UNIVERSITATEA DIN ORADEA FACULTATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

CONCEPłII NOI PRIVIND MECANISMUL BIOCHIMIC AL PROCESELOR DE

VASOCONSTRICłIE ŞI VASODILATAłIE

Lucrare pentru obtinerea titlului ştiinŃific de doctor în ştiinŃe medicale

REZUMAT

Conducãtor ştiinŃific: Doctorand: Prof.univ.Dr.IOAN PUŞCAŞ Chim.COLTĂU MARCELA

GEORGETA

- 2009 -

2

CUPRINS

Cuvânt înainte......................................................................................... 4 Lista de abrevieri..................................................................................... 6 INTRODUCERE...................................................................................... 7

Partea I-a STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII

Capitolul 1 - NOłIUNI GENERALE PRIVIND ACłIUNEA MEDICAMENTELOR .................................................

10

1.1 AcŃiunea medicamentelor la nivel molecular ............. 10 1.2 AcŃiunea medicamentelor la nivel celular................... 14 1.3 AcŃiunea medicamentelor asupra diferitelor aparate şi sisteme................................................................................

22

Capitolul 2 - MECANISMUL DE ACłIUNE AL TERAPIEI VASOCONSTRICTOARE .............................................

34

2.1 Vasoconstrictoare folosite ca antihipotensive ............ 34 2.2 Simpatomimeticele folosite ca vasoconstrictoare sistemice.............................................................................

36

2.3 Vasoconstrictoare folosite ca decongestive .............. 38 2.4 Vasoconstrictoare antimigrenoase ............................. 39 2.5 Vasoconstrictoare folosite în hemoragii digestive superioare...........................................................................

41

Capitolul 3 - MECANISMUL DE ACłIUNE AL TERAPIEI ANTIHIPERTENSIVE ŞI VASODILATATOARE ......

42

3.1 NoŃiuni generale ......................................................... 42 3.2 Antihipertensive inhibitoare ale simpaticului ............ 43 3.3 Blocantele terminatiilor simpatice .............................. 44 3.4 Blocantele α-adrenergice ............................................ 46 3.5 Blocantele β-adrenergice ............................................ 47 3.6 Vasodilatatoarele musculotrope ................................ 48 3.7 Blocantele canalelor de calciu ................................... 50 3.8 Inhibitorii enzimei de conversie şi antagoniştii angiotensinei II...................................................................

51

Capitolul 4 – ANHIDRAZA CARBONICĂ: STRUCTURĂ, FUNCłII, IMPLICAłII FIZIOLOGICE....................

56

4.1 NoŃiuni generale despre anhidraza carbonică ............. 56 4.2 Structura situsului activ al enzimei ............................ 60 4.3 Mecanismul catalitic al anhidrazei carbonice ............. 64 4.4 ImplicaŃii fiziologice ale izoenzimelor anhidrazei carbonice ............................................................................

68

3

Partea a II-a CONTRIBUłII PERSONALE

Capitolul 5 - PREMISE. OBIECTIVE. METODE GENERALE ŞI MATERIALE ................................................................ 5.1 Premise ...................................................................... 5.2 Obiective .................................................................... 5.3 Metode generale ......................................................... 5.4 Materiale .....................................................................

76 76 76 77 90

Capitolul 6 - STUDIUL I - CONCEPłII NOI PRIVIND MECANISMUL DE ACłIUNE AL TERAPIEI VASOCONSTRICTOARE ............................................. 6.1. Studii in vitro ...........................................................

6.1.1. Ipoteza de lucru................................................ 6.1.2. Material şi metodă........................................... 6.1.3. Rezultate........................................................... 6.1.4. DiscuŃii şi concluzii.........................................

91 91 91 91 94 103

6.2. Studii experimentale pe animale............................. 6.2.1. Ipoteza de lucru................................................ 6.2.2. Material şi metodă........................................... 6.2.3. Rezultate........................................................... 6.2.4. DiscuŃii şi concluzii.........................................

105 105 105 107 111

6.3. Studii clinice pe pacienŃi ......................................... 6.3.1. Obiectivele studiului......................................... 6.3.2. Plan de studiu.................................................. 6.3.3. Material şi metodă........................................... 6.3.4. Rezultate........................................................... 6.3.5. Discutii şi concluzii..........................................

113 113 113 114 128 135

6.4. Concluziile Studiului I ........................................... 136 Capitolul 7 - STUDIUL II – CONCEPłII NOI PRIVIND

MECANISMUL DE ACłIUNE AL TERAPIEI ANTIHIPERTENSIVE ŞI VASODILATATOARE .... 7.1. Studii in vitro .........................................................

7.1.1. Ipoteza de lucru............................................... 7.1.2. Material şi metodă.......................................... 7.1.3. Rezultate........................................................... 7.1.4. DiscuŃii şi concluzii..........................................

137 137 137 138 141 152

7.2 Studii experimentale pe animale ............................. 7.2.1. Ipoteza de lucru................................................. 7.2.2. Material si metodă............................................ 7.2.3. Rezultate........................................................... 7.2.4. Discutii si concluzii..........................................

154 154 154 156 161

7.3 Studii clinice pe pacienti .......................................... 7.3.1. Obiectivele studiului..........................................

7.3.2. Plan de studiu...................................................

163 163 163

4

7.3.3. Material si metodă............................................. 7.3.4. Rezultate............................................................. 7.3.5. DiscuŃii şi concluzii...........................................

