Metode si tehnici de biologie celulara si

moleculara utilizate in cercetarea

biomedicala

Curs 2

Dr. Florin Iordache

Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 2013Investete n oameni!Axa prioritar 1: Educaia i formarea n sprijinul creterii economice i dezvoltrii societii bazate pe cunoatereDomeniul major de intervenie 1.2: Calitate n nvmntul superiorTitlul proiectului: Aplicarea metodologiilor de cercetare stiintifica in domeniul stiintelor medicale si promovarea culturii antreprenoriale pentru

facilitarea insertiei pe piata muncii a studentilor medicinisti din ciclul de studii universitare de licenta.

Numrul de identificare al contractului: POSDRU/156/1.2/G/141745Beneficiar: Universitatea de Medicin i Farmacie Carol Davila din Bucureti

Culturi de celule Metode de evaluare a citotoxicitatii, a stresului oxidativ si a

apoptozei

Citometrie in flux Analiza ciclului celular Metode de dozarea a proteinelor Electroforeza, ELISA, Western blot Tehnici de imunohistochimie simpla si dubla Tehnica PCR si Real-Time PCR Variante si aplicatii ale tehnicii PCR: MS-PCR, SNP-PCR, PCR-

RFLP,

Microarray Secventiere genica Transfectie si clonare

Cuprins

Western blot (imunoblot)

Metoda ce imbina tehnicile de electroforeza cu cele imunologicepentru identificarea si cuantificarea proteinelor dintr-un amestecEtape1. Prepararea probelor2. Electroforeza probelor3. Transferul proteinelor pe membrana de nitroceluloza4. Incubarea proteinelor cu Anticorpi specifici

Western blot (imunoblot)1. Prepararea probelorLiza celulara- culturi de celule: RIPA (25mM TrisHCl pH 7.6, 150mM NaCl, 1%

NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS), mecanic in azotlichid, sonicare

- Tesuturi: mecanic, sonicare, apoi chimicDeterminarea concentratiei proteinelor (BCA, Bradford, Lowry)- Pe gel se va incarca o cantitate egala de proteina- Inainte de incarcarea probelor in gel acestea se amesteca cu

loading buffer ce contine SDS (5-10 min, 95-100oC)- 2x Laemnli buffer: 4% SDS, 10% -mercaptoetanol, 20% glicerol,

bromfenol blue, 0.125%M Tris-HCl

Western blot2. Electroforeza (SDS-PAGE)- 2 geluri: gel de concentrare si gel de separareGelul de separare-30% acrilamida/bisacrilamida-1,5M Tris pH 8,8-10% SDS-10% APS (amonium persulfat)-TEMED-se pasa la polimerizat 20-30 minGelul de concentrate- 30% acrilamida/bisacrilamida-1 M Tris pH 6,8-10% SDS-10% APS (amonium persulfat)-TEMED

Western blot

- Se incarca ~ 30-100l/godeu (50mg proteina)- Migrare la 100V, 1-2,5 ore-Dupa transfer, gelul se poate colora (Coomassie Blue) pentru a

vedea daca proteinele au migrat

Western blot3. Transferul proteinelor pe membra de nitrocelulozaTransferul se face in 2 moduri: umed sau semiuscat (15V, 20-30 minute)Membrane: nitroceluloza, florura de poliviniliden (PVDF) sau NylonMembranele leaga proteinele prin interactii hidrofobe (nitroceluloza) sauinteractii hidrofobe si ionice (Nylon incarcat pozitiv)Marimea porilor membranei este intre 0,05 m si 0,45 m. Cu cat porii suntmai mici cu atat capacitatea de legare este mai mare.

Western blot

3. Transferul proteinelor pe membra de nitroceluloza

- Colorare cu Ponceau S pt a vedea daca s-a realizat transferul

https://www.youtube.com/watch?v=krFKPwhiHJE

Western blot

4. Incubarea cu Anticorpi specifici- Blocare 30-60 min - lapte 5% in PBS cu Tween 0.05% (albumina)- Incubare cu Anticorp primar peste noapte la 4oC- Spalare 3x, 15min cu PBS+Tween 0.05%- Incubare cu Anticorp secundar 1 ora la To cam- Spalare 3x, 15min cu PBS+Tween 0.05%- Spalare 1x, 15min cu PBS- Developare: se adauga ECL peste membrana 2-3 min, citire la

aparatul de chemiluminiscenta- ECL: luminol si HRP

Western blot

Imunohistochimie

Reprezinta combinatia dintre 2 stiinte: imunologia si

histochimia, avind ca scop evidentierea proprietatilor

antigenice ale unor substante intr-un tesut, utilizind anticorpi

monoclonali sau seruri polireactive. Vizualizarea substantelor

antigenice se poate face atit la nivel tisular, cit si la nivel

celular si subcelular, pe preparate la gheata sau parafina.

