Tema 7 Bacteriofagul.Genetica.1) Bacteriofagul.Natura.Caractere. Bacteriofagi sunt numite virusurile ce infecteaz bacteriile. Un virus este un organism (o unitate genetic) care nu are structur celular, nu posed metabolism propriu i este capabil s se reproduc doar n celula-gazd. Bacteriofagii sunt parazii intracelulari obligatorii ale celulelor bacteriene. Toate bacteriile pot fi infectate de ctre bacteriofagi. In majoritatea cazurilor, un fag anumeinfecteaz doar celulele unui singur gen, unei anumite specii sau a unei tulpini -specificitatea fagului. Aceast specificitate de infecie este determinat de prezena receptorilor pentru acest fag la suprafaabacteriei-gazd.Structura bacteriofagului Structura fagilor corespunde regulilor generale ce se refer la structura virusurilor. 1. Acid nucleic (ADN sau ARN, mai frecvent dublucatenar, linear sau circular).2. Inveli proteic numit capsid, cu rol de protecie a materialului genetic. Prin receptorii de la suprafa contribuie la infecia gazdei. 3. Unii fagi pot conine i enzime (ex.: lizozim, endolizina). Capsida este constituit din subuniti proteice, capsomere, aranjate simetric ntr-oordine distinct, conferind forma fagului.

Exist 3 forme morfologice principale de fagi: Fag icosaedric: are form sferic constituit din 20 fee triungiulare, 30 muchii i 12 vrfuri (simetrie cubic a capsidei). Fag cilindric: reprezint bastonae proteice formate din capsomere, asamblate ntr-o structur tubular (simetrie helicoidal a capsidei). Fag complex: este constituit din cap icosaedric ataat la o coad helicoidal. Coada este format din doua tuburi concentrice, un tub intern rigid - canalul axial, care este inconjurat de teaca cozii, un manon contractil. Gulerul cozii (colul) se afl la jonciunea capului cu coada. a. La partea distal a cozii se afl o plac hexagonal, placa bazal, la fiecare apex fiind ancorate cte un croet i ofibr. Ele reprezent sistemul de fixare a fagului pe bacteria receptoare i contribuie la injecia materialuluigenetic n celul. Nu toi fagii au o astfel de morfologie. Unii au coad lunga i non-contractila, alii - coada scurt, sau far coad. Exist i fagi filamentoi.

2)Etapele interactiunii bacteriofagului virulent cu celula bacteriana>Fagii moderati.Profagul.Lizogenia.

Bacteriofagii exist n stare de virioni extracelulari, iar la infectarea unei bacterii ei pot duce la douatipuri de infecii: Infecie litic: determinat de fagii viruleni. La finele ciclului de multiplicare bacteria infectat este lizat elibernd fagii nou-formati. Infectie nelitica sau lizogen: determinat defagii temperai (moderai). Ei infecteaz bacteriile fr a le distruge.

INFECTIA LITIC (ciclul biologic al fagului virulent) Adsorbia. Dupa o ciocnire intmpltoare, fagul se fixeaz prin intermediul plcii bazale (la inceput prin fibrele sale, apoi prin croete) de un receptor specific la nivelul peretelui celular bacterian(uneori flageli sau pili).Penetrarea. Dup fixarea ireversibil a fagului pe peretele bacterian, n urma aciunii unei enzime (ex. lizozim) care perforeaz peretele, are loc contracia manonului care apropie capul de placa bazal, canalul axial penetreaz membrane citoplasmic a bacteriei i ADN fagic este injectatin bacterie. Expresia genomului viral (biosinteza componentelor fagice, maturizarea). Dup penetrarea ADN viral n bacterie (fag vegetativ), timp de aproximativ 12 minute,virionul nu este depistat n bacteria infectat. Aceasta este faza de eclips. Ea coincide cusinteza enzimelor virale care vor asigura ulterior: replicarea ADN fagic; sinteza proteinelor fagice; asamblarea acestor elemente.

Asamblarea fagilor. Odat ce compuii capsidei i acizii nucleici se sintetizeaz n cantiti suficiente, are loc asamblarea spontan a particulelor noi de fagi, prin incorporarea acidului nucleic n capsid. Eliberarea. Majoritatea fagilor, dup maturizare, sunt eliberai n urma lizei peretelui bacterian cu enzime ale bacteriofagului (endolizina) Timpul dintre infectie i eliberare (ciclul de reproducere) este de 20-60 minute la 37C, fagii sunt eliberai n valuri de 50-1000 fagi per celul.

