Utilizarea Tehnicilor de Biologie Moleculara Pentru Identificarea Organismelor Modificate Genetic
-
Upload
florinaandreea -
Category
Documents
-
view
80 -
download
10
description
Transcript of Utilizarea Tehnicilor de Biologie Moleculara Pentru Identificarea Organismelor Modificate Genetic
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ „ION IONESCU DE LA BRAD” DIN IAŞI
Utilizarea tehnicilor de biologie moleculară pentru identificarea organismelor
modificate genetic
Cuprins
Introducere.................................................................................................. Pag.3
1.Obṭinerea OMG-urilor............................................................................. Pag.5
2.Tehnici de identificare a OMG urilor...................................................... Pag.8
I.Tehnica PCR............................................................................... Pag.9
II.Tehnica microarray................................................................... Pag.10
III.Metoda cromatografică............................................................. Pag.10
IV.Spectroscopia infraroşie apropiată (SIA)............................ Pag.10
V. Metoda ELISA............................................................................. Pag.11
VI. Metoda LAMP............................................................................. Pag.14
3. Potenţialele riscuri pentru sănătatea umană şi pentru mediul
înconjurător............................................................................................. Pag.15
Concluzii.................................................................................................... Pag.16
Bibliografie
2
Introducere
În decursul ultimelor decenii, biotehnologia a cunoscut progrese importante datorită
descoperirilor ce ţin de mecanismul funcţionării acizilor nucleici (ADN-ului şi ARN-ului) şi
investigaţiilor desfăşurate apoi în domeniul geneticii moleculare. Relevarea particularităţilor
materialului genetic la animale, plante şi microorganisme, precum şi posibilitatea de
modificare a unităţilor lor componente au lărgit considerabil domeniile aplicării
biotehnologiei, generând însă în societate o profundă nelinişte faţă de gradul de securitate şi
caracterul etic al unor asemenea cercetări.
Biotehnologia modernă include aplicarea tehnicilor de recombinare a acizilor nucleici şi
a tehnicilor de fuziune celulară invitro, înlăturând barierele naturale de reproducere sau
recombinare genetică. Astfel, prin metode de inginerie genetică, metode care reprezintă un
sistem de tehnici contemporane de manipulare a genomului, a fost posibilă inserarea unui
spectru larg de gene „de interes"(transgene) în mai mult de 120 de specii de plante care
aparţin la 35 de familii.
O importanţă practică deosebită o au numeroasele varietăţi de plante modificate genetic
(PMG), rezistente la diferite erbicide, insecte dăunătoare, boli, patogeni fungali, bacteriali şi
virali. Un rol aparte va reveni în viitorul apropiat plantelor modificate genetic, ce conţin gene
ale rezistenţei la stresul abiotic, inclusiv la secetă şi la salinitatea solurilor, care astăzi
cauzează până la 50% din pierderile de producţie agricolă mondială. Biofortificarea
plantelor de cultură prin introducerea genelor implicate în îmbunătăţirea calităţilor nutritive
ale produselor alimentare, precum conţinutul de proteine, vitamine şi minerale este o direcţie
relativ nouă, în continuă dezvoltare.
Produsele alimentare derivate din PMG sunt prezente în magazinele şi marketurile
Uniunii Europene (UE) din anul 1996. Acest fapt a condiţionat apariţia unei serii de directive
şi legi emise de Comunitatea Europeană, menite să supună unui control strict comercializarea
şi cultivarea organismelor modificate genetic (OMG). Conform cerinţelor, produsele
alimentare care conţin cel puţin 0,9 - 1% OMG trebuie supuse analizelor şi etichetării.
Necesitatea monitorizării prezenţei PMG şi cantităţii acestora în culturile agricole şi
3
în produsele alimentare derivate din acestea a impus căutarea metodelor analitice eficiente în
detectarea, identificarea şi cuantificarea alogenelor şi a produselor de expresie, care reprezintă
constituenţii genetici de bază. Laboratoarele UE au elaborat şi dezvoltat metode de testare a
PMG la nivel de ADN prin metoda PCR şi/sau proteine, prin analize imunoenzimatice.
4
1.Obṭinerea OMG-urilor
Transformarea genetică reprezintă modificarea genomului unui organism prin
tehnicile biotehnologiilor contemporane, care permit introducerea genelor noi, „de interes",
sau modificarea expresiei unei/ unor gene prezente deja în celulă. Organismele astfel obţinute,
sunt denumite organisme modificate genetic (OMG) sau transgenice.