164 178 188

7.4. Concluziile Studiului II ............................................ 189 Capitolul 8 - STUDIUL III – INHIBITORII ANHIDRAZEI

CARBONICE ŞI CIRCULAłIA CORONARIANĂ. 8.1. Premisele studiului..................................................... 8.2. Material şi metodă....................................................... 8.3. Rezultate....................................................................... 8.4. DiscuŃii şi concluzii .....................................................

191 191 192 195 198

Capitolul 9 - RELAłIA ANHIDRAZĂ CARBONICĂ – pH ÎN MECANISMUL BIOCHIMIC AL PROCESELOR VASCULARE .....................................................................

200

CONCLUZII............................................................................................. 209 IMPORTANłA PRACTICĂ A LUCRĂRII ...................................... 213 BIBLIOGRAFIE...................................................................................... 214 ANEXE...................................................................................................... 237

INTRODUCERE Selectând o parte din preocupările contemporane în domeniu, lucrarea de faŃă îşi propune a realiza o nouă abordare din punct de vedere biochimic şi enzimologic al proceselor de vasoconstricŃie şi vasodilataŃie în strânsă corelaŃie cu procesele fiziologice din organism, abordare care să deschidă noi perspective în studiul diferiŃilor agenŃi farmacologici care sunt utilizaŃi în practica medicală, precum şi al enzimelor implicate în aceste procese. Orânduirea capitolelor s-a făcut într-o manieră logică, astfel ca prin tematica abordată şi modul de tratare să existe o imagine de ansamblu asupra fenomenelor studiate şi descrise în lucrare. Tocmai de aceea am apelat la o bogată iconografie (figuri, tabele, reproduceri, grafice), precum şi la un mare număr de referinŃe bibliografice. Lucrarea este structurată în două părŃi principale. Partea I-a tratează “Stadiul actual al cunoaşterii” şi cuprinde 4 capitole în care sunt prezentate atât NoŃiuni generale privind acŃiunea medicamentelor (Capitolul 1), cât şi mecansimele cunoscute de acŃiune ale terapiilor vasoconstrictoare (Capitolul 2) şi vasodilatatoare (Capitolul 3). Capitolul 4 face o trecere în revistă a datelor de literatură privind anhidraza carbonică, abordată prin prisma structurii, funcŃiilor şi implicaŃiilor ei fiziologice. Partea a II-a a lucrării, alcătuită din 5 capitole o constituie “ContribuŃiile

personale”. Capitolul 5 prezintă scopul studiului, obiectivele lucrării şi metodele generale de lucru. Capitolul 6 cuprinde primul studiu personal, respectiv cel al ContribuŃiilor la mecanismul de actiune al terapiei vasoconstrictoare, fiind la rândul lui împărŃit în mai multe subcapitole în funcŃie de experimentele realizate,

5

adică studii in vitro, in vivo pe animale şi studii clinice pe pacienŃi. În acelaşi mod a fost structurat Capitolul 7 care cuprinde cel de-al doilea studiu personal referitor la ContribuŃii privind mecanismul de acŃiune al terapiei vasodilatatoare.

Capitolul 8 al lucrării îl reprezintă cel de-al treilea studiu referitor la Inhibitorii anhidrazei carbonice şi circulaŃia coronariană. În Capitolul 9 se face o corelare a datelor existente până in prezent cu datele obŃinute în lucrarea de faŃă şi se propune un concept nou privind mecanismul biochimic al proceselor vasculare, concept în care un rol primordial revine anhidrazei carbonice.

Concluziile lucrării reunesc concluziile generale ale studiilor experimentale efectuate precum şi conceptele desprinse în urma efectuării studiilor. În final este prezentată pe scurt, importanŃa practică a acestei teze de doctorat. Bibliografia aflată în încheierea lucrării este materializată în 264 de titluri bibliografice, în care se regăsesc publicaŃii interne şi internaŃionale referitoare la subiectul abordat în lucrare, avându-se în vedere în special lucrãrile apãrute în ultimii 15 ani în acest domeniu. Am speranŃa că munca tuturor celor care au contribuit la realizarea acestei lucrări va găsi interes din partea specialiştilor, iar extinderea în continuare a ariei cercetărilor privind rolul fiziologic al anhidrazei carbonice şi izoenzimelor ei în organism să devină un domeniu pasionant şi de mare perspectivă pentru cercetările de biochimie, fiziologie, patologie şi farmacologie viitoare.

PARTEA I-A STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII

Capitolul 1: NOłIUNI GENERALE PRIVIND ACłIUNEA MEDICAMENTELOR

1.1 AcŃiunea medicamentelor la nivel molecular

Activitatea biologică a substanŃelor medicamentoase presupune o interacŃiune iniŃiala de ordin chimic sau fizico-chimic, cu moleculele componente ale materiei vii. Această acŃiune primară, la nivelul molecular – considerată ca mecanism de actiune – declanşeaza un complex de reacŃii, având drept rezultat efectul global şi răspunsul organismului la medicamente (1). Multe medicamente acŃionează specific asupra unor structuri macromoleculare – farmacoreceptori – din componenŃa reactivului biologic. O altă posibilitate este aceea a unei acŃini nespecifice asupra unor componente ale materiei vii, prin intervenŃia unor mecanisme fizice sau fizico-chimice simple (2).

