Tehnici speciale de microscopie

Această lucrare urmăreşte studierea metodelor de observare a preparatelor ce

nu pot fi vizualizate cu ajutorul microscopului icircn transmisie sau icircn reflexie

I Noţiuni teoretice

Metodele clasice de microscopie nu pot pune icircn evidenţă detaliile preparatelor

atunci cacircnd acestea au dimensiuni foarte mici (sub 1 m) sau nu prezintă un contrast

bun (detaliile au aceeaşi culoare ca şi restul preparatului) Icircn această situaţie la

dispoziţia observatorului stau metodele de colorare a preparatului sau tehnicile speciale

de microscopie

Tehnicile de colorare (ce se vor studia icircn cadrul disciplinei de Histologie) prezintă

icircn anumite situaţii cacircteva dezavantaje necesită o cantitate mare de timp manopera şi

substanţe chimice nu pot fi observate celule sau organisme vii imaginea obţinută diferă

mai mult sau mai puţin de structura reală

Pentru icircnlăturarea acestor deficienţe pot fi utilizate tehnicile speciale de

microscopie Dintre acestea amintim

- Microscopia de imersie

- Microscopia icircn ultraviolet (UV)

- Microscopia de cacircmp icircntunecat

- Microscopia de polarizare

- Microscopia de fluorescenţă

- Microscopia de contrast de fază

- Microscopia electronică

1 Microscopia de imersie

Cele două tehnici de microscopie prezentate (transmisie şi reflexie) nu permit o

mărire mai mare de 1000 de ori deoarece apare fenomenul de difracţie a luminii pe

detaliile preparatului

Pentru a permite observarea unor detalii mai fine una din soluţii este

introducerea icircntre obiect şi obiectiv a unui lichid omogen transparent şi izotrop cu

indice de refracţie cacirct mai mare numit lichid de imersie De obicei se utilizează ulei de

cedru (n=13-15) sau compuşi sintetici (n=13-16) Icircn acest mod se poate creşte

mărirea pacircnă la cca 2000 de ori fără să apară fenomenul de difracţie Un alt avantaj al

folosirii imersiei este mărirea luminozitatii imaginii

h1n

)d

h21(

E

E

20

unde

E - iluminarea imaginii cu lichid de imersie

E0 - iluminarea imaginii icircn absenţa lichidului

h - distanţa obiectiv-obiect

d - diametrul obiectivului

n - indicele de refracţie al lichidului de imersie

E=(12-4)E0

Icircn cazul utilizării tehnicii de imersie este necesar ca preparatul să fie acoperit cu

o lamelă pentru ca lichidul de imersie să nu modifice structura acestuia De asemenea

se utilizează obiective speciale (de imersie) ce sunt inscripţionate rdquoApordquo caracterizate

prin distanţă focală mică avacircnd totodată posibilitatea de a culisa icircn scopul evitării

contactului brutal dintre obiectiv şi lamelă

Au fost studiate aproape toate tipurile de bacterii Performanţele microscoapelor

cu lumină vizibilă merg pana la mărimi de ordinul 2000-3000 de ori ( =025 m)

2 Microscopia de ultraviolet

O altă modalitate de a creşte puterea separatoare este micşorarea lungimii de

undă a radiaţiei folosite pacircnă icircn domeniul ultraviolet UV (6middot10-10 3810-7)m Icircn acest

mod s-au putut distinge obiecte de dimensiuni de 015 m atingacircndu-se o mărire de

6000-7000 de ori

Icircn cazul folosirii radiaţiei UV este necesar ca toate componentele optice ale

microscopului să fie realizate din cuartz deoarece sticla comună este opacă la acest tip

de radiaţii

Imaginea finală va fi obţinută pe un ecran de proiecţie acoperit cu o substanţa

fluorescentă Icircn cazul folosirii radiaţiei UV este obligatorie folosirea ochelarilor şi a

ecranelor de protecţie deoarece retina este foarte sensibilă icircn acest domeniu de lungimi

de undă

3 Microscopia de cacircmp icircntunecat

Tehnica de cacircmp icircntunecat este utilizată pentru observarea preparatelor

transparente şi se bazează pe icircmprăştierea luminii pe detaliile preparatului Orice

