DESCRIEREA MICROSCOPULUI

Se numeşte microscop binocular pentru că permite examinarea cu ambii ochi şi lumipan pentru că are încorporată în el sursa de lumină. Un astfel de microscop este constituit din trei părţi principale: partea mecanică, partea optică şi sistemul de iluminare.

Partea mecanică este formată la rândul ei din următoarele componente: piciorul sau talpa microscopului, coloana microscopului, măsuţa sau platina microscopului şi tubul microscopului.

Piciorul sau talpa microscopului este o piesă care prin forma şi greutatea sa asigură stabilitate microscopului şi serveşte ca suport pentru celelalte componente. În cazul microscopului Olympus CX 21 talpa este de formă aproximativ dreptunghiulară şi are încorporate în ea sursa de lumină şi o parte a dispozitivului de transmis lumina. Pe lângă acestea mai conţine transformatorul, iar pe partea laterală prezintă 2 butoane. Unul este pentru pornit-oprit, iar celălalt este folosit la reglarea intensităţii luminii şi prezintă o scală de reglare a intensităţii de la 1 la 6.

Coloana microscopului serveşte drept suport pentru: măsuţă, tub şi sistemul optic. Este fixată pe talpa microscopului şi are o formă încurbată. În extremitatea liberă, coloana adăposteşte tubul microscopului care nu este vizibil. Pe părţile laterale prezintă câte 2 butoane (vize) situate pe aceeaşi axă.

Viza macrometrică permite deplasarea preparatului microscopic în raport cu obiectivul printr-o mişcare rapidă (vizibilă cu ochiul liber) şi pe o distanţă mare (cca. 4 cm). Cu ajutorul ei se obţine imaginea preparatului microscopic. Această imagine necesită o îmbunătăţire, o finisare, pentru a avea claritatea necesară observării detaliilor fine.

Viza micrometrică permite deplasarea preparatului în raport cu obiectivul pe o distanţă mică printr-o mişcare foarte lentă (ce nu poate fi observată cu ochiul liber). Această deplasare fină va permite o reglare de mare precizie a imaginii. De altfel, prin mişcarea acestei vize se face finisarea (clarificarea) imaginii preliminare obţinute cu ajutorul vizei macrometrice.

Măsuţa sau platina este ataşată de coloana microscopului în poziţie orizontală. Ea este formată din două plăci metalice dispuse una peste cealaltă. Componenta inferioară are o formă aproximativ pătrată, este fixă şi prezintă în zona centrală un orificiu de formă rotundă care permite trecerea luminii ce vine de la condensor înspre preparatul microscopic în timp ce componenta superioară, de formă dreptunghiulară este mobilă (poate fi deplasată înainte şi înapoi)..

Măsuţa prezintă un dispozitiv pentru fixarea preparatului, şi este prevăzut cu un braţ articulat acţionat de un resort. El serveşte la fixarea şi imobilizarea preparatului de examinat pe măsuţa microscopului. Ei sunt fixaţi de o şină metalică. Aceasta este situată la partea mobilă a măsuţei şi se poate deplasa lateral (stânga-dreapta).

Sub măsuţă, în partea dreaptă, se găsesc două şuruburi montate pe acelaşi ax, care alcătuiesc carul mobil (căruciorul) al măsuţei. Şurubul superior este mai gros şi prin rotirea lui este acţionată placa superioară a măsuţei care se va deplasa înainte şi înapoi în funcţie de dorinţa examinatorului. Cum preparatul microscopic este fixat la partea anterioară a acestei componente şi imobilizat cu sistemul de cleme, înseamnă că mişcând componenta superioară a măsuţei deplasăm preparatul înainte sau înapoi, în raport cu obiectivul (care rămâne fix). Şurubul inferior este mai subţire şi prin rotirea lui este acţionat sistemul de cleme. Preparatul imobilizat cu sistemul de cleme poate fi deplasat la dreapta sau la stânga (în raport cu obiectivul), după cum doreşte examinatorul. În felul acesta cu ajutorul celor două şuruburi ale carului mobil se va putea deplasa preparatul microscopic în timpul examinării înainte şi înapoi (cu ajutorul şurubului superior), la dreapta şi la stânga (cu ajutorul şurubului inferior). Aceste mişcări sunt necesare pentru ca examinatorul să poată explora întreaga suprafaţă a secţiunii histologice existente pe preparatul de examinat.

