CROMATOGRAFIA
Cromatografia este o metodă de realizare a
separărilor analitice.
Toate metodele cromatografice implică:
� fază staŃionară;
� o fază mobilă.
Componentele unui amestec sunt trecute peste faza
staŃionară cu ajutorul fluxului fazei mobile.
Separările se bazează pe diferenŃele dintre vitezele
de migrare ale componentelor probei.
Componentele ce urmează a fi separate trebuie să
fie solubile în faza mobilă, astfel incat în timpul separării
ele sunt distribuite între cele două faze.
Cromatografia pe coloană
• Faza staŃionară este depusă într-un tub îngust
de sticlă sau metal.
• Faza mobilă care poate fi lichid sau gaz, este
forŃată să treacă prin solid cu ajutorul presiunii
sau este lăsată să treacă (să se infiltreze)
datorită forŃei gravitaŃionale.
Cromatografia plană
• Faza staŃionară este depusă pe o placă de
sticlă sau plastic.
• Faza mobilă se deplasează prin solid, fie prin
acŃiune capilară, fie sub acŃiunea gravitaŃiei.
Clasificarea separărilor cromatografice
Denumire Tipulfazei
mobile
Tipulfazei staŃio nare
Metoda de fixare a fazeistaŃionare
Gaz-lichid Gaz Lichid Adsorbită într-un solid porosfixat într-un tub, sau adsorbită pe suprafaŃa internă a unui tub
capilar.Gaz-solid Gaz Solid Fixată într-o coloană tubulară
Lichidăsau de
repartiŃie
Lichid Lichid Adsorbită într-un solid porosfixat într-o coloană tubulară
AdsorbŃie Lichid Solid Fixată într-o coloană tubularăHârtie Lichid Lichid Fixată în porii unei hârtii
groaseStart
subŃireLichid Lichid
sausolid
Solid fin divizat depus pe o placă de sticlă; lichidul poate fi
adsorbit pe particuleGel Lichid Lichid Fixat în interstiŃiile unui solid
polimericSchimb
ionicLichid Solid Răşină schimbătoare de ioni
fin divizată fixată într-o coloană tubulară
Toate separările cromatografice se bazează pe
diferenŃele de repartiŃie ale soluŃilor între faza mobilă şi
faza staŃionară.
Echilibrul implicat poate fi descris cantitativ cu
ajutorul coeficientului de repartiŃie K, care pentru
cromatografie este definit astfel:
Unde:
K =C S
C M
CS este concentraŃia analitică a solutului în faza
staŃionară;
CM este concentraŃia sa în faza mobilă.
La concentraŃiile scăzute folosite în cromatografie,
K va fi aproximativ constant astfel încât va exista o
relaŃie liniară între CS şi CM.
Cromatografia realizată în aceste condiŃii se
numeşte cromatografie liniara.
În cromatografia de eluŃie, se introduce o singură
porŃiune a probei dizolvate în faza mobilă pe la capătul
coloanei în care componentele probei se vor distribui
între cele două faze.
Intoducerea unei faze mobile adiŃonale (eluentul)
forŃează solventul conŃinând o parte a probei în josul
coloanei, unde apare o repartiŃie suplimentară între faza
mobilă şi zonele "proaspete" ale fazei staŃionare.
Prin adăugarea unor noi porŃiuni de solvent se va
realiza trecerea moleculelor solutului în josul coloanei
printr-o serie continuă de tranziŃii între faza mobilă şi
faza staŃionară. Deoarece deplasarea solutului poate
avea loc doar în faza mobilă, viteza medie de migrare a
solutului depinde de fracŃia de timp pe care o petrece în
acea fază.
Viteza de deplasare a unui component, reprezintă o
fracŃiune din viteza de migrare a solventului.
Viteza frontală de migrare, caracterizată de factorul
Rf, se defineşte prin raportul:
Rf = viteza frontului adsorbit< 1 viteza fazei mobile
f f
f
A + B
C o l o a n ă c u u m p l u t u r ă
D e t e c t o r
P r o b ă
A
B
S o l v e n t
A
B
A
B A
Reprezentare
schematică a eluŃiei
separării
cromatografice a
componentelor A şi
B ale unui amestec.
