UNIVERSITATEA DE MEDICINA ȘI FARMACIE CRAIOVA

ȘCOALA DOCTORALĂ

TEZĂ DE DOCTORAT CORELAȚII IMUNOHISTOCHIMICE ȘI MOLECULARE LA

NIVELUL MICROVASCULARIZAȚIEI VENOASE ÎN

MELANOMUL CUTANAT PRIMAR REZUMAT

CONDUCĂTOR DOCTORAT:

PROF.UNIV.DR. FRANCISC MIXICH

Student doctorand:

GABRIELA AVRAM

Craiova 2013

2

CUPRINS

I. Stadiul actual al cunoaşterii 3

II. Contribuții personale 4

Obiective 4

Material şi metodă 4

Metoda de cuantificare a venuleor MECA-79 pozitve 6

Reacția de polimerizare în lanț ( PCR) 8

Analiza statistică 8

Rezultate 8

Discuții 10

Concluzii 12

Bibliografie selectivă 15

Cuvinte cheie: melanom, high endothelial venules, MECA-79, regresie,

chemokine, CCL19, CCL21, CCR7

3

I.Stadiul actual al cunoaşterii

Melanomul malign reprezintă o neoplazie a cărui incidență este într-o continuă

creștere, fiind responsabil de 75% din decesele cauzate de neoplaziile cutanate. Deși în

stadiile incipiente, aceasta este de obicei curabil prin rezecție chirurgicală, ratele de

mortalitate prin melanom metastatic sunt încă mari datorită absenței unui tratament

eficient pentru acestă malignitate.[1,2]

O serie de interacțiuni complexe și căi de semnalizare între celulele tumorale și

celulele sistemul imun sunt implicate în procesul de diseminare al melanomului în

ganglionii limfatici.[3,4]

În timpul răspunsului imun în condiții normale, traficulul limfocitelor din sânge

la nivelul ganglionilor limfatici are loc prin venulele mici, denumite venule cu endoteliu

înalt (High Endothelial Venules).[5, 6] HEV sunt venule postcapilare, specializate care

din punct de vedere morfologic și funcțional sunt distincte de venulele obișnuite, acestea

pot fi găsite în zonele paracorticale și interfoliculare ale ganglionilor limfatici.[7]

În melanomul malign, prezența infiltratului limfocitar tumoral (tumour infiltrating

lymphocytes,TIL) este asociată cu un efect anti-tumoral și implicit participă la procesul

de regresie a acestui neoplasm. TIL este direct corelat cu un răspuns imun eficace

împotriva celulelor tumorale, constituind un factor de prognostic pentru supraviețuire.[8]

Martinet și colab.[9] au raportat, pentru prima dată, prezența HEV în tumorile

umane solide, inclusiv în cadrul melanomului cutanat, unde acestea facilitează infiltrarea

limfocitelor la nivel tumoral. Martinet și colab.[10], au demonstrat că densitate mare a

venulelor cu endoteliu înalt a fost corelată cu supraexpresia chemokinelor CCL19 și

CCL21. De asemenea, au constatat că există o puternică legatură între densitatea

intratumorală a venulelor cu endoteliu înalt și procesul de regresie tumorală.

Prezența HEV a fost observată și în cadrul melanomului metastatic, asocierea

acestora cu acumularea de limfocite în structuri nodulare purtând denumirea de organe

limfoide terțiare (tertiary lymphoid organs, TLO).[11] TLO au similitudini morfologice,

4

celulare și vasculare semnificative cu organele limfoide secundare, în special cu

ganglionii limfatici.[12]

Anumite chemokine, CCL19 și CCL21, sunt exprimate constitutiv de celulele

stromale, celule dendritice și de către celulele tumorale din melanom.[13,14] CCL19 și

CCL21 sunt transferate la nivelul celulelor endoteliale unde interacționeză cu receptorul

său specific CCR7, direcționând astfel migrarea limfocitelor la ganglionii limfatici via

