Tehnici speciale de microscopie
Această lucrare urmăreşte studierea metodelor de observare a preparatelor ce
nu pot fi vizualizate cu ajutorul microscopului icircn transmisie sau icircn reflexie
I Noţiuni teoretice
Metodele clasice de microscopie nu pot pune icircn evidenţă detaliile preparatelor
atunci cacircnd acestea au dimensiuni foarte mici (sub 1 m) sau nu prezintă un contrast
bun (detaliile au aceeaşi culoare ca şi restul preparatului) Icircn această situaţie la
dispoziţia observatorului stau metodele de colorare a preparatului sau tehnicile speciale
de microscopie
Tehnicile de colorare (ce se vor studia icircn cadrul disciplinei de Histologie) prezintă
icircn anumite situaţii cacircteva dezavantaje necesită o cantitate mare de timp manopera şi
substanţe chimice nu pot fi observate celule sau organisme vii imaginea obţinută diferă
mai mult sau mai puţin de structura reală
Pentru icircnlăturarea acestor deficienţe pot fi utilizate tehnicile speciale de
microscopie Dintre acestea amintim
- Microscopia de imersie
- Microscopia icircn ultraviolet (UV)
- Microscopia de cacircmp icircntunecat
- Microscopia de polarizare
- Microscopia de fluorescenţă
- Microscopia de contrast de fază
- Microscopia electronică
1 Microscopia de imersie
Cele două tehnici de microscopie prezentate (transmisie şi reflexie) nu permit o
mărire mai mare de 1000 de ori deoarece apare fenomenul de difracţie a luminii pe
detaliile preparatului
Pentru a permite observarea unor detalii mai fine una din soluţii este
introducerea icircntre obiect şi obiectiv a unui lichid omogen transparent şi izotrop cu
indice de refracţie cacirct mai mare numit lichid de imersie De obicei se utilizează ulei de
cedru (n=13-15) sau compuşi sintetici (n=13-16) Icircn acest mod se poate creşte
mărirea pacircnă la cca 2000 de ori fără să apară fenomenul de difracţie Un alt avantaj al
folosirii imersiei este mărirea luminozitatii imaginii
h1n
)d
h21(
E
E
20
unde
E - iluminarea imaginii cu lichid de imersie
E0 - iluminarea imaginii icircn absenţa lichidului
h - distanţa obiectiv-obiect
d - diametrul obiectivului
n - indicele de refracţie al lichidului de imersie
E=(12-4)E0
Icircn cazul utilizării tehnicii de imersie este necesar ca preparatul să fie acoperit cu
o lamelă pentru ca lichidul de imersie să nu modifice structura acestuia De asemenea
se utilizează obiective speciale (de imersie) ce sunt inscripţionate rdquoApordquo caracterizate
prin distanţă focală mică avacircnd totodată posibilitatea de a culisa icircn scopul evitării
contactului brutal dintre obiectiv şi lamelă
Au fost studiate aproape toate tipurile de bacterii Performanţele microscoapelor
cu lumină vizibilă merg pana la mărimi de ordinul 2000-3000 de ori ( =025 m)
2 Microscopia de ultraviolet
O altă modalitate de a creşte puterea separatoare este micşorarea lungimii de
undă a radiaţiei folosite pacircnă icircn domeniul ultraviolet UV (6middot10-10 3810-7)m Icircn acest
mod s-au putut distinge obiecte de dimensiuni de 015 m atingacircndu-se o mărire de
6000-7000 de ori
Icircn cazul folosirii radiaţiei UV este necesar ca toate componentele optice ale
microscopului să fie realizate din cuartz deoarece sticla comună este opacă la acest tip
de radiaţii
Imaginea finală va fi obţinută pe un ecran de proiecţie acoperit cu o substanţa
fluorescentă Icircn cazul folosirii radiaţiei UV este obligatorie folosirea ochelarilor şi a
ecranelor de protecţie deoarece retina este foarte sensibilă icircn acest domeniu de lungimi
de undă
3 Microscopia de cacircmp icircntunecat
Tehnica de cacircmp icircntunecat este utilizată pentru observarea preparatelor
transparente şi se bazează pe icircmprăştierea luminii pe detaliile preparatului Orice
neomogenitate din preparat va determina o modificare a direcţiei razelor de lumină Din
punct de vedere constructiv se utilizează un condensor special alcătuit dintr-o oglindă
concavă şi una convexă (figura 31) astfel icircncacirct doar razele de lumina icircmprăştiate pe
neomogenităţile preparatului să ajungă icircn obiectiv
Figura 31 Microscopia de cacircmp icircntunecat
Condensoarele de cacircmp icircntunecat oferă icircnclinări diferite razelor de lumina
trimise spre preparat Cacircnd se doreşte observarea detaliilor foarte fine se folosesc
condensoare ce produc icircnclinări mari fascicolului incident fiind necesar icircn acelaşi timp
