- 2x Laemnli buffer: 4% SDS, 10% -mercaptoetanol, 20% glicerol,
bromfenol blue, 0.125%M Tris-HCl
Western blot2. Electroforeza (SDS-PAGE)- 2 geluri: gel de concentrare si gel de separareGelul de separare-30% acrilamida/bisacrilamida-1,5M Tris pH 8,8-10% SDS-10% APS (amonium persulfat)-TEMED-se pasa la polimerizat 20-30 minGelul de concentrate- 30% acrilamida/bisacrilamida-1 M Tris pH 6,8-10% SDS-10% APS (amonium persulfat)-TEMED
Western blot
- Se incarca ~ 30-100l/godeu (50mg proteina)- Migrare la 100V, 1-2,5 ore-Dupa transfer, gelul se poate colora (Coomassie Blue) pentru a
vedea daca proteinele au migrat
Western blot3. Transferul proteinelor pe membra de nitrocelulozaTransferul se face in 2 moduri: umed sau semiuscat (15V, 20-30 minute)Membrane: nitroceluloza, florura de poliviniliden (PVDF) sau NylonMembranele leaga proteinele prin interactii hidrofobe (nitroceluloza) sauinteractii hidrofobe si ionice (Nylon incarcat pozitiv)Marimea porilor membranei este intre 0,05 m si 0,45 m. Cu cat porii suntmai mici cu atat capacitatea de legare este mai mare.
Western blot
3. Transferul proteinelor pe membra de nitroceluloza
- Colorare cu Ponceau S pt a vedea daca s-a realizat transferul
https://www.youtube.com/watch?v=krFKPwhiHJE
Western blot
4. Incubarea cu Anticorpi specifici- Blocare 30-60 min - lapte 5% in PBS cu Tween 0.05% (albumina)- Incubare cu Anticorp primar peste noapte la 4oC- Spalare 3x, 15min cu PBS+Tween 0.05%- Incubare cu Anticorp secundar 1 ora la To cam- Spalare 3x, 15min cu PBS+Tween 0.05%- Spalare 1x, 15min cu PBS- Developare: se adauga ECL peste membrana 2-3 min, citire la
aparatul de chemiluminiscenta- ECL: luminol si HRP
Western blot
Imunohistochimie
Reprezinta combinatia dintre 2 stiinte: imunologia si
histochimia, avind ca scop evidentierea proprietatilor
antigenice ale unor substante intr-un tesut, utilizind anticorpi
monoclonali sau seruri polireactive. Vizualizarea substantelor
antigenice se poate face atit la nivel tisular, cit si la nivel
celular si subcelular, pe preparate la gheata sau parafina.
Se lucreaza cu anticorpi monoclonali, de care sunt legate
una sau mai multe molecule enzimatice, ce catalizeaza
transformarea unui substrat incolor intr-un produs de
reactie colorat. Enzima este cuplata covalent cu portiunea
Fc a anticorpului
Imunohistochimie
Enzimele utilizate sunt:
- Peroxidaza (HRP)
- fosfataza alcalina (PA)
Substratele folosite sunt:
- DAB (Di-amino-benzidina brun) sau AEC (3-Amino-9-ethylcarbazolerosu) pentru peroxidaza
- pNPP (p-nitrophenylphosphate galben) si BCIP/NBT (5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium violet) pentru fosfataza
Metoda ABC (dupa Hsu et al.,
1981, modificata de G. Bussolatti & P.
Gugliotta, 1983)
In prima etapa, Ac primar se
cupleaza cu Ag dorit; in a doua etapa
de Ac primar se leaga un Ac secundar,
marcat cu biotina.
In a treia etapa, se introduce un
reactiv cu mai multe molecule de
avidina marcata cu peroxidaza.
La locusul antigenic se leaga un
complex cu multe molecule de
peroxidaza, intensitatea reactiei
cromogene va fi accentuata si
sensibilitatea metodei mare.
Imunohistochimie
Metoda dextranului (DAKO
EnVisionTM Systems, 1996)
Permite cuplarea unui mare
numar de molecule enzimatice pe un
schelet polimeric de dextran
hidrosolubil; cu acest complex se pot
cupla Ac secundari
Se obtine astfel un reactiv care
poate fi utilizat in cadrul unei tehnici
in 2 timpi, care aduce o mare
cantitate de enzime la locul reactiei si
va creste foarte mult sensibilitatea
detectarii Ag dorit.