HEV.[15,16] În plus, expresia CCR7 în celule tumorale din melanom a fost corelată cu

migrarea celulelor tumorale și dezvoltarea metastazelor în ganglionii limfatici.[17,18]

II.CONTRIBUȚII PERSONALE

CAPITOLUL 4. OBIECTIVE. MATERIAL ȘI METODĂ

4.1 Obiectivele lucrării Studiul propune o evaluare completă şi amănunţită a melanomului cutanat primar,

cu ajutorul metodelor clasice de investigare (clinice și paraclinice), precum şi a unor

tehnici moderne cum sunt imunohistochimia şi reacția de polimerizare în lanț

(polymerase chain reaction, PCR).

În acest studiu au fost evaluate mai multe probe de melanom malign cutanat în diferite

etape ale progresiei tumorale urmărindu-se identificarea unor caracteristici histologice

în vederea folosiri acestora ca posibili markeri de evaluare a prognosticului. Cercetarea în

această direcţie este de mare actualitate şi obţinerea rezultatelor propuse poate contribui

la creşterea gradului de cunoaștere a mecanismelor ce intervin în răspunsul antitumoral și

respectiv în procesul de regresie.

Principalele obiective specifice ale studiului includ:

» Evaluarea caracteristicilor histologice tumorale în diferite faze de progresie

tumorală;

» Extinderea cunoștintelor legate de mecanismele ce intervin în procesul de

regresie al melanomului malign cutanat;

» Identificarea venulelor cu endoteliu înalt și legatura acestora cu diferite

caracteristici tumorale dar și cu răspunsul antitumoral.

5

Utilizând tehnica de imunohistochimie ne-am propus să cuantificam și să

caracterizăm profilul vaselor cu endoteliu înalt (HEV) în diferite tipuri de melanom

(melanoma primar, melanom cu metastaze în tranzit și metastaze viscerale). Metoda are

la bază utilizarea anticorpului monoclonal MECA-79 urmată de evaluarea microscopică a

pozitivității vaselor. De asemenea ne-am propus să evaluăm prin tenhica PCR expresia

genică a chemokinelor CCL19, CCL21 dar și a receptorului lor CCR7 în vederea corelării

gradului de expresie cu densitatea venulelor cu endoteliu înalt.

În cercetarea actuală ne-am propus de a spori cunoașterea mecanismelor

moleculare și imunologice implicate în fenomenului de regresie în corelație cu

prezența/absența vaselor cu endoteliu înalt.

4.2. Material și metodă

În acest studiu retrospectiv, am analizat 85 de probe tumorale obținute de la

pacienți diagnosticați cu melanom cutanat. Probele au fost colectate într-o perioadă de 10

ani (2002-2011), la Departamentul de Patologie, al Spitalului Clinic Universitar

Valencia, Spania.

Probele au fost puse la dispoziția noastră cu binevoința Prof. Univ. Dr. CARLOS

MONTEAGUDO în cadrul proiectului POSDRU/107/1.5/S/82705. Cazurile au fost

selectate din specimene consecutive de melanom, primite la Departamentul de Patologie

cu singura condiție ca specimenele tumorale să fie primite proaspete și nefixate. Probele

de melanom primar și metastatic, au fost manual secționate pentru a obține secțiuni

tumorale cu mai mult de 90% conținut de țesut tumoral.

Din fiecare probă s-a prelevat:

» Un fragment tumoral a fost luat pentru realizarea extracție ARN-ului. În cazul

melanoamelor primare s-a prelevat prima secțiune, imediat adiacent zonei cu grosimea

tumorală cea mai mare. Probele tumorale proaspete au fost imediat congelate în azot

lichid și păstrate la o temperatură de -80 ° Celsius.

» Cea de-a doua secțiune în parafină după tehnica de includere standard.

Lotul de studiu a cuprins cazuri de melanoam primar, metastaze în tranzit și

metastaze la distanță.