mărirea intensităţii luminoase deoarece fluxul de lumină ce pătrunde icircn obiectiv este
foarte mic Ataşate la microscop condensoarele de cacircmp icircntunecat trebuiesc centrate
foarte bine pe axul optic al microscopului icircn caz contrar obţinacircndu-se imagini cu
rdquoumbrerdquo
4 Microscopia de polarizare
Microscopia de polarizare se utilizează icircn evidenţierea şi observarea
substanţelor optic active ce se găsesc icircn preparat Substanţele optic active au
proprietatea de a roti planul luminii polarizate
Figura 32 Microscopia de polarizare
Pentru utilizarea acestei tehnici este necesar să se ataşeze la microscop un
polarizor şi un analizor ambele confecţionate din Spat de Islanda ce au proprietatea de
a lăsa să treacă doar razele de lumină ce au un anumit unghi de polarizare
Aceasta tehnică se utilizează atacirct icircn microscopia de transmisie cacirct şi icircn
microscopia de reflexie Icircn cazul montării corecte a polarizorului şi a analizorului doar
razele de lumina ce străbat zonele din preparat ce conţin substanţe optic active vor
ajunge la observator
5 Microscopia de fluorescenţă
Fluorescenţa este proprietatea anumitor substanţe de a emite lumină (radiaţie
vizibilă) atunci cacircnd sunt excitate cu radiaţie UV Deoarece multe substanţe de interes
medical prezintă fluorescenţă (acizi nucleici proteine) această tehnică este foarte
utilizată icircn practica de laborator şi de cercetare medicală
Fiecare substanţă ce prezintă fluorescenţă este caracterizată de o lungime de
undă de excitaţie (icircn UV) şi de o lungime de undă de emisie (icircn vizibil) astfel icircncacirct
tehnica poate nu doar pune icircn evidentă dar şi identifica substanţele respective Icircn acest
scop se utilizează filtre optice şi de UV pentru selectarea radiaţiei de excitaţie şi de
emisie a substanţei ce urmează a fi observată Filtrele se dispun ca icircn figura 33
Figura 33 Microscopia de fluorescenţă
Icircn cadrul acestei tehnici pentru observarea substanţelor ce nu prezintă
fluorescenţă icircn mod direct se utilizează rdquomarkeri de fluore-scenţărdquo substanţe ce au
următoarele proprietăţi
- fluorescenţă intrinsecă
- aditivitate foarte mare
- deteriorează minim structura (substanţa) de care se fixează
Cele mai utilizate sunt substanţele din clasa flavinelor
6 Microscopia de contrast de fază
Este o tehnică ce se utilizează icircn special pentru observarea celulelor şi
organismelor vii atunci cacircnd tehnicile de colorare nu pot fi folosite Metoda pune icircn
evidenţă diferenţa de drum optic pe care o face lumina trecacircnd prin diferite zone ale
preparatului (reamintim că drumul optic este produsul dintre drumul geometric şi
indicele de refracţie al mediului pe care icircl parcurge raza de lumină)
Deci această tehnică pune icircn evidenţă atacirct diferenţe de grosime icircntre diferitele
zone ale preparatului cacirct şi diferenţe de indice de refracţie icircntre acestea Sunt utilizate
obiective speciale (inscripţionate Cf) care au dispuse icircn planul focal o placa de fază ce
defazează lumina cu o semilungime de unda (icircn + se numeşte contrast de fază pozitiv
sau icircn ndash contrast de fază negativ) şi un inel parţial absorbant
De asemenea condensorul prezintă o fanta inelară ce este specifică fiecărui
obiectiv folosit Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special
cu ajutorul căruia se pot observa simultan atacirct inelul parţial absorbant cacirct şi fanta
inelară icircn scopul suprapunerii acestor două imagini
II Parte experimentală
Materiale necesare
1 Microscop de cercetare MC9
2 Microscop Biorom
3 Condensoare de cacircmp icircntunecat
4 Polarizor analizor
5 Obiective de imersie
6 Obiective de contrast de fază
7 Lame cu diferite preparate
Modul de lucru
A Observarea nucleilor celulelor
-se aşează lama cu preparat pe masuţa microscopului şi se fixează cu ajutorul
călăreţilor
-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) şi se localizează zona cu
preparat
-se coboară măsuţa microscopului fără a deplasa preparatul
-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00
-se aplică o picătură de lichid de imersie pe preparat (icircn dreptul obiectivului)
-cu foarte mare atenţie se coboară obiectivul pacircna ce se imer-sează icircn lichid
-privind prin ocular se pune la punct imaginea