neomogenitate din preparat va determina o modificare a direcţiei razelor de lumină Din

punct de vedere constructiv se utilizează un condensor special alcătuit dintr-o oglindă

concavă şi una convexă (figura 31) astfel icircncacirct doar razele de lumina icircmprăştiate pe

neomogenităţile preparatului să ajungă icircn obiectiv

Figura 31 Microscopia de cacircmp icircntunecat

Condensoarele de cacircmp icircntunecat oferă icircnclinări diferite razelor de lumina

trimise spre preparat Cacircnd se doreşte observarea detaliilor foarte fine se folosesc

condensoare ce produc icircnclinări mari fascicolului incident fiind necesar icircn acelaşi timp

mărirea intensităţii luminoase deoarece fluxul de lumină ce pătrunde icircn obiectiv este

foarte mic Ataşate la microscop condensoarele de cacircmp icircntunecat trebuiesc centrate

foarte bine pe axul optic al microscopului icircn caz contrar obţinacircndu-se imagini cu

rdquoumbrerdquo

4 Microscopia de polarizare

Microscopia de polarizare se utilizează icircn evidenţierea şi observarea

substanţelor optic active ce se găsesc icircn preparat Substanţele optic active au

proprietatea de a roti planul luminii polarizate

Figura 32 Microscopia de polarizare

Pentru utilizarea acestei tehnici este necesar să se ataşeze la microscop un

polarizor şi un analizor ambele confecţionate din Spat de Islanda ce au proprietatea de

a lăsa să treacă doar razele de lumină ce au un anumit unghi de polarizare

Aceasta tehnică se utilizează atacirct icircn microscopia de transmisie cacirct şi icircn

microscopia de reflexie Icircn cazul montării corecte a polarizorului şi a analizorului doar

razele de lumina ce străbat zonele din preparat ce conţin substanţe optic active vor

ajunge la observator

5 Microscopia de fluorescenţă

Fluorescenţa este proprietatea anumitor substanţe de a emite lumină (radiaţie

vizibilă) atunci cacircnd sunt excitate cu radiaţie UV Deoarece multe substanţe de interes

medical prezintă fluorescenţă (acizi nucleici proteine) această tehnică este foarte

utilizată icircn practica de laborator şi de cercetare medicală

Fiecare substanţă ce prezintă fluorescenţă este caracterizată de o lungime de

undă de excitaţie (icircn UV) şi de o lungime de undă de emisie (icircn vizibil) astfel icircncacirct

tehnica poate nu doar pune icircn evidentă dar şi identifica substanţele respective Icircn acest

scop se utilizează filtre optice şi de UV pentru selectarea radiaţiei de excitaţie şi de

emisie a substanţei ce urmează a fi observată Filtrele se dispun ca icircn figura 33

Figura 33 Microscopia de fluorescenţă

Icircn cadrul acestei tehnici pentru observarea substanţelor ce nu prezintă

fluorescenţă icircn mod direct se utilizează rdquomarkeri de fluore-scenţărdquo substanţe ce au

următoarele proprietăţi

- fluorescenţă intrinsecă

- aditivitate foarte mare

- deteriorează minim structura (substanţa) de care se fixează

Cele mai utilizate sunt substanţele din clasa flavinelor

6 Microscopia de contrast de fază

Este o tehnică ce se utilizează icircn special pentru observarea celulelor şi

organismelor vii atunci cacircnd tehnicile de colorare nu pot fi folosite Metoda pune icircn

evidenţă diferenţa de drum optic pe care o face lumina trecacircnd prin diferite zone ale

preparatului (reamintim că drumul optic este produsul dintre drumul geometric şi

indicele de refracţie al mediului pe care icircl parcurge raza de lumină)