6

Probele de melanom cutanat ce prezentau metastaze ganglionare nu au fost incluse în

studiu, deoarece vasele cu endoteliu înalt reprezintă o componentă normală a

ganglionilor limfatici.

Caracteristicile clinico-patologice evaluate ale pacienților incluși în studiu sunt:

vârsta, sex, localizare, tipul histologic, ulcerația, nivelul Clark, grosime Breslow, faza de

creștere, regresia, mitoze, nevi asociați în amtecedente și gradul de infiltrare limfocitară.

Regresia tumorală a fost evaluată în conformitate cu College of American

Pathologists (CAP) 2012 respectiv: Ӕnlocuirea celulelor tumorale cu infiltrate inflamator

limfocitar, precum și prezența de fibroză la nivelul dermului, melanofagocitoză și

telangiectazii”.

Infiltratul inflamator limfocitar a fost evaluat, de asemenea, conform College of

American Pathologists (CAP) și a fost împărțit în 3 categorii:

» absent→ limfocitele nu sunt prezente la nivel tumoral sau sunt prezente, dar nu

infiltreză tumora;

» non-dens→infiltratul limfocitar apare numai focal dar nu și de-a lungul întregii

baze în faza de verticală creștere;

» dens→ infiltratul inflamator limfocitar se găseste difuz pe întreaga bază a

tumorii în faze verticală de creștere.

4. 2.1. Metoda de cuantificare a venuleor MECA-79 pozitve

Imunohistochimia a fost efectuată pe microsecțiuni, folosind probe de țesut fixate

în formol și în parafină. Tehnica a fost realizată cu ajutorul sistemului de detectare

EnVision (Dako Detection Kit Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse, ref: K5007). Markerul

folosit în acest studiu a fost anticorpul monoclonal de șoarece MECA-79 (BD

Biosciences Ref: 553863), la o diluție de 1/5 (diluție finală 100 μg / ml).

Evaluarea de imunohistochimică a fost realizată în paralel de două persoane,

folosind un microscop Olympus BX40 și un microscop digital LEICA DMD108 (Leica

Microsystems, Germania).

7

Numărul absolut al venulelor MECA-79 pozitive prezente în zona tumorii (mm2)

a fost cuantificată pentru fiecare secțiune tumorală, iar numărul mediu de vase pozitive

per mm2 a fost calculat pentru fiecare caz tumoral.

Am constatat că venulele MECA-79 pozitive ar putea fi împărțite în două grupuri

diferite: » cuboidale;

» plate.

Am definit HEV ca fiind cuboidale (C-HEV) atunci când când diametrul

lumenului a fost mai mic decât înălțimea endoteliului (Figura 1A) și HEV plate (F-HEV)

când diametrul lumenului a fost mai mare decât înălțimea endoteliu (Figura 1B)

A. B.

Figura 4A- Aspectul cuboidal al celulelor endoteliale (C-HEV) respectiv

4B aspectul plat al endoteliului vascular (F-HEV).

4.2.2. Reacția de polimerizare în lanț ( PCR) Extracția ARN-ului total a fost efectuată în conformitate cu instrucțiunile

producătorului, folosind 1 ml TRIzol Reactiv (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) / 50 mg de

țesut.

Studiul privind expresia cantitativă chemokinelor CCL19, CCL21 precum și a

receptorului lor CCR7 s-a realizat folosind 67 probe tumorale de melanom cutanat

primar, crioconservate.

Pentru extracția ARN-ului din probele de țesut tumoral s-a urmărit protocolul ce

folosește TRIZOL (AMBION), al cărui component principal este o soluție de fenol

8

monofazic și izocianatul de guanidină, ce are la bază o extracție ce conservă ARN-ul în

fază apoasă în timp ce AND-ul și proteinele rămân în fază organică.