Imunohistochimie
Metoda Tiramida
Imunohistochimie
Protocol de lucru
1. Fixarea pieselor se face in formol neutru maximum 24h. Dimensiunea pieselor prelevate
nu depasesc 8-10x8-10x4-5 mm. Pentru biopsiile mici un timp de fixare de 6h este suficient.
2. Sectiuni de 3-4 microni, perfect intinse fara pliuri in apa distilata de 37oC etalate pe lame
silanizate sau tratate cu gelatina cromica (folosim numai in cazuri exceptionale). Sectiunile sunt
uscate la 37oC in termostat sau la temperatura camerei timp de 24h.
3. Deparafinarea: Xilen 3x10 min.
4. Rehidratarea: etanol 3x3 min., apa distilata 1x5 min.
5. Demascatia antigenica a sectiunilor se face prin fierbere, 3x5 min. intr-un vas cu solutie
Histols citrat tampon 0,01 M cu pH 6 (cat.30010) intr-un cuptor cu microunde la o putere de 750
W. Nivelul solutiei de tampon este verificat dupa fiecare 5 minute, iar cantitatea evaporata se
completeaza cu solutie tampon citrat de sodiu (aceeasi solutie pe care o folosim si la fierbere).
6. Racirea sectiunilor in apa distilata la temperatura camerei timp de 5 min.
7. Blocarea peroxidazei endogene timp de 10 min. (90 ml apa distilata+5 ml perhidrol
conc.)
8. Spalare cu apa distilata 5 min.
9. Spalare cu solutie tampon PBS (pH 7,2 - 7,6) 3-5 min.
Incepand de la punctul 10 se lucreaza in camera umeda.
10. Blocarea nespecifica pentru reducerea zgomotului de fond cu BBPS Histols 10 min.(in loc de BSA sau lapte de praf 3% cum se facea inainte) BBPS Histols backround blockingprotein solution cat. 30012.
11. Aplicarea anticorpului primar folosim dilutiile indicate de firma producatoare intr-ocantitate de 80 microlitri. In cazul sectiunilor obtinute prin tehnica TMA cantitatea serului aplicat
este semnificativ mai mica. Diluarea anticorpului primar se face cu Large Volume UltraAB Diluent
(LabVision cat. TA-125-UD). Aplicarea anticorpului se face prin simpla aplicare intr-o cantitate
suficienta care sa ajunga limitele marcate cu Histo Pen (dupa prima rehidratare cu solutie tampon
sectiunile vor fi incercuite, demarcate cu Histo Pen cat. 30020 Tissue Marker Hydrophobic Pen).
12. Incubare la temperatura camerei timp de 60 min.
13. Spalarea cu solutia tampon PBS 3x5 min.
14. Aplicarea polimerului insemnat Histols-MR (cat. 3001150) anti soarece si iepure timp de
30 min).
15. Spalare cu solutie tampon PBS 3x5 min.
16. Aplicarea Histols-DAB cat 30014, solutia de lucru (o picatura 40 microlitri DAB+1ml
substrat) se prepara extemporaneu si poate fi folosita la temperatura camerei timp de 6 ore.
Intensitatea coloratiei se verifica sub microscop timp de 3-10 min. si este oprit dupa obtinerea
intensitatii dorite prin punctul 17.
17. Spalare cu apa distilata 10-15 min.
18. Supracolorare cu Hematoxilina: un timp mai scurt de coloratie obisnuita (aproximativ
jumatate din timpul coloratiei de rutina).
19. Deshidratare: alcool 96o .1x30 sec. alcool absolut 1x30 sec. si acetona 1x30 sec.
20. Clarifiere: xilen 3x3 min.
21. Montare: balsam de Canada, care se poate utiliza si in cazul cromogenului Histols restistant AEC
IHC detection of CD3 antigen in serial sections of paraffin-embedded
human tonsil
Rabbit anti-CD3 1:400, biotinylated anti-rabbit,
ABC, with DAB chromogenic detection.
TSA biotin: rabbit anti-CD3 1:400, biotinylated anti-
rabbit, SA-HRP, biotinyl tyramide, ABC, with DAB
chromogenic detection.