Viza condensorului se află sub măsuţă, în partea stângă şi permite deplasarea acestuia în sus sau în jos, modificând în acest fel cantitatea de lumină ce va fi trimisă în planul preparatului microscopic

Tubul microscopului este dispus în extremitatea liberă a coloanei şi asigură legătura optică între sistemul obiectiv şi sistemul de prisme. În partea lui inferioară tubul microscopului este prevăzut cu un dispozitiv numit revolver. Revolverul este format din două discuri metalice: unul superior fix şi unul inferior rotativ. Discul inferior este prevăzut cu patru orificii în care se montează prin înfiletare obiectivele microscopului. Revolverul este prevăzut la interior cu o “piedică” (un arc de oţel) care serveşte la fixarea obiectivelor în axul optic. Prin rotirea revolverului se poate aduce în axul optic obiectivul dorit, poziţionarea lui corectă fiind confirmată de un mic zgomot metalic pe care îl emite arcul revolverului în momentul când obiectivul a ajuns în poziţie corectă. În partea superioară a tubului se găseşte sistemul de prisme.

Partea optică este alcătuită din următoarele componente majore: sistemul obiectiv, sistemul de prisme şi sistemul ocular.

Sistemul obiectiv este reprezentat de 4 obiective care, aşa cum am mai menţionat, sunt montate pe discul inferior (rotativ) al revolverului. Un obiectiv este un tub metalic în care se află montat un sistem de lentile. Prima lentilă (cea care priveşte spre obiectul de examinat) este plan convexă, fiind dispusă cu faţa plană spre exterior

1

(spre preparatul microscopic). Ea poartă numele de lentilă frontală şi este lentila de bază a obiectivului adică cea care preia imaginea obiectului de examinat.

În funcţie de mediul care se interpune între obiectul de examinat şi lentila frontală a obiectivului se deosebesc două feluri de obiective: obiective uscate la care între obiectul de examinat şi lentila frontală se interpune aerul şi obiective cu imersie la care între preparatul microscopic şi lentila frontală se interpune un lichid, numit lichid de imersie. Obiectivele uscate ale microscopului sunt în număr de 3 şi au următoarea putere de mărire: 4x, 10x, şi 40x. Puterea de mărire este notată pe fiecare obiectiv înaintea cifrei care exprimă apertura lui numerică. Cel de al 4-lea obiectiv al microscopului este obiectivul cu imersie care are o putere de mărire de 100x.

Sistemul de prisme este format dintr-o prismă de bază care preia imaginea de la obiectiv şi prin intermediul altor prisme (prisme deviatoare) o distribuie spre cele două oculare, realizând vederea binoculară a imaginii microscopice. Prismele sunt astfel concepute încât schimbă direcţia razelor de lumină primite de la obiectiv de aşa manieră încât examinarea la microscop să se poată face în poziţia cea mai comodă posibil.

Sistemul ocular este reprezentat de cele două oculare situate la partea superioară a sistemului de prisme. Ocularul este un tub metalic în care s-a montat un sistem de lentile. Microscopul este dotat cu oculare plane cu câmp larg, cu o putere de mărire de 10x. Puterea de mărire a ocularului este înscrisă în partea lui superioară. Distanţa dintre oculare poate fi reglată în funcţie de distanţa interpupilară a fiecărui examinator. Tubul în care este montat ocularul din stânga este prevăzut cu un dispozitiv rotativ care permite corectarea diferenţei de dioptrii dintre cei doi ochi ai examinatorului.

Sistemul de iluminare este alcătuit din sursa de lumină şi dispozitivul de transmis lumina.Sursa de lumină este reprezentată de un bec halogen de 6 V şi 20 W. Alimentarea becului se face de la

reţeaua de 220 V prin intermediul unui transformator inclus în tapa microscopului care are la ieşire un curent de 6 V.

Dispozitivul de transmis lumina este format din totalitatea componentelor pe care razele luminoase dispersate venite de la sursa de lumină le vor întâlni în calea lor spre obiectul de examinat. Prima piesă a acestui dispozitiv este o piesă de formă cilindrică prevăzută cu două lentile ce poartă numele de colector. Rolul colectorului este de a direcţiona razele luminoase, adică el primeşte razele de lumină dispersate ce vin de la sursa de lumină, pe care le va orienta în aşa fel încât la ieşirea din colector fasciculul luminos va fi format din raze paralele între ele. Ele vor fi trimise în sus, sub formă de fascicul de raze paralele, printr-un geam dispus pe partea superioară a tălpii microscopului.