Deci această tehnică pune icircn evidenţă atacirct diferenţe de grosime icircntre diferitele

zone ale preparatului cacirct şi diferenţe de indice de refracţie icircntre acestea Sunt utilizate

obiective speciale (inscripţionate Cf) care au dispuse icircn planul focal o placa de fază ce

defazează lumina cu o semilungime de unda (icircn + se numeşte contrast de fază pozitiv

sau icircn ndash contrast de fază negativ) şi un inel parţial absorbant

De asemenea condensorul prezintă o fanta inelară ce este specifică fiecărui

obiectiv folosit Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special

cu ajutorul căruia se pot observa simultan atacirct inelul parţial absorbant cacirct şi fanta

inelară icircn scopul suprapunerii acestor două imagini

II Parte experimentală

Materiale necesare

1 Microscop de cercetare MC9

2 Microscop Biorom

3 Condensoare de cacircmp icircntunecat

4 Polarizor analizor

5 Obiective de imersie

6 Obiective de contrast de fază

7 Lame cu diferite preparate

Modul de lucru

A Observarea nucleilor celulelor

-se aşează lama cu preparat pe masuţa microscopului şi se fixează cu ajutorul

călăreţilor

-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) şi se localizează zona cu

preparat

-se coboară măsuţa microscopului fără a deplasa preparatul

-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00

-se aplică o picătură de lichid de imersie pe preparat (icircn dreptul obiectivului)

-cu foarte mare atenţie se coboară obiectivul pacircna ce se imer-sează icircn lichid

-privind prin ocular se pune la punct imaginea

B Determinarea depozitelor glucidice

-se montează la microscopul MC9 polarizorul şi analizorul

-se fixează preparatul pe măsuţă

-se pune la punct imaginea

-se deplasează icircn plan orizontal preparatul pe măsuţă pacircnă cacircnd se găseşte o

zona liberă

-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de

icircntunecată

-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă

zonele icircn care se găsesc substanţe optic active

C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei

-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de

fază

-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct

-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial

absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului

-se montează din nou ocularul microscopului

-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)

-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă

atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază

cedru (n=13-15) sau compuşi sintetici (n=13-16) Icircn acest mod se poate creşte

mărirea pacircnă la cca 2000 de ori fără să apară fenomenul de difracţie Un alt avantaj al

folosirii imersiei este mărirea luminozitatii imaginii

h1n

)d

h21(

E

E

20

unde

E - iluminarea imaginii cu lichid de imersie

E0 - iluminarea imaginii icircn absenţa lichidului

h - distanţa obiectiv-obiect

d - diametrul obiectivului

n - indicele de refracţie al lichidului de imersie

E=(12-4)E0

Icircn cazul utilizării tehnicii de imersie este necesar ca preparatul să fie acoperit cu

o lamelă pentru ca lichidul de imersie să nu modifice structura acestuia De asemenea

se utilizează obiective speciale (de imersie) ce sunt inscripţionate rdquoApordquo caracterizate

prin distanţă focală mică avacircnd totodată posibilitatea de a culisa icircn scopul evitării

contactului brutal dintre obiectiv şi lamelă

Au fost studiate aproape toate tipurile de bacterii Performanţele microscoapelor

cu lumină vizibilă merg pana la mărimi de ordinul 2000-3000 de ori ( =025 m)

2 Microscopia de ultraviolet

O altă modalitate de a creşte puterea separatoare este micşorarea lungimii de

undă a radiaţiei folosite pacircnă icircn domeniul ultraviolet UV (6middot10-10 3810-7)m Icircn acest

mod s-au putut distinge obiecte de dimensiuni de 015 m atingacircndu-se o mărire de

6000-7000 de ori

Icircn cazul folosirii radiaţiei UV este necesar ca toate componentele optice ale

microscopului să fie realizate din cuartz deoarece sticla comună este opacă la acest tip

de radiaţii

Imaginea finală va fi obţinută pe un ecran de proiecţie acoperit cu o substanţa

fluorescentă Icircn cazul folosirii radiaţiei UV este obligatorie folosirea ochelarilor şi a

ecranelor de protecţie deoarece retina este foarte sensibilă icircn acest domeniu de lungimi

de undă

3 Microscopia de cacircmp icircntunecat

Tehnica de cacircmp icircntunecat este utilizată pentru observarea preparatelor

transparente şi se bazează pe icircmprăştierea luminii pe detaliile preparatului Orice

neomogenitate din preparat va determina o modificare a direcţiei razelor de lumină Din

punct de vedere constructiv se utilizează un condensor special alcătuit dintr-o oglindă

concavă şi una convexă (figura 31) astfel icircncacirct doar razele de lumina icircmprăştiate pe

