Tema_4

*Probleme generale ale analizei medicamentelorFR X - capitolul Monografii- Metode generale de analiz:Prelevarea probelor pentru analiz.Controlul organolepticDeterminri fizice i fizico-chimiceDeterminri cantitative Determinri farmacognosticeDeterminri farmacotehniceDeterminri biologice i biochimiceControlul preparatelor radiofarmaceutice

Analiza medicamentului defineste in sens larg examinarea partilor constituiente ale unui intreg reprezentat de medicament, presupunand specific determinarea calitativa si/sau cantitativa a compozitiei si/sau structurii substantelor sau amestecurilor utilizand strategii, metode si instrumente caracteristice.

*MEDICAMENT/SUBSTANTA MEDICAMENTOASAPROBA REPREZENTATIVAPROBA FINALA DE ANALIZATDATEEXPERIMENTALEREZULTATUL ANALIZEIBULETIN DE ANALIZA1. Prelevarea probei2. Pregatirea probei pentru analiza3. Determinari experimentale (preliminare, calitative, cantitative)- direct, fara pregatire- dupa o prelucrare specifica 4. Evaluarea critica a rezultatelor

*FR-X: lot - o cantitate de materie prim, presupus a fi unitar, din care se obin una sau mai multe serii de produse

serie - totalitatea unitilor de produs obinute n condiii identice, ntr-un singur ciclu de operaii

recipient - conine unitile de produs care constituie o serie,ex. flacoane, fiole, folii, tuburi, cutii, pungi etc.

ambalaj - conine recipientele grupate adecvatPRELEVAREA PROBELOR PENTRU ANALIZAProbele prelevate pentru determinarile calitative i cantitative trebuie s reprezinte, sub toate aspectele, caracteristicile produsului din lotul sau seria respectiva (FR-X)

*LaboratorCantitate 3p2p proba1p contraproba

*CONTROLUL ORGANOLEPTICCONTROL ORGANOLEPTICAspectCuloareMirosGust

*DETERMINARI FIZICE, FIZICO-CHIMICE I CHIMICEDETERMINAREA SOLUBILITII

prevederile de la alineatul "Solubilitate" au un caracter orientativ privind solubilitatea substanelor n diferii solveniprevederile nscrise n cadrul altor alineate, cum ar fi "solubilitatea n alcool", au un caracter obligatoriu, fiind considerate teste de puritate

Solubilitatea poate fi exprimat prin specificarea volumului de solvent (n mililitri) necesar pentru a dizolva 1 g substan solid sau 1 ml substan lichid, la temperatura de 20 20C.

Verificarea solubilitii substanelor farmaceutice nu este necesar s se efectueze n toi solvenii prevzui n monografie, ci este necesar s se controleze solubilitatea n cel puin doi solveni diferii.

Dac se constat prezena unor impuriti insolubile, se verific solubilitatea i n ceilali solveni prevzui.

*Diferitele solubiliti pot fi exprimate i cu ajutorul unor expresii - n acest caz prevederile de solubilitate se refer la temperatura de 20 5oC.

*

Indice de aciditate = numrul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor grai liberi coninui n 1 g prob de analizat (uleiuri volatile, uleiuri grase, balsamuri, ceruri etc.).

Se calculeaz conform formulei:

n care:- IA = indice de aciditate- V = volumul de KOH 0.1 mol/l n ap folosit la titrare (ml)- m = masa probei luate n lucru (grame)- 5.61 = numrul de miligrame de KOH corespunztor la 1 ml KOH 0.1 mol/l.

DETERMINAREA INDICILOR

*Indice de saponificare = numrul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor liberi i a acizilor rezultai din saponificarea a 1 g prob de analizat.


n care:- IS = indice de saponificare- V1 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea martorului (ml)- V2 = volumul de HCl 0.5 mol/l folosit la titrarea probei (ml)- m = masa probei luate n lucru (grame)- 28.05 = numrul de miligrame de KOH corespunztor la 1 ml KOH 0.5 mol/l n alcool.

*Curs Analiza medicamentelor 2009-2010

*Indice de ester = numrul de miligrame de hidroxid de potasiu necesar pentru neutralizarea acizilor grai rezultai din saponificarea a 1 g prob de analizat.


n care:- IE = indice de ester- IS = indice de saponificare- IA = indice de aciditate.


*Indice de hidroxil = numrul de miligrame de hidroxid de potasiu echivalent cu acidul acetic consumat prin acetilarea a 1 g prob de analizat.


n care:- IH = indice de hidroxil- V1 = volumul de KOH 0.5 mol/l n alcool folosit la titrarea martorului (ml)- V2 = volumul de KOH 0.5 mol/l n alcool folosit la titrarea probei (ml)- m = masa probei luate n lucru (grame)- IA = indice de aciditate-28.05 = numrul de miligrame de KOH corespunztor la 1 ml KOH 0.5 mol/l n alcool.

