Tic Delia _Michiu_. RO-Rezumat teza

ING. DELIA ȚÎC (MICHIU)

TEZĂ DE DOCTORAT

INFLUENȚA HAMEIULUI ASUPRA

BACTERIILOR ŞI ÎN PROCESUL DE

FERMENTA ȚIE AL MUSTULUI DE BERE

(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

Coordonatori ştiin țifici:

Prof. Univ. Dr. Maria TOFANĂ

Prof. Univ. Dr. Philippe THONART

CLUJ-NAPOCA 2012

UNIVERSITATEA DE ŞTIINȚE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ

VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA ŞCOALA DOCTORALĂ

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII

UNIVERSITATEA DIN LIEGE GEMBLOUX

AGRO-BIO TECH

2

CUPRINS INTRODUCERE. SCOP ŞI OBIECTIVE ALE TEZEI 4

CAPITOLUL 1. ACTIVITATEA DE INHIBI ȚIE A ACIZILOR

AMARI DIN HAMEI ASUPRA BACTERIILOR 6

1.1. ACTIVITATEA DE INHIBIȚIE A ISO-α ŞI β ACIZILOR DIN HAMEI

ASUPRA SUŞELOR BACTERIENE LACTOBACILLUS PLANTARUM THT,

PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS ŞI BACILLUS SUBTILLIS S 499 6

1.1.1. Materiale şi metode 6

1.1.2. Metode microbiologice utilizate pentru determinarea activității

de inhibiție a iso-α şi β acizilor din hamei în mediu lichid selectiv 7

1.1.2.1. Creşterea bacteriilor Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus

pentosaceus şi Bacillus subtillis S499 sub influența extractului de iso-α acizi 7

1.1.2.2. Creşterea bacteriilor Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus

pentosaceus şi Bacillus subtillis S499 sub influența extractului de β acizi 7

1.1.2.3. Metoda turbidității sau metoda densității optice 7

1.1.3. Rezultate şi discuții 8

1.1.3.1. Activitatea de inhibiție a iso-α acizilor din hamei asupra

suşelor bacteriene Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus

şi Bacillus subtillis S499 8

1.1.3.2. Activitatea de inhibiție a β acizilor din hamei asupra

suşelor bacteriene Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus

şi Bacillus subtillis S499 10

1.2. ACTIVITATEA DE INHIBI ȚIE A ISO-α ŞI β ACIZILOR DIN HAMEI

ASUPRA BACTERIEI PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS PE PARCURSUL

FERMENTAȚIEI MUSTULUI DE BERE CU DROJDIE SACCHAROMYCES

CEREVISIAE BOULARDII, FERMENTAȚIE CONTAMINATĂ

ARTIFICIAL CU PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS 12

1.2.1. Materiale şi metode 12

1.2.2. Metode microbiologice utilizate pentru determinarea activității

de inhibiție a iso-α acizilor din hamei în mustul de bere 12

1.2.2.1. Creşterea drojdiei Saccharomyces cerevisiae boulardii în

3

mustul de bere aflat în fermentație contaminată artificial cu

Pediococcus pentosaceus sub influența iso-α acizilor din hamei 12

1.2.2.2. Determinarea etanolului prin metoda UV 13

1.2.2.3. Metoda turbidității sau metoda densității optice 13

1.2.2.4. Analiza prin citometrie în flux 13


1.2.3.1. Activitatea de inhibiție a iso-α acizilor asupra drojdiei S. cerevisiae 13

1.2.3.2. Activitatea de inhibiție a iso-α acizilor asupra Pediococcus pentosaceus 14

CAPITOLUL 2. EVALUAREA COMPARATIV Ă A UNOR PROFILE

DE AROMĂ ALE MUSTULUI DE BERE: FERMENTA ȚII

TRADI ȚIONALE ŞI AROMATIZATE CU ULEIURI ESEN ȚIALE

PROVENITE DE LA VARIET ĂȚI DE HAMEI CU

POTENȚIAL DE AROM Ă DIFERIT 16

2.1. ANALIZA COMPUŞILOR VOLATILI DIN MUSTURILE DE BERE

HAMEIATE CU VARIETĂȚILE MAGNUM/HULLER BITTER,

PRIN TEHNICA ITEX/GC-MS 16

2.1.1.Materiale şi metode 16

2.1.2. Metode de analiză 17

2.1.2.1. Producția la scară de laborator a musturilor de bere hameiate cu

varietățile de hamei Magnum/Hüller Bitter 17

2.1.2.2. Monitorizarea conținutului de compuşi volatili, pe parcursul

proceselor de fierbere şi fermentație primară a musturilor de bere

hameiate cu varietățile Magnum/Hüller Bitter 17

2.1.2.3. Analiza GC-MS 18


2.1.3.1. Analiza musturilor de bere hameiate cu varietatea Magnum 18

2.1.3.2. Analiza musturilor de bere hameiate cu varietatea Hüller Bitter 21

CAPITOLUL 3. EVALUAREA STATISTIC Ă A DATELOR 24

CAPITOLUL 4. CONCLUZII GENERALE 26

BIBLIOGRAFIE SELECTIV Ă 29

4

INTRODUCERE

Hameiul (Humulus lupulus L.), este o plantă perenă, unisexuat dioică care aparține

familiei Cannabaceae.

Pentru industria berii sau în scop medicinal, sunt utilizate doar plantele female

care produc flori, în timp ce plantele mascule nu au valoare comercială, au rol doar în

polenizarea plantelor female.

Prima utilizare a hameiului a fost ca şi plantă medicinală, datorită proprietăților sale de

conservare. În prezent hameiul este folosit în industria berii, 98% din cantitatea de hamei

utilizată în lume fiind destinată aceasteia.

S-a demonstrat, de asemenea că hameiul deține proprietăți antiseptice, prezentând

activitate de inhibiție doar asupra bacteriilor Gram-pozitive, nu şi asupra celor Gram-

negative.

Studiul prezentei teze de doctorat a început cu investigațiile asupra activității de

inhibiție a iso-α şi β acizilor amari din hamei asupra bacteriilor Gram-pozitive:

Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus pentosaceus şi Bacillus subtilis S499 .