EXTRACTIA ADN
1. Sange periferic (venos)
2. Secretii nazale, oculare, vaginale, uretrale
3. Raclaj al mucoaselor: bucala, cervicala, uretrala
4. Diverse tipuri de tesut (biopsie)
1. Vilozitati coriale
2. Lichid amniotic (amniocite)
3. Sange fetal
4. Tesut (biopsie): piele
PRENATAL POSTNATAL
POSTMORNEM
1. Produs de conceptie
2. Sange, tesut, etc
Tehnica PCR si Real-Time PCR
Viloziti coriale
Lichid amniotic
Produs de concepie
Recoltarea probelor biologice
Sange periferic (venos):
ADN intracelular - se proceseaza celulele sangelui:
exemple: in vederea identificarii unei mutatii in structura unor gene
specifice: gena DMD
ADN extracelular - se proceseaza plasma
exemple: in vederea identificarii unor virusuri ADN (HBV) si ARN (HCV,
HIV)
exemple: in vederea detectiei si analizei ADN fetal liber circulant in sangele
mamei
Extractia ADN - etapele de lucruSpargerea membranelor:
Detergenti neionici (nonidet (NP40), triton X) si ionici: SDS
- degradeaza lipidele membranare
Enzime: proteinaza K, proteaza - realizeaza digestia proteinelor
membranare
Tiocianat de guanidina - degradeaza proteinele si distruge DNazele si
RNazele
Precipitarea proteinelor: Clorura de sodium/potasiu, Acetat de sodium
Chloroform:alcool izoamilic, Fenol:cloroform
Precipitarea si spalarea ADN: izopropanol si etanol
Elutia ADN: apa, solutie TRIS:EDTA
Categorii metodologice
A. metode manuale
Metoda organica
Metoda bazata pe utilizarea coloanelor
cu membrane de dioxid de siliciu
Metoda bazata pe utilizarea particulelor paramagnetice sau dioxid de siliciu (silica)
Automata
CUANTIFICAREA ADN - determina concentratia
(cantitatea) ADN
Metoda: masurarea spectrofotometrica
ADN: absorbanta maxima la lungimea de unda 260 nm
A260=1 50 ng ADN d.c./ml
A260=1 33 ng ADN m.c./ml
A260=1 40 ng ARN m.c./ml
A260=1 20 ng oligonucleotide d.c./ml
DETERMINAREA PURITATII (calitatea) ADN
Metoda: masurarea spetrofotometrica
ADN: absorbanta maxima la lungimea de unda 260 nm
Proteinele: absorbanta maxima la lungimea de unda 280 nm
Raportul A260 / A280:
interval optim 1.8 - 2.0
< 1.7 - contaminare cu proteine
> 2.0 - contaminare cu ARN
Definitie: PCR este o tehnica de biologie moleculara princare una sau mai multe secvente ADN sunt amplificate
(multiplicate) enzimatic; reactia este exponentiala - initiata
de la cateva copii, generand in final cateva mii pana la
cateva milioane de copii.
Scopul: acestei metode este de a face accesibila analiza unei secvente ADN
REACTIA PCR
Polymerase
Chain
Reaction
Polimerizare
Lant
Reactia
Componentele reactiei PCR
ADN tinta obtinut prin extractia ADN
Primeri (Amorse)
ADN polimeraza
Nucleotide
Cationi
Tampon de reactie
Primeri (Amorse) 2 fragmente mici de ADN
monocatenar (fragmente
oligonucleotidice 15-30
perechi baze)
complementare celor doua capete 3 ale seventei tinta
Functie:
recunosc secventa de interes si se ataseaza de capetele acesteia la o
temperatura specifica = temperatura de atasare a primerilor (se
calculeaza in functie de Tm)
initiaza reactia de polimerizare
ADN polimeraza
enzima termostabila
realizeaza sinteza unei noi secvente ADN identice cu secventa tinta
se ataseaza de primeri
incorporeaza nucleotide pe baza de complementaritate cu secventa tinta;
Exemple comerciale: Taq polimeraza, Go Taq Flexi polimeraza,
AmpliTaq Gold polimeraza, HotStart Taq polimeraza
Nucleotide: sunt livrate fie separat, sub form de soluie stoc de dATP,dCTP, dGTPi dTTP, fie sub form de soluie amestec a celor patrunucleotide. Concentraiile optime depind de lungimea fragmentului cetrebuie amplificat i de numrul de cicluri de amplificare.