*Indice de iod = numrul de grame de iod fixat de 100 g prob de analizat.


n care:- II = indice de iod- V1 = volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea martorului (ml)- V2 = volumul de Na2S2O3 0.1 mol/l folosit la titrarea probei (ml)- m = masa probei luate n lucru (grame)- 0.01269 = numrul de grame de iod corespunztor la 1 ml Na2S2O3 0.1 mol/l.

*Indice de peroxid = numrul de mililitri de tiosulfat de sodiu 0.01 mol/l oxidat de iodul eliberat din acidul iodhidric prin aciunea peroxizilor din 1 g prob de analizat.


n care:- IP = indice de peroxid- V1 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea martorului (ml)- V2 = volumul de Na2S2O3 0.01 mol/l folosit la titrarea probei (ml)- m = masa probei luate n lucru (grame).

*DETERMINAREA PUNCTULUI DE TOPIREPunct de topire = temperatura la care o substan se topete complet. Dac substana se topete cu descompunere, se consider punct de topire sau punct de descompunere, temperatura la care substana i schimb aspectul (se brunific sau apar bule de gaze).

p.t. substane solide pulverizabile

se efectueaz n dispozitive speciale sau ntr-un balon Kjeldahl cu capacitatea de 150 - 250 ml, n care se introduce un termometru potrivit.la termometru se ataeaz, cu ajutorul unui inel de cauciuc sau prin aderen, un tub capilar din sticl, nchis la un capt. ca lichid de nclzire se folosete:apa distilat p.t. < 700Cparafina lichid, acidul sulfuric sau uleiul de silicon - p.t > 700C

*Determinare:proba de analizat pulverizat i uscat se introduce n tubul capilar i se taseaz pentru a forma un strat compact de 3 - 4 mm nlimetubul capilar se ataeaz la termometruinclzirea se efectueaz astfel nct temperatura s se ridice cu 3 - 40C/minut.se citete temperatura la care substana se topete complet.

n cazul substanelor care se descompun prin nclzire prelungit, balonul se nclzete, n prealabil, pn la o temperatur cu aproximativ 100C sub punctul de topire presupus, dup care se ataeaz capilarul cu substana i se continu nclzirea astfel nct temperatura s se ridice cu 1 - 20C/minut.Dac punctul de topire al probei de analizat nu este cunoscut, se efectueaz, n prealabil, o determinare orientativ.

*1 surs de lumin2 mas de prob nclzit3 termometru4 obiectiv 5 surs de lumin6 ocular 7 mner pentru poziionarea probeiTermomicroscopie ( microscop Boetius )n unele cazuri, specificate n monografii, punctul de topire se determin cu un microscop special prevzut cu un dispozitiv de nclzire.

*DETERMINAREA CONCENTRAIEI N ALCOOLse bazeaz pe distilarea alcoolului se determina densitatea sau indicele de refracie a distilatului hidroalcoolic.

Determinare:se folosete un aparat de distilare cu alonj care trebuie s ptrund n apse distil nu mai mult de 30 minutese determin densitatea relativ cu ajutorul picnometrului i se citeste concentraia n alcool a distilatului (% m/V) din tabele alcoolmetrice.

se calculeaz dupa formula:

n care:- c = concentraia n alcool a distilatului corespunztoare densitii relative (% m/V)- m = masa probei luate n lucru (g).

*METODE DE SEPARARE

cromatografice prin volatilizare - Distilare prin extracie: - lichid-lichid- solid-lichid- in faza solida- cu fluide supercritice


*METODE DE SEPARARE PRIN VOLATILIZARE - DISTILAREA -Distilarea este una din cele mai vechi metode de separare si purificare a lichidelor. Separarea se bazeaz pe diferenele dintre presiunile de vapori ale lichidelor care compun un amestec. Pe scurt, distilarea presupune nclzirea lichidelor, separnd vaporii si recondensndu-i pentru a obine un nou lichid care va fi concentrat n compui mai volatili.

PARAMETRII DE LUCRU I EFICIEN: echilibrul de distributie vapori-lichid volatilitatea relativa talerul teoretic


*Curbe de distilare


*METODE DE SEPARARE PRIN EXTRACTIE EXTRACIA LICHID LICHID

Extracie = transferul unei substane dizolvate dintr-un solvent n alt solvent nemiscibil cu primul.

Distribuia substanei respective ntre cele dou faze depinde de solubilitatea acesteia n cei doi solveni. Componenii supui distribuiei interfazice manifest preferine pentru unul sau altul dintre solveni, participnd selectiv la procesul de transfer.