Reacția PCR ne oferă posibilitatea de a detecta în timp real amplificarea genelor

de interes. În toate tehnicile a fost necesară o standardizare, pentru aceasta s-au folosit

gene de referință, GAPDH sau β-ACTINA (pentru control intern) exprimându-se cu

valori similare în toate tipurile tisulare. Goidin și colab. au demonstrat că expresia acestor

două gene variază inclusiv în subpopulațiile celulare în probele selecționate de la același

pacient; de asemenea au demonstrat ca aceste subpopulații exprimă cantități similare de

ARN-18S. Din acest motiv pentru acest studiu s-a utilizat pentru control intern gena 18 S

ARN (Hs99999901_s1) iar pentru gene țintă primeri CCR7 (Hs00171054_m1), CCL19

(Hs00171149_m1), CCL21 (Hs00171076_m1). Reacția de PCR s-a realizată cu ajutorul

plăcilor de 384 probe, folosind sistemul 7900 HT RT-PCR. Toate reacțiile au fost

efectuate în triplicat și rezultatele au fost analizate în mod automat de către sistemul de

software RQ manager 1.2 (PE Applied Biosystems Inc, Foster City, CA).

Pentru cuantificarea relativă a expresiei genelor, a fost utilizată metoda Ct

comparativă. Suma finală a genei țintă, standardizată la o genă de referință endogene

(ΔCt = Ct gena țintă - Ct gena referință), a fost dată de formula: 2-ΔCt, care a permis

comparația între diferitele probe ale studiului nostru.

4.3. Analiza statistică

Informațiile culese au fost înregistrate într-o bază de date alcătuită în programul

Microsoft EXCEL (Figura 5). Analiza statistică a fost realizată cu ajutorul programului

de interpretare statistică SPSS versiunea 17. Comparația între grupuri, precum și corelația

între numărul HEV și variabile clinicopatologice non-continue, a fost realizată prin

intermediul a două teste non parametrice Mann-Whitney U (MW) și Kruskal-Wallis.

CAPITOLUL 5. REZULTATE

Vârsta medie a pacienților a fost de 62 ani, ( 59 % femei și 41 % bărbați ). Cea mai

frecventă localizare a melanomului primar a fost la nivelul trunchiului ( 49 % ), urmat de

extremități( 36 % ) și de cap ( 15 % ).

9

Tipul histologic predominant a fost melanom extensiv în suprafață( 78 % ), urmat

de lentigo malign ( 9 % ) și melanomul nodular (7 % ). Infiltratul inflamator limfocitar a

fost prezent la 69% din cazuri iar regresia parțială a fost înregistrată în 51 % din cazuri.

Venule MECA - 79 pozitive au fost detectațe la 55 % (47/ 85) din cazurile de melanom

studiate. Densitatea totală a venulelor MECA – 79 pozitive per mm2 precum și densitatea

C - HEV au fost mai mare în cadrul melanoamelor primare decât în melanomul metastatic

Zonele cu cea mai mare densitate C - HEV au prezentat, de asemenea, o infiltrare mai

limfocitara proeminentă. În contrast, F - HEV nu au fost, de obicei, înconjurat de

numeroase limfocite. Am găsit o corelație semnificativă între venulele MECA – 79

pozitive și tipul histologic, deși în contrast, am observat diferențe semnificative între

densitatea HEV și localizare ( p < 0.001 ), extremitățile având cel mai mic număr de

venule MECA-79 pozitive. O corelație pozitivă a fost găsită între densitatea HEV și

infiltratul inflamator limfocitar, asocierea fiind importantă din punct de vedere statistic cu

numărul C - HEV ( p < 0.001 ). Mai mult decât atât, am găsit o corelație pozitivă între

densitatea HEV și regresia tumorii ( p < 0.005 ), corelația fiind deosebit de puternică

pentru venulele de tipul F - HEV. Nu a fost găsit corelație semnificativă între densitatea

HEV și vârsta, sex , nivel Clark , grosime Breslow, faza de crestere, figurilor mitotice, de

dezvoltare a ganglionilor limfatici sau metastaze la distanta si supravietuirea.