Fasciculul de raze va întâlni apoi o diafragmă numită diafragma de apertură după care va pătrunde în condensor. Modificarea orificiului diafragmei de apertură se face cu ajutorul unei rotiţe prezente în partea inferioară a condensorului. Condensorul este un dispozitiv prevăzut cu două lentile şi are rolul de a concentra fasciculul de raze paralele pe care le captează cu prima lentilă, astfel încât ele vor fi adunate (concentrate) sub forma unui punct (spot) luminos ce va fi trimis în planul preparatului microscopic. Lumina primită de la condensor va străbate preparatul microscopic şi va intra în lentila frontală a obiectivului concurând la formarea imaginii în microscop.

EXAMINAREA LA MICROSCOPUL OPTIC

Pentru a examina în condiţii optime la microscopul optic, sunt necesare câteva operaţiuni care preced examinarea propriu-zisă. Altfel spus, microscopul trebuie “pregătit” în vederea examinării. Această pregătire constă în următoarele operaţii:1) se poziţionează butonul de reglare a intensităţii luminoase în dreptul cifrei 3;2) se apasă pe butonul de pornire-oprire;3) se coboară măsuţa cu viza macrometrică pentru a avea acces uşor pe măsuţă. În felul acesta preparatul poate fi

aşezat uşor în cea mai corectă poziţie şi nu există riscul zgârierii lentilei frontale a obiectivului sau a lamelei preparatului;

4) se aşează preparatul microscopic pe măsuţă cu lamela în sus şi se imobilizează cu ajutorul celor doi valeţi;5) cu ajutorul carului mobil deplasăm preparatul până când secţiunea colorată se suprapune peste spotul luminos

trimis de condensor; 6) se aduce în axul optic obiectivul 4X, prin rotirea revolverului în sensul acelor de ceasornic.

După efectuarea acestor operaţiuni, microscopul este pregătit pentru examinare. Prin dotarea lui tehnică, microscopul permite o paletă largă de operaţiuni, motiv pentru care o să prezentăm operaţiunile cele mai des utilizate. Pentru examenele curente se folosesc obiectivele 4X, 10X, 40X. Obiectivul 100X se foloseşte numai în anumite situaţii.

2

OBŢINEREA IMAGINII MICROSCOPICE CU OBIECTIVELE 4X, 10X, 40X

În cazul examenelor curente, obţinerea imaginii preparatului de examinat se face întotdeauna cu obiectivul cu puterea de mărire cea mai mică (4X) şi numai ulterior se trece la obiectivul următor (dacă este cazul). Trebuie precizat că microscopul este pregătit pentru examinare aşa cum am prezentat anterior.

OBŢINEREA IMAGINII CU OBIECTIVUL 4X.

Dacă structurile din preparatul microscopic ce urmează a fi examinate sunt de dimensiuni mari, ele nu necesită pentru examinare (cel puţin pentru imagini de ansamblu) decât trepte mici de mărire. În această situaţie se examinează (cel puţin iniţial) cu obiectivul 4X.

Privind lateral (la preparat şi nu în oculare), ridicăm măsuţa cu viza macrometrică până în poziţia cea mai de sus. Apoi privind în oculare, coborâm încet, tot cu viza macrometrică, până când obţinem imaginea preparatului. În acel moment luăm mâna de pe viza macrometrică şi în continuare vom lucra numai cu viza micrometrică. Imaginea obţinută cu ajutorul vizei macrometrice este o imagine preliminară care necesită anumite îmbunătăţiri calitative pentru ca noi să putem observa detaliile fine ale preparatului. Pentru aceasta, imaginea obţinută cu ajutorul vizei macrometrice o vom finisa (clarifica) cu ajutorul vizei micrometrice. În acest moment imaginea este corespunzătoare şi examinatorul poate deplasa preparatul cu ajutorul carului mobil în direcţia dorită astfel încât să poată examina tot ceea ce doreşte de pe suprafaţa de secţiune. Trebuie menţionat faptul că este necesar ca imaginea să fie clarificată în permanenţă cu viza micrometrică pentru ca ea să fie de cea mai bună calitate. Acest lucru este necesar deoarece imaginea bine reglată într-un punct al preparatului nu se va păstra la aceeaşi calitate după deplasarea în alt punct. În timpul examinării o mână va acţiona carul mobil şi cealaltă viza micrometrică.