Cationi - elemente chimice cu rol in mentinerea activitatii optime a enzimei;
Cationi bivalenti de magneziu si mangan
Cationi monovalenti de potasiu
Tampon de reactie - este o solutie ce confera un mediu optim pentru activitatea si stabilitatea enzimei. ConineTRIS, HCl, KCli are pH 8,3.
Aparate PCR
Etapele reactiei PCR
Denaturarea initiala
Amplificarea ADN in trei pasi ce se repeta ciclic
Denaturarea ADN
Atasarea primerilorADN
Elongatia ADN
Elongatia finala
VARIANTE PCR - clasificare in functie de:
Numarul de secvente tinta: Monoplex PCR Multiplex PCR
Metoda de evidentiere a produsilor PCR (ampliconi): PCR + electroforeza Real-time PCR (PCR in timp real)
Matrita tinta: ADN ARN - RT PCR (reverstranscriere PCR)
Scopul urmarit: Calitative Cantitative Semicantitative
PCR monoplex
se amplifica o singura
secventa tinta
exista un singur set de
primeriPCR multiplex
se amplifica mai
multe secvente
tinta
exista mai multe
seturi de primeri
(cel putin 2)
In functie de modul de detectie
La sfarsitul reactiei PCR = End-Point PCR prinelectroforeza:
Plana in gel de agaroza Verticala in gel de poliacrilamida Capilara
In timpul reactiei PCR = Real-Time PCR
Touchdown PCR
Endonucleazele de restricie sunt enzime care recunosc secvene deADN specifice, scurte, se leaga de ele apoi le de cliveaza, fie la situsul
de recunoastere, fie la o distan oarecare de acesta, n funcie de tipulde enzim.
EcoRI recunoate o secvena hexanucleotidic: 5-G-A-A-T-T-C-3 5-G-3 5-A-A-T-T-C-33-C-T-T-A-A-G-5 3-C-T-T-A-A-5 3-G-5
Real Time PCR - PCR in timp real
Metode de detectie a ampliconilor in timp real:
1.Coloranti fluorescenti care se leaga nespecific de molecula ADN
dublu catenara: SYBR Green I,
2. Sonde ADN specifice alcatuite din secvente oligonucleotidice
marcate fluorescent
Frster resonance energy transfer (FRET)
Real-Time PCRTaq-Man
- Hibridizare foarte spcifica intre sonde si tinta
- Sondele pot fi marcate cu fluorocromi diferiti
-Datorita specificitatii si sensibilitatii ridicate nu este
necesara o - procesare ulterioara a datelor
- Dezavantaje: sinteza diverselor probe marcate si costurile
- Monitorizeaza amplificarea oricarei
secvente ADNdc
-Costuri scazute
-Dezavantaje: reactii fals pozitive,
legari nespecifice
Syber Green vs
- SYBR Green II- SYBR Gold- YO (Oxazole Yellow)- TO (Thiazole Orange)-PG (PicoGreen)-Eva Green-BEBO, BOXTO, SYTO9
https://www.youtube.com/watch?v=nKrJnc1xWb0
Proiectarea unui experiment cu determinare
calitativa
Controale:
Pozitiv
Negativ
Control intern:
- Secventa din genom: globina, actina
- Secventa ADN externa
Blanc non-template:
- din extractie
- din PCR
Probe
Aplicaiile reaciei de real-time PCR
Cuantificarea expresiei genice Verificarea datelor de microarray Monitorizarea eficienei terapiilor Cuantificare viral (detectarea numrului de particule virale) Identificarea agenilor patogeni Studiul ADN mitocondrial Imunoprecipitarea cromatinei Determinarea instabilitii microsateliilor Determinarea nivelului de metilare a ADN Detecia inactivrii cromozomului X Monitorizarea post-transplant a grefelor de esut sau de organe Diagnosticul cancerului Cuantificarea ADN n medicina legal Discriminare alelic i calcularea frecvenei alelelor n populaii
ELECTROFOREZA
1937 Arne Tiselius- aparat sofisticat care sa permita separareadiferitelor particule in prezenta unui camp electric
1948 Tiselius- Premiul Nobel pentru Chimie (separareacoloizilor prin metode electroforetice)
1960 Vin Thorne - electroforeza acizilor nucleici
ELECTROFOREZA Denumirea: gr. Electron= electric, lat. Phore = purttor,
evideniindu-se astfel rolul esential al campului electric
reprezint o metod de analiz i separare bazat pemigrarea particulelor solide incarcate electric dispersatentr-un lichid sub aciunea unui cmp electric