1.2 AcŃiunea medicamentelor la nivel celular InteracŃiunea medicamentelor cu moleculele endogene, acŃiunea primară, se poate exercita în afara celulelor, la nivelul membranei celulare sau în interiorul celulelor (35). Unele substanŃe îşi exercită acŃiunea primară în mediul extracelular

6

sau în rezervoarele de lichide transcelulare (sucuri digestive, lichid cefalorahidian, umoare apoasă, endolimfă, lichid articular).

1.3 AcŃiunea medicamentelor asupra diferitelor aparate şi sisteme AcŃiunile la nivel molecular şi celular se repercutează predominant asupra diferitelor aparate şi sisteme – sistem nervos vegetativ, sistem nervos central, sisteme de reglare umorală, organe efectoare.

Capitolul 2 : MECANISMUL DE ACłIUNE AL TERAPIEI VASOCONSTRICTOARE

O serie de medicamente au acŃiune vasoconstrictoare. VasoconstricŃia poate interesa mare parte din teritoriile vasculare, determinând creşterea rezistenŃei periferice şi ridicarea presiunii arteriale. Vasoconstrictoarele cu acŃiune generalizată – de exemplu unele amine simpatomimetice sau angiotensina – sunt utile în cazuri selecŃionate de insuficienŃă circulatorie acută, ca şi în unele stări hipotensive cronice. AcŃiunea constrictoare se poate exercita atât asupra arterelor (vase de rezistenŃă), cât şi asupra venelor (vase de capacitanŃă) – de exemplu în cazul simpatomimeticelor; angiotensina provoacă predominant vasoconstricŃie arterială, iar dihidroergotamina provoacă preodominant venoconstricŃie (78). Alte vasoconstrictoare acŃionează limitat în anumite teritorii. Astfel dozele mici de ergotamine provoacă vasocostricŃie la nivelul teritoriului carotidian, acŃiune utilă în tratamentul migrenei. AcŃiunea vasoconstrictoare puternică a vasopresinei (79) în teritoriul splanhic o indică în tratamentul de urgenŃă al hemoragiilor digestive (80).AcŃiunea locală poate fi determinată de uzul topic al unor vasoconstrictoare, de exemplu unele simpatomimetice folosite ca decongestive ale mucoasei nazale şi conjuctivale sau adrenalina, care se poate adăuga soluŃiilor, sau lidocaina, în scopul prelungirii acŃiunii anestezice locale (81). VasoconstricŃia medicamentoasă se datoreşte actiunii simptomatice de tip alfa-adrenergic, - de exemplu prin noreprinefrină, simulării serotoninergice – de exemplu prin ergotamine şi interesării directe a musculaturii netede vasculare – de exemplu prin vasopresina.

Capitolul 3: MECANISMUL DE ACłIUNE AL TERAPIEI

ANTIHIPERTENSIVE ŞI VASODILATATOARE O serie de medicamente aparŃinând unor grupe farmacodinamice variate

sunt capabile să scadă presiunea arterială, ca urmare a mişcării debitului cardiac şi/sau scăderii rezistenŃei periferice (106). Efectul antihipertensiv se poate datora:

- Inhibării funcŃiei sistemului simpatic prin acŃiune centrală (clonidina, metil dopa şi în parte rezerpina şi blocantele beta-adrenergice); prin paralizia ganglionilor simpatici (trimetafanul şi alte ganglioplegice); prin inhibarea terminaŃiilor simpatice periferice (guanetidina şi în parte, rezerpina); prin blocare alfa–adrenergică (prazosinul) şi prin blocare beta-adrenergica (propanololul şi altele );

7

- VasodilataŃiei directe (hidralazinele, minoxidilul, diazoxidul, nitropusiatul de sodiu), inclusiv prin blocarea canalelor calciului (nifedipina, verapamilul, ditiazemul etc);

- Creşterii diurezei (hidroclorotiazida, furosemidul, spironoloactona); - Interferării sistemului renină-angiotensină (captoprilul, enalaprilul şi alŃi

inhibitori ai enzimei de conversie; losartanul şi alŃi blocanŃi ai receptorilor angiotensinei II).

Capitolul 4: ANHIDRAZA CARBONICĂ: STRUCTURĂ,

FUNCłII, IMPLICAłII FIZIOLOGICE Anhidraza carbonică (AC) catalizează hidratării CO2 (reacŃia 1) şi

disocierea instantanee, consecutivã, a acidului carbonic la bicarbonat (reacŃia 2) şi carbonat (reacŃia 3)

CO2 + H2O → H2CO3 (reacŃia 1)

H2CO3 → H++HCO3- (reacŃia 2)

HCO3- → H+ +CO32- (reacŃia 3) Din punct de vedere biochimic, toate AC sunt proteine cu zinc. PrezenŃa

atomului de Zn şi rolul său esenŃial pentru activitatea cataliticã, AC fiind prima proteinã cu zinc identificatã şi caracterizatã.