S e m n a lB A
T i m p s a u V o l u m
Separarea a doi componenŃi A şi B ai unei probe,
este cu atât mai bună cu cât raportul valorilor R A
este mai diferit de unitate.
/R B
În cazul în care ambele valori RfA şi R B sunt
apropiate de unitate, nu se pot realiza separări eficace,
deoarece compuşii vor migra într-un interval de timp
doar cu puŃin mai lung decât cel necesar deplasării fazei
mobile de-a lungul coloanei.
Procesul descris anterior în decursul căruia solutul
este "spălat" prin coloană prin adăugarea de solvent
proaspăt se numeşte eluŃie.
C
C C
C C C
Izotermele de repartiŃie sunt curbele ce redau
concentraŃia componentului cromatografic în faza
staŃionară (CSA) în funcŃie de concentraŃia aceluiaşi
Acomponent în faza mobilă (CM
temperatură.
). Ele sunt dependente de
Deoarece în cromatografia uzuală, afinitatea
componenŃilor faŃă de faza staŃionară este
determinată de adsorbŃie, aceste tipuri de curbe se
numesc izoterme
de adsorbŃie.
A S
A S
t1 t1
t2
t1 < t2
A S
t2t2
t1
A A A
a M b M c M
Izoterme de repartiŃie
Deoarece procesul de adsorbŃie este exoterm,
creşterea temperaturii defavorizează fixarea
componentului, şi în consecinŃă izotermele vor avea
pante mai accentuate la temperaturi mai joase.
Fixarea componentului cromatografic este
reversibilă; prin urmare, la o valoare CMA =0 va
corespunde CSA =0, adică toate izotermele trec prin
origine.
O cromatogramă furnizează doar o singură
informaŃie calitativă despre fiecare specie din probă, şi
anume timpul său de retenŃie sau poziŃia sa în faza
staŃionară după o anumită perioadă de eluŃie.
Numărul datelor obŃinute pentru o specie chimică
prin cromatografie este mic în comparaŃie cu cele
furnizate dintr-o singură analiză de IR, RMN sau
spectroscopie de masă.
CROMATOGRAFIA PLANĂ
Există două tipuri de cromatografie plană:
cromatografia pe hârtie
cromatografia pe strat subŃire
În cromatografia pe hârtie, se foloseşte drept mediu
o foaie sau o bucată de hârtie de filtru groasă.
În cromatografia pe strat subŃire, separarea are loc
într-un strat de solid fin divizat care a fost fixat pe o
suprafaŃă suport plană.
Atât cromatografia pe hârtie cât şi cea în strat
subŃire oferă mijloace deosebit de simple şi ieftine
pentru separarea şi identificarea componentelor unor
mici probe complexe de substanŃe anorganice, organice
sau biochimice.
CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBłIRE
Prezintă unele avantaje faŃă de cromatografia pe
hârtie, deoarece se pot realiza separări mai nete şi mai
rapide, are o sensibilitate mai ridicată şi se poate adapta
şi la separarea unor amestecuri având concentraŃii mai
mari. Separările pe strat subtire sunt influenŃate de
procesele de adsorbŃie, repartiŃie, excludere (difuzie) şi
schimb ionic.
Stratul este o fază staŃionară subŃire depusă pe o
placă de sticlă, de plastic sau de metal.
Faza staŃionară
Solidele adsorbante (şi uneori absorbante) utilizate
pentru cromatografia pe strat subŃire sunt similare din
punct de vedere al compoziŃiei chimice şi a dimensiunii
particulelor cu cele folosite la realizarea diferitelor faze
staŃionare în cromatografia pe coloană.
Stratul subŃire este realizat dintr-un suport activ şi
un liant, ce conferă printre altele rezistenŃă stratului.
SubstanŃa cel mai des utilizată drept suport este
silicagelul. Acesta este frecvent folosit ca suport pentru
apă sau alŃi solvenŃi polari în separările lichid-lichid.
Un alt suport des utilizat este alumina.
Drept suporŃi, mai pot fi folosiŃi celuloza, diatomita
şi diverşi polimeri organici.