Se lucreaza cu anticorpi monoclonali, de care sunt legate

una sau mai multe molecule enzimatice, ce catalizeaza

transformarea unui substrat incolor intr-un produs de

reactie colorat. Enzima este cuplata covalent cu portiunea

Fc a anticorpului

Imunohistochimie

Enzimele utilizate sunt:

- Peroxidaza (HRP)

- fosfataza alcalina (PA)

Substratele folosite sunt:

- DAB (Di-amino-benzidina brun) sau AEC (3-Amino-9-ethylcarbazolerosu) pentru peroxidaza

- pNPP (p-nitrophenylphosphate galben) si BCIP/NBT (5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitroblue tetrazolium violet) pentru fosfataza

Metoda ABC (dupa Hsu et al.,

1981, modificata de G. Bussolatti & P.

Gugliotta, 1983)

In prima etapa, Ac primar se

cupleaza cu Ag dorit; in a doua etapa

de Ac primar se leaga un Ac secundar,

marcat cu biotina.

In a treia etapa, se introduce un

reactiv cu mai multe molecule de

avidina marcata cu peroxidaza.

La locusul antigenic se leaga un

complex cu multe molecule de

peroxidaza, intensitatea reactiei

cromogene va fi accentuata si

sensibilitatea metodei mare.

Imunohistochimie

Metoda dextranului (DAKO

EnVisionTM Systems, 1996)

Permite cuplarea unui mare

numar de molecule enzimatice pe un

schelet polimeric de dextran

hidrosolubil; cu acest complex se pot

cupla Ac secundari

Se obtine astfel un reactiv care

poate fi utilizat in cadrul unei tehnici

in 2 timpi, care aduce o mare

cantitate de enzime la locul reactiei si

va creste foarte mult sensibilitatea

detectarii Ag dorit.

Imunohistochimie

Metoda Tiramida

Imunohistochimie

Protocol de lucru

1. Fixarea pieselor se face in formol neutru maximum 24h. Dimensiunea pieselor prelevate

nu depasesc 8-10x8-10x4-5 mm. Pentru biopsiile mici un timp de fixare de 6h este suficient.

2. Sectiuni de 3-4 microni, perfect intinse fara pliuri in apa distilata de 37oC etalate pe lame

silanizate sau tratate cu gelatina cromica (folosim numai in cazuri exceptionale). Sectiunile sunt

uscate la 37oC in termostat sau la temperatura camerei timp de 24h.

3. Deparafinarea: Xilen 3x10 min.

4. Rehidratarea: etanol 3x3 min., apa distilata 1x5 min.

5. Demascatia antigenica a sectiunilor se face prin fierbere, 3x5 min. intr-un vas cu solutie

Histols citrat tampon 0,01 M cu pH 6 (cat.30010) intr-un cuptor cu microunde la o putere de 750

W. Nivelul solutiei de tampon este verificat dupa fiecare 5 minute, iar cantitatea evaporata se

completeaza cu solutie tampon citrat de sodiu (aceeasi solutie pe care o folosim si la fierbere).

6. Racirea sectiunilor in apa distilata la temperatura camerei timp de 5 min.

7. Blocarea peroxidazei endogene timp de 10 min. (90 ml apa distilata+5 ml perhidrol

conc.)

8. Spalare cu apa distilata 5 min.

9. Spalare cu solutie tampon PBS (pH 7,2 - 7,6) 3-5 min.

Incepand de la punctul 10 se lucreaza in camera umeda.

10. Blocarea nespecifica pentru reducerea zgomotului de fond cu BBPS Histols 10 min.(in loc de BSA sau lapte de praf 3% cum se facea inainte) BBPS Histols backround blockingprotein solution cat. 30012.

11. Aplicarea anticorpului primar folosim dilutiile indicate de firma producatoare intr-ocantitate de 80 microlitri. In cazul sectiunilor obtinute prin tehnica TMA cantitatea serului aplicat

este semnificativ mai mica. Diluarea anticorpului primar se face cu Large Volume UltraAB Diluent

(LabVision cat. TA-125-UD). Aplicarea anticorpului se face prin simpla aplicare intr-o cantitate

suficienta care sa ajunga limitele marcate cu Histo Pen (dupa prima rehidratare cu solutie tampon

sectiunile vor fi incercuite, demarcate cu Histo Pen cat. 30020 Tissue Marker Hydrophobic Pen).