Mecanismul catalitic precis care regleazã interconversia reversibilã dintre CO2 şi HCO

-3 este încã în curs de definire, dar este în general recunoscut faptul cã

faza "rata-limitantă" a întregului proces este mai degrabã un transfer protonic intramolecular decât adevarata interconversie CO2 → HCO

-3

RelevanŃa fiziologică a izonzimelor AC şi rolul lor fundamental în organismul viu ar fi transportul şi eliminarea CO2, reglarea pH-ului şi a presiunii osmotice, secreŃia lichidelor şi reglarea procesului de schimb ionic (188, 189) sunt deci cele mai obişnuite procese fiziologice care implică activitatea catalitică a uneia sau a mai multor izoenzime ale AC. Izoenzimele I, II şi IV ale AC sunt implicate în respiraŃie şi relarea homeostazieie acido-bazice, procese care implică transportul CO2 şi a bicarbonatului între Ńesuturile care le metabolizează şi situsuriel de excreŃie (plămâni, rinichi). Prin producerea de bicarbonat la nivelul umorii apoase din ochi, izoenzimele Ac sunt implicate în procesul vederii, iar anomalii în funcŃionarea acestor izoenzime conduc la creşterea presiunii intraoculare şi la formarea glaucomului (188). AC II este de asemenea implicată în dezvoltarea oaselor, furnizând acidul pentru resorbŃia în osteoclaste (189). Izoenzimele AC participă de asemenea la formarea lichidului cefalorahidian, prin furnizarea de bicarbonat şi regalrea pH-ului în plexul coroid (188), producerea salivei în celulelele acinare şi ductale, producerea sucului gastric în celulele parietale gastrice, secreŃia sucurilor pancreatice şi biliare (188). Mai mult, izoenzimele AC sunt implicate în mecanismele gustative şi olfactive, în regalrea pH-ului lichidului

8

seminal, în funcŃionarea muschilor şi adaptarea celulelor la stres (189). In faŃa acestui set de activităŃi fiziologice nou recunoscute, se pot adăuga un număr rezonabil de noi roluri care au fost propuse în ultimii ani.

PARTEA a II-a

CONTRIBUłII PERSONALE

Capitolul 5: PREMISE. OBIECTIVE. METODE GENERALE MATERIALE

5.1. Premise Studiul îşi propune astfel să stabilească interrelaŃiile dintre sistemele vasoconstrictoare şi vasorelaxante în modularea tonusului vascular, în strânsă corelaŃie cu anhidraza carbonică – enzimă cu rol major în menŃinerea echilibrului acido-bazic din organism.

5.2. Obiective • Evaluarea relaŃiei dintre diferite grupe de substanŃe vasoconstrictoare,

vasodilatatoare şi izoenzimele AC din musculatura vasculară netedă şi purificate, prin experimente efectuate in vitro, respectiv relaŃia doză-răspuns şi studii cinetice.

• Investigarea modificărilor reactivitătii vasculare, exprimate prin tensiunea arterială, asociate cu modificările enzimatice de la nivelul musculaturii netede vasculare, după administrarea unor medicamente din grupa vasoconstrictoarelor şi vasodilatatoarelor, la animalele de experienŃã.

• Cercetarea particularităŃilor răspunsului vascular corelat cu răspunsul enzimatic la pacienŃii cu diferite afecŃiuni cãrora le este indicat tratamentul cu medicaŃie vasoconstrictoare sau vasodilatatoare, urmãrindu-se din punct de vedere clinic şi enzimologic modificãrile apãrute pe durata tratatmentului.

• Stabilirea unor aspecte noi privind mecanismul de acŃiune al terapiei vasoconstrictoare şi vasodilatatoare, ca şi implicaŃiile enzimatice în aceste mecanisme fiziologice sau patologice.

5.3. Metode generale 5.3.1. Studii in vitro - Realizarea unor experimente in vitro privind relaŃia dozã-rãspuns, la concentraŃii cuprinse între 10-10 - 10-4 M dintre:

� reprezentanŃi ai clasei de vasoconstrictoare şi izoenzimele I şi II ale anhidrazei carbonice;

� reprezentanŃi ai clasei de vasodilatatoare şi antihipertensive şi izoenzimele I şi II ale anhidrazei carbonice.

9

- Studii cinetice privind interacŃiunea dintre substantele vasoconstrictoare şi AC; substanŃele vasodilatatoare şi AC în vederea stabilirii mecanismului de acŃiune al acestor agenŃi farmacologici asupra enzimei.

5.3.2. Studii pe animale de experienŃă - Au fost constituite mai multe loturi de animale (şobolani albi) la care s-au administrat medicamente vasoconstrictoare şi vasodilatatoare şi s-a urmãrit:

� activitatea zilnicã a izoenzimelor AC eritrocitare; � valorile zilnice ale tensiunii arteriale; � la sfârşitul tratamentului, prin sacrificarea loturilor studiate s-a

determinat activitatea izoenzimelor din peretele musculaturii netede vasculare şi s-au comparat valorile obŃinute după diverse terapii cu valorile unui lot martor.

5.3.3. Studii pe grupe de pacienŃi - Studiile clinice pe pacienŃi au implicat selectarea unor bolnavi, voluntari, cu diferite afecŃiuni care au ca indicaŃie terapia vasoconstrictoare sau vasodilatatoare. Astfel, au fost constituite mai multe grupe de studiu în funcŃie de afecŃiunea pacientului şi terapia administrată.

- PacienŃilor din toate grupele li s-au urmãrit zilnic valorile tensiunii arteriale, iar înainte şi după tratament au fost urmărite atât activitatea izoenzimelor AC din hematii, precum şi aspecte clinice şi paraclinice. - Pentru fiecare pacient a fost întocmită o Fişã individuală de urmãrire care cuprinde: Date generale despre pacient; Antecedente heredocolaterale; Antecedente personale fiziologice şi patologice; Examen clinic; Examinãri paraclinice; EvoluŃia clinicã; EvoluŃia activitãŃii enzimelor studiate; ReacŃii adverse.