Prin multe studii s-a raportat pericolul semnificativ pe care îl reprezintă

contaminarea microbiană, pentru industria etanolului, datorită potențialelor pierderi din

punct de vedere al randamentului şi datorită producției de acizi organici nedoriți.

De asemenea, studiile au arătat că prezența acizilor acetic şi lactic, pe parcursul

fermentației poate cauza moartea suşei de drojdie Saccharomyces cerevisiae în anumite

medii şi chiar scăderea producției de etanol.

Având în vedere semnificația contaminărilor bacteriene, pentru industria

etanolului, prezentul studiu a fost continuat cu investigarea activității de inhibiție a iso-α

acizilor din hamei asupra bacteriei Pediococcus pentosaceus pe parcursul fermentației

mustului de bere cu drojdie Saccharomices cerevisiae bulardii.

Prezentul studiu a fost continuat cu analiza unor profile de aromă ale mustului de

bere imbogățit cu uleiuri esențiale provenite de la varietăți de hamei cu potențial de

aromă diferit, prin identificarea compuşilor volatili marker, pe parcursul procesului de

fermentație primară a unor musturi de bere hameiate cu două varietăți de hamei:

fermentații tradiționale şi fermentații aromatizate.

5

Pentru hameierea musturilor de bere şi pentru aromatizarea ulterioară a acestora cu

ulei essențial de hamei extras prin hidrodistilare, s-au folosit două varietăți de hamei:

Magnum şi Hüller Bitter, cultivate în zone pedo-climatice din Transilvania, la ferma

Saaschiz din Mureş, România.

Extracția şi identificarea compuşilor volatili din mustul de bere Magnum/Hüller

Bitter fiert şi fermentat (pe parcursul fermentației primare), s-a realizat prin tehnica

ITEX/GC-MS.

SCOP ŞI OBIECTIVE

Scopul tezei este de a studia eficiența antibacteriană a α şi β acizilor din hamei

asupra suşelor bacteriene Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus pentosaceus şi

Bacillus subtillis S499 şi evaluarea comparativă a unor profile de aromă ale mustului de

bere, îmbogățit cu uleiuri esențiale provenite de la varietăți de hamei cu potențial de

aromă diferit.

Principalele obiective ale prezentei teze sunt:

Investigarea condițiilor în care iso α şi β acizii din hamei prezintă activitate de

inhibiție asupra creşterii suşei bacteriene Lactobacillus plantarum THT ;

Investigarea condițiilor în care iso α şi β acizii din hamei prezintă activitate de

inhibiție asupra creşterii suşei bacteriene Pediococcus pentosaceus;

Evaluarea activității de inhibiție a iso-α acizilor din hamei asupra suşei bacteriene

Pediococcus pentosaceus, pe parcursul fermentației mustului de bere cu suşa de

drojdie Saccharomyces cerevisiae bulardii, fermentație contaminată artificial cu

Pediococcus pentosaceus şi testarea ulterioară a inhibiției asupra drojdiei;

Investigarea condițiilor în care iso-α şi β acizii din hamei prezintă activitate de

inhibiție asupra creşterii suşei bacteriene Bacillus subtillis S499;

Optimizarea unei metode ITEX/GC-MS pentru caracterizarea compuşilor volatili

din mustul de bere, pe parcursul procesului de fermentație primară;

6

Identificarea compuşilor volatili marker, pe parcursul procesului de fermentație

primară a musturilor de bere hameiate cu varietatea Magnum: fermentație

tradițională şi fermentații aromatizate cu ulei esențial de hamei Magnum;

Identificarea compuşilor volatili marker, pe parcursul procesului de fermentație

primară a musturilor de bere hameiate cu varietatea Hüller Bitter: fermentație

tradițională şi fermentații aromatizate cu ulei esențial de hamei Hüller Bitter.

CAPITOLUL 1. ACTIVITATEA DE INHIBI ȚIE A ACIZILOR AMARI

DIN HAMEI ASUPRA BACTERIILOR

1.1. ACTIVITATEA DE INHIBIȚIE A ISO α ŞI β ACIZILOR AMARI DIN HAMEI

ASUPRA SUŞELOR BACTERIENE LACTOBACILLUS PLANTARUM THT,

PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS AND BACILLUS SUBTILLIS S 499

1.1.1. Materiale şi metode

Microorganisme

Suşe bacteriene precum Lactobacillus plantarum subsp. THT, Pediococcus

pentosaceus şi Bacillus subtillis S499, de la Universitatea din Liege, Gembloux Agro

Bio Tech, din Belgia.

Extract de iso-α acizi din hamei: 30%, extract de β acizi din hamei: 10%

Extract de iso-α acizi din hamei ‘’YC ISO 30’’, de concentrație 30% şi extract de

β acizi din hamei ‘’YC ISO 10’’, de concentrație 10%, obținute prin extracție cu CO2 , şi

standardizate la concentrațiile de 30%/10% prin analiza HPLC, de la Universitatea din

Liege, Gembloux Agro Bio Tech, Belgia.

7

1.2.2. Metode microbiologice pentru determinarea activității de inhibi ție a iso-α

acizilor din hamei în mediu lichid selectiv

1.2.2.1. Creşterea bacteriilor Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus pentosaceus

şi Bacillus subtillis S499 sub influența extractului de iso-α acizi

Pentru analiza activității de inhibiție a extractului de iso-α acizi din hamei asupra

celor trei suşe bacteriene în mediu lichid selectiv, s-a folosit metoda care urmează a fii

descrisă, numită ’αβIM1’.

Probele, au fost pregătite prin inocularea culturilor lichide de Lactobacillus

plantarum THT, Pediococcus pentosaceus şi Bacillus subtillis S499 în 100 ml mediu

lichid selectiv MRS (pentru Lactobacillus plantarum THT şi Pediococcus pentosaceus)

şi în 100 ml mediu lichid selectiv 868 (pentru Bacillus subtillis S499), la care s-a adăugat

extractul de iso-α acizi de hamei în concentrații crescătoare.

Densitatea la inoculare a culturilor bacteriene lichide a fost OD600nm = 0.4-0.6 A.