Dac la echilibru concentraiile componenilor sunt sensibil diferite ntre cei doi solveni, procesul poate fi utilizat n scopul separrii lor.


*

Etape in extracia lichid lichid:

Etapa cea mai important este cea de selecionare a sistemului de solveni i stabilirea formei sub care este extras substana. Aceasta se poate realiza prin cunoaterea parametrilor procesului de extracie care sunt: constanta de repartiie coeficientul de extracie factorul de recuperare.

formarea speciei extractibile i punerea sa n contact cu sistemul de solveni adecvai2. sedimentarea3. decantarea4. determinarea cantitativ a componenilor izolai5. recuperarea solvenilor


*PROCEDEE DE EXTRACIE LICHID-LICHID

Dup sensul de curgere al lichidului i dup principiul de funcionare al instalaiei:

1. Extracia simpl2. Extracia continu3. Distribuia n contracurent.


*EXTRACIA SOLID-LICHID

Principii generalese aplic atunci cand este o faz solid sau semi-solid (material vegetal, pulberi de forme farmaceutice solide etc.) implic operaiile de extracie de tip percolare, filtrare i splare.

Are 2 etape, realizate n acelai aparat sau n aparate separate:contactul solventului cu materialul solid supus extraciei i transferul constituientului solubil (solut) n solventsepararea sau splarea soluiei de reziduul solid

Procesul complet include recuperarea solutului separat i a solventului, prin evaporare sau distilare.

APARATURAdepinde de prima etap termeni ce indic tipul de aparat utilizat:solid bed sau fixed bed - se refer la orice operaie n care prin materialul solid fix trece solventul utilizat pentru extraciedispersed contact - se refer la operaiile n care particulele solide, suspendate n fluid sunt n micare relativ unele fa de altele i fa de solvent, n timpul contactului solid-solvent.


EXTRACTIA IN FAZA SOLIDA(SOLID-PHASE-EXTRACTION, SPE)

este un proces de separare prin care compui dizolvai sau suspendai ntr-un amestec lichid sunt separai de alti compusi din amestec n funcie de proprietile lor fizice i chimice

poate fi folosit pentru a izola analiii de interes dintr-o mare varietate de matrici, inclusiv urin, snge, ap, buturi, sol, i esuturi de origine animal

utilizeaz afinitatea substanelor dizolvate sau suspendate ntr-un lichid (faza mobil), pentru un solid prin care proba este trecut (faza staionar) pentru a separa dintr-un amestec componentele dorite i nedorite

rezultatul analiii de interes dorii sau impuritile nedorite din proba sunt reinute pe faza staionar partea care trece prin faza staionar este colectat sau casat (daca conine analiii dorii sau impuritile nedorite) in cazul n care poriunea reinut n faza staionar include analiii dorii, acetia pot fi apoi separai din faza staionar prin colectare printr-un proces suplimentar, n care faza staionar se spal cu un eluent corespunztor.


CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALT PERFORMANHIGH PERFORMANCE/PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)Cromatografia de lichide de nalt performan/nalt presiune (High Performance/Pressure Liquid Chromatography - HPLC) sau de nalt vitez (High Speed Liquid Chromatography HSLC) este o tehnic:modern i rapid care elimin unele dezavantaje ale cromatografiei planare utilizat pentru separarea i determinarea soluilor organici i anorganici din orice probe, n special substane i produse farmaceutice, biologice, alimentare, industriale, de mediu etc.

Clasificaren funcie de mecanismele care stau la baza separrii componentelor,cromatografia de lichide se clasific astfel:cromatografie prin adsorbiecromatografie prin repartiiecromatografie cu faze inversecromatografie prin schimb ioniccromatografie prin excluziune molecular.


APARATURA Schema unui cromatograf HPLC1-2 sau mai multe rezervoare cu solventi o pomp de nalt presiune sistem de degazare injector pentru introducerea probei (precoloane) coloane cromatografice detectoare sistem de prelucrare a datelor


APLICAIILE HPLCANALIZA CALITATIVASepararea si identificarea substanelor medicamentoase

Identificarea unui component prezent intr-un amestec se poate face dupa cromatografiere prin:Metode cromatografice:- Dupa marimile de retentie- Metoda adaosului standard- Metoda retentiei relativeMetode spectrale

elimoclavina lisergol Alcaloizi din ergot


Atenolol

Bupivacaina

Condiii: Coloana: -Burke, 2 4.6 mm x 25 cm Faza mobil: CH2Cl2-EtOH-MeOH(85:10:5),15 mM NH4OAc Viteza de curgere: 1 ml/min; Detecie: 254 nm Timp de curgere = 16 min K = 4.41 =1.13