INFECTIA NON LITIC SAU LIZOGEN : FAGII TEMPERAI Fagii temperai (moderai) atunci cand infecteaz o bacterie pot:- sau induce un ciclu complet de multiplicare, ce duce la lizabacteriei, - sau, mai frecvent, dup injectarea ADN-ului, s integreze acest ADN n cromozomul bacterian prin recombinare specific, formnd un profag (lizogenizare)- sau sa ramn n citoplasm sub form de plasmid. In ultimele dou cazuri bacteria nu moare i, multiplicndu-se, replic genomul viral concomitent cu propriul su genom: bacteria (cultura) este numit lizogen. Ea posed i transmite descende

3)Metode de izolare a bacteriofagului din materialul examinat. Bacteriofagii pot fi intlnii n diferite prelevate umane sau din mediul extern. Fagii indic prezena bacteriilor sensibile.IZOLAREA BACTERIOFAGILORPrelevate: ap, sol, materii fecale, puroi, etcI. Izolarea direct filtrarea prelevatelor prin filtre bacteriene, ultracentrifugare.II. Izolare prin metoda de mbogire fr nsmnare materialul de examinat se inoculeaz ntr-un mediu nutritiv lichid (pentru multiplicarea bacteriile omologe fagului cutat).Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul este supus filtrrii. In filtrat s-au acumulat fagii care s-au inmulit pe contul bacteriilor omologe din prelevat.III. Izolare prin metoda de mbogire cu nsmnare inocularea prelevatului ntr-o suspensie bacterian omolog fagului cutat. Cultura bacterian asigur mbogirea fagilor. Peste 10 ore de incubare la 37 C bulionul este supus filtrrii.

4)Metode de evidentiere a bacteriofagului:OTTo,Furt,Fisher.1. Metoda OTTO. Pe placa de geloz din cutia Petri se nsmneaz n gazon suspensia de bacterii omologe fagului. n continuare se aplic o pictur de filtrat care conine fag (cutia poate fi nclinat ca pictura s se preling). Cutia se incubeaz la 37 C timp de 24 ore. Aprecierea: dac n filtrat se aflau fagi omologi culturii bacteriene, n locul aplicrii filtratului se observ o zon de liz (colonie negativ de fag).2. Metoda FURT Filtratul ce conine fagi se amestec cu geloz topit i se toarn n cutia Petri. Suprafaa cutiei se mparte n 4 sectoare. n fiecare sector se nsmneaz n striuri culturi cunoscute de diferite bacterii. Incubare la 37 c 24 h .Aprecierea: lipsa creterii bacteriilor ntr-un sector indic prezena fagului omolog.3. Metoda FISHERSimilar cu metoda Furt, doar c suprafaa cutiei se mparte n 10 cadrane, astfel pot fi nsmnate 10 culturi bacteriene i pot fi indicai concomitent mai muli fagi.

5)Titrarea bacteriofagului in medii lichide dupa Appelman:Este utilizat pentru determinarea numrului de fagi viruleni n prelevat sau cultur. APPELMAN la diluii logaritmice a culturii de fag (10-1.....10-10) n bulion peptonat se adaug suspensie bacterian omolog fagului examinat. Dup 24 ore de incubare la 37 C se apreciaz titrul fagului: diluia maxim a fagului care nc mai provoac liza bacteriilor (mediu clar).6) Aplicarea practica a bacteriofagului.Fagoidentificarea si fagotipajul microorganismelor.

n domeniul therapeutic:- Tratamentul i profilaxia maladiilor infecioasen domeniul diagnostic- Fago-identificarea identificarea tulpinilor bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor omologi (metoda Otto, Furt, etc). Lizotipizarea (fagotipajul). Permite diferenierea unor tulpini din cadrul aceleeai specii (subdivizarea speciei n lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru tulpini de Staphylococcus aureus, Salmonella Typhi, .a. Lizotipul reprezint un marker epidemiologic. Fagii reprezint un model de studiu pentru geneticieni, fagii temperai se utilizeaz n ingineria genetic (ei pot asigura transferul de material genetic prin transducie).

7)Genetica microorganismelor.Particularitatile organizarii materialului genetic la bacteria.Plasmidele,functiile lor genetice .Genotip.Fenotip