12. Incubare la temperatura camerei timp de 60 min.

13. Spalarea cu solutia tampon PBS 3x5 min.

14. Aplicarea polimerului insemnat Histols-MR (cat. 3001150) anti soarece si iepure timp de

30 min).

15. Spalare cu solutie tampon PBS 3x5 min.

16. Aplicarea Histols-DAB cat 30014, solutia de lucru (o picatura 40 microlitri DAB+1ml

substrat) se prepara extemporaneu si poate fi folosita la temperatura camerei timp de 6 ore.

Intensitatea coloratiei se verifica sub microscop timp de 3-10 min. si este oprit dupa obtinerea

intensitatii dorite prin punctul 17.

17. Spalare cu apa distilata 10-15 min.

18. Supracolorare cu Hematoxilina: un timp mai scurt de coloratie obisnuita (aproximativ

jumatate din timpul coloratiei de rutina).

19. Deshidratare: alcool 96o .1x30 sec. alcool absolut 1x30 sec. si acetona 1x30 sec.

20. Clarifiere: xilen 3x3 min.

21. Montare: balsam de Canada, care se poate utiliza si in cazul cromogenului Histols restistant AEC

IHC detection of CD3 antigen in serial sections of paraffin-embedded

human tonsil

Rabbit anti-CD3 1:400, biotinylated anti-rabbit,

ABC, with DAB chromogenic detection.

TSA biotin: rabbit anti-CD3 1:400, biotinylated anti-

rabbit, SA-HRP, biotinyl tyramide, ABC, with DAB

chromogenic detection.

EXTRACTIA ADN

1. Sange periferic (venos)

2. Secretii nazale, oculare, vaginale, uretrale

3. Raclaj al mucoaselor: bucala, cervicala, uretrala

4. Diverse tipuri de tesut (biopsie)

1. Vilozitati coriale

2. Lichid amniotic (amniocite)

3. Sange fetal

4. Tesut (biopsie): piele

PRENATAL POSTNATAL

POSTMORNEM

1. Produs de conceptie

2. Sange, tesut, etc

Tehnica PCR si Real-Time PCR

Viloziti coriale

Lichid amniotic

Produs de concepie

Recoltarea probelor biologice

Sange periferic (venos):

ADN intracelular - se proceseaza celulele sangelui:

exemple: in vederea identificarii unei mutatii in structura unor gene

specifice: gena DMD

ADN extracelular - se proceseaza plasma

exemple: in vederea identificarii unor virusuri ADN (HBV) si ARN (HCV,

HIV)

exemple: in vederea detectiei si analizei ADN fetal liber circulant in sangele

mamei

Extractia ADN - etapele de lucruSpargerea membranelor:

Detergenti neionici (nonidet (NP40), triton X) si ionici: SDS

- degradeaza lipidele membranare

Enzime: proteinaza K, proteaza - realizeaza digestia proteinelor

membranare

Tiocianat de guanidina - degradeaza proteinele si distruge DNazele si

RNazele

Precipitarea proteinelor: Clorura de sodium/potasiu, Acetat de sodium

Chloroform:alcool izoamilic, Fenol:cloroform

Precipitarea si spalarea ADN: izopropanol si etanol

Elutia ADN: apa, solutie TRIS:EDTA

Categorii metodologice

A. metode manuale

Metoda organica

Metoda bazata pe utilizarea coloanelor

cu membrane de dioxid de siliciu

Metoda bazata pe utilizarea particulelor paramagnetice sau dioxid de siliciu (silica)

Automata

CUANTIFICAREA ADN - determina concentratia

(cantitatea) ADN

Metoda: masurarea spectrofotometrica

ADN: absorbanta maxima la lungimea de unda 260 nm

A260=1 50 ng ADN d.c./ml

A260=1 33 ng ADN m.c./ml

A260=1 40 ng ARN m.c./ml

A260=1 20 ng oligonucleotide d.c./ml

DETERMINAREA PURITATII (calitatea) ADN

Metoda: masurarea spetrofotometrica

ADN: absorbanta maxima la lungimea de unda 260 nm

Proteinele: absorbanta maxima la lungimea de unda 280 nm

Raportul A260 / A280:

interval optim 1.8 - 2.0

< 1.7 - contaminare cu proteine

> 2.0 - contaminare cu ARN

Definitie: PCR este o tehnica de biologie moleculara princare una sau mai multe secvente ADN sunt amplificate

(multiplicate) enzimatic; reactia este exponentiala - initiata

de la cateva copii, generand in final cateva mii pana la

cateva milioane de copii.