Extractul de iso-α acizi de hamei (30%) a fost utilizat în concentrații de: 50mg/l,

100mg/l, 150mg/l, 200mg/l, 250mg/l (pentru Lactobacillus plantarum THT şi

Pediococcus pentosaceus) şi de 5mg/l, 10mg/l, 15mg/l, 20mg/l, 25mg/l (pentru Bacillus

subtillis S499). S-a preparat de asemenea şi o probă martor, în aceleaşi condiții, dar fără

adiția extractului de hamei.

Probele au fost inoculate cu culturi bacteriene Lactobacillus plantarum THT,

Pediococcus pentosaceus şi Bacillus subtillis S499 şi incubate la 37°C/30°C sub agitare

la 100Rpm, 4h şi 30min.

1.2.2.2. Creşterea bacteriilor Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus pentosaceus

şi Bacillus subtillis S499 sub influența extractului de β acizi

S-a utilizat metoda ’αβIM1’ , iar concentrațiile extractului de β acizi au fost:

15mg/l; 30 mg/l; 60mg/l; 100mg/l; 200mg/l (pentru Lactobacillus plantarum THT şi

Pediococcus pentosaceus) şi 0,05 mg/l; 0,15 mg/l; 0,25 mg/l; 0,35 mg/l; 0,45 mg/l,

(pentru Bacillus subtillis S499).

1.2.2.3. Metoda turbidității sau metoda densității optice

Creşterea bacteriilor în mediu lichid selectiv sub influența extractelor de iso-α şi β

acizi de hamei, a fost stabilită prin metoda turbidității sau metoda densității optice.

8

1.1.3. Rezultate şi discuții

1.1.3.1. Activitatea de inhibiție a iso-α acizilor din hamei asupra suşelor bacteriene

Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus şi Bacillus subtillis S499

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0,450

0 50 100 150 200 250 300

0

50

100

150

200

250

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

0 50 100 150 200 250 300

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 50 100 150 200 250 300

Figura 1. Creşterea suşei Lactobacillus plantarum sub influența iso-α acizilor

Timp ( minute )

D.O

. 60

0nm

Figura 2. Creşterea procentului de inhibiție pentru Lactobacillus

plantarum

Concentrația ( mg/l )

Inh

ibiți

e (%

)

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0,450

0 50 100 150 200 250 300

0

50

100

150

200

250

Figura 3. Creşterea suşei Pediococcus pentosaceus sub influența iso-α acizilor

Figura 4. Creşterea procentului de inhibiție pentru

Pediococcus pentosaceus

D.O

. 600

nm

Timp ( minute )

Inh

ibiți

e (%

)

Concentrație ( mg/l )

mg/l

mg/l

9

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0 50 100 150 200 250 300

0

5

10

15

20

25

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

0 5 10 15 20 25 30

� Suşele bacteriene Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus pentosaceus

au fost inhibate în prezența extractului de iso-α acizi de hamei (30%) la diferite

concentrații în mediu lichid selectiv MRS cu pH inițial 6.5;

� Concentrația minimă inhibitorie (MIC) de iso-α acizi asupra Lactobacillus

plantarum THT a fost de 50mg/l (7,5% inhibiție) la pH 6.2 după o incubare de 4h şi

30min la 37°C/100Rpm, iar concentrația care a generat inhibiția cea mai mare a fost de

250 mg/l (68,7% inhibiție) la pH 7.0;

� Pediococcus pentosaceus a fost inhibat la o concentrație minimă (MIC) de

iso-α acizi de 50mg/l (13,2 % inhibiție) la pH 6.4. Inhibițiile cele mai mari, au fost la 150

mg/l şi 200 mg/l (71,1%/96,3% inhibiție) la pH 6.5-7.0; Concentrația maximă inhibitorie

a fost de 250 mg/l (100% inhibiție);

� Concentrațiile de iso-α acizi utilizate pentru testul de inhibiție asupra suşei

Bacillus subtillis S499 au fost de 10 ori mai mici decât în cazul celorlalte două suşe

bacteriene, şi de asemenea aceste concentrații au fost foarte apropiate datorită

sensibilității mari a acestei bacterii la iso-α acizii din hamei;

� Concentrația minimă inhibitorie asupra suşei Bacillus subtillis S499, a fost

de 5mg/l (6,7 % inhibiție) la pH 5.9 după o incubare de 4h şi 30 min la 30°C/100Rpm;

� Rezultatele analizei asupra Bacillus subtillis S499 au arătat de asemenea

existența unei concentrații maxime inhibitorii a iso-α acizilor: 25 mg/l (100% inhibiție);

Figura 5. Creşterea suşei Bacillus subtillis S 499 sub influența iso-α

acizilor

Figura 6. Creşterea procentului de inhibiție pentru Bacillus subtillis S 499

D.O

. 600

nm

Timp ( minute )

Inh

ibiți

e (%

)


mg/l

10

1.1.3.2. Activitatea de inhibiție a β acizilor din hamei asupra suşelor bacteriene

Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus şi Bacillus subtillis S499

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0 50 100 150 200 250 300

0

15

30

60

100

200

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

0 50 100 150 200 250

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0,450

0,500

0 50 100 150 200 250 300

0

15

30

60

100

200

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

0 50 100 150 200 250

D.O

. 600

nm

Timp ( minute )

Inh

ibiți

e (%

)


Figura 7. Creşterea bacteriei Lactobacillus plantarum sub influența β

acizilor

Figura 8. Creşterea procentului de inhibiție pentru Lactobacillus plantarum

D.O

. 600

nm

Timp ( minute )

Inh

ibiți

e (%

)


Figura 9. Creşterea bacteriei Pediococcus pentosaceus sub influența

β acizilor

Figura 10. Creşterea procentului de inhibiție pentru Pediococcus pentosaceus

mg/l

mg/l

11

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0,350

0,400

0,450

0,500

0 50 100 150 200 250 300

0

0,05

0,15

0,25

0,35

0,45

-5,0

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

50,0

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5

� Suşele bacteriene Lactobacillus plantarum THT şi Pediococcus pentosaceus

au fost inhibate în prezența extractului de β acizi de hamei (10%) la diferite concentrații

în mediu lichid selectiv MRS cu pH inițial 6.5;

� Concentrația minimă inhibitorie (MIC) de β acizi asupra Lactobacillus

plantarum THT a fost de 15mg/l (4,0% inhibiție) la pH 6.2 după o incubare de 4h şi