Capitolul 6: STUDIUL I

CONCEPłII NOI PRIVIND MECANISMUL DE ACłIUNE AL TERAPIEI VASOCONSTRICTOARE

Au fost studiate, conform metodologiei descrise în Capitolul 5, efectele

următoarelor substanŃe vasoconstrictoare: adrenalina, noradrenalina, dihidroergotamina, oximetazolina, ergotamina, vasopresina, angiotensina II prin studii efectuate in vitro, pe animale de experienŃă şi studii clinice pe pacienŃi.

Rezultatele studiului I, obŃinute în experimentele in vitro, in vivo pe animale de experienŃă şi în studiile clinice pe pacienŃi sunt prezentate succint în graficele reprezentate în cele ce urmează:

10

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

10-8M 10-6M 10-4M

Acti

vit

ate

a A

C I d

in m

ucu

latu

ra v

ascu

lara

nete

da (

UE

/ml)

Bazal AC I vasculara Adrenalina NoradrenalinaVasopresina Angiotensina II DihidroergotaminaOximetazolina Ergotamina

Fig.6.2. – Efectul substanŃelor vasoconstrictoare asupra AC I vasculară, in vitro

MARTOR

VASOPRESINA

ANGIOTENSIN

A

NORADRENALIN

A

DIHID

ROERGOTAM

INA

ERGOTAMIN

A

OXIM

ETAZOLINA

0

50

100

150

200

250

300

350

Cre

ste

rea a

cti

vit

ati

i A

C I

si

a

ten

siu

nii

art

eri

ale

(%

)

TA AC I VASCULARA

Fig.6.5 – Creşterile procentuale ale activităŃii AC I din musculatura vasculară

netedă şi ale tensiunii arteriale, la şobolanii trataŃi cu terapie vasoconstrictoare.

11

*

*

*

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Acti

vit

ate

a A

C I s

i A

C I

I d

in h

em

ati

i (U

E/m

l)

AC IIAC I

*

NORADRENALINA DIHIDROERGOTAMINA ERGOTAMINA VASOPRESINA

*

*

**

Fig. 6.11. - Efectul terapiei vasoconstrictoare asupra izoenzimelor I şi II ale AC

din hematii la pacienŃi. Valorile reprezintă media ± abaterea standard; *diferenŃa

semnificativă (p<0.05) comparativ cu valorile dinaintea tratamentului.

Din acest studiu se desprind următoarele concluzii: 1. SubstanŃele cu efecte vasoconstrictoare activează AC I purificată şi din

musculatura vasculară netedă prin mecanism direct de acŃiune. 2. Studiile cinetice dovedesc un mecanism de activare de tip non-competitiv

asupra situsului activ al izoenzimei AC I purificată. 3. Datele obŃinute in vivo confirmã rezultatele din vitro privind acest efect

activator al vasoconstrictoarelor asupra izoenzimei AC I. Mai mult, datele aratã cã activarea AC I din musculatura netedã vascularã este paralelã cu creşterea valorilor tensiunii arteriale. Cu cât activarea izoenzimei este mai puternicã cu atât se produce o creştere mai pronunŃatã a valorilor tensiunii arteriale.

Capitolul 7: STUDIUL II

CONCEPłII NOI PRIVIND MECANISMUL DE ACłIUNE AL TERAPIEI VASODILATATOARE

Conform metodologiei prezentate în capitolul 5, în acest studiu au fost cercetate

in vitro, pe animale de experienŃă şi clinic, pe pacienŃi, următoarele substante vasodilatatoare şi antihipertensive: clonidina, rezerpina, hidralazina, prazosin, propranolol, amlodipină şi losartan. Rezultatele obŃinute în cadrul acestui studiu sunt prezentate mai jos:

12

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

10-8M 10-6M 10-4M

Acti

vit

ate

a A

C I

vascu

lara

(U

E/m

l)

Bazal AC I vasculara Clonidina RezerpinaPrazosin Propranolol AmlodipinaEnalapril Losartan Hidralazina

Fig.7.2 – Efectul subtanŃelor vasodilatatoare şi antihipertensive asupra AC I din

musculatura netedă vasculară, in vitro.

MARTO

R

REZER

PIN

A

PRAZO

SIN

ENALA

PRIL

CLO

NID

INA

HID

RALA

ZINA

PRO

PRANO

LOL

LOSARTA

N

AM

LODIP

INA

0

20

40

60

80

100

120

Inh

ibit

ia a

cti

vit

ati

i A

C I

si

a T

A (

%)

AC I VASCULARA TA

Fig.7.5 – InhibiŃia procentuală a activităŃii AC I din musculatura vasculară

netedă şi a tensiunii arteriale la şobolanii trataŃi cu terapie vasodilatatoare.

13

**

*

0

0.5

1

1.5

2

PROPRANOLOL ENALAPRIL

Acti

vit

ate

a A

C I

si

AC

II d

in h

em

ati

i (U

E/m

l)

AC IIAC I

* *

**

*

Fig. 7.12. Efectul produs de propranolol, amlodipină, enalapril şi losartan

asupra izoenzimelor I şi II ale AC din hematii. Valorile reprezintă media ±

abaterea standard; *diferenŃa semnificativă (p<0.05) comparativ cu valorile

dinaintea tratamentului.

Rezultatele studiului II au condus la următoarele concluzii: 1. SubstanŃele cu efecte vasodilatatoare şi antihipertensoare inhibă AC I

purificată şi din musculatura vasculară netedă prin mecanism direct de acŃiune.

2. Studiile cinetice dovedesc un mecanism de inhibiŃie de tip non-competitiv asupra situsului activ al izoenzimei AC I purificată.