Scopul: acestei metode este de a face accesibila analiza unei secvente ADN

REACTIA PCR

Polymerase

Chain

Reaction

Polimerizare

Lant

Reactia

Componentele reactiei PCR

ADN tinta obtinut prin extractia ADN

Primeri (Amorse)

ADN polimeraza

Nucleotide

Cationi

Tampon de reactie

Primeri (Amorse) 2 fragmente mici de ADN

monocatenar (fragmente

oligonucleotidice 15-30

perechi baze)

complementare celor doua capete 3 ale seventei tinta

Functie:

recunosc secventa de interes si se ataseaza de capetele acesteia la o

temperatura specifica = temperatura de atasare a primerilor (se

calculeaza in functie de Tm)

initiaza reactia de polimerizare

ADN polimeraza

enzima termostabila

realizeaza sinteza unei noi secvente ADN identice cu secventa tinta

se ataseaza de primeri

incorporeaza nucleotide pe baza de complementaritate cu secventa tinta;

Exemple comerciale: Taq polimeraza, Go Taq Flexi polimeraza,

AmpliTaq Gold polimeraza, HotStart Taq polimeraza

Nucleotide: sunt livrate fie separat, sub form de soluie stoc de dATP,dCTP, dGTPi dTTP, fie sub form de soluie amestec a celor patrunucleotide. Concentraiile optime depind de lungimea fragmentului cetrebuie amplificat i de numrul de cicluri de amplificare.

Cationi - elemente chimice cu rol in mentinerea activitatii optime a enzimei;

Cationi bivalenti de magneziu si mangan

Cationi monovalenti de potasiu

Tampon de reactie - este o solutie ce confera un mediu optim pentru activitatea si stabilitatea enzimei. ConineTRIS, HCl, KCli are pH 8,3.

Aparate PCR

Etapele reactiei PCR

Denaturarea initiala

Amplificarea ADN in trei pasi ce se repeta ciclic

Denaturarea ADN

Atasarea primerilorADN

Elongatia ADN

Elongatia finala

VARIANTE PCR - clasificare in functie de:

Numarul de secvente tinta: Monoplex PCR Multiplex PCR

Metoda de evidentiere a produsilor PCR (ampliconi): PCR + electroforeza Real-time PCR (PCR in timp real)

Matrita tinta: ADN ARN - RT PCR (reverstranscriere PCR)

Scopul urmarit: Calitative Cantitative Semicantitative

PCR monoplex

se amplifica o singura

secventa tinta

exista un singur set de

primeriPCR multiplex

se amplifica mai

multe secvente

tinta

exista mai multe

seturi de primeri

(cel putin 2)

In functie de modul de detectie

La sfarsitul reactiei PCR = End-Point PCR prinelectroforeza:

Plana in gel de agaroza Verticala in gel de poliacrilamida Capilara

In timpul reactiei PCR = Real-Time PCR

Touchdown PCR

Endonucleazele de restricie sunt enzime care recunosc secvene deADN specifice, scurte, se leaga de ele apoi le de cliveaza, fie la situsul

de recunoastere, fie la o distan oarecare de acesta, n funcie de tipulde enzim.

EcoRI recunoate o secvena hexanucleotidic: 5-G-A-A-T-T-C-3 5-G-3 5-A-A-T-T-C-33-C-T-T-A-A-G-5 3-C-T-T-A-A-5 3-G-5

Real Time PCR - PCR in timp real

Metode de detectie a ampliconilor in timp real:

1.Coloranti fluorescenti care se leaga nespecific de molecula ADN

dublu catenara: SYBR Green I,

2. Sonde ADN specifice alcatuite din secvente oligonucleotidice

marcate fluorescent

Frster resonance energy transfer (FRET)

Real-Time PCRTaq-Man

- Hibridizare foarte spcifica intre sonde si tinta

- Sondele pot fi marcate cu fluorocromi diferiti

-Datorita specificitatii si sensibilitatii ridicate nu este

necesara o - procesare ulterioara a datelor

- Dezavantaje: sinteza diverselor probe marcate si costurile

- Monitorizeaza amplificarea oricarei

secvente ADNdc

-Costuri scazute

-Dezavantaje: reactii fals pozitive,

legari nespecifice

Syber Green vs

- SYBR Green II- SYBR Gold- YO (Oxazole Yellow)- TO (Thiazole Orange)-PG (PicoGreen)-Eva Green-BEBO, BOXTO, SYTO9

https://www.youtube.com/watch?v=nKrJnc1xWb0

Proiectarea unui experiment cu determinare

calitativa

Controale:

Pozitiv

Negativ

Control intern:

- Secventa din genom: globina, actina

- Secventa ADN externa

Blanc non-template:

- din extractie

- din PCR

Probe

Aplicaiile reaciei de real-time PCR

Cuantificarea expresiei genice Verificarea datelor de microarray Monitorizarea eficienei terapiilor Cuantificare viral (detectarea numrului de particule virale) Identificarea agenilor patogeni Studiul ADN mitocondrial Imunoprecipitarea cromatinei Determinarea instabilitii microsateliilor Determinarea nivelului de metilare a ADN Detecia inactivrii cromozomului X Monitorizarea post-transplant a grefelor de esut sau de organe Diagnosticul cancerului Cuantificarea ADN n medicina legal Discriminare alelic i calcularea frecvenei alelelor n populaii

ELECTROFOREZA

1937 Arne Tiselius- aparat sofisticat care sa permita separareadiferitelor particule in prezenta unui camp electric

1948 Tiselius- Premiul Nobel pentru Chimie (separareacoloizilor prin metode electroforetice)

1960 Vin Thorne - electroforeza acizilor nucleici

ELECTROFOREZA Denumirea: gr. Electron= electric, lat. Phore = purttor,

evideniindu-se astfel rolul esential al campului electric

reprezint o metod de analiz i separare bazat pemigrarea particulelor solide incarcate electric dispersatentr-un lichid sub aciunea unui cmp electric

Moleculele de ADN sunt incarcate negativ si vor migra spre polul pozitiv

ELECTROFOREZAFortele care determina mobilitatea electroforetica depind de: voltajulaplicat (65-75 V), sarcina neta a moleculelor, masa moleculara sicoeficientul de frictiune- teoretic: 5 v/cm

ELECTROFOREZA Cuva (tanc) de electroforeza

2 electrozi conectati la o sursa de curent

Gel de electroforeza (pentru o migrarea mai buna a moleculelor)

un lichid (tampon de electroforeza)

Gelul de electroforeza- Gel de agaroza (polizaharid, D-galactoza and 3,6-anhidro-L-

galactopiranoza, extras din alge)

- Gelurile de agaroza au o concentratie de 1-5%, in functie dedimensiunea fragmentelor ce trebuie separate

- Gelurile de agaroza permit separarea acizilor nucleici cudimensiuni intre 100-1500 pb

Gel de poliacrilamida: permit separarea acizilor nucleici cu dimensiuniintre 60-450 pb si a proteinelor

- dezavantaje: neurotoxic si cancerigen

Gelurile de agaroza se formeaza prin incalzirea agarozei la cuptorul cumicrounde timp de 3-4 minute. Aceste geluri polimerizeaza formand oretea cu ochiuri de dimensiuni variabile in functie de concentratia gelului

Gelurile de poliacrilamida polimerizeaza la temperatura camerei inprezenta unor agenti de polimerizare

Gelurile cu concentratie mica (< 3%) separarea moleculelor cu MMmare

Gelurile cu concentratie mare (> 3%) separarea moleculelor cu MMmica

ELECTROFOREZA

Gel de agarozaGel de poliacrilamida

260, 250

+ +

--

Gel de agaroza

200

260

250

200

ELECTROFOREZA Tamponul de electroforeza

- TAE: Tris, acid acetic, EDTA

- TBE: Tris, acid boric, EDTA

- Acid citric

- Glicina

- Acid fosforic

TRIS = tris(hidroximetil)aminometan

Pentru vizualizarea fragmentelor de acizi nucleici :

- colorarea gelului: bromura de etidiu, Syber Green, EvaGreen, GelGreen, GelRed sau

- Colorarea tamponului: bromura de etidiu

ELECTROFOREZA

Tipuri de electroforeza In functie de suportul folosit:

1. Electroforeza in solutie libera = electroforeza capilara

2. Electroforeza pe diferite suporturi: hartie, film, geluri

In functie de planul de electroforeza:

1. Electroforeza orizontala acizi nucleici

2. Electroforeza verticala - proteine

Tipuri de electroforeza

Electroforeza pentru acizi nucleici1. In gel de agaroza

2. DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in gradient denaturant

3. TGGE: (temperature gradient gel electrophoresis): electroforeza in gel in gradient de temperatura

- Ambele metode sunt folosite in domeniul biomedical (mutatii) si ecologiemicrobiana

4. PFGE (pulse field gel electophoresis): electroforeza in camp pulsatoriu

- Gel de agaroza, dar voltajul este schimbat in 3 directii (1 catre centrugelului, 2 care actioneaza intr-un unghi de 60o)

- Pentru genotipare, epidemiologie moleculara

Tipuri de electroforezaDGGE

Tipuri de electroforeza Electroforeza pentru separarea proteinelor

1. PAGE: in gel de poliacrilamida

2. SDS-PAGE: electroforeza in conditii denaturante

- Agenti de denaturare: SDS, uree si formamida

1. IEF (focusare izoelectrica): se realizeaza intr-un gradient de pH, fiecareproteina migrand pana atinge punctul unde pH = pI