În ceea ce privește exprimarea intratumorală a chemokinelor CCL19, CCL21 și a

receptorul lor CCR7, un numar de 19 cazuri din cele 85 totale au fost excluse din cauza

valorilor medii ale Ct ale genei endogenă de referintă care a avut valori în afara

intervalului 9.5-13.5.

Prin urmare, posibilele corelații între nivelurile relative de exprimare ale

chemokinelor CCL19, CCL21, receptorului CCR7 și densitatea venulelor MECA-79

pozitive, respectiv tipul acestora au fost evaluate în 66 de cazuri.

Utilizînd testul de corelație Pearson am observat că nu existată la nivelul lotului

studiat nici o corelație între expresia acestor chemokine și densitate venulelor MECA-79

pozitive. În schimb am constatat că în cazurile pentru care am notat prezenta C-HEV ( 25

cazuri ) a existat un nivel mai ridicat al expresiei chemokinelor CCL19 și CCL21 decât la

cazurile lipsite de C-HEV (testul Mann-Whitney, p = 0,007 și respectiv 0,016).

10

Similar, cazurile ce au prezentat venule cu endteliu plat (F-HEV), 31 de cazuri au

prezentat un nivel mai ridicat al expresei chemokinei CCL19 și a receptorului CCR7 decât

cazurile fără F-HEV( testul Mann-Whitney, p = 0,002 și respectiv 0,039). În plus, este

interesant faptul că pentru cazurile în care C-HEV este predominantă comparativ cu F-

HEV (14/66) acestea au avut un nivel mai ridicat de expresie al chemokinelor CCL19,

CCL21 și a receptorului lor, CCR7 (Mann-Whitney, p = 0,007, 0,034 și respectiv 0,002).

În ceea ce privește procesul de regresie am notat o puternică corelație între

numarului total al venulelor MECA-79 pozitive (C-HEV, respectiv F-HEV) și prezența

procesului de regresiei tumorale. De asemenea am notat o corelație importantă între

gradul infiltratului inflamator (0, absent; 1; non-dens; 2, dens) și numărul total al

venulelor MECA-79 pozitive.

CAPITOLUL 6. DISCUȚII

În timpul răspunsului imun în condiții normale, traficul limfocitelor din sânge la

nivelul parenchimului ganglionilor limfatici are loc prin venule mici de colectare, numite

venule cu endoteliu înalt (HEV). HEV sunt venule post-capilare specializate, distincte din

punct de vedere morfologic și funcțional de venulele obișnuite și pot fi găsite în zonele

paracorticale și interfoliculare ale ganglionilor limfatici.

Prezența infiltratului limfocitar tumoral (TIL) reprezintă un răspuns imun al

gazdei împotriva celulelor tumorale. Prezența infiltratului inflamator limfocitar este

considerată ca având un prognostic favorabil în diferite neoplasme : sân, colon, plămân,

carcinom ovarien, incluzând melanomul cutanat.

Martinet și colab.[10] au descris prezența HEV (high endothelial vessels) și în

cadrul melanoamului cutanat și a demonstrat că există o densitate mai mare a HEV la

nivelul melanoamelor subțiri asociate cu nivele reduse de invazie și semne de regresie,

sugerând că densitatea HEV reprezintă un biomarker de prognostic favorabil pentru

melanom malign.

Rezultatele noastre susțin ideea că, în cadrul melanomului malign cutanat, HEV

sunt prezente în majoritatea tumorilor primare iar prezența și densitatea acestora poate

previziona eficiența răspunsului gazdei împotriva celulelor tumorale.

11

Cu privire la melanomul metastatic, prezența HEV a fost descrisă pentru prima

dată de către Cipponi și col.[11] Conform constatărilor noastre, densitatea HEV în cadrul

melanomului metastatic este foarte scăzută, tot aici am observat și un infiltrat inflamator

limfocitar mai sărac spre deosebire de tumorile primare.

Pe baza observațiilor noastre, am identificat două tipuri de HEV ce pot fi găsite

în cadrul melanoamelor cutanate :

» HEV MECA - 79 - pozitive ce prezintă endoteliul cubic ( C - HEV );

» HEV MECA - 79 - pozitive căptușite cu endoteliul plat ( F - HEV ).