3. Datele obtinute in vivo confirmã rezultatele din vitro privind acest efect inhibitor al vasodilatatoarelor asupra izoenzimei AC I. Mai mult, datele aratã cã inhibitia AC I din musculatura netedã vascularã este paralelã cu scăderea valorilor tensiunii arteriale. Cu cât inhibitia izoenzimei este mai puternicã cu atât se produce o scădere mai pronunŃatã a valorilor tensiunii arteriale.

4. Deoarece intensitatea efectului inhibitor asupra AC I este mai puternic decât efectul de scădere al tensiunii arteriale se poate sugera că inhibiŃia AC precede şi determină scăderea valorilor tensiunii arteriale.

14

Capitolul 8: STUDIUL III

INHIBITORII ANHIDRAZEI CARBONICE ŞI CIRCULAłIA CORONARIANĂ

Inhibitorii specifici ai anhidrazei carbonice de tipul acetazolamidei,

conform datelor clasice, în reducerea presiunii intraoculare, în glaucom, ameliorarea ventilaŃiei pulmonare din cordul pulmonar cronic , apneea de somn , edeme , boala de altitudine, sindromul Meniere şi unele forme de epilepsie (188, 226). Pornind de la aceste date experimentale şi clinice, şi cunoscând rolul receptorilor alfa şi beta-adrenergici în reglarea tonusului vascular general şi cel al circulaŃiei coronariene (235, 236), precum şi de la locul consacrat al beta-blocantelor în terapia cardiopatiei ischemice, în lucrarea de faŃă am investigat efectul acetazolamidei şi propranololului asupra evoluŃiei clinice şi electrocardiografice la un lot de bolnavi cu cardiopatie ischemică.

Rezultatele acestui studiu clinic, cardiografic şi enzimologic atestă clar efectul coronarodilatator al acetazolamidei , care se manifestă clinic prin dispariŃia anginei la testul de efort electrocardiografic şi ameliorarea remarcabilă a modificărilor de tip ischemic ale segmentului ST şi ale undei T. Compararea cu un preparat cu efect coronarodilatator dovedit – propanololul – arată că inhibitorul enzimatic este de o eficientă clinică egală , electrocardiografic ducând la ameliorări ale traseului de repaus şi efort într-o manieră similară. Totodată , preparatul este net superior faŃă de placebo.

Interpretarea acestora poate fi legată de implicaŃiile anhidrazei carbonice I , prin inhibiŃia produsă de acetazolamidă, în fenomenele vasculare.

Capitolul 9: RELAłIA ANHIDRAZĂ CARBONICĂ - pH

ÎN MECANISMUL BIOCHIMIC AL PROCESELOR VASCULARE

Rezultatele obŃinute în cele trei studii experimentale efectuate au condus la

concluzia că toŃi agenŃii care acŃionează asupra modificării tonusului vascular sunt în acelaşi timp activatori sau inhibitori direcŃi ai izoenzimei I a anhidrazei carbonice. O imagine de ansamblu a efectelor activatoare produse de vasoconstrictoare şi a efectelor inhibitoare produse de vasodiltatoare este redată în Figura 9.1 în care este prezentat efectul principalilor agenŃi vasoconstrictori şi vasodilatatori asupra AC I din musculatura vasculară netedă, in vitro.

15

Noradrenalin

Angiotensina

Vasopresina

Oximetazolina

Propranolol

Bazal AC I

Amlodipina

ClonidinaPrazosinReserpina

Losartan

Hidroclorotiazid

a

-100%

-80%

-60%

-40%

-20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

0 10-8 M 10-6 M 10-4 M

Ac

tiv

ita

tea

AC

I v

as

cu

lara

( %

)Dihidroergotamin

Ergotamina

Fig. 10.1 Efectul agenŃilor vasoconstrictori şi vasodilatatori asupra AC I din

musculatura vasculara netedă

În Figura 9.2 este prezentat comparativ efectul terapiei vasoconstrictoare şi vasodilatatoare asupra izoenzimei AC I din musculatura netedă vasculară şi asupra valorilor tensiunii arteriale (în procente), obŃinut in vivo, la animalele de experienŃă. În grafic sunt prezentate efectele obŃinute de câte doi reprezentanŃi (cei mai activi) din cele două clase de terapii studiate.

0%

50%

100%

150%

200%

250%

Mo

dif

ica

ri a

le A

C I

si

TA

(%

)

MARTOR VASOPRESINA ANGIOTENSINA LOSARTAN AMLODIPINA

AC I

TA

Fig.9.2. - Efectul comparativ al substanŃelor vasoconstrictoare şi vasodilatatoare

asupra activităŃii AC I vasculare şi tensiunii arteriale

16

Ca urmare, toŃi stimulii sau mesagerii primari (în cazul nostru vasoconstrictoarele sau vasodilatatoarele) au un efect direct asupra AC I, a cărei activitate este corelată direct cu modificările tensiunii arteriale.

Indiferent dacă aceşti stimuli, sau mesageri primari, îşi exercită efectele prin intermediul receptorilor specifici de membrane, a canalelor ionice, a pompelor simport sau antiport sau direct, toate influenŃează activitatea enzimei şi consecutiv realizează modificări de pH de care depind legarea stimulilor de receptori, deschiderea sau închiderea canalelor ionice sau funcŃionarea pompelor.