2. 2DGE (Two-dimensional gel electrophoresis): IEF si SDS-PAGE (pH izoelectric si MM)

Tipuri de electroforeza

Tipuri de electroforeza

Electroforeza biochimie clinica

Electroforeaza proteinelor serice: albumina, 1 globuline,

2 globuline, 1 globuline, 2 globuline, globuline

- malnutritie, malabsorbtie, sindrom nefrotic, neoplazii, hepatita, boli autoimune

Electroforeza hemoglobinei anemie

Electroforeza lipoproteinelor boli cardiovasculare

TEHNICA MICROARRAY

DNA MICROARRAY PRINCIPII GENERALE

Tehnica MICROARRAY reprezinta o tehnologie multiplex utilizata in studii debiologie moleculara si medicina.

Principiul de baza al tehnicii este similar principiului se bazeaza pecomplementaritatea scventelor genice de a se recunoaste intre ele si de a

detecta prezenta sau absenta ADN/ARN-ului de interes.

Spoturile pot fi fragmente scurte de gene SONDE utilizate la hibridizarea ADNc tinta, in conditii foarte bine definite

Complexele SONDA-TINTA pot fi vizualizate si cuantificate pe baza detectiei influorescenta a unui fluorofor marker fluorescent atasat tintei in vedereacuantificarii relative a abundentei acizilor nucleici existenti in proba tinta

Prin tehnologia microarray pot fi furnizate informatii asupra expresiei simultane a mii degene sau chiar a intregului genom.

A permis identificarea unor seturi de gene supra- si sub- exprimate in diferite patologii:cancer de san, de prostata, pulmonar, precum si in dereglarea anumitor procese

fiziologice: inducerea apoptozei sau raspunsul la terapie.

Utilizata pentru detectia SNP-urilor (single nucleotide polymorphism), a aberatiilor demetilare, detectia splicing-ului alternativ, detectia de patogeni, amplificare genica, detectia

genelor de fuziune.

Principiul.

Microarray-ul este o matrice solida miniaturizata pe care sunt depozitate intr-o ordine binestabilita mii de fragmente specifice de acizi nucleici.

ADNc sintetizat prin reactia de revers transcriere de pe ARNm-ul extras din proba deinteres, este marcat fluorescent si hibridizat pe suprafata array-ului.

Cuantificarea nivelelor de expresie se bazeaza pe faptul ca intensitatea semnaluluifluorescent al fiecarui spot este direct proportionala cu cantitatea de ARN/ADN prezenta in

proba analizata, care a hibridizat spotul respectiv.

Tehnica microarray compara nivelurile de expresie a unei gene in doua conditii diferite (ex.Cancer vs. normal).

DNA MICROARRAY PRINCIPII GENERALE

Tipuri de sonde

Suporturile array pot contine fie ADNc fie oligonucleotide.

Un sistem ADNc microarray cuprinde o colectie de mii de sonde, apartinand unor bancide ADNc. Primul pas: selectarea secventelor de interes din bazele de date

internationale, ce urmeaza a fi apoi amplificate prin PCR folosind primeri specifici,

purificate si apoi depozitate (sub forma de spoturi) in pozitii bine determinate pe

suprafata array-ului (20.000 spoturi/cm2). Avantaj: pot fi depozitate structuri clonate

care nu au fost inca secventiate, noi gene. Dezavantaj: dificultatea mentinerii si utilizarii

unor colectii voluminoase de clone de ADNc.

Oligonucleotide microarray realizata prin sinteza in situ. In loc de a fi sintetizate inprealabil, oligonucleotidele sunt produse baza cu baza, direct pe suprafata array-ului.

Avantaj: eliminarea necesitatii unei colectii de clone ADNc; sensibilitate de hibridizare

ridicata; Dezavantaj: pot fi sintetizate doar secvente cunoscute

Tehnologiile two-color permit hibridizarea pe acelasi array a 2 probe marcate cufluorocromi diferiti (ex: Cy3 si Cy5). Probele marcate vor hibrida competitiv, rezultatul

fiind exprimat ca raport, punand in evidenta diferentele de expresie intre cele 2 probe.