neomogenităţile preparatului să ajungă icircn obiectiv

Figura 31 Microscopia de cacircmp icircntunecat

Condensoarele de cacircmp icircntunecat oferă icircnclinări diferite razelor de lumina

trimise spre preparat Cacircnd se doreşte observarea detaliilor foarte fine se folosesc

condensoare ce produc icircnclinări mari fascicolului incident fiind necesar icircn acelaşi timp

mărirea intensităţii luminoase deoarece fluxul de lumină ce pătrunde icircn obiectiv este

foarte mic Ataşate la microscop condensoarele de cacircmp icircntunecat trebuiesc centrate

foarte bine pe axul optic al microscopului icircn caz contrar obţinacircndu-se imagini cu

rdquoumbrerdquo

4 Microscopia de polarizare

Microscopia de polarizare se utilizează icircn evidenţierea şi observarea

substanţelor optic active ce se găsesc icircn preparat Substanţele optic active au

proprietatea de a roti planul luminii polarizate

Figura 32 Microscopia de polarizare

Pentru utilizarea acestei tehnici este necesar să se ataşeze la microscop un

polarizor şi un analizor ambele confecţionate din Spat de Islanda ce au proprietatea de

a lăsa să treacă doar razele de lumină ce au un anumit unghi de polarizare

Aceasta tehnică se utilizează atacirct icircn microscopia de transmisie cacirct şi icircn

microscopia de reflexie Icircn cazul montării corecte a polarizorului şi a analizorului doar

razele de lumina ce străbat zonele din preparat ce conţin substanţe optic active vor

ajunge la observator

5 Microscopia de fluorescenţă

Fluorescenţa este proprietatea anumitor substanţe de a emite lumină (radiaţie

vizibilă) atunci cacircnd sunt excitate cu radiaţie UV Deoarece multe substanţe de interes

medical prezintă fluorescenţă (acizi nucleici proteine) această tehnică este foarte

utilizată icircn practica de laborator şi de cercetare medicală

Fiecare substanţă ce prezintă fluorescenţă este caracterizată de o lungime de

undă de excitaţie (icircn UV) şi de o lungime de undă de emisie (icircn vizibil) astfel icircncacirct

tehnica poate nu doar pune icircn evidentă dar şi identifica substanţele respective Icircn acest

scop se utilizează filtre optice şi de UV pentru selectarea radiaţiei de excitaţie şi de

emisie a substanţei ce urmează a fi observată Filtrele se dispun ca icircn figura 33

Figura 33 Microscopia de fluorescenţă

Icircn cadrul acestei tehnici pentru observarea substanţelor ce nu prezintă

fluorescenţă icircn mod direct se utilizează rdquomarkeri de fluore-scenţărdquo substanţe ce au

următoarele proprietăţi

- fluorescenţă intrinsecă

- aditivitate foarte mare

- deteriorează minim structura (substanţa) de care se fixează

Cele mai utilizate sunt substanţele din clasa flavinelor

6 Microscopia de contrast de fază

Este o tehnică ce se utilizează icircn special pentru observarea celulelor şi

organismelor vii atunci cacircnd tehnicile de colorare nu pot fi folosite Metoda pune icircn

evidenţă diferenţa de drum optic pe care o face lumina trecacircnd prin diferite zone ale

preparatului (reamintim că drumul optic este produsul dintre drumul geometric şi

indicele de refracţie al mediului pe care icircl parcurge raza de lumină)

Deci această tehnică pune icircn evidenţă atacirct diferenţe de grosime icircntre diferitele

zone ale preparatului cacirct şi diferenţe de indice de refracţie icircntre acestea Sunt utilizate

obiective speciale (inscripţionate Cf) care au dispuse icircn planul focal o placa de fază ce

defazează lumina cu o semilungime de unda (icircn + se numeşte contrast de fază pozitiv

sau icircn ndash contrast de fază negativ) şi un inel parţial absorbant

De asemenea condensorul prezintă o fanta inelară ce este specifică fiecărui

obiectiv folosit Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special

cu ajutorul căruia se pot observa simultan atacirct inelul parţial absorbant cacirct şi fanta