30min la 37°C/100Rpm, iar concentrațiile cu inhibițiile cele mai mari au fost de 100

mg/l şi 200 mg/l (68,7 and 74,9 % inhibiție) la pH 6.5-7.0;

� În cazul bacteriei Pediococcus pentosaceus, aceasta a fost inhibată la o

concentrație minimă de β- acizi de 15mg/l (2,8 % inhibiție) la pH 6.2, după 4h şi 30min

incubare la 30°C/100Rpm; Inhibițiile cele mai mari, au fost la 100 mg/l şi 200 mg/l

(73,2 şi 89,6% inhibiție) la pH 6.5-7.0;

� Asupra bacteriei Bacillus subtillis S499 s-au utilizat concentrații foarte mici

de β acizi, de 100 de ori mai mici decât în cazul celorlalte două bacterii, şi de asemenea şi

în acest caz concentrațiile au fost foarte apropiate datorită sensibilității şi mai mari a

bacteriei Bacillus subtillis S499 la β acizi față de iso-α acizii din hamei;

� Concentrația minimă inhibitorie (MIC) a β-acizilor asupra Bacillus

subtillis S499, a fost 0,05mg/l (0,4 % inhibiție) la pH 5.8 după o incubare de 4h şi 30 min

la 30°C/100Rpm;

D.O

. 600

nm

Timp ( minute )

Inh

ibiți

e (%

)


Figura 11. Creşterea bacteriei Bacillus subtillis S 499 sub influența β acizilor

Figura 12. Creşterea procentului de inhibiție pentru Bacillus subtillis S499

mg/l

12

1.2. ACTIVITATEA DE INHIBIȚIE A ISO α ACIZILOR AMARI DIN HAMEI

ASUPRA SUŞEI BACTERIENE PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS PE PARCURSUL

FERMENTAȚIEI MUSTULUI DE BERE CU DROJDIE SACCHAROMYCES

CEREVISIAE BOULARDII, CONTAMINATĂ ARTIFICIAL CU PEDIOCOCCUS

PENTOSACEUS


Microorganisme

Suşa de drojdie Saccharomyces cerevisiae subsp. boulardii şi suşa bacteriană

Pediococcus pentosaceus, de la Universitatea din Liege, Gembloux Agro Bio Tech,

Belgia.

Extract de iso-α-acizi din hamei: 30%

S-a utilizat acelaşi extract de iso-α-acizi din hamei ‚’’YC ISO 30’’, cu concentrație

de 30% , ca şi în cazul testelor de inhibiție realizate pe mediu lichid selectiv.

1.2.2. Metode microbiologice pentru determinarea activit ății de inhibi ție a iso-α

acizilor în mustul de bere

1.2.2.1. Creşterea drojdiei Saccharomyces cerevisiae boulardii în mustul de bere aflat

în fermentație contaminată artificial cu Pediococcus pentosaceus sub influența iso-α

acizilor din hamei

Pentru testarea acțiunii antibacteriene a extractului de iso-α acizi din hamei, asupra

bacteriei P. pentosaceus în mustul de bere, s-a utilizat metoda microbiologică ‘αβIM1’.

Probele au fost pregătite în 100 ml must de bere (5.0 pH), la o densitate optică de

OD600nm = 0.4 A. S-au folosit cinci concentrații crescătoare de extract de iso-α acizi

(30%): 20mg/l; 50 mg/l; 100mg/l; 150mg/l; 300mg/l.

Primul pas în analiză, a fost inocularea mustului de bere cu 1 ml cultură lichidă de

drojdie Saccharomyces cerevisiae boulardii , urmând după aceea adăugarea extractului

de iso-α acizi, în concentrații diferite.

13

În final probele de must de bere au fost contaminate artificial cu 1ml cultură

bacteriană lichidă Pediococcus pentosaceus şi ulterior incubate timp de 4h şi 30min la

30°C/100Rpm.

1.2.2.2. Determinarea etanolului prin metoda UV

Etanolul este oxidat la acetaldehidă de către nicotinamid-adenin dinucleotida

(NAD), în prezența enzimei alcool dehidrogenaza (ADH).

1.2.2.3. Metoda turbidității sau metoda densității optice

Creşterea bacteriilor în mustul de bere sub influența extractului de iso-α acizi din

hamei a fost stabilită prin metoda turbidității sau metoda densității optice.

1.2.2.4. Analiza prin citometrie în flux

Analiza nivelului de expresie GFP a fost efectuată prin sortarea celulelor active

(FACS) cu ajutorul fluorescenței şi a unui citometru în flux FACScan (Becton

Dickinson).

1.2.3. Rezultate şi discuții

1.2.3.1. Activitatea de inhibiție a iso-α acizilor asupra drojdiei S.cerevisiae

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

0

300

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

Timp de fermentatie (minute)

Eta

nol

(g/l

)

Blank 20mg/l 100mg/l 300mg/l

Blank 0,249 0,618 2,240

20mg/l 0,290 0,810 1,664

100mg/l 0,309 1,067 2,240

300mg/l 0,236 1,024 2,475

30 270 1080

Figura 14. Concentrațiile de etanol în mustul de bere fermentat cu

S.cerevisiae, sub influența iso-α-acizilor şi a contaminării cu P. pentosaceus : proba martor, 20mg/l; 100mg/l;

300mg/l

D.O

. 600

nm

Timp ( minute )

Figura 13. Creşterea drojdiei Saccharomyces cerevisiae boulardii sub influența iso-α-acizilor: 300mg/l (T2) şi

proba martor (T1),

mg/l

14

1.2.3.2. Activitatea de inhibiție a iso-α acizilor asupra Pediococcus pentosaceus

A.

B.

Figura 15. Analiza viabilității celulare prin citometrie în flux a S. cerevisiae şi P.pentosaceus, intensitatea fluorescenței roşii (FL-

3) în funcție mărimea celulelor (FSC) după un tratament cu iodură de propidiu (PI): Rândul A: proba martor;

Rândul B: 20mg/l iso-α-acizi;

(t0= 30min) (t4= 4h30min) (t5= 18h)

15

C.

D.