Schema experiment microarray two color

Etapa de hibridizare se realizeaza cu 2 probede ADNc care urmeaza a fi comparate (probe

de tesut bolnav / tesut sanatos; celule tratate /

celule netratate) marcate cu doi fluorofori

diferiti

Markeri fluorescenti : Cy3, cu lungime de undade emisie 570 nm (corespunzator spectrului

cu lumina verde), si Cy5 cu lungime de unda

de emisie 670 nm (corespunzator spectrului

cu lumina rosie)

Cele doua tipuri de probe sunt amestecate sihibridizate pe acelasi cip microarray care va fi

scanat pentru a analiza intensitatea

semnalului fluorescent a celor doi fluorocromi

Intensitatile relative ale semnalului fluorescenta celor doi markeri pot fi analizate ca raport in

vederea identificarii genelor cu expresie

stimulata sau inhibata - up-regulated or down-

regulated

1. Fabricarea cip-ului microarray (cele 2 metode)

2. Purificarea si revers-transcrierea. Trebuie realizata

intr-un timp cat mai scurt (ARN-ul are stabilitate

redusa, fiind tinta degradarii enzimatice). De pe

ARNm extras este sintetizat fie ADNc, fie ARNc.

De asemenea, ARNc poate fi obtinut si din ADNc

dublu catenar.

3. Marcarea fluorescenta a probelor. Se realizeaza

prin incorporarea unor nucleotide analoage

conjugate cu un fluorocrom, in timpul procesului

de revers-transcriptie.

4. Hibridizarea pe lama. Etapa in care sondele

imobilizate pe suprafata lamelor vor forma hetero-

duplicati cu ARN/ADNc marcat fluorescent.

Hibridizarea: 12-24 h, 45-65 grade C. Apoi lamele

sunt spalate.

5. Achizitia de imagini (scanarea) si cuantificarea

expresiei genice

6. Crearea unei baze de date, filtrarea si normalizarea

7. Bioinformatica: analize statistice, analiza legaturilor

dintre date, data mining (Pattern-uri similare a

expresiei genice in diferite experimente

Etapele unui experiment microarray

Procesul de productie microarray

POST PROCESARE

Construirea chip-ului:

Cantitati masive de

produsi PCR (cADN)

sau OLIGO

PURIFICARE si

PREPARARE

PREPARARE SLIDE-URI PRINTARE

Preparare ARN:

CELULE/TESUT

IZOLARE ARN

OBTINEREA cADN

HIBRIDIZAREA

MARCAREA

PROBELOR

ANALIZA DATELOR

Microarray cu mii de oligonucleotide "printate" pe

o lama de sticla, nylon, plastic, etc.

Tipuri de suporturi microarrayPentru fabricarea suporturilor microarray sunt folosite mai multe metode:

- "depozitarea": probele (oligo, cDNA) sunt inainte sintetizate, apoi depozitate (spotted)

pe suprafata unui suport de sticla

- "printarea": secventele ce reprezinta o anumita gena sunt sintetizate direct pe

suprafata sticlei , oligonucleotida cu oligonucleotida

- fotolitografia pe substrat de siliciu, unde sunt adaugate nucleotidele una cate una

- electrochimic, pe anumiti microelectrozi

Miniaturizate: densitate foarte mare (1.300.000 oligonucleotide/cm2)

Spotted glass slide

microarrays

Avantaje

Pret scazut per array

Selectarea specifica a genelor (custom)

Orice specie poate fi analizata

Hibridizare competitiva

Sistem deschis al arhitecturii aparatului

Dezavantaje

Management-ul clonelor (numeroase)

Controlul calitatii

-Datele obtinute pot fi variabile

-Uneori se pot desprinde nucleotide,

daca nu sunt bine aderate

Avantaje

Productia de linie

Un numar mare de gene

Numeroase specii

Dezavantaje

Costul sistemului de analiza

Costul chip-ului

Limitarea particularizarii/ajustarii

Affymetrix GeneChip system

(printing microarray)

Construirea chip-ului microarray

Arrayed Library

(96 or 384-well plates of

bacterial glycerol stocks)

PCR amplification

Directly from colonies with

SP6-T7 primers in 96-well

plates

Consolidate into

384-well plates

Spot as microarray

on glass slides

LABEL

3XSSC

HYB CHAMBER

ARRAY

SLIDE

LIFTERSLIP

SLIDE LABEL

Umiditate

Temperatura

Formamida (scade temperatura de melting)

Camera de hibridizare

cDNA microarrayscDNA ACy5 labeled

cDNA BCy3 labeled

Hybridization Scanning

Laser 1 Laser 2

+

Analysis Image Capture

Analiza imaginilor obtinute

Normal vs. Normal Normal vs. Tumor

Analiza: Scatter plots, significance analysis, clustering, pathway analysis

Stabilirea intensitatii fluorescentei in probe experimentale vs. normal;

De ce am analiza atat de multe gene?

Deoarece simpla secventirere a unui genom nu este de ajuns. Exista mii de gene cunoscute, dar despre care nu stim absolut nimic, carora nu li s-a asociat o anumita functie in celula.