Două tipuri de dispozitive pentru cromatografia pe
strat subŃire:
C
Flux
S
B
S
C
D Flux
a. flux ascendent;b. flux descendent;
S: poziŃia iniŃialăa probei (start);
D: developator;C: suprafaŃa
cromatografică; B: împletitură de
a. b.
bumbac.
ALEGEREA SOLVENTILOR
CondiŃia generală impusă solvenŃilor cromatografici
este anhidritatea perfectă.
Aşezarea solvenŃilor uzuali în ordinea puterii de
eluare se numeşte serie eluotropică.
Seria eluotropică, după Trappe
1. eter de petrol 8. cloroform
2. hexan 9. eter etilic
3. ciclohexan 10. acetat de etil
4. tetraclorură de carbon
11. acetonă
5. toluen 12. alcool etilic
6. benzen 13. alcool metilic
7. clorură de metilen
14. apă
Valorile Rf depind de polaritatea fazei mobile,
crescând odată cu aceasta.
SolvenŃi utilizaŃi frecvent în cromatografia pe strat
subŃire
SolvenŃi Tipuri de amestecuri
hexan hidrocarburi,
compuşi carbonilici
hexan + eter etilic Alcooli
cloroform (85%) + metanol (14%)
+ amoniac (1%)
solvent universal
cloroform (70%) + metanol (25%)
+ amoniac (5%)
compuşi cu caracter
acid
cloroform (50%) + benzen (50%)
- saturat în NH3
compuşi cu caracter
bazic
Se depune o picătură de probă pe o placă
cromatografică, după care, peste spotul format se
pipetează puŃin eluent.
a. b. c.
Test preliminar pentru alegerea solventului optim în cromatografia pe strat
subŃire
Eluentul cel mai indicat va forma mai multe zone
inelare, separate şi suficient de apropiate de centru (a),
în timp ce un solvent ce conduce la o zonă punctiformă
nu are o putere de eluŃie suficientă (b), iar unul ce
formează un inel mare cu componenŃii plasaŃi spre
periferie arată o putere de eluare prea mare (c).
ANALIZA CANTITATIVA
Cantitatea unui component este caracterizată de
suprafaŃa şi intensitatea spoturilor.
O estimare semicantitativă a cantităŃii unui
component prezent, poate fi obŃinută prin compararea
ariei spotului cu cea a unui standard.
După vizualizarea spotului, se calculează imediat
valorile Rf, datorită posibilităŃii de apariŃie a fenomenului
de atenuare, mai ales în cazul relevării (vizualizării)
chimice. Zona este încercuită cu un creion (sau se
zgârie stratul subŃire), se măsoară distanŃele parcurse
de zone şi frontul de solvent, iar valoarea Rf se
calculează astfel:
Rf = hs hf
hf Frontul de solvent
hS
Linia de start
hS - DistanŃa parcursă de solut.
hf - DistanŃa parcursă de solvent.
Evaluarea valorilor Rf poate fi utilizată şi în scopuri
calitative prin compararea cu valorile Rf ale unor
compuşi cunoscuŃi.
CROMATOGRAFIA PE HÂRTIE
Cromatografia pe hârtie este, în mod deosebit, o
cromatografie de repartiŃie. Această metodă poate fi
descrisă într-o manieră simplificată ca fiind trecerea
unei faze mobile lichide prin structura poroasă a hârtiei,
care conŃine faza staŃionară. Developarea se termină
înainte ca faza mobilă să atingă marginea superioară a
hârtiei, astfel încât zonele sunt distribuite de-a
curmezişul hârtiei.
FaŃă de cromatografia pe strat subŃire, această
metodă are o serie de dezavantaje, cum ar fi: timpii de
developare mai lungi, delimitarea destul de slabă a
zonelor, exactitatea destul de slabă în analizele
cantitative, iar uneori dificultatea de reproducere a
condiŃiilor de developare.
FAZA STAłIONARĂ
În general, hârtia este compusă din fibre de
celuloză direcŃionate în mod dezordonat.
Se folosesc de obicei hârtii speciale de înaltă
puritate şi reproductibile din punct de vedere al
porozităŃii şi grosimii. Astfel de hârtii conŃin suficient de
multă apă, astfel încât să putem considera
cromatografia pe hârtie ca fiind de tip lichid-lichid.
