5.2. Enzimecoagulante din lapte5.2.1.NaturasiidentitateacoagululuisicoagulantilorPrimulpreparat din cheagstandardizatcomercializat, a fostprodussivandut de Cro.Hansen A/S, Danemarca in anul 1874 si a fost probabil primul tip de enzima comercializata.

Tabel. 5.1 Enzime utilizate in tehnologia produselor lactateEnzimeExempleaplicabilitate

ProteinazeacideCoagularealaptelui

Proteinazesi peptidase neutreMaturarea accelerate a branzei; eliminareagustuluiamar; branzamodificataenzimatic;produciadealimentepe baz de laptehipoalergenic

LipazeAccelereazamaturareabranzei; branzamodificataenzimatic; modificabranzamodificataenzimatic; modificari de aroma a branzei; modificareastructuriiproduselor lactate grase

beta-galactozidazaProduse din zer cu lactozaredusa

LactoperoxidazaSterilizareala rece alaptelui; nlocuitori de laptepentruviei;

Lizozimulnlocuitorde nitraipentru casuri ibrnzcuochii

Acesta a fostatunciinceste, prin definiie, unextractdinrumegtoareabomasum, n mod idealconinnd n principalchimozina, enzimacare este specifica pentruhidrolizakappa-cazeinei idestabilizarea cazeinei.Cu toate acestea, n funcie de vrstavieilordin care esteextras, cheagulpoate coninemai multsaumai puinapepsina, o altproteazacid cuo gama larga de substrat de cazein.Atat chimozina cat si pepsina dar si toate enzimele de coagulare din lapte utilizate in industria branzeturilor, sunt clasificate ca proteinaze aspartice cu numarul 3.4.23 in Comisia Enzimelor.Deoarece existacum mai multetipuri sisurse diferitedeenzimede coagulare din lapte pe pia, Federaia Internaionalde lactate(IDF /FIL) decreta oficial ca denumirea cheag este rezervata pentru preparate enzimatice din stomacul ierbivorelor si alte enzime de coagulare ( de regula cele microbiene) ar trebui numiti coagulanti.In ceea ce ii priveste pe specialistii in branzeturi, cheagul si coagulantii sunt mai utili daca sunt clasificati in functie de sursa, nu doar in functie de provenienta animala, de materia vegetala sau microbiana din care sunt preparate, fiind necesara aceasta clasificare pentru a selecta cea mai potrivita enzima pentru soiul de branza respectiv. Acesta este un aspect foarte important in tehnologia fabricarii branzeturilor deoarece afecteaza productia branzei, durata de stocare dar si aroma si textura finala.5.2.2. Principalele caracteristici ale cheagului si coagulantilor din diferite surseDintre cheagu obtinut de la animale, cheagul de vitel este considerat in general enzima ideala pentru coagularea laptelui, in industria alimentara. Aceasta preferinta apare partial prin familiarizarea traditionala cu produsul prin utilizare de lunga durata dar, are de asemenea o buna baza stiintifica in care cheagul de vitel contine in general 80-90% chimozina. Asta inseamna ca cea mai mare parte a pierderii cazeinei in cuva de branza este intreptata in special catre kappa cazeina la coagularea laptelui, dar nu si la alte cazeine.5.2. Principalele surse de enzime coagulante din lapte (cheag si coagulanti) folosite in prepararea branzeturilor.TipSursaEnzima componentCaracteretehnologice

Animale

Cheag de vitel;Cheag de bovineStomaculbovinelorChimozina A si BPepsinasigastrinaConcentratie mare de kappa-cazeina: hidrolizagenerala a cazeinei; randament maxim; texturasi aroma traditionala in branzeturile dure si semi-dure

Pasta de cheagStomac de oaieSauvitelChimozina A si B,Pepsina si gastricina, lipazapregastricaCoagularesirandamentoptim cu o aroma picante pa procesare