De asemenea, deseori un cluster de gene poate detine mai multa informatie in ce priveste functionalitatea celulei, per total, decat analiza unei singure gene in particular

Analiza datelor microarray

Bioinformatica- Este un domeniu in sine de analiza

- Trebuie realizata de catre oameni specializati

- Presupune o cunoastere aprofundata a genelor, a cailor biochimice, a notarii

genelor, cailor de semnalizare, a traficului intracelular, etc

- Se folosesc software-uri speciale, precum Spotfire, Genesifter, Genespring

Identificarea de noi gene implicate in progresia bolilor si in raspunsul la tratament

Identifiarea efectelor secundare si a profilului de reactie la diferite medicamente

Extragerea de informatii prognostice (ex. Clasificarea tumorilor in functie de sute de parametri, comparativ cu doar 2 sau 3 parametri in prezent)

Identificarea de noi tinte terapeutice si accelerarea descoperirii si testarii de noi medicamente

Genotipare

Atribuirea de functii anumitor gene (pt. 90% din genele noastre nu le-a fost atribuita nici o functie)

Stratificarea pacientilor (farmacogenomica)

Identificare microbiana

Medicina personalizata

Medicina de precizie (discurs Barak Obama 2015)

Aplicatii ale Microarray

Secventierea ADN este o aplicatie ce utilizeaza un

cumul de metode si tehnologii de biologie moleculara

cu scopul de a determina succesiunea de nucleotide

intr-o secventa ADN.

Secventierea ADN

Secventierea Maxam-Gilbert

19761977 Walter Gilbert si Allan Maxam au dezvoltat

secventierea prin degradare chimica

Secventierea Sanger

1975 Frederick Sanger si Alan Coulson propun secventiereaenzimatica

Secventierea Maxam-Gilbert19761977 Allan Maxam si Walter Gilbert au dezvoltat secventiereaprin degradare chimica ce implica:

- marcarea radioactiva a ADN monocatenar

- 32P

- modificarea chimica a bazelor azotate

- dimetil sulfat G

- dimetil sulfat in acid formic A+G

- hidrazina C+T

- hidrazina in 2mM NaCl C

- clivajul chimic specific al bazelor azotate

- piperidina

- electroforeza in gel de poliacrilamida

- autoradiografie

Cathode (-)

Anode (+)

Secventierea Sanger - sinteza enzimatica

1975 Frederick Sanger si Alan Coulson

Etape de lucru:

1. Amplificarea secventei ADN pentru care dorim sa aflam succesiunea de nucleotide

1. Purificarea ampliconilor

2. Reactia PCR de secventiere

3. Purificarea fragmentelor ADN obtinute

4. Electroforeza capilara a fragmentelor ADN

5. Interpretarea electroforegramelor

Secventierea Sanger (dideoxy, dye-terminator)

Reactia PCR de secventiere prezinta urmatoarele componente:

ADN tinta regiune pentru care vrem sa cunoastem seventa de nucleotide

1 singur primer

enzima de polimerizare - ADN polimeraza

dNTP deoxinucleotide

ddNTP marcate radioactiv/fluorescent - dideoxinucleotide-actioneaza ca terminatori de catena

tampon de reactie si cationi

ddNTP:

- NU prezinta gruparea OH in pozitia 3 a pentozei si de aceea nu se mai poate atasa un alt nucleotid

Sistem automat de umplere cu polimer

Recipient cu polimer

Anod

Fereastra de detectie Dispozitiv incarcare probe, catod

Cuptor

Sistem de capilare

3130 Genetic Analzyer (Applied Biosystems)

Pirosecventierea

Este o tehnica de secventiere propusa in anul 2000

Nu include reactia PCR ciclica si nu necesita electroforeza

Componentele reactiei:

ADN tinta

1 Primer

Tampon de reactie

4 Enzime

Enzime:

ADN polimeraza catalizeaza incorporarea nucleotidelor

ATP sulfurilaza converteste pirofosfatul in ATP in prezenta APS (adenozin 5 fosfosulfat)

Luciferaza oxideaza luciferina in prezenta ATP si genereaza lumina

Apiraza degradeaza nucleotidele neincorporate si excesul de ATP

https://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFe0aA

Cromatograma = electroforegrama

Interpretarea secventelor ADN

- bioinformatica -

NCBI - National Center for Biotechnology Information include:

baze de date:

Nucleotide

Gene

Proteine

motoare de cautare BLAST

UCSC (University of California Santa Cruz) motor de cautare

BioEdit

Secventiere de noua generatie (NGS)next-generation sequencing

VA MULTUMESC PENTRU ATENTIE!