Evoluṭia tehnico-experimentală a ingineriei genetice, în special a metodelor de transfer al
genelor peste barierele de sex şi la distanţe taxonomice mari, a permis transgeneza unui număr
impunător de plante cu importanţă economică: cereale, leguminoase, specii pomicole sau
forestiere etc. Obţinerea autorizării unei varietăţi modificate genetic (MG) în conformitate
cu reglementările de rigoare impune respectarea următoarelor cerinţe: stabilitate în expresia şi
moştenirea transgenelor în generaţiile succesive; segregare mendeliană a fenotipului
transgenic, reglarea organ-specifică a expresiei alogenelor şi exploatarea produsului său în
scop agronomic, alimentar, medical, farmaceutic etc. În afara aplicaţiilor practice,
manipulările genetice permit analiza structurii şi funcţiei genelor, oferind posibilităţi de a
cunoaşte şi a interveni în mecanismele de dezvoltare a plantelor.
Alimentele în care se pot regăsi evenimente modificate genetic pot fi:
produse pe bază de porumb: mălai şi griş de porumb, ulei de porumb, chips
de porumb, fulgi de porumb pentru micul dejun,
produse pe bază de soia : ulei de soia, creme-desert pe baza de soia, lapte de
soia, branză de soia,
cartofi şi subproduse de cartofi,
ingrediente:
- faină de porumb utilizată la producerea pâinii, cerealelor pentru micul dejun,
biscuiţi aperitiv;
- grişul de porumb în : biscuiţi aperitiv, pesmet, bere, cereale pentru micul dejun;
- amidonul de porumb: în sosuri, mezeluri, creme pentru deserturi, preparate pentru
deserturi deshidratate, ciorbe, mâncare pentru nou-născuţi, produse de patiserie;
- siropul de glucoză, dextroză, maltodextrinele în : sosuri, biscuiţi, batoane de cereale,
bere, ciorbe, biscuiţi pentru aperitiv, fructe cu zahar încorporate în iaurturi şi diferite
deserturi, îngheţate;
5
- aditivi din soia (lecitina) sau din porumb (amidon oxidat, amidon acetilat, arome).
Pentru o justă apreciere a efectelor pe care alimentele modificate genetic le pot
avea asupra stării de sănătate, este necesară cunoaşterea modului în care sunt obţinute
aceste organisme şi apoi studierea potenţialelor efecte.
Obţinerea organismelor modificate genetic include câteva etape, care pot fi
rezumate astfel:
I. Identificarea, izolarea şi clonarea genelor „de interes".
II. Transferul genelor la plante.
III. Regenerarea, selecţia şi testarea plantelor MG.
Figura 1.1. Etapele transformării genetice
1,2- Identificarea şi izolarea genei „ de interes", obţinerea ADN-ului recombinat (integrarea
transgenei în vector);
3 - Transferul genei himere în celula vegetală prin metode directe sau indirecte;
4 - Selectarea celulelor modificate genetic;
5 - Regenerarea plantelor din celulele transformate genetic;
6 - Reproducerea sexuată/ asexuată a plantelor modificate genetic.
6
Metodele folosite pentru realizarea de organisme modificate genetic sunt prezentate
schematic in figura 2.
Fig. 2.1. Prezentare schematică a metodelor de obţinere a OMG-urilor
7
2. Tehnici de identificare a OMG -urilor
Pentru analiza calitativă şi cantitativă a materialului modificat genetic în
produsele alimentare, au fost elaborate şi implementate numeroase metode analitice.
Concomitent cu metodele clasice, ca PCR şi ELISA, sunt utilizate şi alte procedee de
analiză precum cromatografia şi spectroscopia infraroşie.
Necesitatea de a monitoriza şi verifica prezenţa şi cantitatea materialului modificat
genetic în culturile agricole MG şi în produsele derivate a generat o cerere crescândă de
metode analitice de detecţie, identificare şi cuantificare a secvenţei de nucleotide inserate şi a
produşilor de expresie a transgenei, deoarece anume aceste componente sunt considerate ca
fiind contituienţi de bază.
Unele laboratoare au elaborat metode de analiză bazate pe detecţia ADN-ului utilizând
tehnica de amplificare PCR (Polymerase Chain Reaction) ori pe proteine, apelând la
analizele imunoenzimatice ELISA (enzyme linked immunosorbent assays), care se deosebesc
prin unele avantaje şi dezavantaje în funcţie de scopul cercetării şi de posibilităţile
laboratorului.