Moleculele de ADN sunt incarcate negativ si vor migra spre polul pozitiv
ELECTROFOREZAFortele care determina mobilitatea electroforetica depind de: voltajulaplicat (65-75 V), sarcina neta a moleculelor, masa moleculara sicoeficientul de frictiune- teoretic: 5 v/cm
ELECTROFOREZA Cuva (tanc) de electroforeza
2 electrozi conectati la o sursa de curent
Gel de electroforeza (pentru o migrarea mai buna a moleculelor)
un lichid (tampon de electroforeza)
Gelul de electroforeza- Gel de agaroza (polizaharid, D-galactoza and 3,6-anhidro-L-
galactopiranoza, extras din alge)
- Gelurile de agaroza au o concentratie de 1-5%, in functie dedimensiunea fragmentelor ce trebuie separate
- Gelurile de agaroza permit separarea acizilor nucleici cudimensiuni intre 100-1500 pb
Gel de poliacrilamida: permit separarea acizilor nucleici cu dimensiuniintre 60-450 pb si a proteinelor
- dezavantaje: neurotoxic si cancerigen
Gelurile de agaroza se formeaza prin incalzirea agarozei la cuptorul cumicrounde timp de 3-4 minute. Aceste geluri polimerizeaza formand oretea cu ochiuri de dimensiuni variabile in functie de concentratia gelului
Gelurile de poliacrilamida polimerizeaza la temperatura camerei inprezenta unor agenti de polimerizare
Gelurile cu concentratie mica (< 3%) separarea moleculelor cu MMmare
Gelurile cu concentratie mare (> 3%) separarea moleculelor cu MMmica
ELECTROFOREZA
Gel de agarozaGel de poliacrilamida
260, 250
+ +
--
Gel de agaroza
200
260
250
200
ELECTROFOREZA Tamponul de electroforeza
- TAE: Tris, acid acetic, EDTA
- TBE: Tris, acid boric, EDTA
- Acid citric
- Glicina
- Acid fosforic
TRIS = tris(hidroximetil)aminometan
Pentru vizualizarea fragmentelor de acizi nucleici :
- colorarea gelului: bromura de etidiu, Syber Green, EvaGreen, GelGreen, GelRed sau
- Colorarea tamponului: bromura de etidiu
ELECTROFOREZA
Tipuri de electroforeza In functie de suportul folosit:
1. Electroforeza in solutie libera = electroforeza capilara
2. Electroforeza pe diferite suporturi: hartie, film, geluri
In functie de planul de electroforeza:
1. Electroforeza orizontala acizi nucleici
2. Electroforeza verticala - proteine
Tipuri de electroforeza
Electroforeza pentru acizi nucleici1. In gel de agaroza
2. DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in gradient denaturant
3. TGGE: (temperature gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in gradient de temperatura
- Ambele metode sunt folosite in domeniul biomedical (mutatii) si ecologiemicrobiana
4. PFGE (pulse field gel electophoresis): electroforeza in camp pulsatoriu
- Gel de agaroza, dar voltajul este schimbat in 3 directii (1 catre centrugelului, 2 care actioneaza intr-un unghi de 60o)
- Pentru genotipare, epidemiologie moleculara
Tipuri de electroforezaDGGE
Tipuri de electroforeza Electroforeza pentru separarea proteinelor
1. PAGE: in gel de poliacrilamida
2. SDS-PAGE: electroforeza in conditii denaturante
- Agenti de denaturare: SDS, uree si formamida
1. IEF (focusare izoelectrica): se realizeaza intr-un gradient de pH, fiecareproteina migrand pana atinge punctul unde pH = pI
2. 2DGE (Two-dimensional gel electrophoresis): IEF si SDS-PAGE (pH izoelectric si MM)
Tipuri de electroforeza
Tipuri de electroforeza
Electroforeza biochimie clinica
Electroforeaza proteinelor serice: albumina, 1 globuline,
2 globuline, 1 globuline, 2 globuline, globuline
- malnutritie, malabsorbtie, sindrom nefrotic, neoplazii, hepatita, boli autoimune
Electroforeza hemoglobinei anemie
Electroforeza lipoproteinelor boli cardiovasculare
TEHNICA MICROARRAY
DNA MICROARRAY PRINCIPII GENERALE
Tehnica MICROARRAY reprezinta o tehnologie multiplex utilizata in studii debiologie moleculara si medicina.