B Determinarea depozitelor glucidice
-se montează la microscopul MC9 polarizorul şi analizorul
-se fixează preparatul pe măsuţă
-se pune la punct imaginea
-se deplasează icircn plan orizontal preparatul pe măsuţă pacircnă cacircnd se găseşte o
zona liberă
-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de
icircntunecată
-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă
zonele icircn care se găsesc substanţe optic active
C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei
-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de
fază
-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct
-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial
absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului
-se montează din nou ocularul microscopului
-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)
-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă
atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază
cedru (n=13-15) sau compuşi sintetici (n=13-16) Icircn acest mod se poate creşte
mărirea pacircnă la cca 2000 de ori fără să apară fenomenul de difracţie Un alt avantaj al
folosirii imersiei este mărirea luminozitatii imaginii
h1n
)d
h21(
E
E
20
unde
E - iluminarea imaginii cu lichid de imersie
E0 - iluminarea imaginii icircn absenţa lichidului
h - distanţa obiectiv-obiect
d - diametrul obiectivului
n - indicele de refracţie al lichidului de imersie
E=(12-4)E0
Icircn cazul utilizării tehnicii de imersie este necesar ca preparatul să fie acoperit cu
o lamelă pentru ca lichidul de imersie să nu modifice structura acestuia De asemenea
se utilizează obiective speciale (de imersie) ce sunt inscripţionate rdquoApordquo caracterizate
prin distanţă focală mică avacircnd totodată posibilitatea de a culisa icircn scopul evitării
contactului brutal dintre obiectiv şi lamelă
Au fost studiate aproape toate tipurile de bacterii Performanţele microscoapelor
cu lumină vizibilă merg pana la mărimi de ordinul 2000-3000 de ori ( =025 m)
2 Microscopia de ultraviolet
O altă modalitate de a creşte puterea separatoare este micşorarea lungimii de
undă a radiaţiei folosite pacircnă icircn domeniul ultraviolet UV (6middot10-10 3810-7)m Icircn acest
mod s-au putut distinge obiecte de dimensiuni de 015 m atingacircndu-se o mărire de
6000-7000 de ori
Icircn cazul folosirii radiaţiei UV este necesar ca toate componentele optice ale
microscopului să fie realizate din cuartz deoarece sticla comună este opacă la acest tip
de radiaţii
Imaginea finală va fi obţinută pe un ecran de proiecţie acoperit cu o substanţa
fluorescentă Icircn cazul folosirii radiaţiei UV este obligatorie folosirea ochelarilor şi a
ecranelor de protecţie deoarece retina este foarte sensibilă icircn acest domeniu de lungimi
de undă
3 Microscopia de cacircmp icircntunecat
Tehnica de cacircmp icircntunecat este utilizată pentru observarea preparatelor
transparente şi se bazează pe icircmprăştierea luminii pe detaliile preparatului Orice
neomogenitate din preparat va determina o modificare a direcţiei razelor de lumină Din
punct de vedere constructiv se utilizează un condensor special alcătuit dintr-o oglindă
concavă şi una convexă (figura 31) astfel icircncacirct doar razele de lumina icircmprăştiate pe
neomogenităţile preparatului să ajungă icircn obiectiv
Figura 31 Microscopia de cacircmp icircntunecat
Condensoarele de cacircmp icircntunecat oferă icircnclinări diferite razelor de lumina
trimise spre preparat Cacircnd se doreşte observarea detaliilor foarte fine se folosesc
condensoare ce produc icircnclinări mari fascicolului incident fiind necesar icircn acelaşi timp
mărirea intensităţii luminoase deoarece fluxul de lumină ce pătrunde icircn obiectiv este
foarte mic Ataşate la microscop condensoarele de cacircmp icircntunecat trebuiesc centrate
foarte bine pe axul optic al microscopului icircn caz contrar obţinacircndu-se imagini cu
rdquoumbrerdquo
4 Microscopia de polarizare
Microscopia de polarizare se utilizează icircn evidenţierea şi observarea
substanţelor optic active ce se găsesc icircn preparat Substanţele optic active au
proprietatea de a roti planul luminii polarizate
Figura 32 Microscopia de polarizare
Pentru utilizarea acestei tehnici este necesar să se ataşeze la microscop un
polarizor şi un analizor ambele confecţionate din Spat de Islanda ce au proprietatea de