Fig.2.1. Detecṭia, identificarea ṣi cuantificarea OMG
Alte laboratoare s-au orientatat spre dezvoltarea unor tehnologii analitice care pot oferi
8
soluţii alternative la metodele de testare a OMG existente. Acestea includ masspectrometria,
cromatografia, tehnologia ADN - chip, Electro.spray.ionisation (ESI), spectroscopia
infraroşie apropiată etc. (fig. 2.1.).
I. Tehnica PCR
Reacṭia PCR permite amplificarea selectivă, într-un număr foarte mare de copii, a unei
secvenṭe ADN prezentă într-o proporṭie relativ redusă în cadrul unui amestec complex
de fragmente ADN. Analiza produṣilor rezultaṭi prin amplificare într-o reacṭie PCR
clasică permite formularea unei concluzii calitative („da" sau „nu") asupra prezenṭei
OMG-urilor în proba testată. În practică, evaluarea ampliconilor se face, în
general,prin separare electroforetică în gel de agaroză, marcare cu EtBr, vizualizare în prezeṭa
luminii UV ṣi compararea cu probe standard.
Pentru obṭinerea informaṭiilor cantitative referitoare la conṭinutul de acizi nucleici,
este utilizată tehnica real-time PCR care reprezintă o variantă mult mai performantă a
reacṭiei PCR clasice.
Principiul real-time PCR
Tehnica real-time PCR utilizează primeri specifici pentru amplificarea secvenṭei ṭintă,
iar în tandem cu aceṣtia constructe oligonucleotidice speciale sau alte tipuri de
molecule incluse în mediul de reacṭie indică acumularea produsului PCR . Astfel, de-a
lungul mai multor cicluri de amplificare constructele oligonucleotidice care sunt
de asemenea specifice secvenṭei ṭintă vor determina modificarea semnificativă a
semnalului fluorescent.
PCR este o tehnica de laborator ce necesita personal instruit si echipament special.
Caracteristici de baza ale analizei prin PCR:
- poate fi foarte sensibilă, capabilă de detecṭia uneia sau mai multor copii ale genelor
sau secvenṭei ṭintă de interes în cadrul unui material genetic al unui organism sau genom.
Trebuie luate toate masurile pentru evitarea contaminării încruciṣate.
- necesită puṭin timp de reacṭie în comparaṭie cu testele imunologice, aproape toṭi
reactivii necesari, sunt disponibili în comerṭ ṣi pot fi uṣor obṭinuṭi.
- impul de analiză a probelor este de aproximativ o zi.
- PCR facilitează diferenṭierea între anumite tipuri de modificări genetice. Metodele de
9
diagnostic pentru identificarea evenimentelor transgenice specifice necesită timp de
dezvoltare adiṭional ṣi eforturi de validare.
II. Tehnica microarray
Tehnica microarray are la baza hibridarea moleculară dintre două fragmente
complementare de ADN. În contextul testării OMG, este utilizată în combinaṭie cu
amplificarea PCR multiplex, corespunzând, practic, etapei post-PCR - analiza produṣilor de
reacṭie. Această tehnică are o mare capacitate de procesare, constituind o strategie
foarte potrivită pentru o problemă majoră cu care se confruntă domeniul testării OMG -
creṣterea numărului de evenimente de transformare.
III. Metoda cromatografică
Metoda cromatografică permite identificarea OMG la nivelul metaboliţilor -
dizaharide (trehaloza, maltoza şi izomaltoza), alcooli (maltitolul) sau al diferenţelor depistate
în profilul chimic, constatate la analiza uleiului provenit din rapiţa modificată genetic.
Combinarea metodelor de cromatografie lichidă şi masspectrometrie au permis evidenţierea
diferenţelor din cadrul paternelor de trigliceride. Rapiditatea, sensibilitatea înaltă şi analiza
cantitativă a diferitor metaboliţi, implicaţi în metabolismul carbonului (glucidele di- şi
trimere), azotului (aminele, aminoacizi, acizi organici), oferă posibilitatea identificării
simultane a diferitor metaboliţi într-o singură probă, fără a impune o separare ulterioară a
acestora.