Principiul de baza al tehnicii este similar principiului se bazeaza pecomplementaritatea scventelor genice de a se recunoaste intre ele si de a
detecta prezenta sau absenta ADN/ARN-ului de interes.
Spoturile pot fi fragmente scurte de gene SONDE utilizate la hibridizarea ADNc tinta, in conditii foarte bine definite
Complexele SONDA-TINTA pot fi vizualizate si cuantificate pe baza detectiei influorescenta a unui fluorofor marker fluorescent atasat tintei in vedereacuantificarii relative a abundentei acizilor nucleici existenti in proba tinta
Prin tehnologia microarray pot fi furnizate informatii asupra expresiei simultane a mii degene sau chiar a intregului genom.
A permis identificarea unor seturi de gene supra- si sub- exprimate in diferite patologii:cancer de san, de prostata, pulmonar, precum si in dereglarea anumitor procese
fiziologice: inducerea apoptozei sau raspunsul la terapie.
Utilizata pentru detectia SNP-urilor (single nucleotide polymorphism), a aberatiilor demetilare, detectia splicing-ului alternativ, detectia de patogeni, amplificare genica, detectia
genelor de fuziune.
Principiul.
Microarray-ul este o matrice solida miniaturizata pe care sunt depozitate intr-o ordine binestabilita mii de fragmente specifice de acizi nucleici.
ADNc sintetizat prin reactia de revers transcriere de pe ARNm-ul extras din proba deinteres, este marcat fluorescent si hibridizat pe suprafata array-ului.
Cuantificarea nivelelor de expresie se bazeaza pe faptul ca intensitatea semnaluluifluorescent al fiecarui spot este direct proportionala cu cantitatea de ARN/ADN prezenta in
proba analizata, care a hibridizat spotul respectiv.
Tehnica microarray compara nivelurile de expresie a unei gene in doua conditii diferite (ex.Cancer vs. normal).
DNA MICROARRAY PRINCIPII GENERALE
Tipuri de sonde
Suporturile array pot contine fie ADNc fie oligonucleotide.
Un sistem ADNc microarray cuprinde o colectie de mii de sonde, apartinand unor bancide ADNc. Primul pas: selectarea secventelor de interes din bazele de date
internationale, ce urmeaza a fi apoi amplificate prin PCR folosind primeri specifici,
purificate si apoi depozitate (sub forma de spoturi) in pozitii bine determinate pe
suprafata array-ului (20.000 spoturi/cm2). Avantaj: pot fi depozitate structuri clonate
care nu au fost inca secventiate, noi gene. Dezavantaj: dificultatea mentinerii si utilizarii
unor colectii voluminoase de clone de ADNc.
Oligonucleotide microarray realizata prin sinteza in situ. In loc de a fi sintetizate inprealabil, oligonucleotidele sunt produse baza cu baza, direct pe suprafata array-ului.
Avantaj: eliminarea necesitatii unei colectii de clone ADNc; sensibilitate de hibridizare
ridicata; Dezavantaj: pot fi sintetizate doar secvente cunoscute
Tehnologiile two-color permit hibridizarea pe acelasi array a 2 probe marcate cufluorocromi diferiti (ex: Cy3 si Cy5). Probele marcate vor hibrida competitiv, rezultatul
fiind exprimat ca raport, punand in evidenta diferentele de expresie intre cele 2 probe.
Schema experiment microarray two color
Etapa de hibridizare se realizeaza cu 2 probede ADNc care urmeaza a fi comparate (probe
de tesut bolnav / tesut sanatos; celule tratate /
celule netratate) marcate cu doi fluorofori
diferiti
Markeri fluorescenti : Cy3, cu lungime de undade emisie 570 nm (corespunzator spectrului
cu lumina verde), si Cy5 cu lungime de unda
de emisie 670 nm (corespunzator spectrului
cu lumina rosie)
Cele doua tipuri de probe sunt amestecate sihibridizate pe acelasi cip microarray care va fi
scanat pentru a analiza intensitatea
semnalului fluorescent a celor doi fluorocromi
Intensitatile relative ale semnalului fluorescenta celor doi markeri pot fi analizate ca raport in
vederea identificarii genelor cu expresie
stimulata sau inhibata - up-regulated or down-
regulated
1. Fabricarea cip-ului microarray (cele 2 metode)
2. Purificarea si revers-transcrierea. Trebuie realizata
intr-un timp cat mai scurt (ARN-ul are stabilitate
redusa, fiind tinta degradarii enzimatice). De pe
ARNm extras este sintetizat fie ADNc, fie ARNc.