Figura 16. Analiza viabilității celulare prin citometrie în flux a S. cerevisiae şi P.pentosaceus, intensitatea fluorescenței roşii (FL-

3) în funcție mărimea celulelor (FSC) după un tratament cu iodură de propidiu (PI): Rândul C: 100mg/l iso-α-acizi;

Rândul D: 300mg/l iso-α-acizi;

(t0= 30min) (t4= 4h30min) (t5= 18h)

16

� În comparație cu analiza pe mediu selectiv, în mustul de bere fermentat suşa

bacteriană Pediococcus pentosaceus se dezvoltă mult mai lent şi de asemenea este mult

mai sensibilă la extractul de iso-α acizi din hamei;

� Mustul de bere nu reprezintă un mediu specific de creştere pentru

Pediococcus pentosaceus, datorită pH-ului scăzut, bacteria dezvoltându-se într-un

interval de pH de 4.5-8.0 şi datorită conținutului redus în nutrienți;

� Cu privire la acțiunea iso-α acizilor asupra drojdiei S. cerevisiae boulardii,

rezultatele au arătat că aceasta nu a fost inhibată în prezența extractului de iso-α acizi

din hamei;

� Concentrația de etanol de asemenea nu a fost influențată, evidențiindu-se şi

mai mult faptul că activitatea drojdiei nu a fost compromisă;

CAPITOLUL 2. EVALUAREA COMPARATIV Ă A UNOR PROFILE DE

AROMĂ ALE MUSTULUI DE BERE: FERMENTA ȚII TRADI ȚIONALE

ŞI AROMATIZATE CU ULEIURI ESEN ȚIALE PROVENITE DE LA

VARIET ĂȚI DE HAMEI CU POTEN ȚIAL DE AROM Ă DIFERIT

2.1. ANALIZA COMPUŞILOR VOLATILI DIN MUSTURILE DE BERE HAMEIATE

CU VARIETĂȚI DE HAMEI MAGNUM/H ÜLLER BITTER, PRIN TEHNICA

ITEX/GC-MS


Hameiul

S-au luat în analiză două varietăți de hamei: Magnum şi Hüller Bitter cultivate în

zone pedo-climatice din Transilvania, la ferma Saschiz din Mures, Romania.

Suşa de drojdie

Suşa de drojdie luată în studiu a fost Saccharomyces cerevisiae W 34/70, suşă de

fermentație inferioară.

17

2.1.2. Metode de analiză

2.1.2.1. Producția la scară de laborator a musturilor de bere hameiate cu varietățile de

hamei Magnum/Hüller Bitter

Pentru acest studiu comparativ, s-au realizat două musturi de bere, unul hameiat

cu varietatea Magnum şi unul cu Hüller Bitter, fiecare dintre acestea fiind divizate

ulterior pentru trei fermentații, acestea diferențiindu-se doar prin regimul de hameiere.

Musturile (12°P) au fost obținute la scară de laborator (2L), utilizându-se malț din orz

100%. Hameiul utilizat a fost sub formă de peleți Magnum - 12.9 % şi Hüller Bitter - 6.9

% α-acizi în scopul de a obține o valoare amară a produsului finit de 10g α-acids/hL.

Musturile au fost răcite ulterior la 8-9°C şi aromatizate cu ulei esențial de hamei

Magnum/Hüller Bitter extras prin hidrodistilare, în concentrații de 0.6mg/l (aromatizare

după Opstaele, 2010) respectiv 0.9mg/l pentru fiecare varietate.

Toate musturile au fost însămânțate cu suşa de drojdie Saccharomyces cerevisiae

W 34/70, (106 cells/ml – 0,500 L/hL) şi supuse fermentării. Fermentația inferioară a fost

condusă la 8-10°C, timp de 5 zile.

2.1.2.2. Monitorizarea conținutului de compuşi volatili, pe parcursul proceselor de

fierbere şi fermentație primară a musturilor de bere hameiate cu varietățile

Magnum/Hüller Bitter

Probele de must de bere, prelevate pe parcursul fierberii acestuia au fost

codificate “ WMGb5”, “ WMGb20” şi “ WMGb60” (Magnum) şi “ WHBb5”,

WHBb20”, “ WHBb60” (Hüller Bitter), prelevarea acestora realizându-se după 5, 20, şi

60min (sfârşitul fierberii) de fierbere.

Pe parcursul procesului de fermentație primară atât probele de must de bere

nearomatizate cât şi cele aromatizate cu ulei esențial de hamei Magnum/Hüller Bitter, s-

au recoltat zilnic la 24h, 48h, 72h, 96h, 120h şi au fost codificate ’’W-varietatea-f-ore de

fermentație nearomatizată’’ şi ’’W-varietatea-VO1/VO2-f-ore de fermentație

aromatizată’’.

18

2.1.2.3. Analiza GC-MS

Extracția compuşilor volatili din musturile de bere hameiate cu varietățile

Magnum/Hüller Bitter, pe parcursul proceselor de fierbere şi fermentație primară, s-a

realizat prin tehnica ITEX/GC-MS.

Analiza a fost realizată cu ajutorul unui GC-MS Shimadzu model QP-2010, dotat

cu un autosampler AOC-5000 (CombiPAL).

Separarea compuşilor s-a realizat printr-o coloană capilară ZB-5ms: 50m x

0.32mm x 0.25µm, Phenomenex, USA.

Musturile de bere hameiate cu varietățile Magnum/Hüller Bitter, pe parcursul

proceselor de fierbere şi fermentație primară, au fost analizate prin metodele

mMB1/mMB1 s.t. 5.5- pentru musturile nearomatizate/split 100 - pentru musturile

aromatizate(metode descrise detaliat în teza de doctorat).