inelară icircn scopul suprapunerii acestor două imagini

II Parte experimentală

Materiale necesare

1 Microscop de cercetare MC9

2 Microscop Biorom

3 Condensoare de cacircmp icircntunecat

4 Polarizor analizor

5 Obiective de imersie

6 Obiective de contrast de fază

7 Lame cu diferite preparate

Modul de lucru

A Observarea nucleilor celulelor

-se aşează lama cu preparat pe masuţa microscopului şi se fixează cu ajutorul

călăreţilor

-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) şi se localizează zona cu

preparat

-se coboară măsuţa microscopului fără a deplasa preparatul

-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00

-se aplică o picătură de lichid de imersie pe preparat (icircn dreptul obiectivului)

-cu foarte mare atenţie se coboară obiectivul pacircna ce se imer-sează icircn lichid

-privind prin ocular se pune la punct imaginea

B Determinarea depozitelor glucidice

-se montează la microscopul MC9 polarizorul şi analizorul

-se fixează preparatul pe măsuţă

-se pune la punct imaginea

-se deplasează icircn plan orizontal preparatul pe măsuţă pacircnă cacircnd se găseşte o

zona liberă

-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de

icircntunecată

-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă

zonele icircn care se găsesc substanţe optic active

C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei

-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de

fază

-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct

-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial

absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului

-se montează din nou ocularul microscopului

-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)

-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă

atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază

ecranelor de protecţie deoarece retina este foarte sensibilă icircn acest domeniu de lungimi

de undă

3 Microscopia de cacircmp icircntunecat

Tehnica de cacircmp icircntunecat este utilizată pentru observarea preparatelor

transparente şi se bazează pe icircmprăştierea luminii pe detaliile preparatului Orice

neomogenitate din preparat va determina o modificare a direcţiei razelor de lumină Din

punct de vedere constructiv se utilizează un condensor special alcătuit dintr-o oglindă

concavă şi una convexă (figura 31) astfel icircncacirct doar razele de lumina icircmprăştiate pe

neomogenităţile preparatului să ajungă icircn obiectiv

Figura 31 Microscopia de cacircmp icircntunecat

Condensoarele de cacircmp icircntunecat oferă icircnclinări diferite razelor de lumina

trimise spre preparat Cacircnd se doreşte observarea detaliilor foarte fine se folosesc

condensoare ce produc icircnclinări mari fascicolului incident fiind necesar icircn acelaşi timp

mărirea intensităţii luminoase deoarece fluxul de lumină ce pătrunde icircn obiectiv este

foarte mic Ataşate la microscop condensoarele de cacircmp icircntunecat trebuiesc centrate

foarte bine pe axul optic al microscopului icircn caz contrar obţinacircndu-se imagini cu

rdquoumbrerdquo

4 Microscopia de polarizare

Microscopia de polarizare se utilizează icircn evidenţierea şi observarea

substanţelor optic active ce se găsesc icircn preparat Substanţele optic active au

proprietatea de a roti planul luminii polarizate

Figura 32 Microscopia de polarizare

Pentru utilizarea acestei tehnici este necesar să se ataşeze la microscop un

polarizor şi un analizor ambele confecţionate din Spat de Islanda ce au proprietatea de

a lăsa să treacă doar razele de lumină ce au un anumit unghi de polarizare

Aceasta tehnică se utilizează atacirct icircn microscopia de transmisie cacirct şi icircn

microscopia de reflexie Icircn cazul montării corecte a polarizorului şi a analizorului doar

razele de lumina ce străbat zonele din preparat ce conţin substanţe optic active vor

ajunge la observator

5 Microscopia de fluorescenţă

Fluorescenţa este proprietatea anumitor substanţe de a emite lumină (radiaţie

vizibilă) atunci cacircnd sunt excitate cu radiaţie UV Deoarece multe substanţe de interes

medical prezintă fluorescenţă (acizi nucleici proteine) această tehnică este foarte

utilizată icircn practica de laborator şi de cercetare medicală

Fiecare substanţă ce prezintă fluorescenţă este caracterizată de o lungime de

undă de excitaţie (icircn UV) şi de o lungime de undă de emisie (icircn vizibil) astfel icircncacirct

tehnica poate nu doar pune icircn evidentă dar şi identifica substanţele respective Icircn acest

scop se utilizează filtre optice şi de UV pentru selectarea radiaţiei de excitaţie şi de

emisie a substanţei ce urmează a fi observată Filtrele se dispun ca icircn figura 33