Cheag de porcsioaieStomaculanimaluluicorespunzatorChimozina, pepsin sigastrinaNu se utilizeaz pe scar larg; cel mai bine utilizat cu lapte de la aceeai animal

Vegetale

PlantacoagulantaCvnaracardunculusCiprozina, cardozinaFabricate la nivel localpescarmicpentrubrnzeturiartizanale

Microbiane

Coagulant mieheitipL,TLiXLRhizomucormieheiProteinazaasparticaR. mucorEnzimeletermostabilede tip Lsiproteoliticefolosite in procesareabanzeturilortari

Coagulant pusillusRhizomucorpmillusProteinazaasparticaR. mucorProprieti similare cu-enzima miehei tip L, darmaisensibil la pH

Coagulant parasiticaCryphonectraparasiticaProteinaza asparticaC. parasiticaFoarte resistant la caldura; utilizat in preparareabranzeturilor de specialitateprecum Ementaller

Chimozina obtinuta prin fermentareKluyveromyceslactis;AspergillusnigerChimozina din vitelAceleasi caracterisitici ca ale chimozinei din vitel

Proteoliza nespecifica a alfa si beta cazeinei in timpul fomrmarii casului poate duce la pierderea de azot din zer, reducand randamentul la procesarea branzei.Cea de-a doua enzima din cheagul de vitel este pepsina (CE 3.4.23.1). Se crede de catre producatorii de branzeturi traditionale ca aceasta creste calitatea cheagului in procesul de maturare a branzei, insa nu exista nicio dovada concreta. Intr-adevar producatorii de branza traditional fac sortimente de branza excelenta (in special Cheddar) folosind chimozina pura obtinuta din clonarea drojdiei GM si fungilor asemanatoare chimozinei gena.Ovine, caprine i porcine pot oferi preparate pe baza de cheag care sunt enzimatic similare ca si cheagul din vitel, insa nu este ideal pentru coagularea laptelui de vaca . Cheagul pasta este o forma bruta de cheag, obtinuta din stomacurile macerate a viteilor alaptati, miel sau ied si contin lipaza pregastrica pentru a imbunatatii aroma branzei . Este folosita in general in sortimentele de branza italienesti.Multe plante produc proteinaze ce coaguleaza laptele.CU toate acestea nu sunt produs pentru comercializare, ci sunt folositi la nivel local, ( in special in Portugalia) pentru procesarea branzei artizanale. Coagulantul micribian cel mai cunoscut sic el mai utilizat este cel produs de Rhizomucor miehei. Preparatul comercial este un amestec de aspartil proteinaze si se comercializeaza in trei tipuri. Enzima nemodificata (tip L) este foarte rezistenta la cardura si hidrolizeaza toate cazeinele nu doar kappa cazeina. Desi aceasta a fost folosita in poricesul de fabricatie al branzei moale, si altor branzeturi, actiunea proteolitica nespecifica reduce randamentul branzei, deoarece casul petrece o perioada mai lunga de timp in zer si provoaca amaraciune pe termen lung. Rezistenta termina a enzimei este de asemenea un potential dezanvantaj in fabricarea branzei unde zerul este procesat ca ingredient alimentar. Tratarea si prelucrarea termica nu elimina activitatea coaguluilui si poate cauza distrugerea proteinei in alte produse alimentare, in care protein din zer este ingredient suplimentar (ex .carnati, placinte cu carne, supe).Pentru a depasi aceste probleme, producatorii de enzime pentru produse lactate au dezvoltat versiunea termolabila a coagulantului R. miehei (TL si XL) folosind oxidarea chimica pentru a modifica lanturile laterale a metioninei. Aceste enzime pot fi denaturate prin pasteturizarea zerului si sunt de asemenea mai putin proteolitice decat proteinaza native. Acesti coagulanti sunt o buna alternative pentru chimozina produsa prin fermentatie insa textura de branza tare obtinuta cu acestia devine friabila mult mai rapid in comparative cu cea obtinuta prin chimozina. De asemenea aroma branzei tari difera de cea la care s-a folosit chimozina.Cea mai utilizata alternative de cheag de vitel la nivel mondial In industria branzeturilor este chimozina obtinuta prin fermentatie. Este produs prin fermentatie la scara larga de GM Kluyveromyces lactis sau Aspergillus niger. In ambele cazuri microorganismele au fost modificate cu ajutorul tehnologiei genetice prin incorporarea genei pro-chimizina de vitel in organismul gazda cu o enzima adecvata pentru a asigura secretia necesara mediului de crestere.Enzima este usor de recoltat si purificat din cultura, spre deosebire de sistemul de productie pe baza de E.coli ce produce chimozina folosind corpi de incluziune.