În consecință, am găsit o corelație puternică între densitatea de C - HEV și

prezența/gradul de infiltrare limfocitară.

Topografic, cea mai mare densitate a infiltratului limfocitar a fost găsită în zonele

cu o densitate mare de C - HEV, un fapt care întărește rolul important al acestor vase de

sânge în recrutarea infiltratului inflamator tumoral din melanoamul primar.

Interesant, am constatat ca densitatea vaselor MECA – 79 pozitive, de tipul F -

HEV la nivelul cazurilor de melanoam primar a prezentat cea mai importantă corelație

din punct de vedere statistic cu regresiea tumorală. Putem explica această corelație a F -

HEV cu o fază de regresie târzie prin faptul că, în acest moment, limfocitele nu mai sunt

necesare și prin urmare, celulele endoteliale ale acestor vase își pierd aspectul lor

caracteristic (cubic), care este important pentru migrarea limfocitelor la nivel tumoral.

Prin hibridizare in situ, s-a demonstrat că chemokina CCL19 este exprimată de

celule non - endoteliale din zona celulară T și de către celulele perivasculare asociate

membranei bazale a HEV, dar nu a fost observată hibridizarea la nivelul celulelor

endoteliale.

În ceea ce privește expresia chemokinelor CCL21, CCL19 și CCR7 Martinet și

col.[10] au observat că densitatea vaselor cu endoteliu înalt în melanomul cutanat este

asociată cu supraexpresia receptorului CCR7 și a liganzilor săi. S-a găsit o corelație

semnificativă între expresia genelor ce codifică aceste trei proteine și densitatea HEV,

MECA - 79 pozitive. Noi am găsit o corelație pozitivă a expresiei chemokinelor CCL19

și CCL21 nivel intratumoral cu " prezența " HEV de orice tip.

În ceea ce privește eventualele diferențe biologice între tipurile de HEV cuboidal

și plat de HEV, am emis ipoteza că diferite cantități intratumorale de CCL19 și CCL21 ar

12

putea fi, asociate cu aceste diferențe morfologice și funcționale și am arătat că acele

cazuri în care numărul de C - HEV depășește pe cea a F - HEV au niveluri mai ridicate de

CCL19, CCL21 și CCR7 .

Pe baza rezultatelor noastre, evaluarea densității HEV și în special, prezența C-

HEV din cadrul melanoamelor primare poate servi ca o reflectare a unei etape active a

răspunsului imun imediat prin niveluri ridicate de CCL19 și CCL21.

Aceste constatări ar putea fi aplicate la pacienții cu melanom cutanat tratați cu

Ipilimumab, un medicament care blochează antigenul asociat limfocitelor T citotoxice,

potentând astfel răspunsul antitumoral.

În cadrul lotului nostru tumorile primare au fost deja excizate înainte de

tratament, dar credem că prezența și tipul de HEV poate fi evaluată atât în tumorile

primare cât și în tumorile recurente sau metastatice, biopsiate în timpul sau imediat după

tratament, în scopul de a găsi diferențe, în special, pentru prezența C - HEV, care pot

furniza probe de potențare a răspunsului imun determinat de tratament.

În ceea ce privește densitatea HEV, am arătat că aceasta este mai mică în tumorile

metastatice decât în tumorile primare. Prin urmare, studiile ulterioare trebuie efectuate în

scopul de a determina dacă tipul și / sau densitatea HEV sunt influențate la pacienții

diagnosticați cu melanom cutanat și tratați cu Ipilimumab.

CONCLUZII

În acest studiu am analizat probe tumorale de la 85 de pacienți diagnosticați cu

melanom cutanat, probe colectate într-o perioadă de 10 ani (2002-2011), la

Departamentul de Patologie, al Spitalului Clinic Universitar, Valencia.