Materialul genetic al celulei bacteriene:1. Cromosomul2. Plasmidele Modificarea patrimoniului genetic al bacteriilor are importan major n bacteriologia medical, deoarece ea poate cauza modificri n potenialul patogen al bacteriilor sau sensibilitatea lor la antibiotice.Organizarea materialului genetic la bacterii : Genomul bacterian este alcatuit din repliconi, care sunt formatiuni genetice ce se pot replica independent. Acestea sunt cromozomul bacterian,elementelegenetice extracromozomiale (plasmidele si genomul bacteriofagilor) si elementele genetice transpozabile (fragmentele de insertie si transpozonii).Cromozomul bacterian : Majoritatea genelor bacteriene se gasesc intr-un cromozom haploid, echivalent nuclear care codifica informatiile absolut necesare supravietuirii speciei in conditii normale.Pe langa dispozitia dublu spiralata spre dreapta a catenelor de ADN, acestea sufera o suprahelicare spre stanga. Acest mod de organizare denumit "supercoil" sau "supertwist" asigura pe de o parte "impachetarea" economica a ADN si pe de alta parte o configuratie optima activitatii functinale a ADN (replicare, transcriptie, recombinare).Plasmidele Plasmidele sunt molecule circulare de ADN autonome, extracromozomiale, libere in citoplasma care se replica independent de cromozom.. Plasmidele pot fi: conjugative, care se pot transfera singure la alte bacterii, ca de exemplu plasmidele de rezistenta la antibiotice neconjugative, care nu pot parasi ele insasi bacteria de origine, ci numai prin intermediul unui alt plasmid conjugativ sau a unui bacteriofag (de exemplu plasmidul care codifica secretia de beta-lactamaza laS.aureus)episomi, care se pot integra prin recombinare in cromozomul bacterian, pierzandu-si astfel autonomia de replicare. Un exemplu de episom este factorul de sex F (plasmidul F sau factorul de fertilitate).8 Variabilitatea caracterelor principale ale microorganismelor.Variabilitatea dirijata si importanta ei practica.Variabilitateala bacterii este cea care intereseaza medicina in mod deosebit. Variabilitatea este : aparitia unor caractere diferite de cele ale genitorilorImportanta variabilitatii dirijate:Modificarea materialului ereditar la bacteriilor da nastere unor tulpini bacteriene noi care, prin virulenta si rezistenta la chimioterapie, se adapteaza mai bine conditiilor de mediu si inlocuiesc bacteriile mai putin adaptabile.Suportulmaterialalereditatii este ADN. Structura si replicarea acestuia este similiara cu cea de la celulele eucariote.

9) Mutatiile spontane,induse.Fcatorii mutageni.I. MUTAII1. Substituia unei nucleotide cu alta n timpul replicrii ADN2. Deleia, inseria sau inversarea unor nucleotide ntr-o gen.Frecvena mutaiilor 10-6 10-10 pentru un caracter anumit. Modificrile determinate de mutaii (ex.: rezistena la AB) se transmit la descendeni (transmitere vertical). Unele mutaii pot fi reversibile.

10)Transferul de material genetic si recombinarea. TRANSFERUL DE MATERIAL GENETICMaterialul genetic poate fi transferat de la o bacterie la alta (transmitere orizontal). Trei mecanisme de transfer sunt posibile:Transformarea Fragmente de ADN (eliberate n urma lizei bacteriene) pot penetra n alte bacterii i se pot integra prin recombinare n ADN-ul lor. Este necesar ca bacteria care accept materialul genetic s se afle ntr-o stare particular, de competen. Transformarea se poate realiza doar n cadrul bacteriilor de aceeai specie sau din specii nrudite

Transducia Transferul de material genetic se realizeaz prin intermediul bacteriofagilor moderai. n momentul exciziei profagului din cromosomul bacterian el devine virulent, multiplicndu-se i liznd bacteria gazd. n cursul acestui proces fragmente de ADN bacterian pot fi ntroduse din eroare n particulele virale, care la rndul lor se pot integra prin recombinare n cromosomul altei bacterii acest proces reprezint transducia. Transducia poate fi specializat i generalizat

C. ConjugareaMecanismul cel mai frecvent n natur. Este un transfer de ADN (plasmide conjugative) de la o bacterie donor ctre o bacterie receptor. Bacteria donor exprim pe suprafaa sa structuri ce permit contactul dintre celule (pili F). n timpul conjugrii plasmida se replic i o copie trece prin intermediului pilului F n bacteria receptor. Transferul se efectueaz ntre bacteriile de aceeai specie, dar i ntre specii diferite. Multiple gene de rezisten la AB sunt localizate n plasmide i prin conjugare se asigur caracterul epidemic al rezistenei la AB.Plasmida conjugativ poate asigura transferul unei plasmide neconjugative sau al unor gene cromosomale (prin integrarea plasmidei n cromosom)

RECOMBINAREA1. Recombinarea generalizat (schimb de ADN ntre 2 secvene corespunztoare) 2. Recombinarea specific (integrarea sau excizia unei secvene de ADN, ex: plasmid, bacteriofag)3. Transpoziia Elementele transpozabile reprezint secvene de ADN cu lungime variabil, flancate de secvene repetate inversate. mperecherea acestor secvene permite excizia lor i renserarea n alt loc al cromosomului sau plasmidei. Unele elemente, numite transpozoni, conin gene suplimentare (frecvent gene de rezisten la AB).Transpoziia duce la rearanjamente genomice. Unii transpozoni, numii conjugativi, au capacitatea de a trece de la o bacterie la alta

11)Importanta geneticii microorganismelor pentru medicina.Ingineria genica..Importana practic: numeroase gene de rezisten la AB sunt situate pe transpozoni, ce perimite rspndirea lor. Transpozonii pot trece de la cromosom la plasmid i ulterior la alte bacterii prin conjugare. Transpozonii conjugativi pot trece direct la alt bacteria.