Figura 33 Microscopia de fluorescenţă

Icircn cadrul acestei tehnici pentru observarea substanţelor ce nu prezintă

fluorescenţă icircn mod direct se utilizează rdquomarkeri de fluore-scenţărdquo substanţe ce au

următoarele proprietăţi

- fluorescenţă intrinsecă

- aditivitate foarte mare

- deteriorează minim structura (substanţa) de care se fixează

Cele mai utilizate sunt substanţele din clasa flavinelor

6 Microscopia de contrast de fază

Este o tehnică ce se utilizează icircn special pentru observarea celulelor şi

organismelor vii atunci cacircnd tehnicile de colorare nu pot fi folosite Metoda pune icircn

evidenţă diferenţa de drum optic pe care o face lumina trecacircnd prin diferite zone ale

preparatului (reamintim că drumul optic este produsul dintre drumul geometric şi

indicele de refracţie al mediului pe care icircl parcurge raza de lumină)

Deci această tehnică pune icircn evidenţă atacirct diferenţe de grosime icircntre diferitele

zone ale preparatului cacirct şi diferenţe de indice de refracţie icircntre acestea Sunt utilizate

obiective speciale (inscripţionate Cf) care au dispuse icircn planul focal o placa de fază ce

defazează lumina cu o semilungime de unda (icircn + se numeşte contrast de fază pozitiv

sau icircn ndash contrast de fază negativ) şi un inel parţial absorbant

De asemenea condensorul prezintă o fanta inelară ce este specifică fiecărui

obiectiv folosit Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special

cu ajutorul căruia se pot observa simultan atacirct inelul parţial absorbant cacirct şi fanta

inelară icircn scopul suprapunerii acestor două imagini

II Parte experimentală

Materiale necesare

1 Microscop de cercetare MC9

2 Microscop Biorom

3 Condensoare de cacircmp icircntunecat

4 Polarizor analizor

5 Obiective de imersie

6 Obiective de contrast de fază

7 Lame cu diferite preparate

Modul de lucru

A Observarea nucleilor celulelor

-se aşează lama cu preparat pe masuţa microscopului şi se fixează cu ajutorul

călăreţilor

-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) şi se localizează zona cu

preparat

-se coboară măsuţa microscopului fără a deplasa preparatul

-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00

-se aplică o picătură de lichid de imersie pe preparat (icircn dreptul obiectivului)

-cu foarte mare atenţie se coboară obiectivul pacircna ce se imer-sează icircn lichid

-privind prin ocular se pune la punct imaginea

B Determinarea depozitelor glucidice

-se montează la microscopul MC9 polarizorul şi analizorul

-se fixează preparatul pe măsuţă

-se pune la punct imaginea

-se deplasează icircn plan orizontal preparatul pe măsuţă pacircnă cacircnd se găseşte o

zona liberă

-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de

icircntunecată

-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă

zonele icircn care se găsesc substanţe optic active

C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei

-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de

fază

-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct

-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial

absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului

-se montează din nou ocularul microscopului

-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)

-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă

atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază

Figura 32 Microscopia de polarizare

Pentru utilizarea acestei tehnici este necesar să se ataşeze la microscop un

polarizor şi un analizor ambele confecţionate din Spat de Islanda ce au proprietatea de

a lăsa să treacă doar razele de lumină ce au un anumit unghi de polarizare

Aceasta tehnică se utilizează atacirct icircn microscopia de transmisie cacirct şi icircn

microscopia de reflexie Icircn cazul montării corecte a polarizorului şi a analizorului doar

razele de lumina ce străbat zonele din preparat ce conţin substanţe optic active vor

ajunge la observator

5 Microscopia de fluorescenţă

Fluorescenţa este proprietatea anumitor substanţe de a emite lumină (radiaţie

vizibilă) atunci cacircnd sunt excitate cu radiaţie UV Deoarece multe substanţe de interes

medical prezintă fluorescenţă (acizi nucleici proteine) această tehnică este foarte

utilizată icircn practica de laborator şi de cercetare medicală

Fiecare substanţă ce prezintă fluorescenţă este caracterizată de o lungime de

undă de excitaţie (icircn UV) şi de o lungime de undă de emisie (icircn vizibil) astfel icircncacirct

tehnica poate nu doar pune icircn evidentă dar şi identifica substanţele respective Icircn acest

scop se utilizează filtre optice şi de UV pentru selectarea radiaţiei de excitaţie şi de

emisie a substanţei ce urmează a fi observată Filtrele se dispun ca icircn figura 33