Cazurile au fost selectate din specimene consecutive de melanom primite la

Departamentul de Patologie, cu singura condiție ca specimenele tumorale sa fie primite

proaspete și nefixate. Probele din tumorile primare şi metastatice au fost secționate

manual pentru a obține probe cu mai mult de 90% conținut de țesut tumoral.

1. Vârsta medie a pacienților inclusi în studiu a fost de 62 ani, (59% femei și 41%

bărbați) cu o preponderență a sexului feminin.

13

2. Tipul histologic predominant a fost de melanom cu extensie superficială, în

proporție de 78%, urmat de lentigo malign 9% și melanom nodular 7%.

3. Am studiat prezența regresiei în diferitele subgrupuri histopatologice și am

notat: 52% din cei cu melanom extensiv în suprafață prezintă regresie tumorală, 67% din

cei cu melanom dezvoltat pe lentigo malign și 25 % pentru cei cu melanom acral.

4. Analizând numărul vaselor MECA-79 pozitive și repartiția pe sexe a pacienților

incluși în studiu, am observat o densitate mai mare a venulelor MECA-79 pozitive în

rândul pacienților de sex masculin.

5. Cele mai numeroase venule MECA-79 pozitive au fost detectate în cazul

melanoamelor dezvoltate pe lentigo malign. Din punct de vedere statistic nu am găsit nici

o corelație semnificativă între venulele MECA-79 pozitive și tipul histologic, în schimb

am constatat diferențe semnificative între densitatea HEV și diferite site-uri anatomice

(p<0.001), la extremități existând cel mai mic număr de vase.

6. Procesul de regresie a fost notat la 51% din cazurile incluse în studiu.

7. Am observat o densitate mai mare a venulelor MECA-79 pozitive în cadrul

melanoamlor primare ce prezentau zone de regresie. Mai mult decât atât, am găsit o

corelație pozitivă între densitatea HEV și regresia tumorală (p<0.005), corelația fiind însă

deosebit de puternică pentru venulele de tip F-HEV.

8. O corelație pozitivă am găsit între densitatea HEV și infiltratul limfocitar,

asocierea fiind mai puternică cu densitatea C-HEV (p<0.001).

9. Rezultatele noastre susțin ideea că, în cadrul melanomului malign cutanat, pot

fi detectate venule cu endoteliu înalt în majoritatea tumorilor primare, iar prezența și

densitatea acestora poate prezice eficiența răspunsului gazdei împotriva celulelor

tumorale.

10. Am constatat că densitatea vaselor MECA–79 pozitive de tipul F-HEV la

nivelul melanoamelor primare a prezentat cea mai puternică corelație cu regresia

tumorală. Putem explica corelația dintre F–HEV și regresia tumorală cu o fază de regresie

târzie, prin faptul că, în acest moment, limfocitele nu mai sunt necesare și, prin urmare,

celulele endoteliale de la acest nivel îşi pierd aspectul lor caracteristic (cubic), care este

important pentru migrarea limfocitelor la nivel tumoral.

14

11. Ca o concluzie finală, identificarea și cuantificarea HEV poate fi de mare

interes pentru furnizarea de informații biologice și prognostice asupra răspunsului imun

de la nivel tumoral, oferind astfel un punct de plecare pentru dezvoltarea de noi strategii

terapeutice. Constatarea nostră privind asocierea puternică între densitatea F-HEV și faza

de regresie târzie din melanomul primar nu a fost raportată anterior.

Pe baza rezultatelor noastre, aducem argumente că determinarea densităţii

venulelor de tipul F-HEV asociată cu niveluri mai ridicate ale expresiei chemokinelor

CCL19, CCL21 și receptorului CCR7, ar putea servi drept indicatori utili ai regresiei

tumorale în melanomul malign.

15

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

Baekkevold ES, Yamanaka T, Palframan RT, et al. The CCR7 ligand ELC (CCL19)

is transcytosed in high endothelial venules and mediates T cell recruitment. J. Exp. Med.

2001;193:1105-1112.