OBŢINEREA IMAGINII CU OBIECTIVUL 10X

Fără a mai modifica imaginea obţinută cu ajutorul obiectivului 4X, prin rotirea revorverului aducem în axul optic al microscopului obiectivul de 10X. Cu ajutorul vizei micrometrice clarificăm imaginea. Dacă este cazul reglăm intensitatea luminii cu ajutorul butonului de reglare de pe partea laterală a tălpii microscopului. După ce examinăm şi cu acest obiectiv secţiunea colorată dacă există aspecte ce dorim să le examinăm cu un obiectiv cu putere de mărire mai mare, aducem aceste aspecte în centrul câmpului microscopic şi trecem la examinarea cu obiectivul 40X.

OBŢINEREA IMAGINII CU OBIECTIVUL 40X

Fără să modificăm în nici un fel imaginea reglată pentru obiectivul 10X, aducem în axul optic obiectivul 40X prin rotirea revolverului în sensul acelor de ceasornic. Dacă imaginea a fost corect reglată pentru obiectivul 10X, ea se păstrează şi la schimbarea pe obiectivul 40X doar că pierde din claritate. Imaginea va fi în continuare clarificată numai cu viza micrometrică (utilizarea vizei macrometrice este total contraindicată). Dacă este cazul reglăm intensitatea luminii cu ajutorul butonului de reglare de pe partea laterală a tălpii microscopului. Examinatorul poate acum studia toate detaliile care îl interesează. La încheierea examinării, se roteşte revorverul şi aducem în axul optic al microscopului o poziţie în care nu avem fixat nici un obiectiv. Cu ajutorul vizei macrometrice coborâm măsuţa pentru ca preparatul să poată fi luat uşor.

Obţinerea imaginii microscopice se face aşa cum am mai spus, începând de fiecare dată cu obiectivul 4X. Acest obiectiv cuprinde în câmpul microscopic o suprafaţă mare din preparat ceea ce permite localizarea uşoară a unor structuri, chiar dacă uneori nu permite observarea unor detalii foarte fine ale acestora. Întotdeauna, localizarea structurilor pe suprafaţa de secţiune se face cu obiectivul 4X. Dacă dorim să observăm anumite detalii identificate cu obiectivul 4X, vom examina cu obiectivul 10X şi dacă este cazul cu obiectivul 40X. Ordinea în care se lucrează cu aceste obiective (4X, 10X, 40X) este întotdeauna aceasta. Fiecare obiectiv are destinaţia lui şi trebuie folosit ca atare.

De reţinut!Pentru o examinare corectă care să asigure o imagine de calitate şi protecţia aparatului şi materialelor este

obligatorie respectarea acestei modalităţi de examinare. Regulile care nu trebuie în nici un caz uitate sau ignorate sunt: preparatul se aşează pe măsuţă întotdeauna cu lamela în sus; după obţinerea imaginii cu obiectivul 4X, nu se mai utilizează viza macrometrică; pentru celelalte obiective

(10X şi 40X) este suficientă viza micrometrică. dacă, dintr-un motiv sau altul, în timpul examinării, imaginea s-a dereglat, nu se forţează reglarea ei cu viza

macrometrică ci se reia examinarea de la capăt (cu obiectivul 4X); în nici un caz nu se încearcă obţinerea imaginii cu viza macrometrică pentru fiecare obiectiv în parte.

Recoltarea probelor

3

Recoltarea este operaţiunea de prelevare a unor mici fragmente de ţesut sau organ, fie din organismul viu, fie de la cadavre. Deşi este considerată de multe ori o operaţiune banală (şi tratată cu superficialitate) ea reprezintă de fapt una din cele mai importante etape ale efectuării preparatului permanent. Acţionarea cu brutalitate sau instrumentar neadecvat asupra organului sau ţesutului din care se recoltează piesa, poate cauza modificări (artefacte de recoltare) care pot pune în reală dificultate pe cel care va examina în final preparatul histologic. Pentru realizarea unei recoltări corecte este necesară respectarea cu stricteţe a unor reguli: recoltarea trebuie făcută cu instrumentar corespunzător şi foarte bine ascuţit (bisturiu cu lame de unică

folosinţă, lame de bărbierit etc.) şi să nu se exercite presiuni, tracţiuni sau alte manopere asemănătoare ce pot cauza ruperea sau strivirea unor structuri;