a lăsa să treacă doar razele de lumină ce au un anumit unghi de polarizare
Aceasta tehnică se utilizează atacirct icircn microscopia de transmisie cacirct şi icircn
microscopia de reflexie Icircn cazul montării corecte a polarizorului şi a analizorului doar
razele de lumina ce străbat zonele din preparat ce conţin substanţe optic active vor
ajunge la observator
5 Microscopia de fluorescenţă
Fluorescenţa este proprietatea anumitor substanţe de a emite lumină (radiaţie
vizibilă) atunci cacircnd sunt excitate cu radiaţie UV Deoarece multe substanţe de interes
medical prezintă fluorescenţă (acizi nucleici proteine) această tehnică este foarte
utilizată icircn practica de laborator şi de cercetare medicală
Fiecare substanţă ce prezintă fluorescenţă este caracterizată de o lungime de
undă de excitaţie (icircn UV) şi de o lungime de undă de emisie (icircn vizibil) astfel icircncacirct
tehnica poate nu doar pune icircn evidentă dar şi identifica substanţele respective Icircn acest
scop se utilizează filtre optice şi de UV pentru selectarea radiaţiei de excitaţie şi de
emisie a substanţei ce urmează a fi observată Filtrele se dispun ca icircn figura 33
Figura 33 Microscopia de fluorescenţă
Icircn cadrul acestei tehnici pentru observarea substanţelor ce nu prezintă
fluorescenţă icircn mod direct se utilizează rdquomarkeri de fluore-scenţărdquo substanţe ce au
următoarele proprietăţi
- fluorescenţă intrinsecă
- aditivitate foarte mare
- deteriorează minim structura (substanţa) de care se fixează
Cele mai utilizate sunt substanţele din clasa flavinelor
6 Microscopia de contrast de fază
Este o tehnică ce se utilizează icircn special pentru observarea celulelor şi
organismelor vii atunci cacircnd tehnicile de colorare nu pot fi folosite Metoda pune icircn
evidenţă diferenţa de drum optic pe care o face lumina trecacircnd prin diferite zone ale
preparatului (reamintim că drumul optic este produsul dintre drumul geometric şi
indicele de refracţie al mediului pe care icircl parcurge raza de lumină)
Deci această tehnică pune icircn evidenţă atacirct diferenţe de grosime icircntre diferitele
zone ale preparatului cacirct şi diferenţe de indice de refracţie icircntre acestea Sunt utilizate
obiective speciale (inscripţionate Cf) care au dispuse icircn planul focal o placa de fază ce
defazează lumina cu o semilungime de unda (icircn + se numeşte contrast de fază pozitiv
sau icircn ndash contrast de fază negativ) şi un inel parţial absorbant
De asemenea condensorul prezintă o fanta inelară ce este specifică fiecărui
obiectiv folosit Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special
cu ajutorul căruia se pot observa simultan atacirct inelul parţial absorbant cacirct şi fanta
inelară icircn scopul suprapunerii acestor două imagini
II Parte experimentală
Materiale necesare
1 Microscop de cercetare MC9
2 Microscop Biorom
3 Condensoare de cacircmp icircntunecat
4 Polarizor analizor
5 Obiective de imersie
6 Obiective de contrast de fază
7 Lame cu diferite preparate
Modul de lucru
A Observarea nucleilor celulelor
-se aşează lama cu preparat pe masuţa microscopului şi se fixează cu ajutorul
călăreţilor
-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) şi se localizează zona cu
preparat
-se coboară măsuţa microscopului fără a deplasa preparatul
-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00
-se aplică o picătură de lichid de imersie pe preparat (icircn dreptul obiectivului)
-cu foarte mare atenţie se coboară obiectivul pacircna ce se imer-sează icircn lichid
-privind prin ocular se pune la punct imaginea
B Determinarea depozitelor glucidice
-se montează la microscopul MC9 polarizorul şi analizorul
-se fixează preparatul pe măsuţă
-se pune la punct imaginea
-se deplasează icircn plan orizontal preparatul pe măsuţă pacircnă cacircnd se găseşte o
zona liberă
-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de
icircntunecată
-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă
zonele icircn care se găsesc substanţe optic active
C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei
-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de
fază
-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct
-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial
absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului
-se montează din nou ocularul microscopului
-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)
-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă
atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază
ecranelor de protecţie deoarece retina este foarte sensibilă icircn acest domeniu de lungimi
de undă
3 Microscopia de cacircmp icircntunecat
Tehnica de cacircmp icircntunecat este utilizată pentru observarea preparatelor
transparente şi se bazează pe icircmprăştierea luminii pe detaliile preparatului Orice
neomogenitate din preparat va determina o modificare a direcţiei razelor de lumină Din
punct de vedere constructiv se utilizează un condensor special alcătuit dintr-o oglindă
concavă şi una convexă (figura 31) astfel icircncacirct doar razele de lumina icircmprăştiate pe
neomogenităţile preparatului să ajungă icircn obiectiv
Figura 31 Microscopia de cacircmp icircntunecat
Condensoarele de cacircmp icircntunecat oferă icircnclinări diferite razelor de lumina
trimise spre preparat Cacircnd se doreşte observarea detaliilor foarte fine se folosesc
condensoare ce produc icircnclinări mari fascicolului incident fiind necesar icircn acelaşi timp
mărirea intensităţii luminoase deoarece fluxul de lumină ce pătrunde icircn obiectiv este
foarte mic Ataşate la microscop condensoarele de cacircmp icircntunecat trebuiesc centrate
foarte bine pe axul optic al microscopului icircn caz contrar obţinacircndu-se imagini cu
rdquoumbrerdquo
4 Microscopia de polarizare
Microscopia de polarizare se utilizează icircn evidenţierea şi observarea
substanţelor optic active ce se găsesc icircn preparat Substanţele optic active au
proprietatea de a roti planul luminii polarizate
Figura 32 Microscopia de polarizare
Pentru utilizarea acestei tehnici este necesar să se ataşeze la microscop un
polarizor şi un analizor ambele confecţionate din Spat de Islanda ce au proprietatea de
a lăsa să treacă doar razele de lumină ce au un anumit unghi de polarizare
Aceasta tehnică se utilizează atacirct icircn microscopia de transmisie cacirct şi icircn
microscopia de reflexie Icircn cazul montării corecte a polarizorului şi a analizorului doar
razele de lumina ce străbat zonele din preparat ce conţin substanţe optic active vor
ajunge la observator
5 Microscopia de fluorescenţă
Fluorescenţa este proprietatea anumitor substanţe de a emite lumină (radiaţie
vizibilă) atunci cacircnd sunt excitate cu radiaţie UV Deoarece multe substanţe de interes
medical prezintă fluorescenţă (acizi nucleici proteine) această tehnică este foarte
utilizată icircn practica de laborator şi de cercetare medicală
Fiecare substanţă ce prezintă fluorescenţă este caracterizată de o lungime de
undă de excitaţie (icircn UV) şi de o lungime de undă de emisie (icircn vizibil) astfel icircncacirct
tehnica poate nu doar pune icircn evidentă dar şi identifica substanţele respective Icircn acest
scop se utilizează filtre optice şi de UV pentru selectarea radiaţiei de excitaţie şi de
emisie a substanţei ce urmează a fi observată Filtrele se dispun ca icircn figura 33
Figura 33 Microscopia de fluorescenţă
Icircn cadrul acestei tehnici pentru observarea substanţelor ce nu prezintă
fluorescenţă icircn mod direct se utilizează rdquomarkeri de fluore-scenţărdquo substanţe ce au
următoarele proprietăţi
- fluorescenţă intrinsecă
- aditivitate foarte mare
- deteriorează minim structura (substanţa) de care se fixează
Cele mai utilizate sunt substanţele din clasa flavinelor
6 Microscopia de contrast de fază
Este o tehnică ce se utilizează icircn special pentru observarea celulelor şi
organismelor vii atunci cacircnd tehnicile de colorare nu pot fi folosite Metoda pune icircn
evidenţă diferenţa de drum optic pe care o face lumina trecacircnd prin diferite zone ale
preparatului (reamintim că drumul optic este produsul dintre drumul geometric şi
indicele de refracţie al mediului pe care icircl parcurge raza de lumină)
Deci această tehnică pune icircn evidenţă atacirct diferenţe de grosime icircntre diferitele
zone ale preparatului cacirct şi diferenţe de indice de refracţie icircntre acestea Sunt utilizate
obiective speciale (inscripţionate Cf) care au dispuse icircn planul focal o placa de fază ce
defazează lumina cu o semilungime de unda (icircn + se numeşte contrast de fază pozitiv