Figura 33 Microscopia de fluorescenţă

Icircn cadrul acestei tehnici pentru observarea substanţelor ce nu prezintă

fluorescenţă icircn mod direct se utilizează rdquomarkeri de fluore-scenţărdquo substanţe ce au

următoarele proprietăţi

- fluorescenţă intrinsecă

- aditivitate foarte mare

- deteriorează minim structura (substanţa) de care se fixează

Cele mai utilizate sunt substanţele din clasa flavinelor

6 Microscopia de contrast de fază

Este o tehnică ce se utilizează icircn special pentru observarea celulelor şi

organismelor vii atunci cacircnd tehnicile de colorare nu pot fi folosite Metoda pune icircn

evidenţă diferenţa de drum optic pe care o face lumina trecacircnd prin diferite zone ale

preparatului (reamintim că drumul optic este produsul dintre drumul geometric şi

indicele de refracţie al mediului pe care icircl parcurge raza de lumină)

Deci această tehnică pune icircn evidenţă atacirct diferenţe de grosime icircntre diferitele

zone ale preparatului cacirct şi diferenţe de indice de refracţie icircntre acestea Sunt utilizate

obiective speciale (inscripţionate Cf) care au dispuse icircn planul focal o placa de fază ce

defazează lumina cu o semilungime de unda (icircn + se numeşte contrast de fază pozitiv

sau icircn ndash contrast de fază negativ) şi un inel parţial absorbant

De asemenea condensorul prezintă o fanta inelară ce este specifică fiecărui

obiectiv folosit Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special

cu ajutorul căruia se pot observa simultan atacirct inelul parţial absorbant cacirct şi fanta

inelară icircn scopul suprapunerii acestor două imagini

II Parte experimentală

Materiale necesare

1 Microscop de cercetare MC9

2 Microscop Biorom

3 Condensoare de cacircmp icircntunecat

4 Polarizor analizor

5 Obiective de imersie

6 Obiective de contrast de fază

7 Lame cu diferite preparate

Modul de lucru

A Observarea nucleilor celulelor

-se aşează lama cu preparat pe masuţa microscopului şi se fixează cu ajutorul

călăreţilor

-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) şi se localizează zona cu

preparat

-se coboară măsuţa microscopului fără a deplasa preparatul

-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00

-se aplică o picătură de lichid de imersie pe preparat (icircn dreptul obiectivului)

-cu foarte mare atenţie se coboară obiectivul pacircna ce se imer-sează icircn lichid

-privind prin ocular se pune la punct imaginea

B Determinarea depozitelor glucidice

-se montează la microscopul MC9 polarizorul şi analizorul

-se fixează preparatul pe măsuţă

-se pune la punct imaginea

-se deplasează icircn plan orizontal preparatul pe măsuţă pacircnă cacircnd se găseşte o

zona liberă

-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de

icircntunecată

-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă

zonele icircn care se găsesc substanţe optic active

C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei

-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de

fază

-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct

-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial

absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului

-se montează din nou ocularul microscopului

-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)

-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă

atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază

Figura 33 Microscopia de fluorescenţă

Icircn cadrul acestei tehnici pentru observarea substanţelor ce nu prezintă

fluorescenţă icircn mod direct se utilizează rdquomarkeri de fluore-scenţărdquo substanţe ce au

următoarele proprietăţi

- fluorescenţă intrinsecă

- aditivitate foarte mare

- deteriorează minim structura (substanţa) de care se fixează

Cele mai utilizate sunt substanţele din clasa flavinelor

6 Microscopia de contrast de fază

Este o tehnică ce se utilizează icircn special pentru observarea celulelor şi

organismelor vii atunci cacircnd tehnicile de colorare nu pot fi folosite Metoda pune icircn

evidenţă diferenţa de drum optic pe care o face lumina trecacircnd prin diferite zone ale

preparatului (reamintim că drumul optic este produsul dintre drumul geometric şi

indicele de refracţie al mediului pe care icircl parcurge raza de lumină)