Ben-Baruch A. Organ selectivity in metastasis: Regulation by chemokines and their

receptors. Clin. Exp. Metastasis. 2008;25:345-356.

Clemente CG, Mihm MC, Jr, Bufalino R, Zurrida S, Collini P, Cascinelli N.

Prognostic value of tumor infiltrating lymphocytes in the vertical growth phase of

primary cutaneous melanoma. Cancer 1996;77:1303–1310.

Drayton DL, Liao S, Mounzer RH, Ruddle NH. Lymphoid organ development: from

ontogeny to neogenesis. Nat. Immunol. 2006;7:344-353.

Förster R, Ohl L, Henning G. Lessons learned from lymphocytes: CC chemokine

receptor-7 involved in lymphogenic metastasis of melanoma. J. Natl. Cancer Inst.

2001;93:1588-1589.

Frishberg DP, Balch C, Balzer BL, et al. Protocol for the examination of specimens

from patients with melanoma of the skin. College of American Pathologists, 2012.

http://www.cap.org/apps/docs/committees/cancer/cancer_protocols/2012/SkinMelanoma

_12pr otocol.pdf.

Gauguet JM, Von Andrian UH. High endothelial venules. Immunol. Today

1995;16:449-457.

Girard JP, Springer TA. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for

lymphocyte migration. Immunol. Today 1995;16:449-457.

Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, et al. Improved survival with ipilimumab in

patients with metastatic melanoma. N Engl. J Med. 2010;363:711-23.

Hussein MR. Tumour-infiltrating lymphocytes and melanoma tumorigenesis: an insight.

Br.J. Dermatol. 2005;153:18-21.

Lens MB, Dawes M. Global perspectives of contemporary epidemiological trends of

cutaneous malignant melanoma. Br. J. Dermatol. 2004; 150: 179–185.

Liao S RN: Synchrony of high endothelial venules and lymphatic vessels revealed by

immunization. J. Immunol. 2006;177:3369-3379.

Liotta LA, Kohn EC. The microenvironment of the tumour–host interface. Nature

16

2001;411:375–379.

Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time

quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method. Methods 2001;25:402-408

MacKie RM, Hauschild A, Eggermont AM. Epidemiology of invasive cutaneous

melanoma. Ann. Oncol. 2009; Suppl 6: vi1–7.

Martinet L, Garrido I, Filleron T, et al. Human solid tumors contain high endothelial

venules: association with T- and B-lymphocyte infiltration and favorable prognosis in

breast cancer. Cancer Res. 2011;71:5678-5687.

Martinet L, Le Guellec S, Filleron T, et al. High endothelial venules (HEVs) in human

melanoma lesions. OncoImmunology. 2012;1:6, 829–839.

Monteagudo C, Ramos D, Pellín-Carcelén A, et al. CCL27-CCR10 and CXCL12-

CXCR4 chemokine ligand-receptor mRNA expression ratio: new predictive factors of

tumor progression in cutaneous malignant melanoma. Clin. Exp. Metastasis 2012;29:625-

637.

Monteagudo C, Pellin-Carcelen A, Martin JM, Ramos D. Role of chemokines in

melanoma progression. Actas Dermosifiliogr. 2011;102:498-504.

Rimm DL, Camp RL, Charette LA, et al. Tissue microarray: a new technology for

amplification of tissue resources. Cancer J. 2001;7:24–31.

Rollins BJ. Inflammatory chemokines in cancer growth and progression, Eur. J. Cancer

2006;42:760–767.

Streeter PR, Rouse BT, Butcher EC. Immunohistologic and functional

characterization of vascular addressin involved in lymphocyte homing into peripheral

lymph nodes. J. Cell.Biol.1988;107:1853-1862.

Thorn M, Ponten F, Bergstrom R, Sparen P, Adami HO. Clinical and histopathologic

predictors of survival in patients with malignant melanoma: a population-based study in

Sweden. J. Natl. Cancer Inst. 1994;86:761-769.

17