Condiii: Coloana: Whelk-O 1, 25 cm x 4.6 mm i.d. Faza mobil:hexan-n-propanol-trietilamina (80:20:0.1) Viteza de curgere: 1 ml/min Detecie: 254 nm Timp de curgere: 7-8 min K = 1.89 = 1.25


Efedrina

KetoconazolCondiii:Coloana: (S,S)Whelk-O 110/100(FEC) 25 x 4.6 mmFaza mobil: Diclormetan-hexan-IPA + 0.011 M acetat de amoniu (46:46:8)Viteza de curgere: 1.5 m>/minDetecie: 254 nmTimp de reinere: 16 minK = 6.60 = 1.19

Condiii:Coloana: Chiral AGP 100 x 4.0 mmPrecoloan: Chiral AGP, 10 x 3.0 mmFaza mobil: ac. octanoic 0.001 M n tampon fosfat pH 7.0Detecie: 225 nm


Analiza produilor modificai chimic (prin derivatizare)

este adesea necesar pentru a atinge o cromatografie satisfctoare. se aplic pentru componentele de toate polaritile i greutile moleculare i este un avantaj al HPLC fa de gaz-cromatografie.Este utilizat pentru a crete sensibilitatea deteciei cand detectrile utilizate nu sunt satisfctoare pentru componentele nederivate. Absorbia n UV i fluorescena pot fi obinute cu ajutorul unor reactivi. UV: N-succinimid-p-nitrofenilacetat (SNPA), fenilhidrazin i 3,5-dinitrobenzen (DNBC). derivaii fluoresceni pot fi formai cu ageni de tipul: cloruri de dansil (DNS-Cl), 4-bromometil-7-metoxicumarina (BMC) i cu unele amine fluorescente.


Detectarea imunologic

Tehnica implic colectarea de solvent n fraciuni mici (1 ml) i prelevri de medicament n fraciuni.

Necesit mult timp, dar au reversibilitate i selectivitate mai mare decat detectrile convenionale.

n multe cazuri, lichidele biologice pot fi injectate direct n coloan.

HPLC cu detectare imunologic este utilizat pentru analiza metaboliilor care sunt dificil de izolat din lichidele biologice prin extracie (glucuronidele). Astfel de compui polari nu pot fi observai n concentraii mici prin detectri convenionale, ele fiind mascate de componentele endogene.

Poate fi utilizat pentru determinarea: canabinoidelor, opioidelor, lisergidelor, glicozidelor cardiotonice din lichidele biologice.


ANALIZA CANTITATIVA

Se bazeaza pe corelatia care exista intre aria (inaltimea) picului si concentratia componentului respectiv.

Metodele de determinare constau in masurarea: Aria picului:- metode manuale- metode electronice Concentratia probei:- metoda normarii ariilor- calibrare cu standard extern- metoda standardului intern- metoda adausului standard


Determinarea cantitativ a substanelor farmaceutice

Determinarea cantitativ a vitaminei B-12 din serCondiii:HPLC/ICP-MSICP = Inductively coupled plasma emission spectrometerHPLC/ICP-MS cu sistem de lucru LC-10A, ELAN6100, Waitresss LC Coloana:COSMOSIL, 5C18-ARFaza mobil: ap-ac.acetic-isopropanol (90:1:9)Viteza de curgere: 10 ml/min

Determinarea amitriptilinei i perfenazineiCondiii:HPLC/Agilent 1000Coloana: cianopropilFaza mobil: acetonitril-metanol-fosfat monopotasicViteza de curgere 2.0 mL/minDetecie: UV 215 nm


Determinarea omapatrilatului din plasm (inhibitor de endopeptidaz)

Alte determinri cantitativeDeterminarea activitii antioxidante a capsaicinei;Determinarea cantitativ a aminoacizilor din lichidul cefalorahidian;Determinarea cantitativ a cumarinei din extracte alcoolice.CondiiiHPLC: Waters 510 HPLC pump, Waters automated gradient Coloana analitic BDS Hypercil C8 (3 m, 50 mm2 mm ID) precedat de Hypercil C8.Faza mobil: 62.5 % ap i 37.5 % acetonitril, cu acetat de amoniu 1 mmol/L la pH 5.5. Viteza de curgere: 0.2 mL/min,Volumul injectat 25 L.