Tipuri de faze staŃionare folosite în cromatografia
pe hârtie
Faza
staŃionară
SolvenŃi utilizaŃi
Apoasă apa; soluŃii tamponate +atmosferă saturată cu apă
Hidrofilă alcool metilic; formamida;glicolii; glicerolul
Hidrofobă dimetilformamida; hidrocarburi aromatice şi alifatice; kerosen;solvenŃi oxigenaŃi
FAZA MOBILĂ
Există o largă varietate de combinaŃii de faze
staŃionare şi mobile, nefiind neapărat necesar ca cele
două sisteme să fie nemiscibile. Faza mobilă utilizată
este formată de obicei din diferite combinaŃii de solvenŃi,
soluŃii de săruri şi soluŃii tampon
Alegerea optimă a condiŃiilor de eluŃie se face în
urma unor testări preliminare.
Tipuri de faze mobile utilizate în cromatografia pe
hârtie
Faza mobilă Tipuri de amestecuri separate
Apă - fenol SubstanŃe hidrofile
Izopropanol - amoniac - apă (9:1:2)
SubstanŃe hidrofile
n-Butanol - acid acetic - apă (4:1:5)
SubstanŃe hidrofile
Formamidă - benzen SubstanŃe intermediarhidrofile
Formamidă - benzen - ciclohexan
SubstanŃe intermediar hidrofile
Formamidă - cloroform SubstanŃe intermediar hidrofile
Formamidă - cloroform- benzen
SubstanŃe intermediar hidrofile
Dimetilformamidă –ciclohexan
SubstanŃe hidrofobe
Kerosen - izopropanol SubstanŃe hidrofobe
PROCEDEE CARACTERISTICE
CROMATOGRAFIEI PLANE
După obŃinerea hârtiei sau a stratului dorit,
procedeele experimentale pot fi împărŃite în cinci etape
de bază, şi anume:
• tratamentul pregătitor;
• aplicarea probei;
• developarea;
• vizualizarea;
• interpretarea datelor.
TRATAMENTUL PREGATITOR
Se realizează în funcŃie de tipul cromatografiei (de
repartiŃie sau de adsorbŃie) şi aplicarea finală.
AdsorbanŃii au poziŃii adsorbante cu activităŃi
diferite şi reŃin, mai puternic, apa. Pentru ca adsorbŃia să
fie folosită la capacitatea sa maximă, adsorbantul
trebuie să fie într-un anumit grad de uscare (să fie
activat).
AdsorbanŃii nu trebuie să fie supuşi la o temperatură
de uscare prea înaltă sau un timp de uscare prea
îndelungat, deoarece pot avea loc transformări chimice,
care vor conduce la un comportament adsorbant
modificat.
APLICAREA PROBEI
Înainte de aplicarea probei, pe hârtie sau pe placă se
trasează linia de start, care reprezintă locul unde va fi
aplicată proba, şi care trebuie să fie suficient de departe
de marginea hârtiei sau plăcii, astfel încât să nu fie
scufundată în sistemul de solvent utilizat pentru
developare.
Instrumentele cele mai utilizate la aplicarea probelor
sunt pipetele (micropipete), capilarele de precizie şi
microseringile.
DEVELOPAREA
În vederea realizării unei separări corespunzătoare,
este necesar ca procesul cromatografic să aibă loc într-
o cameră de developare saturată în fază mobilă.
De remarcat că asigurarea unei developări
corespunzătoare presupune o bună etanşare la aer a
camerelor de developare.
Developarea ascendentă presupune urcarea fazei
mobile din rezervor pe hârtie sau pe stratul subŃire, în
timp ce developarea descendentă are loc atunci când
faza mobilă coboară din rezervor. Datorită rezistenŃei
mecanice convenabile este preferată developarea
ascendentă în cazul cromatografiei pe strat subŃire, spre
deosebire de cromatografia pe hârtie când se preferă
developrarea descendentă ca urmare a unei rezistenŃe
mecanice slabe.
Flu x
S up or t
H
P
S
Sup or t
H
S
Flux
Camere de developare folosite în cromatografia pe hârtie.
a. Developare ascendentă.
b. Developaredescendentă.
H - hârtie de filtru; P - probă;
a . b .
S - solvent de
developare;
Flux - curgerea solventului.