IV. Spectroscopia infraroşie apropiată (SIA)
Spectroscopia infraroşie apropiată (SIA) are o gamă largă de aplicare în
agricultură, industria farmaceutică, controlul produselor alimentare etc. şi reprezintă o metodă
analitică rapidă, care permite măsurarea compoziţiei chimice a materialelor. Legăturile
covalente dintre atomii de C, N, H, O şi P absorb energia în regiunea infraroşie, în care
posedă frecvenţe oscilatorii specifice, iar combinaţiile formate sunt detectabile la lungimea de
undă de 400 - 2500 nm, adică în regiunea infraroşie. Unele transgene pot modifica structura
fibrelor în plante, diferenţe care nu pot fi evidenţiate după conţinutul de proteine sau ulei, însă
se evidenţiază cu uşurinţă prin SIA.
V. Metoda ELISA
10
ELISA, implica testarea pentru detecṭia proteinelor specifice prin exploatarea
specificităṭii legăturii între antigenul exprimat ṣi anticorpul ṭintă.
Testul de marcare enzimatică (enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) (metoda
ELISA) este unul de alternativă PCR şi permite identificarea proteinelor (enzimelor)
codificate de transgene, cum ar fi, de exemplu, neomicin- fosfotransgeraza (nptII), EPSPS,
proteinele Bt, enzima PAT etc.
Metoda ELISA are ca principiu utilizarea unui marker enzimatic legat de un anticorp,
antigen sau haptenă (substanţă care reacţionează cu anticorpii, dar nu induce sinteza de
anticorpi - adică nu determină un răspuns imun). Prezenţa markerului enzimatic permite
detectarea reacţiei antigen-anticorp. Deci antigenele sau anticorpii sunt cuplaţi covalent cu o
enzimă (în locul radioizotopului sau fluorocromului). Cuplarea markerului enzimatic cu
antigenele sau cu anticorpii se face cu ajutorul unor molecule bifuncţionale care leagă cei doi
compuşi (fig.2.2). Evidenţierea reacţiei antigen-anticorp se realizează prin degradarea unui
substrat specific (marker enzimatic), urmată de o modificare de culoare, măsurată
spectrofotometric. De exemplu, paranitrofenil fosfatul (galben) se utilizează pentru fosfataza
alcalină; 3,3',5,5'-tetrametil-benzidina (galben) sau 3-Amino-9-etilcarbazolul (roşu) - pentru
peroxidaza.
Fig. 2.2 Prezentare schematică a principiului testului ELISA;
A - Anticorpii specifici antigenelor se ataşează de suprafaţa solidă;
B - Adăugarea probei în care se pot conţine sau pot lipsi antigenele;
11
C – Adăugarea enzimelor legate de anticorpi şi conjugarea lor;
D – Adaugarea substratului cromogenic. În prezenţa enzimei se formează produşi de reactie
cu culoare modificata, care poate fi masurata spectofotemetric.
Actualmente, există mai multe tipuri ale acestei metodologii, şi anume proce-
deul „Sandwich" ELISA şi ELISA competitivă.
Metoda „sandwich" ELISA. O varietate a tehnicii imunoenzimatice este procedeul
ELISA cu utilizarea a doi anticorpi („sandwich" ELISA) (fig. 3.2.), fiind unul dintre cel
mai des utilizat în analiza transgenelor. Acest procedeu este rapid şi simplu în efectuare. Dacă
antigena standard purificată este competentă, atunci tehnologia permite şi determinarea
cantitativă a antigenului în proba cercetată. Testul dat necesită doi anticorpi, unul numit
anticorp de captare şi altul de detectare.
Denumirea „sandwich" a acestei variante de ELISA provine de la complexul format
dintre cei doi anticorpi între care se află legată antigena. Produsele formate sunt
cuantificate prin măsurarea cantităţii de anticorpi secundari legaţi de matrice, utilizând
substrate colorimetrice.
Fig. 3.2 Etapele principale ale metodei „sandwich" ELISA
Metoda ELISA competitivă. În cazul în care o pereche de anticorpi nu sunt potriviţi
pentru scopul propus, există o altă varietate a tehnologiei imunoenzimatice şi anume testul
12
ELISA tip competitiv (fig. 4.2.). Pentru utilizarea acestui tip de ELISA, este necesar ca un
reagent să fie conjugat cu enzima de detecţie. Enzima poate fi linkată cu altă imunogenă sau
anticorp primar.