Definitie Atunci cnd se folosete un gaz ca faz mobil ntr-un sistem cromatografic, tehnica este denumit gaz-cromatografie (GC, cromatografie de gaze, cromatografie in faza gazoasa). Aceast tehnic se efectueaz ntotdeauna ntr-o coloan cromatografic deoarece faza mobil trebuie s curg n mod continuu. Clasificare cromatografia gaz-lichid (GLC): - faza staionar este un lichid - fenomenul de separare are loc prin repartiie cromatografic cromatografia gaz-solid (GSC) - faza staionar este o suprafa solid- fenomenul de separare are loc prin adsorbie. GAZ CROMATOGRAFIAGAS-CHROMATOGRAPHY (GC)


APARATURA

Filters/TrapsColumnData systemSyringe/SamplerInletsDetectorsRegulators


APLICAIILE GAZ-CROMATOGRAFIEI

1. Identificarea compuilor medicamentoi si cercetarea impuritatilor

se folosesc mrimile de reinere VR i tR identitatea timpului de reinere al unui component cu acela al aceluiai component pur ofer un indiciu c cei doi componeni sunt identici timpii de reinere sunt proporionali cu punctele de fierbere ale componenilor care ies din coloan n ordinea acestora folosind diferite faze staionare selective componenii se pot separa chiar dac au aceleai puncte de fierbere timpul de retenie depinde de diferii factori (lungimea coloanei, diametru, temperatura). Din aceast cauz, n scopuri calitative se utilizeaz aa-numiii timpi de retenie relativi, trr, definii prin relaia:

unde:tA = timpul de retenie al componentei A; tet = timpul de retenie al etalonului.


Se practic adugarea n amestecul de analizat a unei componente pure. Dac are loc creterea pe cromatogram a maximului ce corespunde componentului adugat, aceasta se consider drept dovad a identitii componentei - etalon. Operaia se efectueaz pentru aceeai prob de analizat pe mai multe coloane cu diferii adsorbani.

2. Studii de stabilitate pentru materii prime si produse finite cu posibilitatea identificarii produsilor de degradare.

3. Studii farmacocinetice studii de biodisponibilitate (determinarea concentratiei plasmatice).


4. Determinarea cantitativ a compuilor medicamentoi

Principala problem a analizei cantitative n gaz-cromatografie este msurarea ariei picurilor. Aria picurilor este proporional cu cantitatea de substan ce se gsete n zona eluat. Aria maximului picului poate fi calculat prin mai multe metode: msurarea nlimii maximului simetric, considerndu-l de forma unui triunghi, cnd aria este proporional cu nlimea: metod destul de precis, dar exactitatea ei depinde de msura n care forma maximului rmne neschimbat dac cantitatea de substan variaz. - planimetrarea ariei de sub pic - aparatele moderne evalueaza ariile cu ajutorul dispozitivelor de integrare i a computerelor.

Prin metodele enumerate se msoar aria sau cantitatea de substan proporional cu aria de sub pic. Aceste cantiti trebuie transformate n valori sau procente ale componenilor analizai.

- Gaz-cromatografele moderne efectueaz automat determinrile cantitative prin ataarea la aparat a unui calculator adecvat.


Definitie:

Este o tehnica cromatografica in care faza staionar este constituita din compui n a cror structur se afl grupri acide sau bazice ionizabile capabile s rein cationi sau anioni, in anumite conditii experimentale.

Aceti compui poart numele de rini schimbtoare de ioni. Ionii schimbatorului pot fi inlocuiti de ali ioni fie din faza mobil, fie din prob, de unde denumirea de cromatografie prin schimb ionic.

Clasificare:

cromatografie de schimb cationic: schimbtorul reine ionii ncrcai pozitiv, nlocuind ionul H+ al acestuia Ex: (-SO3H, -PO3H2)

cromatografie de schimb anionic: schimbtorul reine ionii ncrcai negativ, inlocuind ionul X- al acestuia Ex: (-RN+H3X-) CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB IONIC ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY (IEC)


1324


APARATURA


APLICAIILE CROMATOGRAFIEI IONICE

Cromatografia ionica se dezvolt n zilele noastre cu aplicaii n: analiza medicamentelor chimia anorganic chimia organic


Cromatografia cu fluide supercritice (SFC) deriv din metodele convenionale ale cromatografiei de lichide, n special din HPLC i din gaz-cromatografie (GC), fiind o metod de separare puternic i universal, att la scar analitic, ct i la scar preparativ. Relaia celor trei tipuri de cromatografie este redat ma jos:CROMATOGRAFIA CU FLUIDE SUPERCRITICE SUPERCRITICAL FLUID CHROMATOGRAPHY (SFC)


Caracterisiticile fluidelor supercritice

Densitate (Kg/m3)Vscozitate (cP)Difuziune (mm2/s)Gaz10.011-10Lichid10000.5-1.00.001Fluid supercritic100-8000.05-0.10.01-0.1