RELEVAREA
După terminarea developării, se procedează la
relevarea (vizualizarea) spoturilor.
Detectarea se poate face direct dacă compuşii sunt
coloraŃi sau fluorescenŃi.
O altă metodă des utilizată este aceea a pulverizării
unei soluŃii care să conducă la formarea unor compuşi
coloraŃi cu speciile prezente pe hârtie sau placă.
După vizualizarea spotului se calculează valoarea Rf.
Aceste valori Rf se pot utiliza în scopuri calitative, prin
compararea cu valorile Rf ale unor compuşi cunoscuŃi.
Cromatografia plană are numeroase aplicaŃii în
monitorizarea calităŃii mediului,biochimie, farmacie,
biologie.
CROMATOGRAFIA DE GAZE
Cromatografia de gaze este o variantă
cromatografică folosită pentru separarea amestecurilor
de gaze sau lichide volatile, bazată pe repartiŃia diferită a
componenŃilor amestecului de analizat între două faze: o
fază staŃionară solidă (cromatografia de adsorbŃie) sau
lichidă depusă pe un suport solid inert (cromatografia
de repartiŃie) şi o fază mobilă gazoasă (gazul purtător).
Ca urmare a repartiŃiei diferite a componenŃilor din
amestec între cele două faze şi a fenomenelor de
transfer de masă prin difuzie ce au loc în coloana
cromatografică, se realizează o deplasare cu viteze
diferite a acestora prin coloană, componenŃii părăsind
coloana eşalonat în timp.
Aceştia ajung apoi într-un sistem de detecŃie, dând
naştere unui semnal electric proporŃional cu
concentraŃia (masa) lor, care, ulterior este amplificat şi
înregistrat sub forma unei cromatograme.
Pentru un component "i" prezent în amestec,
constanta de distribuŃie între cele două faze este dată de
relaŃia:
K i =concentratie component in faza
satationara
concentratie component in faza mobila
Cu cât componenŃii amestecului de analizat au
constante de distribuŃie mai diferite, cu atât separarea
cromatografică realizată este mai bună. Valorile acestor
constante de distribuŃie depind de natura componenŃilor
de separat, de ansamblul faza staŃionară - fază mobilă
ales şi de temperatura din coloană.
5 7 8
3 D < <2
4
1 6
Schema bloc a unei instalaŃii gaz cromatografice
• rezervorul cu gaz purtator care joacă rol de faza mobilă (1);
• dispozitivul de măsurare şi reglare a presiunii
gazului purtător (2);
• dispozitiv de injectare a probei în coloană (3);
• coloana cromatografică (4);
• detector (5);
• termostat (6);
• amplificator (7);
• înregistrator (8).
Faza mobilă, care este de obicei un gaz inert (heliu
sau azot) trece continuu prin sistemul cromatografic
transportând proba aflată în stare de vapori. În coloană,
separarea are loc datorită adsorbŃiei sau respectiv,
repartiŃiei componenŃilor probei pe faza stationară solidă
sau lichidă.
După separare, fiecare component este detectat pe
masură ce părăseşte coloana cromatografică şi este
înregistrat sub forma unui pic cromatografic.
Gazul purtator utilizat drept fază mobilă trebuie să
fie un gaz inert, care să nu interacŃioneze cu proba, şi
care să permită o funcŃionare adecvata a detectorului
utilizat.
Presiunea şi debitul acestuia în coloană sunt
controlate cu ajutorul unui reductor de presiune şi a
unui debitmetru.
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE PE COLOANĂ
Cromatografia de lichide pe coloană este o variantă
cromatografică în care componenŃii amestecului de
analizat se separă datorită migrării lor diferenŃiale de-a
lungul unei coloane umplută cu o fază staŃionară solidă
sau lichidă pe suport inert sub influenŃa unei faze mobile
lichide.
Separarea are loc pe baza unui proces de adsorbŃie
(cromatografia solid - lichid, CLS) sau repartiŃie
(cromatografia lichid - lichid, CLL) al componenŃilor între
cele două faze, proces ce se produce în mod repetat
până la părăsirea coloanei cromatografice.