2.1.3.Rezultate şi discuții

2.1.3.1. Analiza musturilor de bere hameiate cu varietatea Magnum

0

5

10

15

20

25

WMGb5 WMGb20 WMGb60 WMGf 24 WMGf 48 WMGf 72 WMGf 96 WMGf 120

WMG beer wort during boiling and primary fermentation (hours)

Co

nce

ntr

atio

n (

% f

rom

to

tal

pea

ks a

rea)

D - Limonene β - Mircene

Propanoic acid 2methyl 2methylpropyl ester Propanoic acid 2methyl 2methylbutyl ester

Propanoic acid 2methyl 3methylbutyl ester Propanoic acid 2 methyl hexyl ester

Figura 17. Influența proceselor de fierbere şi fermentație ale mustului de bere WMG

asupra concentrației compuşilor volatili marker din hamei

19

0

5

10

15

20

25

WMGb5 WMGb20 WMGb60 WMGVO1f 24 WMGVO1f 48 WMGVO1f 72 WMGVO1f 96 WMGVO1f 120

Mustul de bere WMGVO1- fierbere si fermentatie primara (h)

Co

nce

ntr

atia

(%

din

ari

a to

tala

a

pea

k-u

rilo

r)




Figura 18. Influența proceselor de fierbere şi fermentație ale mustului de bere

WMGVO1 asupra concentrației compuşilor volatili marker din hamei

0

5

10

15

20

25

WMGb5 WMGb20 WMGb60 WMGVO2f 24 WMGVO2f 48 WMGVO2f 72 WMGVO2f 96 WMGVO2f120

Mustul de bere WMGVO2- fierbere si fermentatie primara (h)

Co

nce

ntr

atia

(%

din

ari

a to

tala

a p

eak-

uri

lor)


Propanoic acid 2methyl 2methylpropyl ester Propanoic acid 2methyl 2methylbutyl esterPropanoic acid 2methyl 3methylbutyl ester Propanoic acid 2 methyl hexyl ester

Figura 19. Influența proceselor de fierbere şi fermentație ale mustului de bere

WMGVO2 asupra concentrației compuşilor volatili marker din hamei

20

0

2

4

6

8

10

12

WMGf 2

4

WMGVO1f

24

WMGVO2f

24

WMGf 4

8

WMGVO1f

48

WMGVO2f

48

WMGf 7

2

WMGVO1f

72

WMGVO2f 7

2

WMGf 9

6

WMGVO1f

96

WMGVO2f

96

WMGf 120

WMGVO1f 12

0

WMGVO2f 12

0

Mustul de bere WMG, WMGVO1, WMGVO2 - fermentatie primara (h)

Co

nce

ntr

atie

(%

)

Etanol Extract aparent

Figura 20. Evoluția concentrației de etanol şi a extractului aparent, pe parcursul

procesului de fermentație primară a musturilor de bere WMG, WMGVO1, WGVO2

Mustul de bere WMG

În probele de must de bere WMG (must nearomatizat), s-au identificat 15

compuşi marker de proces, care s-au pierdut pe parcursul procesului de fermentație

primară;

Au fost identificați 5 compuşi marker de autentificare de proces, prezenți de la

inceputul şi până la sfârşitul fermentației primare a mustului de bere; Dintre acesti

compuşi doar unul a fost identificat ca şi compus marker provenit din hamei: Propanoic

acid 2-metil 2-metilbutil ester;

Compuşii 1-Butanol 3-metil acetat, Hexanoic acid etil ester (Etil caproat),

Acetic acid hexil ester, Octanoic acid etil ester (Etil caprilat), Decanoic acid etil ester

(Etil caprat) au apărut pe parcursul fermentației primare şi concentrația lor a crescut spre

sfârşitul acesteia, aceştia fiind identificați ca şi markeri de concentrare.

Musturile de bere WMGVO1/WMGVO2

S-a identificat un număr mai mic de compuşi markeri de proces: 8 compuşi

volatili;

21

Un număr mai mare de compuşi marker de autentificare din hamei, a fost

evidențiat: 15/18 compuşi volatili (WMGVO1/ WMGVO2), majoritatea aparținând

varietății de hamei;

În musturile aromatizate, concentrația compuşilor marker de concentrare scade

semnificativ, pierderile fiind mai mari în cazul mustului de bere aromatizat în

concentrație de 0.9mg/l ulei esențial Magnum, în special pentru 1-Butanol 3-metil acetat,

Hexanoic acid etil ester, Octanoic acid etil ester şi Decanoic acid etil ester;

2.1.3.2. Analiza musturilor de bere hameiate cu varietatea Hüller Bitter

0

5

10

15

20

25

30

WHBb5 WHBb20 WHBb60 WHBf 24 WHBf 48 WHBf 72 WHBf 96 WHBf 120

Mustul de bere WHB- fierbere si fermentatie primara (h)

Co

nce

ntr

atia

(%

din

ari

a to

tala

a p

eak-

uri

lor)




Figura 21. Influența proceselor de fierbere şi fermentație ale mustului de bere WHB


22

0

5

10

15

20

25

30

WHBb5 WHBb20 WHBb60 WHBVO1f 24 WHBVO1f 48 WHBVO1f 72 WHBVO1f 96 WHBVO1f 120

Mustul de bere WHBVO1- fierbere si fermentatie primara (h)

Co

nce

ntr

atia

(%

din

ari

a to

tala

a p

eak-

uri

lor)




Figura 22. Influența proceselor de fierbere şi fermentație ale mustului de bere WHBVO1


0

5

10

15

20

25

30

WHBb5 WHBb20 WHBb60 WHBVO2f 24 WHBVO2f 48 WHBVO2f 72 WHBVO2f 96 WHBVO2f 120

Mustul de bere WHBVO2- fierbere si fermentatie primara (h)

Co

nce

ntr

atia

(%

din

ari

a to

tala

a p

eak-

uri

lor)


Propanoic acid 2methyl 2methylpropyl ester Propanoic acid 2methyl 2methylbutyl esterPropanoic acid 2methyl 3methylbutyl ester Propanoic acid 2 methyl hexyl ester

Figura 23. Influența proceselor de fierbere şi fermentație ale mustului de bere WHBVO2


23

0

2

4

6

8

10

12

WHBf 2

4

WHBVO1f 2

4

WHBVO2f

24

WHBf 4

8

WHBVO1f

48

WHBVO2f

48

WHBf 7

2

WHBVO1f

72

WHBVO2f

72

WHBf 9

6

WHBVO1f

96

WHBVO2f

96

WHBf 1

20

WHBVO1f1

20

WHBVO2f1

20

Mustul de bere WHB, WHBVO1, WHBVO2-fermentatie primara (h)

Co

nce

ntr

atie

(%

)

Etanol Extract aparent

Figura 24. Evoluția concentrației de etanol şi a extractului aparent, pe parcursul

procesului de fermentație primară a musturilor de bere WHB, WHBVO1, WHBVO2

Mustul de bere WHB

S-au identificat 13 compuşi marker de proces, care spre sfârşitul fermentației

primare au dispărut;