LichidGazFluid supercriticDensitate mareXXDifuzibilitate mareXXVscozitate sczutXXCompresibilitate mareXX


APARATURA


APLICAIILE CROMATOGRAFIEI CU FLUIDE SUPERCRITICE

1. Determinarea unor sulfonamideCondiii:Aparatura: Sistem Gilson SF3 pSFC Coloana: 250 x 4,6 mm cu faz staionar cianopropil (mrimea particulelor 5 mm)Temperatura: 50o CSistem injecie: Model 7125, 10 mlFaza mobil: CO2 modificat cu metanol (10% primele 5 minute, cretere liniar la 15% timp de 10 minute)Viteza de curgere: 2 ml, 21 minutePresiunea: 180 bariDetecie: UV 230 nmTIC


2. Analiza unor substane anticancerigene i anti-HIV

Taxol, R = CH3

Albendazol sulfoxid (ABZSO) - antihelmintic

- Chiralpak AD, eluie cu 2-propanol - Chiralcel OD, eluie cu metanol 3. Separri chiralice


5. Alte aplicatii

Separri de vitamine liposolubileSeparri de acizi graiSepararea benzodiazepinelor din serPurificri de substane farmaceutice

Cromatografia cu fluide supercritice a fost conceputa mai ales pentru separarea:substantelor termolabilecompusilor nevolatiliunor macromolecule


Definiie: Cromatografia de excludere steric este o metod prin care moleculele se separ pe baza mrimii lor sau n termeni tehnici, pe baza volumului hidrodinamic. n mod curent, se aplic moleculelor mari sau complecilor macromoleculari, cum ar fi proteinele i polimerii industriali. Clasificare: cromatografie de filtrare prin gel (Gel Filtration Chromatography, GFC) - faza mobil este o soluie apoas. cromatografie de permeaie prin gel (Gel Permeation Chromatography, GPC) - faza mobil este de natur organic. cromatografia de excludere de mrime

CROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE


Calibrare/EchilibrareIntroducerea probei Eluia


APARATURA


APLICAIILE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUDERE

1. SEPARAREA MOLECULELOR

Separarea moleculelor cu mrime diferit gelurile care exclud substanele cu mase moleculare mai mari de 5.000 u.a.m. realizeaz o veritabil desalefiere, deoarece ionii minerali care difuzeaz liber pot fi eliminai n acest modsepararea iodului nefixat n cursul purificrii unui trasor, dup marcarea unei proteine cu 131I.

Analiza unui amestec de macromolecule purificarea fraciunilor plasmatice pentru prepararea de medicamente sau reactivi de diagnostic analiza stabilitii materialelor plastice (ambalaje)

Separarea celulelorlimfocitele izolate de monocite Fracionarea moleculelor micianaliza peptideloranaliza coloranilor


2. DETERMINAREA MASEI MOLECULAREetalonarea direct a coloanei cromatografice cu etaloane de mas molar cunoscutetalonarea indirect, plecnd de la determinarea volumului hidrodinamicdeterminarea masei molare a imunoglobulinelor IgG din forme farmceutice, presupunnd c 90 % sunt sub form de monomeri i 10 % sub form de dimeri.

3. DETERMINAREA DISTRIBUIEI MASELOR MOLECULARE se bazeaza pe relatia liniara dintre volumul de elutie si logaritmul masei moleculare.

4. DETERMINAREA PURITII UNOR SUBSTANE FARMACEUTICE Ex: determinarea unor proteine cu mase moleculare mari (ca impuritati) in insulina.


Diagrama spectrului electromagnetic al luminii


SPECTROMETRIA UV - VIS

Regiunea spectral:

UV - ndeprtat: 100 - 200 nmUV - apropiat: 200 - 400 nmVIS: 400 - 800 nm.

Absorbtia luminii in UV-VIS se datoreaza prezentei cromoforilor.

Cromofori (grupe cromofore) sunt grupe de atomi, care prezente ntr-o substan pot da natere la spectre electronice (de absorbie).

Grup auxocrom este o grup de atomi saturat care, ataat unui cromofor, modific lungimea de und (max) la care are loc absorbia i intensitatea maxim de absorbie.


Tipuri de tranziii:- tranziii - * (alcani)- tranziii - * (alchene, compui carbonilici, alchine, azo compui)- tranziii n - * (oxigen, azot, sulf, compui halogenai)- tranziii n - * (compui carbonilici)- tranziii d d* (metale)


Spectrometru UV-VIS cu monofasciculSpectrometru UV-VIS cu fascicul dublu


Substante determinabile spectrometric


SPECTROSCOPIA N INFRAROU INFRARED SPECTROSCOPY (IR)

Grupeaza metode de identificare si dozare nedestructive bazate pe absorbtia sau reflexia de catre probe a radiatiilor electromagnetice cuprinse intre 0,75 - 1000 m:

Regiunea fundamentala 2,5 - 25 m = regiunea IR analitic


APARATURA

Elementele constitutive ale unui spectrofotometru n IR: - sursa de radiaii- monocromatorul- cuva pentru proba- detectorul- amplificatorul- dispozitivul de nregistrare.