5.2.3. Productia de cheag si coagulanti

Cheagul din animale sunt secretate de mucoasa stomacului ca proenzime inactive ce pot fi extrase cu usurinta prin macerarea cu apa, saramura slaba sau solutie tampon. Un conservant ( de obicei benzoate de sodium) este adaugat in aceasta etapa pentru a preveni cresterea microbiana pe parcursul etapelor viitoare de productie, ce implica filtrarea si acidifierea pentru a active proenzimele.Dupa scaderea pH-ului la 5.5 si dupa a doua filtrare pentru a clarifica extranctul, preparatul este standardizat la coagularea laptelui de comert filtrate steril si ambalat sub forma de produs enzimatic lichid pentru a fi transportat spre refrigerare. Cheagurile de animale nu sunt produse purificate dar contine diferite enzime retinute de mucoasa tesutului in timpul sacrificarii. Cu toate, acestea, enzimele de vitel de buna calitate din tesutul abdominal sunt chimozina si pepsina, fiind necesara doar standardizarea acestora.Coagulantii microbieni sunt produsi prin fermentatie submersa cu alimentare discontinua a organismelor de productie Rhizomucor sau Cryphonectria. Fermentatia dureaza de obicei mai multe zile dupa care enzima este recuperate sub forma de filtrate brut, concentrata prin ultrafiltrare si standardizata. Nu este necesara purificarea de catre producator pentru inlaturarea altor enzime secundare, precum lipazele si hidrolazele de amidon desi tulpinile de productie sunt selectate atent pentru a minimaliza numarul acestor contaminanti.Este important de retinut ca, coagulanti precum Rhizomucor contin cantitati semnificative de enzime din amidon degradat ce trec in compozitia zerului si nu sunt indepartati prin prelucrarea acestuia. Concentratele proteice din zer din fabricile ce utilizeaza coagulanti microbieni nu ar trebui sa fie folositein retetele de sosuri, sau alte alimente ce contin amidon ca agent de ingrosare.Chimozina obtinuta prin fermentatie este provenita in principal de la drojdia GM (Kluyveromyces lactis) sau mucegai filamentos GM (Aspergillus Niger). Ambele organisme sunt folosite de multa vreme in fermentatii alimentare si in productia de enzime alimentare , iar modificarile genetice rezultate sunt aprobate ca fiind sigure in Europa si America de Nord.Un accent deosebit se pune pe etapa de acidifiere a procesului de fernentatie pentru obtinerea chimozinei pentru a asigura eliminarea organismului sursa si ca ADN-ul este descompus inainte ca enzima sa fie izolata din fermentat. 