în cazul recoltării probelor de la cadavre, operaţiunea trebuie efectuată în cel mai scurt timp posibil pentru evitarea instalării alterărilor post-mortem;

se recoltează fragmente de ţesut sau organ sub formă de felii a căror grosime nu trebuie să depăşească 5 mm, iar direcţia în care se face secţionarea va determina orientarea finală a secţiunilor, importantă mai ales în cazul unor organe cum ar fi muşchii sau pereţii organelor cavitare. Dacă piesele sunt mai groase există riscul ca ele să nu poată fi pătrunse în timp util de agenţii fixatori. Dacă grosimea este corespunzătoare, celelalte dimensiuni (lungimea, lăţimea) nu sunt foarte importante din punctul de vedere al fixării, putând fi alese în funcţie de necesităţi;

când pe suprafaţa organului din care recoltăm proba există leziuni vizibile macroscopic, secţiunea trebuie astfel orientată încât fragmentul prelevat să cuprindă atât ţesut lezat cât şi ţesut sănătos;

recoltarea pieselor din diferite ţesuturi şi organe trebuie să se facă într-o anumită ordine stabilită în funcţie de rapiditatea cu care ele încep să se altereze. Astfel, structurile cele mai sensibile sunt glandele endocrine, apoi mucoasa gastrică şi intestinală, sistemul nervos, testiculele, rinichii etc;

imediat după recoltare piesele trebuie introduse în recipientul cu soluţie fixatoare (bucată cu bucată).

Fixarea probelor

Pentru studiul histologic nu este suficient ca proba de examinat să fie transparentă şi să posede un contrast optic adecvat. Celulele şi ţesuturile (mai ales cele prelevate de la animale) sunt instabile din punct de vedere fizic şi chimic. Tratamentele la care ele sunt supuse pentru obţinerea preparatului microscopic le-ar putea distruge în mod grav dacă ele nu ar fi stabilizate într-un anumit fel. Fără modificarea amplasării lor spaţiale, proteinele structurale şi alţi constituenţi trebuie făcuţi insolubili pentru toţi reactivii la care urmează să fie expuse. Celulele şi materialele extracelulare trebuie “conservate” astfel încât modificările structurale şi de compoziţie chimică ale pieselor prelucrate histologic să fie minime. Această “conservare” este subiectul fixării. Mai simplu spus, fixarea are ca scop întreruperea fenomenelor vitale din celule şi ţesuturi, cu păstrarea cât mai fidelă a structurii acestora. După părerea majorităţii specialiştilor histologi, fixarea este operaţiunea cea mai delicată dintre toate etapele realizării preparatului histologic permanent. Greşelile survenite în timpul fixării compromit iremediabil rezultatul final al prelucrării histologice. Materialul biologic poate fi fixat prin metode fizice sau prin metode chimice.

Pentru majoritatea studiilor histologice sunt utilizaţi fixatorii lichizi. Substanţele ce pot fi folosite pentru fixarea chimică a pieselor biologice sunt numeroase şi diverse. Ele pot fi folosite ca fixatori simpli sau ca amestecuri fixatoare. Agenţii fixatori simpli utilizaţi în tehnica histologică sunt foarte numeroşi, iar dintre aceştia amintim: alcoolul etilic, alcoolul metilic, acetona, cloroformul, acidul acetic, acidul tricloracetic, acidul picric, clorura mercurică (sublimatul), formolul etc. De cele mai multe ori aceşti agenţi fixatori intră în compoziţia unor amestecuri fixatoare, cu excepţia ultimului care este folosit frecvent ca fixator simplu.

Formolul comercial este o soluţie apoasă de formaldehidă 40%. Dacă formolul este utilizat ca fixator în soluţii apoase simple, el trebuie diluat cu câteva zile înainte.

Modul de preparare: considerând formolul comercial ca fiind o soluţie cu concentraţia de 100%, din care se prepară diferite soluţii de lucru. De exemplu: pentru formol histologic 10% se diluează 10 ml formol concentrat cu 90 ml apă distilată. Fixarea se face cel puţin o săptămână la temperatura camerei. Marele avantaj al fixării cu formol este faptul că după încheierea perioadei de fixare, piesele pot fi păstrate în continuare în fixator, fără ca ele să sufere modificări majore care să compromită prelucrarea ulterioară. Datorită acestui avantaj, formolul este cel mai utilizat fixator.

4