APLICAIILE SPECTROSCOPIEI N IR

nu exist compui care s prezinte spectre IR identice.

domeniul frecvenelor < 1500 cm-1 (regiunea amprentelor digitale) sunt mult utilizate pentru stabilirea identitii substanelor analizate.

1. IDENTIFICAREA SUBSTANELOR MEDICAMENTOASE

se compar spectrul substanei de analizat cu spectrul obinut n aceleai condiii cu substane etalon

se compar spectrul substanei de analizat cu spectrul etalon (din cataloage sau monografii) la care s-au precizat valorile benzilor de absorbie caracteristice i care trebuie s fie prezente i n spectrul substanei de analizat.

Spectrul etalon = se obine utiliznd drept substane aa - numitele substane de referin pentru IR (s.r.i.r.) nscrise n capitolul Standarde al farmacopeelor.


Exemple:

acetazolamid, acid iopanoic, acid nalidixic p-aminobenzoat de etil, ampicilina sodic, trihidrat de ampicilin, benzilpenicilina potasic, palmitat de cloramfenicol, clordiazepoxid, acetat de clortestosteron, cloxacilina sodic clorhidrat de cocain, acetat de cortizon, acetat de dezoxicortizon, dexametazona, dextran 40 i 70, diazepam, ergocalciferol lactobionat de eritromicin, furosemid, hidroclorotiazid, hidrocortizon, hidroxiprogesteron


2. DECELAREA IMPURITILOR SUBSTANELOR MEDICAMENTOASE

Impuritile substanelor medicamentoase provenite din procesul de obinere, ct i cele rezultate prin degradarea substanei pstrate n condiii necorespunztoare produc modificri vizibile atunci cnd se efectueaz o analiz atent a spectrului nregistrat.

Se observ: modificri ale benzilor de absorbie care trebuie s caracterizeze substana pur apariia altor benzi caracteristice unor legturi sau funcii noi.


3. DETERMINAREA CANTITATIV A SUBSTANELOR MEDICAMENTOASE determinarea cantitativ a substanelor medicamentoase ca atare determinarea cantitativ a substanelor medicamentoase din produsele farmaceutice. Probleme: realizarea unor condiii standardizate respectarea legii Lambert-Beer.

Exemplu: Alilestrenolul - se foloseste solvent CCl4. maximele de absorbie caracteristice = 1310 cm-1, 1650 cm-1. legea Lambert-Beer se verific folosind soluii de concentraii = 0,5-2 g% (m/v). se poate determina n aceste condiii i din diverse produse farmaceutice.


Componentele unui spectrometru FT-IR


Avantajele FT-IR

Vitez: deoarece toate frecvenele sunt msurate simultan, majoritatea determinrilor FT-IR sunt de ordinul secundelor

Sensibilitate: sensibilitatea metodei este mult mbuntit deoarece detectorii utilizai sunt mai sensibili, zgomotul de fond este mult sczut, iar scanarea rapid permite coadiia mai multor scanri, reducnd zgomotul msurat ntmpltor la nivelul dorit (semnal mediu)

Simplitatea aparaturii: oglinda mobil a interferometrului este singura parte a aparatului care se mic continuu, astfel nct este foarte puin posibil o defectare mecanic

Calibrarea intern: aceste aparate utilizeaz ca standard de calibrare intern a lungimii de und, lasere cu He, Ne. Aparatura are auto-calibrare i nu necesit o calibrare de ctre utilizator.


APLICAIILE FT-IR

metod utilizat pentru identificarea oricrei probe. sensibilitatea va face posibil identificarea unei cantiti foarte mici de impuriti, ceea ce demonstreaz c analiza FT-IR este o metod valoroas n controlul de calitate sau n aplicaiile asigurrii calitii. sensibilitatea i precizia detectorilor FT-IR, la care se adaug gama larg de software de algoritm au crescut utilizarea practic a metodei n analiza cantitativ. Evaluare i identificare: de compui organici, anorganici n formularea medicamentelor n determinarea omogenitii materialelor n medicina legal.