Ca şi compuşi marker de autentificare s-au identificat doar 5 compuşi ; Nu a fost

identificat nici un compus marker al varietății de hamei;

Concentrațiile compuşilor foarte volatili, proveniți de la varietatea de hamei Hüller

Bitter, au scăzut foarte mult pe parcursul procesului de fermentație primară pierderea

unora fiind evidențiată chiar după fierbere: Propanoic acic 2-metil, 3-metilbutil ester, sau

după 24h/48h de fermentație primară: β-mircen, D-limonen, Propanoic acic 2-metil, 2-

methilpropil ester ;

Concentrațiile esterilor etilici rezultați din activitatea drojdiei, au fost mari spre

sfârşitul fermentației primare;

Musturile de bere WHBVO1/ WHBVO2

În musturile de bere aromatizate cu ulei esențial de hamei varietatea Hüller Bitter,

au fost identificați mai puțini compuşi volatili marker de proces: 5 compuşi volatili;

24

De asemenea compuşii marker de autentificare din hamei au fost într-un număr

mai mare față de mustul de bere nearomatizat: 16/18 compuşi volatili (WHBVO1/

WHBVO2), majoritatea aparținând varietății hameiului;

În comparație cu mustul nearomatizat, fermentațiile aromatizate s-au dovedit a fi

mai intense, remarcându-se de asemenea o creştere a concentrației compuşilor

terpenoidici şi a esterilor .

CAPITOLUL 3. EVALUAREA STATISTIC Ă A DATELOR

Datele obținute în urma identificării compuşilor volatili marker din musturile de

bere hameiate cu două varietăți de hamei: Magnum şi Hüller Bitter, pe parcursul fierberii

şi fermentației primare, prin tehnica ITEX/GC-MS, au fost analizate folosind metode de

analiză statistică multivariantă.

Pentru analiza statistică PCA, au fost aleşi 12 compuşi volatili marker, identificați

prin tehnica ITEX/GC-MS în musturile de bere nearomatizate şi aromatizate în

concentrație de 0.6 mg/l, la anumite intervale de timp pe durata fierberii şi fermentației

primare.

Analiza chemometrică PCA a datelor rezultate privind compuşii volatili marker

identificați în mustul de bere aromatizat cu ulei esențial, varietatea Magnum, este

prezentată în figura 25.

Biplot (axes F1 and F2: 91,79 %)

WMGVO1f 120

WMGVO1f 96

WMGVO1f 72

WMGVO1f 48 WMGVO1f 24

WMGb60

WMGb20

WMGb5

1 Butanol 3methy l acetate

Acetic acid hexy l ester

Decanoic acid ethy l

ester

Hexanoic acid ethy l ester

Octanoic acid ethy l ester

Propanoic acid 2 methy l hexy l ester

Propanoic acid 2methy l 3methy lbuty l

ester

Propanoic acid

2methy l 2methy lbuty l esterPropanoic acid

2methy l 2methy lpropy l

ester

β - Mircene

D - Limonene

-10

-5

0

5

10

-15 -10 -5 0 5 10 15

F1 (48,06 %)

F2 (4

3,73

%)

Figura 25. Analiza chemometrică PCA a rezultatelor obținute prin tehnica ITEX/GC-

MS în mustul de bere aromatizat WMGVO1 pe parcursul fierberii şi fermentației primare

25

Au fost identificate corelații semnificativ pozitive între compuşii volatili marker

Decanoic acid etil ester, 1 Butanol 3-metil acetat, Hexanoic acid etil ester şi Octanoic

acid etill ester. Alți compuşi precum D-limonenul, a stabilit corelații negative cu

compusul β-mircen în timp ce Propanoic acid 2 metil, 2metilpropil ester a prezentat

corelații pozitive cu compuşii Decanoic acid etil ester, 1 Butanol 3-metil acetat, Hexanoic

acid etil ester şi Octanoic acid etil ester.

Dintre toate probele analizate pe durata fierberii si fermentației primare, doar proba

martor a prezentat valori negative atât pe axa F1 cât şi pe axa F2 a reprezentării

compuşilor principali.

În ceea ce priveşte analiza chemometrică PCA a datelor obținute prin tehnica

ITEX/GC-MS în cazul mustului de bere aromatizat cu ulei esențial de hamei, varietatea

Hüller Bitter, prezentată în figura 26, majoritatea compuşilor volatili marker au prezentat

valori pozitive atât pe reprezentarea compuşilor principali F2 cât şi pe reprezentările F1 şi

F2.

Probele WHBVO1f72, WHBVO1f120 au avut valori pozitive pe axele F1,

respectiv F2 în timp ce probele WMGb20, WMGb60, şi WMGVO1f24 au prezentat

valori pozitive doar pe axa F2 a reprezentării compuşilor principali.

In cazul mustului de bere WHBVO1, trei probe nu au putut fi interpretate pe

această reprezentare: WMGb5, WMGVO1f48 şi WMGVO1f96, datorită faptului că se

aflau foarte aproape de centrul intersecției compuşilor principali.

Compuşii Acetic acid hexil ester şi Propanoic acid 2 metil hexyl ester, nu au putut

fii interpretați pe această reprezentare, de asemenea pentru că se aflau foarte aproape de

centrul intersecției compuşilor principali (datorită neexistenței lor în aceste probe).