5.2.4. Formularea si standardizarea cheagului si coagulantilor.Cel mai comun tip de cheag produs este cel in stare lichida, este ieftin, usor de adaugat in retetele pentru branzeturi si usor de amestecat. Toate produsele sunt sunt formulate intr-un mod similar, indiferent de sursa lor, si sunt folosite aceleasi tipuri de stabilizatori (clorura de sodiu, sorbitol, glycerol). Singurul conservant folosit este benzoatul de sodium, insa unii producatori sterilizeaza produsele prin filtrare pentru a preveni dezvoltarea bacteriilor in produsele lichide depozitate. Unele cheaguri si coagulanti sunt comercializati sub forma de praf sau tableta, in special pentru livrarea in tarile calde.Indiferent daca sunt lichide sau solide, produsele sunt standardizate astfel incat un anumit volum sau greutate sa aibe aceeasi activitate de coagulare a laptelui sau putere. Puterea coagulului sau cheagului este determinata printr-o metoda standard internationala IDF standard 157A, dezvoltata de catre Organizaia Internaional de Standardizare (ISO) i Asociaia Chimitilor analisti oficiali (AOAC). Prezentul standard utilizeaza unitatile de coagulare a laptelui si masoara coagularea acestuia la pH 6.5. Standardul 157A foloseste preparat din cheag de vitel ca referinta, si este folosit la standardizarea cheagurilor si a chimozinei obtinuta prin fermentatie (FPC). O metoda similara este folosita si la standardizarea coagulantilor microbieni. Metoda standard pentru a stabili compozitia cheagului ( chmozina si pepsina %) este IDF 110B. ]]]]5.4.2 Tehnologia de suplimentare a enzimelorCa si in cazul cu cele mai bune idei stiintifice, transferul tehnologiei in lumea reala a inovatiei proceselor si fabricare a produselor prezinta provocari unice si neprevazute. Astfel s-a intamplat pentru aceea dintre noi care au incercat introducerea enzimelor proteolitice in branza. Proteinazele adaugate la defalcarea cazeinei din branza sunt necesare in cantitati mici deoarece, ca toate enzimele ele sunt catalizatori si o cantitate mica va converti o cantitate mare de substrat. Acest lucru este bun din puct de vedere al costurilor si eficientei conversiei dar aceasta inseamna amestecarea enzimelor active cu tone de branza. Suplinetarea uniforma cu enzime in matricea branzei este un procedeu destul de greu in sine, insa problema distribuirii unei cantitati asa mici este departe de a fi banala. Adaugarea enzimelor in laptele pentru branza ar fii ideala din punct de vedere logic, deoarece cultura starter si cheagul sunt de asemenea adaugate in lapte si amestecate. Dar, spre deosebire de etapele traditionale ale retetei, proteinazele de maturare incep rapid eliminarea peptidelor solubile din cazeina.Aceste peptide sunt pierdute in zer cand cheagul de branza este separat, cauzand pierderi inactptabil ale randamentului. De asemenea defalcarea premature a cazeinelor perturba structura lor ordonata, previne formarea gelului, si face casul moare si imposibil de procesat in etapele urmatoare de acidiere ale acestuia, inainte de sarare si presare in branza. Aceste probleme sunt accentuate de pierderea enzimelor adaugate in zer de aproximativ 95% fiind clar ca adaugarea proteinazelor direct in lapte nu este o optiune.