De asemenea, ARNc poate fi obtinut si din ADNc
dublu catenar.
3. Marcarea fluorescenta a probelor. Se realizeaza
prin incorporarea unor nucleotide analoage
conjugate cu un fluorocrom, in timpul procesului
de revers-transcriptie.
4. Hibridizarea pe lama. Etapa in care sondele
imobilizate pe suprafata lamelor vor forma hetero-
duplicati cu ARN/ADNc marcat fluorescent.
Hibridizarea: 12-24 h, 45-65 grade C. Apoi lamele
sunt spalate.
5. Achizitia de imagini (scanarea) si cuantificarea
expresiei genice
6. Crearea unei baze de date, filtrarea si normalizarea
7. Bioinformatica: analize statistice, analiza legaturilor
dintre date, data mining (Pattern-uri similare a
expresiei genice in diferite experimente
Etapele unui experiment microarray
Procesul de productie microarray
POST PROCESARE
Construirea chip-ului:
Cantitati masive de
produsi PCR (cADN)
sau OLIGO
PURIFICARE si
PREPARARE
PREPARARE SLIDE-URI PRINTARE
Preparare ARN:
CELULE/TESUT
IZOLARE ARN
OBTINEREA cADN
HIBRIDIZAREA
MARCAREA
PROBELOR
ANALIZA DATELOR
Microarray cu mii de oligonucleotide "printate" pe
o lama de sticla, nylon, plastic, etc.
Tipuri de suporturi microarrayPentru fabricarea suporturilor microarray sunt folosite mai multe metode:
- "depozitarea": probele (oligo, cDNA) sunt inainte sintetizate, apoi depozitate (spotted)
pe suprafata unui suport de sticla
- "printarea": secventele ce reprezinta o anumita gena sunt sintetizate direct pe
suprafata sticlei , oligonucleotida cu oligonucleotida
- fotolitografia pe substrat de siliciu, unde sunt adaugate nucleotidele una cate una
- electrochimic, pe anumiti microelectrozi
Miniaturizate: densitate foarte mare (1.300.000 oligonucleotide/cm2)
Spotted glass slide
microarrays
Avantaje
Pret scazut per array
Selectarea specifica a genelor (custom)
Orice specie poate fi analizata
Hibridizare competitiva
Sistem deschis al arhitecturii aparatului
Dezavantaje
Management-ul clonelor (numeroase)
Controlul calitatii
-Datele obtinute pot fi variabile
-Uneori se pot desprinde nucleotide,
daca nu sunt bine aderate
Avantaje
Productia de linie
Un numar mare de gene
Numeroase specii
Dezavantaje
Costul sistemului de analiza
Costul chip-ului
Limitarea particularizarii/ajustarii
Affymetrix GeneChip system
(printing microarray)
Construirea chip-ului microarray
Arrayed Library
(96 or 384-well plates of
bacterial glycerol stocks)
PCR amplification
Directly from colonies with
SP6-T7 primers in 96-well
plates
Consolidate into
384-well plates
Spot as microarray
on glass slides
LABEL
3XSSC
HYB CHAMBER
ARRAY
SLIDE
LIFTERSLIP
SLIDE LABEL
Umiditate
Temperatura
Formamida (scade temperatura de melting)
Camera de hibridizare
cDNA microarrayscDNA ACy5 labeled
cDNA BCy3 labeled
Hybridization Scanning
Laser 1 Laser 2
+
Analysis Image Capture
Analiza imaginilor obtinute
Normal vs. Normal Normal vs. Tumor
Analiza: Scatter plots, significance analysis, clustering, pathway analysis
Stabilirea intensitatii fluorescentei in probe experimentale vs. normal;
De ce am analiza atat de multe gene?
Deoarece simpla secventirere a unui genom nu este de ajuns. Exista mii de gene cunoscute, dar despre care nu stim absolut nimic, carora nu li s-a asociat o anumita functie in celula.