sau icircn ndash contrast de fază negativ) şi un inel parţial absorbant
De asemenea condensorul prezintă o fanta inelară ce este specifică fiecărui
obiectiv folosit Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special
cu ajutorul căruia se pot observa simultan atacirct inelul parţial absorbant cacirct şi fanta
inelară icircn scopul suprapunerii acestor două imagini
II Parte experimentală
Materiale necesare
1 Microscop de cercetare MC9
2 Microscop Biorom
3 Condensoare de cacircmp icircntunecat
4 Polarizor analizor
5 Obiective de imersie
6 Obiective de contrast de fază
7 Lame cu diferite preparate
Modul de lucru
A Observarea nucleilor celulelor
-se aşează lama cu preparat pe masuţa microscopului şi se fixează cu ajutorul
călăreţilor
-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) şi se localizează zona cu
preparat
-se coboară măsuţa microscopului fără a deplasa preparatul
-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00
-se aplică o picătură de lichid de imersie pe preparat (icircn dreptul obiectivului)
-cu foarte mare atenţie se coboară obiectivul pacircna ce se imer-sează icircn lichid
-privind prin ocular se pune la punct imaginea
B Determinarea depozitelor glucidice
-se montează la microscopul MC9 polarizorul şi analizorul
-se fixează preparatul pe măsuţă
-se pune la punct imaginea
-se deplasează icircn plan orizontal preparatul pe măsuţă pacircnă cacircnd se găseşte o
zona liberă
-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de
icircntunecată
-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă
zonele icircn care se găsesc substanţe optic active
C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei
-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de
fază
-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct
-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial
absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului
-se montează din nou ocularul microscopului
-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)
-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă
atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază
Figura 32 Microscopia de polarizare
Pentru utilizarea acestei tehnici este necesar să se ataşeze la microscop un
polarizor şi un analizor ambele confecţionate din Spat de Islanda ce au proprietatea de
a lăsa să treacă doar razele de lumină ce au un anumit unghi de polarizare
Aceasta tehnică se utilizează atacirct icircn microscopia de transmisie cacirct şi icircn
microscopia de reflexie Icircn cazul montării corecte a polarizorului şi a analizorului doar
razele de lumina ce străbat zonele din preparat ce conţin substanţe optic active vor
ajunge la observator
5 Microscopia de fluorescenţă
Fluorescenţa este proprietatea anumitor substanţe de a emite lumină (radiaţie
vizibilă) atunci cacircnd sunt excitate cu radiaţie UV Deoarece multe substanţe de interes
medical prezintă fluorescenţă (acizi nucleici proteine) această tehnică este foarte
utilizată icircn practica de laborator şi de cercetare medicală
Fiecare substanţă ce prezintă fluorescenţă este caracterizată de o lungime de
undă de excitaţie (icircn UV) şi de o lungime de undă de emisie (icircn vizibil) astfel icircncacirct
tehnica poate nu doar pune icircn evidentă dar şi identifica substanţele respective Icircn acest
scop se utilizează filtre optice şi de UV pentru selectarea radiaţiei de excitaţie şi de
emisie a substanţei ce urmează a fi observată Filtrele se dispun ca icircn figura 33
Figura 33 Microscopia de fluorescenţă
Icircn cadrul acestei tehnici pentru observarea substanţelor ce nu prezintă
fluorescenţă icircn mod direct se utilizează rdquomarkeri de fluore-scenţărdquo substanţe ce au
următoarele proprietăţi
- fluorescenţă intrinsecă
- aditivitate foarte mare
- deteriorează minim structura (substanţa) de care se fixează
Cele mai utilizate sunt substanţele din clasa flavinelor
6 Microscopia de contrast de fază
Este o tehnică ce se utilizează icircn special pentru observarea celulelor şi
organismelor vii atunci cacircnd tehnicile de colorare nu pot fi folosite Metoda pune icircn
evidenţă diferenţa de drum optic pe care o face lumina trecacircnd prin diferite zone ale
preparatului (reamintim că drumul optic este produsul dintre drumul geometric şi
indicele de refracţie al mediului pe care icircl parcurge raza de lumină)