În funcŃie de modul de lucru există mai multe
tehnici de lucru care se deosebesc între ele prin modul
de realizare a separării cromatografice, şi anume:
(1) Cromatografia prin eluŃie
(2) Cromatografia frontală
(3) Cromatografia prin deplasare
Dintre aceste procedee, cel mai utilizat este primul.
În cromatografia prin eluŃie, proba se introduce cu
ajutorul unei micropipete sau al unei microseringi în
cantitate mică la capătul coloanei, după care se adaugă
lichidul ce funcŃioneaza drept fază mobilă, numit eluent.
ComponenŃii probei sunt antrenaŃi de faza mobilă de-a
lungul coloanei, realizându-se astfel separarea lor,
datorită constantelor de repartiŃie/adsorbŃie K =
[Ci]S/[Ci]M diferite.
La baza coloanei, componenŃii sunt colectaŃi sub
forma unor fracŃiuni şi analizaŃi, metoda permiŃând atât
determinarea calitativâ cât şi cantitativă a componenŃilor
dintr-un amestec.
R1 R2
3
P1
2
4
ab
5 7
D I C
6
8
CF
Schema bloc a unui cromatograf de lichide sub presiune
1 - rezervoare de solvenŃi (faze mobile);
2 - dispozitiv de pompare şi producere a gradientului de
faza mobilă;
3 - injector;
4 - coloana analitică (a) şi coloana de referinŃă (b);
5 - detector;
6 - înregistrator;
7 - calculator;
8 - colector de fracŃiuni.
În cromatografia de lichide sub presiune, coloanele
trebuie să reziste la presiuni ridicate, ceea ce impune
etanşeizari la capete.
Aceste coloane cromatografice sunt umplute cu
faze staŃionare solide sau lichide depuse pe suport solid
inert.
În cromatografia de adsorbŃie, ca faza staŃionară
solidă se folosesc diferite materiale pulverulente, dintre
care cele mai utilizate sunt alumina şi silicagelul.
Într-o măsură mai mică se folosesc, de asemenea,
silicatul de magneziu, pământul diatomitic, pulberea de
zahăr, precum şi o serie de adsorbenŃi modificaŃi.
În cromatografia de repartiŃie, ca suport se
foloseşte frecvent celuloza, silicagelul, pământul
diatomitic.
CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB IONIC
Cromatografia de schimb ionic este o metodă de
separare bazată pe echilibre de schimb ionic între o fază
staŃionară schimbătoare de ioni şi o fază mobilă lichidă
ce conŃine substanŃe ionizabile supuse procesului de
analiză.
ReacŃia de schimb ionic ce are loc în cazul unei
astfel de separări este o reacŃie reversibilă şi pe această
proprietate de reversibilitate se bazează posibilitatea de
regenerare a fazei staŃionare schimbătoare de ioni.
O astfel de reacŃie poate fi reprezentată prin
ecuaŃia:
R X +
Ys c him b
ionic
regenerare
R Y +
X
unde X şi Y sunt specii ionice cu aceeaşi sarcină
electrică.
Schimbătorii de ioni utilizaŃi drept faze staŃionare
sunt materiale insolubile în cei mai mulŃi solvenŃi având
grefate grupe funcŃionale ionizabile a căror sarcină
electrostatică este neutralizată de ioni mobili
(contraioni) ce pot fi înlocuiŃi cu ioni de aceeaşi sarcină,
prezenŃi în soluŃia de analizat.
Dintre acestea, cel mai des utilizate sunt răşinile
sintetice schimbătoare de ioni, datorită proprietăŃilor lor
mecanice bune, a stabilităŃii lor chimice şi a uniformităŃii
lor granulometrice. Ele sunt constituite dintr-o reŃea
polimerică tridimensională (obŃinută printr-o reacŃie de
copolimerizare sau policondensare) pe care sunt grefate
grupările ionizabile ce le conferă proprietăŃi de
schimbători de ioni.
După semnul sarcinii purtată de gruparea
funcŃională ionizabilă fixată pe reŃeaua
macromoleculară, se disting două categorii de răşini
schimbătoare de ioni:
• răşini schimbătoare de cationi (cationiŃi) având
grefate grupări sulfonice - SO3-, carboxilice - COO-,
aminodiacetice - N(CH2COO-)2, fosforice - PO32-,
etc.