De asemenea, deseori un cluster de gene poate detine mai multa informatie in ce priveste functionalitatea celulei, per total, decat analiza unei singure gene in particular
Analiza datelor microarray
Bioinformatica- Este un domeniu in sine de analiza
- Trebuie realizata de catre oameni specializati
- Presupune o cunoastere aprofundata a genelor, a cailor biochimice, a notarii
genelor, cailor de semnalizare, a traficului intracelular, etc
- Se folosesc software-uri speciale, precum Spotfire, Genesifter, Genespring
Identificarea de noi gene implicate in progresia bolilor si in raspunsul la tratament
Identifiarea efectelor secundare si a profilului de reactie la diferite medicamente
Extragerea de informatii prognostice (ex. Clasificarea tumorilor in functie de sute de parametri, comparativ cu doar 2 sau 3 parametri in prezent)
Identificarea de noi tinte terapeutice si accelerarea descoperirii si testarii de noi medicamente
Genotipare
Atribuirea de functii anumitor gene (pt. 90% din genele noastre nu le-a fost atribuita nici o functie)
Stratificarea pacientilor (farmacogenomica)
Identificare microbiana
Medicina personalizata
Medicina de precizie (discurs Barak Obama 2015)
Aplicatii ale Microarray
Secventierea ADN este o aplicatie ce utilizeaza un
cumul de metode si tehnologii de biologie moleculara
cu scopul de a determina succesiunea de nucleotide
intr-o secventa ADN.
Secventierea ADN
Secventierea Maxam-Gilbert
19761977 Walter Gilbert si Allan Maxam au dezvoltat
secventierea prin degradare chimica
Secventierea Sanger
1975 Frederick Sanger si Alan Coulson propun secventiereaenzimatica
Secventierea Maxam-Gilbert19761977 Allan Maxam si Walter Gilbert au dezvoltat secventiereaprin degradare chimica ce implica:
- marcarea radioactiva a ADN monocatenar
- 32P
- modificarea chimica a bazelor azotate
- dimetil sulfat G
- dimetil sulfat in acid formic A+G
- hidrazina C+T
- hidrazina in 2mM NaCl C
- clivajul chimic specific al bazelor azotate
- piperidina
- electroforeza in gel de poliacrilamida
- autoradiografie
Cathode (-)
Anode (+)
Secventierea Sanger - sinteza enzimatica
1975 Frederick Sanger si Alan Coulson
Etape de lucru:
1. Amplificarea secventei ADN pentru care dorim sa aflam succesiunea de nucleotide
1. Purificarea ampliconilor
2. Reactia PCR de secventiere
3. Purificarea fragmentelor ADN obtinute
4. Electroforeza capilara a fragmentelor ADN
5. Interpretarea electroforegramelor
Secventierea Sanger (dideoxy, dye-terminator)
Reactia PCR de secventiere prezinta urmatoarele componente:
ADN tinta regiune pentru care vrem sa cunoastem seventa de nucleotide
1 singur primer
enzima de polimerizare - ADN polimeraza
dNTP deoxinucleotide
ddNTP marcate radioactiv/fluorescent - dideoxinucleotide-actioneaza ca terminatori de catena
tampon de reactie si cationi
ddNTP:
- NU prezinta gruparea OH in pozitia 3 a pentozei si de aceea nu se mai poate atasa un alt nucleotid
Sistem automat de umplere cu polimer
Recipient cu polimer
Anod
Fereastra de detectie Dispozitiv incarcare probe, catod
Cuptor
Sistem de capilare
3130 Genetic Analzyer (Applied Biosystems)
Pirosecventierea
Este o tehnica de secventiere propusa in anul 2000
Nu include reactia PCR ciclica si nu necesita electroforeza
Componentele reactiei:
ADN tinta
1 Primer
Tampon de reactie
4 Enzime
Enzime:
ADN polimeraza catalizeaza incorporarea nucleotidelor
ATP sulfurilaza converteste pirofosfatul in ATP in prezenta APS (adenozin 5 fosfosulfat)
Luciferaza oxideaza luciferina in prezenta ATP si genereaza lumina
Apiraza degradeaza nucleotidele neincorporate si excesul de ATP
https://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFe0aA
Cromatograma = electroforegrama
Interpretarea secventelor ADN
- bioinformatica -
NCBI - National Center for Biotechnology Information include:
baze de date:
Nucleotide
Gene
Proteine
motoare de cautare BLAST
UCSC (University of California Santa Cruz) motor de cautare
BioEdit
Secventiere de noua generatie (NGS)next-generation sequencing
VA MULTUMESC PENTRU ATENTIE!
Top Related