Deci această tehnică pune icircn evidenţă atacirct diferenţe de grosime icircntre diferitele
zone ale preparatului cacirct şi diferenţe de indice de refracţie icircntre acestea Sunt utilizate
obiective speciale (inscripţionate Cf) care au dispuse icircn planul focal o placa de fază ce
defazează lumina cu o semilungime de unda (icircn + se numeşte contrast de fază pozitiv
sau icircn ndash contrast de fază negativ) şi un inel parţial absorbant
De asemenea condensorul prezintă o fanta inelară ce este specifică fiecărui
obiectiv folosit Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special
cu ajutorul căruia se pot observa simultan atacirct inelul parţial absorbant cacirct şi fanta
inelară icircn scopul suprapunerii acestor două imagini
II Parte experimentală
Materiale necesare
1 Microscop de cercetare MC9
2 Microscop Biorom
3 Condensoare de cacircmp icircntunecat
4 Polarizor analizor
5 Obiective de imersie
6 Obiective de contrast de fază
7 Lame cu diferite preparate
Modul de lucru
A Observarea nucleilor celulelor
-se aşează lama cu preparat pe masuţa microscopului şi se fixează cu ajutorul
călăreţilor
-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) şi se localizează zona cu
preparat
-se coboară măsuţa microscopului fără a deplasa preparatul
-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00
-se aplică o picătură de lichid de imersie pe preparat (icircn dreptul obiectivului)
-cu foarte mare atenţie se coboară obiectivul pacircna ce se imer-sează icircn lichid
-privind prin ocular se pune la punct imaginea
B Determinarea depozitelor glucidice
-se montează la microscopul MC9 polarizorul şi analizorul
-se fixează preparatul pe măsuţă
-se pune la punct imaginea
-se deplasează icircn plan orizontal preparatul pe măsuţă pacircnă cacircnd se găseşte o
zona liberă
-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de
icircntunecată
-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă
zonele icircn care se găsesc substanţe optic active
C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei
-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de
fază
-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct
-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial
absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului
-se montează din nou ocularul microscopului
-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)
-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă
atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază
Figura 33 Microscopia de fluorescenţă
Icircn cadrul acestei tehnici pentru observarea substanţelor ce nu prezintă
fluorescenţă icircn mod direct se utilizează rdquomarkeri de fluore-scenţărdquo substanţe ce au
următoarele proprietăţi
- fluorescenţă intrinsecă
- aditivitate foarte mare
- deteriorează minim structura (substanţa) de care se fixează
Cele mai utilizate sunt substanţele din clasa flavinelor
6 Microscopia de contrast de fază
Este o tehnică ce se utilizează icircn special pentru observarea celulelor şi
organismelor vii atunci cacircnd tehnicile de colorare nu pot fi folosite Metoda pune icircn
evidenţă diferenţa de drum optic pe care o face lumina trecacircnd prin diferite zone ale
preparatului (reamintim că drumul optic este produsul dintre drumul geometric şi
indicele de refracţie al mediului pe care icircl parcurge raza de lumină)
Deci această tehnică pune icircn evidenţă atacirct diferenţe de grosime icircntre diferitele
zone ale preparatului cacirct şi diferenţe de indice de refracţie icircntre acestea Sunt utilizate
obiective speciale (inscripţionate Cf) care au dispuse icircn planul focal o placa de fază ce
defazează lumina cu o semilungime de unda (icircn + se numeşte contrast de fază pozitiv
sau icircn ndash contrast de fază negativ) şi un inel parţial absorbant
De asemenea condensorul prezintă o fanta inelară ce este specifică fiecărui
obiectiv folosit Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special
cu ajutorul căruia se pot observa simultan atacirct inelul parţial absorbant cacirct şi fanta
inelară icircn scopul suprapunerii acestor două imagini
II Parte experimentală
Materiale necesare
1 Microscop de cercetare MC9
2 Microscop Biorom
3 Condensoare de cacircmp icircntunecat
4 Polarizor analizor
5 Obiective de imersie
6 Obiective de contrast de fază