26

Biplot (axes F1 and F2: 85,52 %)

WHBVO1f 120

WHBVO1f 96

WHBVO1f 72

WHBVO1f 48

WHBVO1f 24

WHBb60

WHBb20

WHBb5

1 Butanol 3methy l

acetate

Acetic acid hexy l ester

Decanoic acid ethy l

ester

Hexanoic acid ethy l ester

Octanoic acid ethy l ester

Propanoic acid 2 methy l hexy l ester

Propanoic acid 2methy l 3methy lbuty l ester

Propanoic acid 2methy l

2methy lbuty l ester

Propanoic acid 2methy l

2methy lpropy l esterβ - Mircene

D - Limonene

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

-12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12

F1 (47,07 %)

F2 (3

8,46

%)

Figura 26. Analiza chemometrică PCA a rezultatelor obținute prin tehnica ITEX/GC-MS

în mustul de bere aromatizat WHBVO1 pe parcursul fierberii şi fermentației primare

CAPITOLUL 4. CONCLUZII GENERALE

3.1. Activitatea antibacteriană a extractului de iso-α şi β acizilor din hamei asupra

suşelor bacteriene Lactobacillus plantarum THT, Pediococcus pentosaceus şi

Bacillus subtillis S 499

Dintre cele trei suşe studiate, cea mai rezistentă la acțiunea extractelor de iso-

α şi β acizi din hamei, a fost Lactobacillus plantarum THT;

Cea mai sensibilă suşă, a fost Bacillus subtillis S499 pentru care s-au folosit

concentrații de extract iso-α de 10 ori mai mici, şi β de 100 de ori mai mici, față de

celelalte suşe bacteriene;

Pentru toate bacteriile luate în studiu Lactobacillus plantarum THT,

Pediococcus pentosaceus şi Bacillus subtillis S49, extractele de iso-α şi β acizi din hamei

au prezentat o acțiune bacteriostatică, la pH 6.0-7.0, respectiv la pH 5.8-6.0 ( Bacillus

subtillis S499),pe durata unei incubări de 4h30min.

27

3.2. Activitatea antibacteriană a extractului de iso-α acizi din hamei asupra

Pediococcus pentosaceus în mustul de bere fermentat cu drojdie

Saccharomyces cerevisiae boulardii

Extractul de iso-α acizi din hamei a prezentat activitate de inhibiție doar asupra

suşei bacteriene Pediococcus pentosaceus;

Concentrația de etanol nu a fost influențată, evidențiindu-se astfel faptul că

activitatea drojdiei pe parcursul fermentației nu a fost compromisă;

Rezultatele obținute evidențiază acțiunea bacteriostatică a extractului de iso-α

acizi asupra bacteriei Pediococcus pentosaceus la pH mic: 3.8-4.2.

3.3. Identificarea compuşilor volatili marker, pe parcursul procesului de

fermentație al musturilor de bere hameiate cu varietățile Magnum şi Hüller

Bitter: fermenta ții tradi ționale şi aromatizate

În mustul WMG nearomatizat a fost identificat un singur compus marker de

proces din hamei Propanoic acid, 2 metil, 2-metilbutil ester, iar în mustul WHB nu s-a

identificat nici un astfel de marker;

S-au identificat doi compuşi marker speciali: Propanoic acid 2 metil hexil ester

(Hexil isobutirat) - marker de discriminare a varietății de hamei Magnum şi Propanoic

acid 2 metil, 2-metilbutl ester - marker de autentificare din hamei atât în musturile de

bere hameiate cu varietatea Magnum cât şi cu Hüller Bitter, excepție făcând mustul

WHB;

Scăderea concentrațiilor compuşilor marker de concentrare, rezultați pe durata

fermentației musturilor aromatizate, a fost mai intensă în cazul varietății Magnum,

darorită conținutului ridicat în compuşi volatili marker din hamei;

Profilul de aromă al hameiului în produsul finit, poate fi îmbunătățit prin

aromatizarea mustului de bere, înainte de însămânțare, cu ulei esențial de hamei în

condițiile unei fermentații normale.

28

PERSPECTIVE

1. Utilizarea metodei microbiologice de inhibiție asupra altor suşe bacteriene şi de

drojdii, în mediu lichid selectiv la pH mic;

2. Optimizarea unei metode ITEX/GC-MS, indicată pentru a oferi o amprentă mai

complexă al compuşilor volatili din musturile de bere aromatizate;

3. Aplicarea parametrilor de aromatizare în producțiile industriale.

29

BIBLIOGRAFIE SELECTIV Ă

1. Behr, J. and R. F. Vogel, 2009, Mechanisms of Hop Inhibition: Hop Ionophores,

J. of Agricultural and Food Chemistry, 57, 6074-6075

2. Blanco, C., A. Rojas, Dieudonné Nimubona, 2007, Effects of acidity and

molecular size on bacteriostatic properties of beer hop derivates, Trends in Food

Science & Technology, 18, 144-149

3. Delvigne, F., Alison Brognauxa, Nathalie Gorretb, P. Neubauerc, Angélique

Delafossed, Marie-Laure Collignond, Dominique Toyed, M. Crined, M.

Boxuse, P. Thonart, 2011, Characterization of the response of GFP microbial

biosensors sensitive to substrate limitation in scale-down bioreactors, Biochemical

Engineering Journal, 55, 131-139

4. Dragone, G., S. I. Mussatto, João Almeida E. Silva, 2007, High Gravity

Brewing by Continuous Process Using Immobilised Yeast: Effect of Wort

Original Gravity on Fermentation Performance, J. Inst. Brew., 113(4), 391–398

5. Guido, L. F., J. R. Carneiro, J. R. Santos, P. J. Almeida, J. A. Rodrigues,

2004, A.A. Barros, J. Chromatogr., 17, 1032

6. King, A. J., R. Dickinson, 2003, Biotransformation of hop aroma terpenoids by

ale and lager yeasts, FEMS Yeast Research, 3, 53-62

7. Opstaele, F. V., G. De Rouck, Jessika De Clippeleer, G. Aerts , L. De

Cooman, 2010, Analytical and Sensory Assessment of Hoppy Aroma and

Bitterness of Conventionally Hopped and Advanced Hopped Pilsner Beers, J. Inst.

Brew., 116 (4), 445–458

8. Teuber, M. and A. F. Sehmalreck, 1973, Membrane Leakage in Bacillus

subtilis 168 Induced by the Hop Constituents Lupulone, Humulone,

Isohumulone and Humulinic Acid, Arch. Mikrobiol., 94, 159-171

9. Tofană Maria, Sonia Ancuţa Socaci, Carmen Socaciu, D. E. Mihăiescu,

Cristina Semeniuc, Delia Truţa, 2009, Optimization of HS/GC-MS Method for

the Determination of Volatile Compounds from some Indigenous Hop Varieties,

Bulletin UASVM Agriculture, 66 (2), 500-505

Tic Delia _Michiu_. RO-Rezumat teza

Documents

Transcript of Tic Delia _Michiu_. RO-Rezumat teza