Fig.4.2 Etapele principale ale metodei ELISA competitivă
Principale caracteristici ale analizelor ELISA:
- mai putin sensibila decat PCR, de aceea mai putin susceptibila decat PCR in rezultate
„pozitive false” cauzate de mici nivele de contaminare;
- costuri mari pentru dezvoltarea testelor si generarea de standarde pentru anticorpi si
proteine;
- cost mic pentru proba din momentul elaborarii rectivilor;
- metodele bazate pe proteina necesita timp pentru reactivi si dezvoltarea metodei;
- testarea bazata pe proteina furnizeaza un proces de testare cantitati 656f59g va in cazul
in care este produsa proteina detectabila. Totusi produsele MG pot fi produse numai
urmand anumite etape sau numai in anumite parti ale plantelor si aceste organisme
modificate genetic sunt putin probabil de a fi usor detectate prin ELISA.
- Aditional, procesarea industriala denatureaza usor proteinele, lucru ce face
problematica utilizarea metodelor ELISA pentru alimentele procesate.
13
VI. Metoda LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification)
Noua metodă permite identificarea Organismelor Modificate Genetic (OMG) chiar şi
în concentraţii mai mici, de până la 0,1%. Tehnologia folosită se bazează pe o combinaţie de
tehnici de amplificare bioluminiscentă şi izotermă care poate monitoriza contaminarea
alimentelor cu ingrediente ce conţin OMG-uri.
Metoda se bazeaza pe amplificarea DNA-ului la o temperatură constantă, urmată de
aplicarea noii tehnologii de reportare a biolumiscenţei (BART), pentru determinarea în timp
real a conţinutului de OMG. Această metodă necesită doar un echipament standard pentru
extragerea ADN-ului şi asigurarea unei temperaturi constante pentru detectarea şi
amplificarea ADN-ului. În acest fel, soluţia LAMP-BART poate asigura monitorizarea în
timp real a existenţei culturilor modificate genetic, precum şi a interacţiunii acestora cu plante
sau culturile nemodificate genetic.
3. Potenţialele riscuri pentru sănătatea umană şi pentru mediul
înconjurător prezentate de organismele modificate genetic
14
Pe de o parte, aceste organisme sunt promovate ca fiind sigure şi necesare societăţii
umane, în timp ce opozanţii le consideră neesenţiale şi potenţial cauzatoare de efecte negative
asupra sănătăţii şi mediului. Niciuna dintre aceste opinii nu poate fi însă corectă, din simplu
considerent că OMG-urile nu reprezintă o categorie omogenă, punerea în balanţă
a beneficiilor şi riscurilor trebuind făcută pentru fiecare caz în parte.
Analiza impactului potenţial al introducerii şi utilizării OMG-urilor are în vedere o
serie de factori ca: implicaţiile tehnice pentru practica agricolă, inputurile din
agricultură, fluxul de gene, biodiversitatea, impactul economic, avantajele pentru
sistemul sanitar, riscurile pentru sănătatea consumatorilor şi organismele non-ţintă,
asigurarea securităţii alimentare, implicaţiile de natură etică sau culturală.
Fig 4. Aspecte cu impact pe sănătatea publică date de utilizarea OMG
Concluzii
15
1. OMG-urile reprezintă o realitate a societăṭii moderne, iar utilizarea lor prezintă o
serie de avantaje, dar ṣi potenṭiali factori de risc pentru mediul înconjurător, pentru cel
economico-social ṣi pentru sănătatea consumatorilor.
2. Utilizarea OMG-urilor în obţinerea produselor alimentare, ca în cazul oricărei
alte tehnologii, prezintă o serie de avantaje, dar poate genera şi riscuri pentru mediu şi
sănătate, de aceea trebuie acţionat în sensul identificării şi eliminării riscurilor pentru
îndeplinirea celor două deziderate principale ale Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii
privind alimentaţia: securitatea şi siguranţa.
3. Testarea moleculară reprezintă un instrument esenṭial în contextul implementării
politicilor europene din domeniul OMG.
16
Bibliografie
BADEA E.M., SĂNDULESCU D. Biotehnologii.vegetale, Bucureşti, 2001
DUCA M., KALOSHIAN I. Tehnici de cercetare în biologia moleculară, Chişinău, CE
USM, 2002.
http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/
http://www2.biologie.fu-berlin.de/lampart/gp03/GUS_assay.html.
http://www.brutarul.ro/index.php/ro/altestiri/481-soluie-pentru-identificarea-culturilor-
modificate-genetic.html
17