SPECTROSCOPIA N IR APROPIATNEAR INFRARED SPECTROSCOPY (NIRS)

este o tehnic rapid i nedistructiv, capabil de a furniza date despre constituenii oricrei matrie acoper lungimi de und cuprinse de la mijlocul infraroului pn la domeniul vizibil. 13000-4000 cm-1 sau 800-2500 nm


APARATURA Spectrofotometru NIR: surs de lumin monocromator suport care s in proba sau o suprafaa pe care se pune proba detector prin intermediul cruia se fac msurtori de reflexie sau transmitan.


Moduri de masurare NIR


AVANTAJE NIR

nu este necesara prepararea probei reducere timp de analiza metoda nedistructiva cantitati mici de reactivi metoda excelenta pentru analiza probelor solide

metoda neinvaziva


Definitie:

Spectroscopia de mas este o metod instrumental de analiz care se bazeaz pe fragmentarea moleculelor substanelor organice sub aciunea unor radiaii cu energii mari de pn la 100 eV, iar din analiza - numrului - sarcinii - masei fragmentelor rezultate - se obin informaii asupra structurii identitii substanelor cercetate.Datorit acumulrii de energie are loc fragmentarea moleculelor cu ruperea unor legturi interatomice, proces prin care rezult : - mai ales ioni pozitivi (rar negativi)- radicali- ioni radicali - molecule neutre. Aceste fragmente constituie piese importante de reconstituire a structurii moleculare.

SPECTROSCOPIA DE MASA - MASS SPECTROSCOPY (MS)


Reprezentarea spectrelor de mas: spectrul de bare al metanolului; spectrul de mas continuu al unei substane organice oarecare


Diagrama unui spectrometru de masInjector Sursade ioniAnalizor de masaDetectorSistem dateSistem de presiune inalta


Surse de ionizare

Ionizarea prin impact electronic (Electron ionisation - EI) Ionizarea chimic (Chemical ionisation CI) Bombardarea cu atomi rapizi (Fast Atom/Ion Bombardment FAB)Ionizarea prin desorbie laser asistat de o matrice (Matrix assisted laser desorption ionization - MALDI)Ionizarea la Presiune Atmosferic (Atmospheric Pressure Chemical Ionization - APCI) Ionizarea prin electrospray (Electrospray Ionization - ESI)


APLICAIILE SPECTROSCOPIEI DE MASInterpretarea spectrelor+++++


Identificarea unui compus cu ajutorul spectrotecii MS

Exist spectroteci care corespund unor colecii (biblioteci) de spectre de mas ale substanelor cunoscute, n care sunt incluse (codate) principalele picuri ale acestora.Utilizarea acestor spectroteci, n care se caut picurile care intereseaz, implic urmtoarele etape:

reducerea datelor, prin care spectrul substanei care ne intereseaz este redus la cel mult 16 picuri, acordnd preferin picurilor mai grele, mai semnificative dect picurilor uoare; fiecare spectru este redus n bibliotec la 8 picuri

precercetarea, care const n selecionarea spectrelor reduse din spectrotec, la acelea care au picuri cu aceleai poziii ca i picurile din spectrul redus al substanei cercetate, chiar dac intensitatea lor este diferit

cercetarea principal, care const n reluarea seleciei precedente printr-un algoritm mai subtil care include printre criteriile de alegere: intensitatea masa raritatea picului, afectnd un indice de identitate de la 0 la 1000 fiecrui spectru, prin aceasta realizndu-se o clasare prin similaritatea descresctoare.Exist numeroi algoritmi de cercetare, iar prin modificarea criteriilor de alegere se poate reduce cercetarea prin verificarea i alegerea ntre diverse clasamente.Cea mai important spectrotec de mas este aceea a NIST (National Institut of Standards and Technology), care includea peste 250000 de spectre la nivelul anului 1996, iar n prezent numrul spectrelor este desigur mai mare.


Stabilirea formulei moleculare

Spectrele de mas pot fi utilizate cu anse mari de certitudine pentru stabilirea formulei moleculare a unei substane, deoarece poziia fiecrui pic care provine din fragmentarea unui ion precedent (exceptnd cazul unor reamenajri) ofer informaii care se pot utiliza pentru stabilirea ionului n cauz. Exemplu: prezena unui pic cu (M-1)+ - ionul s-a format prin pierderea unui atom de hidrogen prezena unui pic cu masa (M-15)+ - ionul provine din ionul M+ prin pierderea foarte probabil a unei grupe de metil (CH3 cu masa M=15) daca ionul M+ conduce la un ion cu masa (M-18)+ - ionul a pierdut o molecul de ap.

Trebuie s se in seama c, de regul, procesul de fragmentare sau cel de reamenajare a ionilor care se formeaz din ionul molecular trebuie s conduc la radicali sau ioni mai stabili dect ionul din care provin.



****

Tema_4

Documents

Transcript of Tema_4