7 Lame cu diferite preparate
Modul de lucru
A Observarea nucleilor celulelor
-se aşează lama cu preparat pe masuţa microscopului şi se fixează cu ajutorul
călăreţilor
-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) şi se localizează zona cu
preparat
-se coboară măsuţa microscopului fără a deplasa preparatul
-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00
-se aplică o picătură de lichid de imersie pe preparat (icircn dreptul obiectivului)
-cu foarte mare atenţie se coboară obiectivul pacircna ce se imer-sează icircn lichid
-privind prin ocular se pune la punct imaginea
B Determinarea depozitelor glucidice
-se montează la microscopul MC9 polarizorul şi analizorul
-se fixează preparatul pe măsuţă
-se pune la punct imaginea
-se deplasează icircn plan orizontal preparatul pe măsuţă pacircnă cacircnd se găseşte o
zona liberă
-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de
icircntunecată
-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă
zonele icircn care se găsesc substanţe optic active
C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei
-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de
fază
-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct
-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial
absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului
-se montează din nou ocularul microscopului
-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)
-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă
atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază
cu ajutorul căruia se pot observa simultan atacirct inelul parţial absorbant cacirct şi fanta
inelară icircn scopul suprapunerii acestor două imagini
II Parte experimentală
Materiale necesare
1 Microscop de cercetare MC9
2 Microscop Biorom
3 Condensoare de cacircmp icircntunecat
4 Polarizor analizor
5 Obiective de imersie
6 Obiective de contrast de fază
7 Lame cu diferite preparate
Modul de lucru
A Observarea nucleilor celulelor
-se aşează lama cu preparat pe masuţa microscopului şi se fixează cu ajutorul
călăreţilor
-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) şi se localizează zona cu
preparat
-se coboară măsuţa microscopului fără a deplasa preparatul
-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00
-se aplică o picătură de lichid de imersie pe preparat (icircn dreptul obiectivului)
-cu foarte mare atenţie se coboară obiectivul pacircna ce se imer-sează icircn lichid
-privind prin ocular se pune la punct imaginea
B Determinarea depozitelor glucidice
-se montează la microscopul MC9 polarizorul şi analizorul
-se fixează preparatul pe măsuţă
-se pune la punct imaginea
-se deplasează icircn plan orizontal preparatul pe măsuţă pacircnă cacircnd se găseşte o
zona liberă
-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de
icircntunecată
-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă
zonele icircn care se găsesc substanţe optic active
C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei
-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de
fază
-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct
-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial
absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului
-se montează din nou ocularul microscopului
-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)
-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă
atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază
-se roteşte icircncet polarizorul pacircnă icircn momentul icircn care imaginea este maxim de
icircntunecată
-se aduce din nou preparatul icircn cacircmpul vizual zonele luminoase reprezintă
zonele icircn care se găsesc substanţe optic active
C Determinarea icircncărcăturii biologice a apei
-se montează la microscopul Biorom condensorul şi obiectivele de contrast de
fază
-se icircnlocuieşte un ocular cu ocularul de punere la punct
-din şuruburile de punere la punct se centrează sistemul astfel icircncacirct inelul parţial
absorbant din obiectiv să corespundă cu fanta inelară a condensorului
-se montează din nou ocularul microscopului
-pe o lamă curată se pune o picătură de apă stătută (24h)
-se fixează lama la microscop şi se caută observarea germenilor existenţi icircn apă
atacirct prin tehnica de microscopie clasică cacirct şi prin cea de contrast de fază
Top Related