Toate celulele au mecanisme specifice şi foarte sensibile de transmitere a semnalelor, care au fost conservate pe durata evoluŃiei. O mare varietate de stimuli, incluzând hormoni, neurotransmiŃători şi factori de creştere acŃionează prin intermediul receptorilor proteici din membrana plasmatică. Receptorii leagă molecula semnalului, amplifica semnalul, îl integrează în interiorul altor receptori şi îl transmit în celulă şi prin mecansime de semnalizare: canale ionice, enzime receptoare, proteine membranare care acŃioneaza prin intermediul proteinelor G, toate acestea fiind dependente de modificările de pH.

CONCLUZII şi CONTRIBUłII

1. Anhidraza carbonică nu este un simplu catalizator al reacŃiei de hidratare a

CO2. 2. SubstanŃele vasoconstrictoare studiate in vitro sunt activatori direcŃi ai AC I

purificate şi ai AC I izolată din musculatura vasculară netedă, conform relaŃiei doză-răspuns.

3. Efectul activator este prezent in vitro şi asupra izoenzimei AC II purificate, dar la o intensitate mult mai redusă comparativ cu izoenzima AC I.

4. Studiile cinetice dovedesc un mecanism de activare de tip non-competitiv produsă de vasoconstrictoare asupra AC I, vasoconstrictoarele legându-se de enzimă în situsuri diferite de buzunarul hidrofob în care se leagă CO2.

5. Vasoconstrictoarele administrate in vivo la animale de experienŃă confirmã acest efect activator al vasoconstrictoarelor asupra izoenzimei AC I, arătând în plus că activarea AC I din musculatura netedă vasculară este paralelă cu creşterea valorilor tensiunii arteriale. Cu cât activarea izoenzimei este mai puternică cu atât se produce o creştere mai pronunŃată a valorilor tensiunii arteriale.

6. Studiile clinice pe pacienŃi dovedesc că agenŃii vasoconstrictori studiaŃi activează AC I din hematii, paralel cu creşterea valorilor tensiunii arteriale şi ameliorarea clinică a simptomelor.

7. Creşterea activităŃii enzimei este urmată de o scădere a pH-ului intracelular care ar avea drept consecinŃe modificãri ale conformaŃiei receptorilor pentru agenŃii vasoconstrictori, modificãri ale statusului unor enzime implicate în procesul de transmitere intracelulară a semnalului vasoconstrictor şi ar putea influenŃa în mod direct sistemul efector.

17

8. Prin modificările de pH pe care le iniŃiază, AC I este implicată direct în mecanismul biochimic de acŃiune al agenŃilor vasoconstrictori.

9. SubstanŃele cu efecte vasodilatatoare şi antihipertensoare studiate in vitro inhibă AC I purificată şi din musculatura vasculară netedă prin mecanism direct de acŃiune, după relaŃia doză-răspuns.

10. Efectul inhibitor al substanŃelor vasodilatatoare este prezent şi asupra asupra AC II purificate, dar mult mai redus.

11. Studiile cinetice dovedesc un mecanism de inhibiŃie de tip non-competitiv asupra izoenzimei AC I purificată, ceea ce înseamnă că vasodilatatoarele nu sunt în competiŃie cu substratul pentru situsul activ al enzimei.

12. Studiile in vivo pe animale de experienŃă dovedesc la fel un efect inhibitor al vasodilatatoarelor asupra izoenzimei AC I din musculatura netedă vasculară, efect paralel cu scăderea valorilor tensiunii arteriale. Cu cât inhibiŃia izoenzimei este mai puternică cu atât se produce o scădere mai pronunŃatã a valorilor tensiunii arteriale.

13. Deoarece intensitatea efectului inhibitor asupra AC I este mai puternic decât efectul de scădere al tensiunii arteriale se poate sugera că inhibiŃia AC I precede şi determină scăderea valorilor tensiunii arteriale.

14. Studiile clinice pe pacienŃi dovedesc că agenŃii vasodilatatori studiaŃi inhibă AC I din hematii, paralel cu scăderea valorilor tensiunii arteriale şi ameliorarea clinică a simptomelor.

15. Scăderea activităŃii izoenzimei AC I produsă de terapia vasodilatatoare şi antihipertensivă este urmată de o creştere a pH-ului intracelular cu consecinŃe asupra conformaŃiei receptorilor pentru agenŃii vasodilatatori şi antihipertensivi, modificări ale statusului unor enzime implicate în procesul de transmitere intracelulară a semnalului vasodilatator şi ar putea influenŃa în mod direct sistemul efector.

16. Prin modificările de pH pe care le iniŃiază, AC I este implicată direct în mecanismul biochimic de acŃiune al agenŃilor vasodilatatori şi antihipertensivi.

17. Corelarea rezultatelor obŃinute în studiile I şi II dovedesc că activitatea AC I din hematii, care reflectă activitatea aceleaşi izoenzime din musculatura netedă vasculară, este crescută la pacienŃii hipertensivi şi scăzută la cei hipotensivi comparativ cu normotensivii.

18. Inhibitorii anhidrazei carbonice de tipul acetazolamidei produc vasodilataŃie coronariană cu dispariŃia anginei la testul de efort prin inhibiŃia directă şi specifică a AC I.

19. Datele obŃinute arată existenŃa unui mecanism distinct privind implicaŃia AC I în modificările vasculare.

20. Stimulii sau mesagerii primari care produc modificări vasculare acŃionează printr-un mecanism dual :

� asupra receptorului specific de pe membrana celulară, cu formarea unui complex stimul-receptor, cuplarea cu proteinele G şi transmiterea semnalelor la efector.

18

� asupra izoenzimelor AC, care prin activarea sau inhibiŃia lor asigură un pH adecvat transmiterii semnalelor în celulă.

21. Modificările de pH produse de activarea sau inhibiŃia AC vor influenŃa legarea stimulului de receptor, formarea complexului stimul-receptor, cuplarea acestuia cu proteinele G şi transmiterea semnalelor la efectorul celular.

22. Între adenilat ciclază şi anhidraza carbonică există o relaŃie inversă, respectiv: activarea AC este însoŃită de inhibiŃia adenilat ciclazei care produce scăderea cAMP şi vasoconstricŃie; inhibiŃia AC este paralelă cu activarea adenilat ciclazei, creşterea cAMP şi vasodilataŃie.

23. Prin modificările de pH pe care le iniŃiază sub acŃiunea stimulilor activatori sau inhibitori, endogeni sau exogeni, AC I ar putea constitui un modulator al proceselor fiziologice şi patologice de vasoconstricŃie şi vasodilataŃie.

24. Modificările apărute la nivelul pH-ului intracelular pot influenŃa activitatea canalelor ionice, activitatea pompelor simport şi antiport, precum şi activitatea ATP-azei, toate acestea având la rândul lor implicaŃii majore în modularea proceselor vasculare.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

•••• Bourne H.R., Roberts J.M. – Drugs receptors and pharmacodynamics. In: Basic and clinical pharmacology (Katzung .G, ed.), Lange Prentice-Hall Int. London, 1995, pag.9-32.

•••• Brady W.J., O’Connor R.R. – Interpretation of the electrocardiogram; clinical correlation suggested. European Heart Journal, 2008, 29, 1-3.

•••• Chegwidden W.R., Dodgson S.J., Spencer I.M. - The roles of carbonic anhydrase in metabolism, cell growth and cancer in animals. In: The

Carbonic Anhydrases – New Horizons (Chegwidden W.R., Edwards Y. Carter N., eds.), Birkhauser Verlag, Basel, 2000, pag. 343-63.

•••• Clapham D.E., Neer E.J. – New roles for G proteins βγ-dimers in transmembrane signaling. Nature, 1993, 365:403-406.

•••• Hoffman B.B., Lefkowitz R.J. – Cathecolamines, sympathomimetic drugs, and adrenergic receptor antagonists. In: Goodman & Gilman’s. The

Pharmacological Basis of Therapeutics. Ninth Edition. (J.G.Hardman, L.E. Limbird, A.G.Gilman, eds.). McGraw-Hill Companies Inc. New York, 1996, pag.199 – 248.

•••• Kaplan N.M. - Calcium Channel Blockers. In: Clinical Hypertension.

Seventh Edition (Kaplan N.M., ed.), Williams & Wilkins, Baltimore, USA, 1998, pag.216-221.

•••• Khalifah R.G. - The carbon dioxide hidration activity of carbonic anhydrase: stop-flow kinetic studies on the native human isozymes B and C. J.Biol.Chem., 1971, 246:2561-2573.

•••• Manrique C., Lastra G., Gardner M., Sowers J.R. - The renin angiotensin aldosterone system in hypertension: roles of insulin resistance and oxidative stress. The Medical Clinics of North America , 2009, 93 (3): 569–82.

19

•••• Meldrum N.U., Roughton F.J. - Carbonic anhydrase. Its preparation and properties. J Physiol. 1933 , 80(2):113–142.

•••• Messerli F.H., Williams B., Ritz E . - Essential hypertension. Lancet, 2007, 370 (9587): 591–603.

•••• Pierdomenico S.D., Di Nicola M., Esposito A.L., et al.. - Prognostic Value of Different Indices of Blood Pressure Variability in Hypertensive Patients. American Journal of Hypertension, 2009, 10: 1-103.

•••• Puscas I, Coltau M., Domuta G. - Rapid method for differentiation of carbonic anhydrase I from carbonic anhydrase II activity. Analytical

Letters,1999, 32, 5-9. •••• Puscas I. - Carbonic anhydrase is a modulator of vasculary and secretory

processes in the organism. The pH theory. Digestion, 1998, 59 (suppl. 3), 671.

•••• Puscas I., Coltau M., Baican M., Pasca R., Domuta G., Hecht A.- Vasoconstrictive drugs increase carbonic anhydrase I in vascular smooth muscle while vasodilating drugs reduce the activity of this isozyme by a direct mechanism of action. Drugs under Experimental and Clinical

Research, Carouge, Switzerland, 2001, XXVII, 231-238. •••• Rang H.P., Dale M.M.- Pharmacology. Churchill Livingstone, Edinburgh,

1987 pag.3-34. •••• Ross E.M. – Pharmacodynamics: Mechanisms of drug action and relationship

between drug concentration and effect. In: Goodman & Gilman’s. The

Pharmacological Basis of Therapeutics. Ninth Edition. (J.G.Hardman, L.E. Limbird, A.G.Gilman, eds.). McGraw-Hill Companies Inc. New York, 1996, pag.29 – 42.

•••• Rowlett R.S. - Structure and catalytic mechanism of the beta-carbonic anhydrases. Biochim. Biophys. Acta. 2009, 11, 564-573.

•••• Stroescu V. – Farmacodinamia generala. In: Bazele farmacologice ale

practicii medicale. Editia a VI-a. Editura Medicala, Bucuresti, 1999, pp.48 – 116.