Daca preparatele peptidide ar fii mai ieftine, ar putea fii adaugate pe aceasta cale insa marile fabric de branza vand zerul pe post de concentrat pentru a fii adaugat in produse alimentare, process necesar functionalitatii acestora. Orice enzime de maturare trebuie distruse inainte ca zerul sa fie procesat si vandut. Microincapsularea enzimelor este solutia evidenta pentru problema de mai sus, pentru a proteja cazeina din lapte si pentru a asigura prinderea acestora fizic in matricea casului gelatinizat. Optiunile includ grasimi, amidon sau capsule gelatinoase dar una dintre acestea nu au un mecanism satisfacator de eliberare in branza. Un grup de cercetatori a dezvoltat un tip special de lipozomi fosfolipidici, tehnologie eficace pentru a depasi aceasta problema. Proteinazele si peptidazele au fost inglobate in lipozomi si au fost adaugati in laptele pentru branza. Majoritatea enzimelor de maturare au fost inglobate in spatiul in spatiile cu apa din particulele de cas si foarte putine au fost pierdute in zer.

Lipozomii au fost degradati in mod natural in matricea branzei dupa separarea zerului, acest lucru permitand contact total intre proteine si enzimele de maturare. Cu toate acestea, desi tehnica a fost adoptata in numeroase studii experimentale pe branza, costul ridicat al fosfolipidelor pure necesare pentru a face lipozomii stabili la capacitate maxima, duce aceasta tehnica la extrem avand costuri asemanatoare cu tehnologiile de comercializare la scara larga. Recent, lipozomii au devenit disponibili pe piata sub forma de amestec pro-lipozomi si folositi pentru a introduce enzime in branza Cheddar. Branzeturile semitari caracterizate pri Gouda si Edam sunt realizate printr-un process ce include o etapa de spalare a cheagului pentru a inlocui o parte din zer cu apa, reducand aciditatea. Desi aceasta etapa precum si etapa branzei moi ofera oportunitati pentru introducerea enzimei uniform in matricea branzei, ambele cauzeaza probleme prin inmuierea premature a casului, scaderea randamentului si pierderea enzimelor neincluse in cas. Branzeturile spalate sunt sarate cu saramura, lucru care poate parea ca ofera o alta oportunitate pentru adaugarea enzimelor, insa cercetarile arata ca trecerea enzimei din saramura in textura tare din interiorul casului este lenta, excuzand aceasta metoda, ceea ce face casul spalat dificil de tratat cu enzimele de maturare. In diferitele varietati de branzeturi precum branza Cheddar, adaugarea de enzime in casul macinat si sarat ( inainte de presare in forma finala a casului) a fost initial propusa pentru fabricarea branzeturilor in laborator. Cu toate acestea, aceasta tehnica este dificild e adaptat la echipamentele de sarare automata in fabricile mari de branza si desi enzimele pot fi granulate cu sare uscata este un process scump pentru ingrediente ieftine si nu se utilizeaza la scara larga. O metoda alternative de adaugare a enzimelor a fost conceputa recent, implicand amestecarea branzei de vaci cu enzima intr-un vas in care este aplicata presiune negative, astfel incat enzima este aspirate in matricea casului. Totusi, nu este clar cum sunt rezolvate probeleme de distributie uniforma, modificarea umiditatii in cas si in structura , de aceasta inventive. Orice metoda fizica este folosita pentru a plasa enzimele in branza de vaci, ete nevoie de un mecanism pentru a dispersa aceste enzime, iar aceaste se face cu apa sau un constituent natural al branzei, precum sarea sau grasimea. In concluzie, tot acest domeniu tehnologic de adaugare enzimatica are nevoie urgent de idei noi si cercetari, insa cercetarile au nevoie de feedback de la tehnologii branzeturilor si economistii in afaceri. De exemplu, exista suficienta expertiza in enzimologie moleculara aplicata pentru a crea matrice complexe de micro particule enzimatice ce ar elibera si metabolize aminoacizi, acizi grasi si zaharuri in compusi de aroma cunoscuti. Astfel de expertize au fost folosite in stiinta enzimelor imobilizate, enzimologie celulara si membranologie, dar nu a existat inca un stimulant pentru a aplica aceasta metoda la cercetarea maturarii branzei.Acest lucru este de inteles in conditiile actuale, deoarece traseul logic de urmat in adaugarea sistemelor enzimatice complexe ce sunt usor de introdus branza este prin tehnologie celulara. Natura a reusit acest lucre, deci de ce sa il anulam? Raspunsul simplu este ca natura a proiectat cellule microbiene pentru procesele vitale eficiente, nu pentru tehnologia de maturare a branzei, iar arhitectura si celula microbiana are nevoie de modificari pentru imbinare corecta. Tehnologia genetica indeplineste acest lucru din punct de vedere al tehnologiei celulare dar oricat de sigura este aceasta tehnologie, consumatorii si mass-media sunt fem impotriva alegerii acestei rute.