Deci această tehnică pune icircn evidenţă atacirct diferenţe de grosime icircntre diferitele

zone ale preparatului cacirct şi diferenţe de indice de refracţie icircntre acestea Sunt utilizate

obiective speciale (inscripţionate Cf) care au dispuse icircn planul focal o placa de fază ce

defazează lumina cu o semilungime de unda (icircn + se numeşte contrast de fază pozitiv

sau icircn ndash contrast de fază negativ) şi un inel parţial absorbant

De asemenea condensorul prezintă o fanta inelară ce este specifică fiecărui

obiectiv folosit Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special

cu ajutorul căruia se pot observa simultan atacirct inelul parţial absorbant cacirct şi fanta

inelară icircn scopul suprapunerii acestor două imagini

II Parte experimentală

Materiale necesare

1 Microscop de cercetare MC9

2 Microscop Biorom

3 Condensoare de cacircmp icircntunecat

4 Polarizor analizor

5 Obiective de imersie

6 Obiective de contrast de fază

7 Lame cu diferite preparate

Modul de lucru

A Observarea nucleilor celulelor

-se aşează lama cu preparat pe masuţa microscopului şi se fixează cu ajutorul

călăreţilor

-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) şi se localizează zona cu

preparat

-se coboară măsuţa microscopului fără a deplasa preparatul

-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00

-se aplică o picătură de lichid de imersie pe preparat (icircn dreptul obiectivului)

-cu foarte mare atenţie se coboară obiectivul pacircna ce se imer-sează icircn lichid

-privind prin ocular se pune la punct imaginea

B Determinarea depozitelor glucidice

-se montează la microscopul MC9 polarizorul şi analizorul

-se fixează preparatul pe măsuţă

-se pune la punct imaginea

-se deplasează icircn plan orizontal preparatul pe măsuţă pacircnă cacircnd se găseşte o

zona liberă

-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de

icircntunecată

-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă

zonele icircn care se găsesc substanţe optic active

C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei

-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de

fază

-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct

-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial

absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului

-se montează din nou ocularul microscopului

-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)

-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă

atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază

cu ajutorul căruia se pot observa simultan atacirct inelul parţial absorbant cacirct şi fanta

inelară icircn scopul suprapunerii acestor două imagini

II Parte experimentală

Materiale necesare

1 Microscop de cercetare MC9

2 Microscop Biorom

3 Condensoare de cacircmp icircntunecat

4 Polarizor analizor

5 Obiective de imersie

6 Obiective de contrast de fază

7 Lame cu diferite preparate

Modul de lucru

A Observarea nucleilor celulelor

-se aşează lama cu preparat pe masuţa microscopului şi se fixează cu ajutorul

călăreţilor

-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) şi se localizează zona cu

preparat

-se coboară măsuţa microscopului fără a deplasa preparatul

-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00

-se aplică o picătură de lichid de imersie pe preparat (icircn dreptul obiectivului)

-cu foarte mare atenţie se coboară obiectivul pacircna ce se imer-sează icircn lichid

-privind prin ocular se pune la punct imaginea

B Determinarea depozitelor glucidice

-se montează la microscopul MC9 polarizorul şi analizorul

-se fixează preparatul pe măsuţă

-se pune la punct imaginea

-se deplasează icircn plan orizontal preparatul pe măsuţă pacircnă cacircnd se găseşte o

zona liberă

-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de

icircntunecată

-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă

zonele icircn care se găsesc substanţe optic active

C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei

-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de

fază

-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct

-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial

absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului

-se montează din nou ocularul microscopului

-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)

-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă

atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază

-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de

icircntunecată

-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă

zonele icircn care se găsesc substanţe optic active

C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei

-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de

fază

-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct

-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial

absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului

-se montează din nou ocularul microscopului

-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)

-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă

atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază