1 [RO]

Syphilis Total Ab 1 placă - 96 72530 5 plăci - 480 72531 KITURI PENTRU DETECTAREA CALITATIVĂ A ANTICORPILOR ÎMPOTRIVA TREPONEMA PALLIDUM ÎN PLASMĂ UMANĂ SAU SER PRIN UTILIZAREA UNEI TEHNICI IMUNOENZIMATICE

883679 - 2014/11

2 [RO]

CUPRINS

1. SCOPUL UTILIZĂRII

2. SUMAR ȘI EXPLICAȚIA TESTULUI

3. PRINCIPIILE PROCEDURII

4. REACTIVI

5. AVERTISMENTE ȘI PRECAUȚII

6. PROBE

7. PROCEDURA

8. LIMITĂRILE TESTULUI

9. CARACTERISTICI DE PERFORMANȚĂ

10. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE.

3 [RO]

1. SCOPUL UTILIZĂRII

Aceste kituri sunt menite a fi utilizate de personalul instruit și calificat corespunzător pentru detectia calitativă a anticorpilor împotriva Treponema pallidum în ser și plasmă umană. Produsul poate fi utilizat pentru screening-ul donatorilor de sânge și pentru a sprijini diagnosticarea pacienților suspectați de infecție cu sifilis.

2. SUMAR ȘI EXPLICAȚIA TESTULUI

Sifilisul este o infecție cronică cu evouție în patru stadii distincte: primar, secundar, terțiar și cuaternar. Aceste stadii sunt însoțite de simptome clinice diverse, producând în mod obișnuit leziuni inițiale, cunoscute ca șancru, apoi iritatie sifilitica, urmata de perioade lungi de latență. Infecția netratată poate conduce la probleme cardiovasculare și sifilis neurologic.

Infecția este cauzată de spirochetele Treponema pallidum, și se transmite de obicei prin contact sexual, deși boala se mai poate transmite și prin transfuzie cu sânge infectat. Se mai produce și transmiterea intrauterină. Acest organism s-a dovedit a fi practic imposibil de cultivat în mediu artificial, iar diagnosticarea infecției depinde, de obicei, de demonstrarea prezenței anticorpilor în sânge, întrucât aceștia apar la scurtă vreme după infecția inițială și pot rămâne prezenți mulți ani.

Testele pentru Sifilis se clasifică în patru categorii: examinare microscopică directă, teste pentru detectia anticorpilor treponemici, teste pentru detectia anticorpilor non-treponemici și teste directe cu antigen. Ca urmare a perioadelor îndelungate de latență și a caracterului nespecific al testelor non-treponemice, metodele ce detectează anticorpii specifici antitreponemici au devenit din ce în ce mai răspândite pentru screening. Syphilis Total Ab este un astfel de test.

3. PRINCIPIILE PROCEDURII

Syphilis Total Ab utilizează trei antigene recombinante într-o testare de tip sandwich. Antigenele vor detecta IgG, IgM și IgA specifici pentru T. Pallidum, ceea ce face ca testul să detecteze anticorpi în toate stadiile infecției. Godeurile sunt acoperite cu un amestec din antigenele recombinante T. Pallidum 15Kd, 17Kd și 47Kd. Anticorpii specifici din probele de ser sau plasmă se combină cu aceste antigene și cu aceleași antigene conjugate cu peroxidaza de hrean atunci când conjugatul este adăugat într-un godeu în care a fost incubata proba. După ce materialul nereactiv a fost îndepărtat prin spălare, prezența enzimei legate, ce indică prezența în probă a anticorpilor specifici, este evidențiată prin modificarea culorii amestecului substrat/cromogen. Intensitatea culorii este comparată cu aceea din godeurile cu control pentru a determina prezența sau absența anticorpilor specifici.

4 [RO]

4. REACTIVI 4.1. Descriere

Identificare pe etichetă Descriere Prezentare/ Preparare

72530 72531

R1 Microplate

Microplacă 12 stripuri a câte 8 godeuri fiecare, acoperite cu antigene recombinante T. pallidum (rAg) Număr de identificare specific = 97

1 placă Gata de utilizare

5 plăci Gata de utilizare

R2 Concentrated washing solution (20X)

Soluție de spălare concentrată (20X) Soluție tampon Tris-NaCl pH 7.4 Conservant: ProClin™ 300 (0.04%)

1 fiolă 70 ml

A se dilua

1 fiolă 235 ml

A se dilua

R3 Negative control

Control negativ Soluție tampon Tris-HCl, ce conține Albumină Serică Bovină (BSA) Conservant: ProClin™ 300 (0.1%)

1 fiolă 2.1 ml

Gata de utilizare

1 fiolă 2.1 ml

Gata de utilizare

R4 Positiv control

Control pozitiv (Uman) Ser uman ce conție anticorpi anti – Treponema palidum, negativ pentru HIV-1/2, AgHBs și HCV si diluat într-o soluție tampon Tris ce conține BSA Conservant: ProClin™ 300 (0.1%)

1 fiolă 1.6 ml

Gata de utilizare

1 fiolă 1.6 ml

Gata de utilizare

R6 Conjugate Conjugat T. pallidum rAg / Peroxidază Conservant: ProClin™ 300 (0.05%)

1 fiolă 8 ml

Gata de utilizare

1 fiolă 30 ml

Gata de utilizare

R8 Substrate buffer

Tampon pentru substrat Acid citric și soluție de acetat de sodiu, pH 4.0, ce conține H2O2 (0.015%) și dimetil sulfoxid (DMSO) (4%)

1 fiolă 60 ml A se

reconstitui

1 fiolă 60 ml A se

reconstitui

R9 Cromogen: TMB solution(11X)

Cromogen: Soluție TMB Soluție ce conține 3.3’, 5.5’ tetrametilbenzidină (TMB)

1 fiolă 5 ml

A se dilua

1 fiolă 5 ml

A se dilua

R10 Stopping solution Soluție de stopare Soluție de acid sulfuric (H2SO4 1N)

1 fiolă 28 ml

Gata de utilizare

1 fiolă 28 ml

Gata de utilizare

4.2 Condiții de conservare și manipulare Kitul va fi păstrat la +2-8°C. Fiecare componentă a kitului va fi păstrată la o temperatură de +2-8°C și poate fi utilizată până la data de expirare indicată pe ambalaj (cu excepția cazului în care este specificat altfel). După deschidere și în absența contaminării, reactivii R3, R4, R6, R8, R9 și R10 conservați la 2-8°C pot fi utilizați până la data de expirare indicată pe etichetă.

Identificare Conservare

R1 După deschiderea ambalajului vacuumat, bandeletele cu godeuri vor fi depozitate la o temperatură de +2-8°C și pot fi utilizate timp de 1 lună dacă sunt păstrate în ambalajul original, bine închis.

R2 Soluția de spălare diluată poate fi depozitată la o temperatură de +2-30°C timp de 2 săptămâni. Soluția de spălare concentrată (R2) poate fi depozitată la o temperatură de +2-30°C.

R8 + R9 După reconstituire, reactivii depozitati la întuneric pot fi utilizați timp de 6 ore la temperatura camerei (18-30°C).

5 [RO]

5. AVERTISMENTE ȘI PRECAUȚII A se utiliza pentru diagnosticarea in vitro de către un cadru medical. 5.1. Precauții cu privire la sănătate și siguranță: • Acest kit de testare va fi manipulat numai de personal calificat instruit cu privire la procedurile de laborator și familiarizat cu potențialele pericole. Purtați îmbrăcăminte de protecție adecvată, mănuși, protecție pentru ochi/față și manipulați adecvat, conform Bunelor Practici de Laborator.

• Kitul de testare conține componente sanguine umane. Materialul de origine umană utilizat la prepararea

reactivului R4 (Control Pozitiv) a fost testat și a fost găsit nereactiv la antigenii de suprafață pentru hepatita B (HBs Ag) și la anticorpii împotriva virușilor imunodeficienței umane (HIV-1 și HIV-2) și la anticorpii anti-HCV. Nicio metodă de testare cunoscută nu poate oferi asigurări complete cu privire la absența agenților infecțioși. Prin urmare, toate derivatele din sânge uman, reactivii și probele de origine umană, vor fi manipulate ca și cum ar prezenta potențial de risc infecțios, cu respectarea Precauțiunilor Universale recomandate pentru agenții patogeni transmisibili prin sânge, după cum sunt acestea definite prin reglementările locale, regionale și naționale.

• Scurgeri biologice: Scurgerile de material de origine umana vor fi tratate ca având potențial infecțios.

Scurgerile care nu conțin acid vor fi decontaminate imediat, inclusiv zona de deversare, materialele și orice suprafețe sau echipamente contaminate, cu un dezinfectant chimic adecvat ce este eficient în cazurilor riscurilor biologice aferente probelor implicate (în mod obișnuit o diluție de înălbitor de uz casnic 1:10, 70-80% etanol sau izopropanol, un iodofor [prescum 0.5% Wescodyne™ Plus, etc.), și vor fi șterse până la uscare completă.

Scurgerile care conțin acid ar trebui să fie absorbite în mod adecvat (șterse) sau neutralizate, iar zona spălată cu apă și ștearsă până la uscare completă; materialele utilizate pentru absorbția scurgerilor pot necesita eliminare în calitate de deșeuri cu risc biologic. Apoi zona va fi decontaminată cu unul dintre dezinfectanții chimici.

ATENȚIE: În autoclavă nu vor fi plasate soluții ce conțin înălbitor! • Aruncați toate probele și materialele utilizate pentru efectuarea testului ca și cum acestea ar conține agenți

infecțioși. Deșeurile de laborator, chimice și cu risc biologic trebuie să fie manipulate și eliminate conform reglementărilor locale, regionale și naționale.

• Pentru recomandările și precauțiunile aferente anumitor componente chimice din kitul de testare vă rugăm

să consultați pictograma(ele) menționate pe etichete și informațiile furnizate la finalul instrucțiunilor de utilizare. Fișa de Siguranță (MSDS) este disponibilă pe www.bio-rad.com.

5.2. Precauții legate de procedură 5.2.1 Preparare Exactitatea rezultatelor depinde de implementarea corectă a următoarelor Bune Practici de Laborator: • Nu utilizați reactivi expirați. • Nu amestecați și nu asociați reactivi din loturi diferite în cadrul aceleiași runde de testare. • Înainte de utilizare așteptați timp de 30 minute pentru ca reactivii să se stabilizeze la temperatura camerei

(18-30°C). • Denumirea testului, precum și numărul specific de identificare a testului, sunt notate pe rama fiecărei

microplăci. De asemenea, acest număr de identificare specific este menționat și pe fiecare strip. Syphilis Total Ab: Număr de identificare specific = 97 Înainte de utilizare verificați numărul specific de identificare. Dacă numărul de identificare lipsește sau este

diferit de numărul specificat, corespunzător testării ce urmează a fi efectuate, atunci stripul nu trebuie utilizat.

OBSERVAȚIE: Pentru soluția de spălare (R2, etichetă identificare: 20X culoare verde), tampon substrat peroxidază (R8, etichetă identificare: tampon TMB, culoare albastră), cromogen (R9, etichetă identificare: TMB 11X, culoare violet) și soluție de stopare (R10, etichetă identificare: 1N culoare roșie), este posibilă utilizarea altor loturi decât cele conținute în kit, cu condiția ca în cadrul unei runde de testare să fie utilizat același lot. Acești reactivi pot fi utilizați cu câteva alte produse ale companiei noastre. Vă rugăm să contactați serviciul nostru tehnic pentru informații detaliate.

6 [RO]

• Reconstituiți reactivii cu atenție, evitând contaminarea de orice fel. • Utilizați vesela din sticlă, bine spălate și clătite cu apă deionizată sau, preferabil, utilizați materiale de unică

folosință. • Nu permiteți uscarea plăcii în intervalul de timp dintre sfârșitul operațiunii de spălare și distribuirea

reactivilor. • Reacția enzimatică este foarte sensibilă la ionii metalici. În consecință, nu permiteți niciunui element

metalic să intre în contact cu diversele soluții de conjugat sau de substrat. • Soluția de developare (tampon substrat + cromogen) trebuie să fie colorate în roz. Modificarea acestei

culori roz la câteva minute după reconstituire indică faptul că reactivul nu poate fi utilizat și trebuie să fie înlocuit.

Soluția de developare poate fi preparată într-o tavă de plastic curată, de unică folosință, sau într-un recipient de sticlă ce a fost mai întâi prespălat cu 1N HCl clătit bine cu apă distilată și uscat. Acest reactiv va fi depozitat la întuneric.

• Nu utilizați niciodată același recipient pentru a distribui conjugatul și soluția de developare. 5.2.2. Prelucrare • Nu modificați procedura de testare. • Nu efectuați testul în prezența vaporilor reactivi (acizi, alcalini, aldehide) sau a prafului ce ar putea modifica

activitatea enzimatică a conjugatului. • Utilizați un nou vârf pentru distribuția fiecarei probe. • Spălarea godeurilor este un pas esențial în cadrul procedurii: respectați numărul recomandat de cicluri de

spălare și asigurați-vă că toate godeurile sunt complet umplute și apoi că sunt golite complet. Spălarea incorectă poate conduce la rezultate eronate.

• Respectați cu strictețe procedurile de spălare descrise pentru a obține cele mai înalte peformanțe de testare. În cazul anumitor instrumente, ar putea fi necesară optimizarea procedurii de spălare (creșterea numărului de cicluri de pași de spălare și/sau a volumului de tampon de spălare pentru fiecare ciclu) pentru a obține un nivel acceptabil de densitate optică de fundal pentru probele negative.

• În cazul în care sunt necesare adaptari sau proceduri speciale vă rugăm să ne contactați.

6. PROBE Prelevați o probă de sânge conform practicilor curente. Testul va fi realizat pe ser sau plasmă nediluate (prelevate pe EDTA , Citrat de Sodiu, heparina Na sau ACD). Probele ce conțin agregate vor fi purificate prin centrifugare înainte de testare. Probele vor fi depozitate la o temperatură de +2-8°C dacă testul este realizat în termen de 7 zile sau pot fi depozitate la -20°C pentru o perioadă mai îndelungată. A nu se repeta mai mult de 5 cicluri de congelare/decongelare. Probele care au fost tratate termic la 56°C timp de 1/2 oră pot fi utilizate. Probele cu un conținut de albumină mai mic de 120 g/l, cu un conținut de bilirubină sub 200 mg/l, probele ce conțin până la 33 g/l de trioleină și probele ce conțin până la 2 g/l de hemoglobină nu afectează rezultatele. Cu toate acestea, nu este recomandată utilizarea de ser sau plasmă conta hiperlipemice sau hiperhemolizate. Probele vor fi dezghețate și amestecate bine înainte de testare. Dacă este necesară transportarea probelor, acestea vor fi împachetate conform reglementărilor în vigoare cu privire la transportul agenților etiologici și de preferință în condiții de congelare.

7. PROCEDURA

7.1. Materiale necesare, dar care nu sunt furnizate: • Apă distilată. • Hipoclorit de sodiu (înălbitor de uz casnic) și bicarbonat de sodiu. • Hârtie absorbantă. • Pelicule adezive. • Mănuși de unică folosință. • Ochelari de protecție. • Eprubete de unică folosință. • Pipete sau multipipete automate sau semiautomate, reglabile sau fixe pentru măsurarea și distribuirea de

volume de 50 μl, 1 ml și 10 ml. • Cilindri gradați cu capacitate de 100 ml și 1 L • Spălător de microplăci automat, semiautomat sau manual (*).

7 [RO]

• Incubator pentru microplăci reglat la 37°C ±1°C (*). • Recipient pentru deșeuri cu risc biologic. • Cititor de microplăci dotat cu filtre de 450, 490 nm and 620-700 nm (*). (*) Vă rugăm să ne consultați pentru informații detaliate cu privire la echipamentul recomandat de

departamentul nostru tehnic. 7.2. Prepararea reactivilor 7.2.1. Reactivi gata de utilizare Reactiv 1 (R1): Microplacă Fiecare ramă suport ce conține 12 stripuri este împachetată într-un ambalaj de aluminiu sigilat. Tăiați ambalajul cu foarfeca sau cu bisturiul pe o lungime de 0.5 până la 1 cm deasupra sigiliului. Deschideți ambalajul și scoateți rama. Introduceți stripurile neutilizate înapoi în ambalaj. Închideți ambalajul bine și depozitați-l corespunzător la o temperatură de +2-8°C. Reactiv 3 (R3): Control pozitiv Reactiv 4 (R4): Control negativ Reactiv 6 (R6): Conjugat A se omogeniza prin răsturnare înainte de utilizare Reactiv 10 (R10): Soluție de stopare 7.2.2. Reactivi pentru reconstituire Reactiv 2 (R2): Soluție de spălare concentrată (20X) Diluați 1:20 în apă distilată pentru a obține soluția de spălare gata de utilizare. Preparați 800 ml pentru o placă de 12 stripuri. Reactiv 8 (R8) + Reactiv 9 (R9): Soluție pentru developare enzime Diluați 1:11 cromogen (R9) în Tamponul Substrat (ex. 1 ml reactiv R9 + 10 ml de reactiv R8) întrucât sunt necesari și suficienți 10 ml pentru tratarea a 12 stripuri. Omogenizați.

7.3. Procedura de testare Procedura va fi respectată cu strictețe. A se utiliza seruri de control pozitiv și negativ pentru fiecare test pentru validarea calității testului. Vor fi respectate următoarele bune practici de laborator: 1) Determinați cu atenție distribuirea probelor și planul de identificare. 2) Preparați soluția de spălare diluată R2 3) Scoateți rama suport și numărul de stripuri necesar din ambalajul de protecție (R1). Introduceți stripurile

neutilizate înapoi în ambalaj. Închideți ambalajul și depozitați-l la o temperatură de +2-8°C. 4) Distribuiți în godeu în următoarea ordine (distributia in placa recomandată):

• 50 µl de control negativ (R3) in A1, B1, C1 • 50 µl de control pozitiv (R4) in D1, E1 • 50 µl de probă nediluată în fiecare godeu, F1, G1, etc • 50 µl de conjugat (R6) în fiecare godeu

În funcție de sistemul utilizat, puteți regla poziția sau ordinea de distribuire a controalelor. Omogenizați amestecul cu cel puțin 3 aspirari sau cu un agitator pentru microplaci timp de 5 secunde. OBSERVAȚIE: Distribuirea probelor și a controalelor poate fi controlată vizual în acestă etapă de manipulare, există o diferență de colorație între un godeu gol și un godeu ce conține o proba. Conjugatul se repartizează în termen de 5 minute de la distribuirea probei. Există o diferență clară de colorație între un godeu gol și un godeu ce conține soluția roșie de conjugat (R6) (vezi § 7.7). 5) Atunci când este posibil, acoperiți placa cu o nouă peliculă adezivă. 6) Incubați microplaca timp de 30 până la 35 minute la 37°C ± 1°C. 7) Dacă este necesar, îndepărtați pelicula adezivă. Aspirați conținutul tuturor godeurilor într-un recipient

pentru deșeuri lichide și adăugați cel puțin 0,370 ml de soluție de spălare în fiecare godeu. Aspirați din nou și repetați spălarea de cel puțin 4 ori (vor fi realizate 5 spălări în total). Volumul rezidual trebuie să fie mai mic de 10 μl (dacă este necesar, uscați stripurile amplasându-le cu gura în jos pe hârtie absorbantă).

Dacă dispuneți de un spălător automat, respectați acelați ciclu de operare.

8 [RO]

OBSERVAȚIE: Treceți la etapa de spălare în termen de 20 minutes. 8) Preparați soluția pentru developare (reactiv R8 + R9). 9) Distribuiți rapid, în fiecare godeu, 50 μl din soluția de developare (R8+R9), preparată proaspăt înainte de

utilizare. Permiteți poducerea reacției la întuneric timp de 25 până la 35 minute la temperatura camerei (18 - 30°C). Nu utilizați folie adezivă în timpul acestei incubații.

OBSERVAȚIE: Distribuirea soluției de developare, de culoare roz, poate fi controlată vizual în această etapă de manipulare. Există o diferență clară de colorație între un godeu gol și un godeu ce conține soluția roz de conjugat. (vezi § 7.7). 10) Adăugați 50 μl de soluție de stopare (R10) în aceeași ordine și în acelați ritm de distribuire ca și în cazul

soluției de developare. Omogenizați amestecul de reacție. OBSERVAȚIE: Distribuirea soluției de stopare incolore poate fi controlată vizual în această etapă de manipulare. Culoarea substratului, roz (în cazul eșantioanelor negative) sau albastru (în cazul eșantioanelor pozitive), dispare din godeuri, care devin incolore (în cazul eșantioanelor negative) sau galbene (în cazul eșantioanelor pozitive) după adăugarea soluției de stopare. 11) Ștergeți cu atenție baza fiecărei plăci. Așteptați cel puțin 4 minute după adăugarea soluției de stopare,

în termen de 30 de minute de la oprirea reacției, citiți densitatea optică la 450/620-690 nm utilizând un cititor de plăci.

12) Asigurați-vă de concordanța dintre citirea spectrofotometrică și citirea vizuală a plăcii, distribuirea probelor și planul de identificare.

7.4. Control de calitate Utilizați controale negative (R3) și pozitive (R4) la fiecare efectuare a testului pentru validarea testării. (vezi §7.5).

7.5. Criterii de validare a testului Acest test este validat dacă sunt respectate condițiile de mai jos: 1) Pentru controlul negativ R3: DO R3 ≤ 0.080 Dacă una dintre valorile controlului este mai mare decât ceastă valoare, atunci nu luați în considerare valoarea și repetați calculul utilizând cele două valori de control pozitiv rămase. 2) Pentru controlul pozitiv R4: OD R4 ≥ 0.700

7.6 Calcularea/interpretarea rezultatelor Valoarea limită este determinată cu controlul negativ R3: Calculați valoarea de absorbanță medie pentru controlul negativ R3 și calculați cut-off (CO) după cum urmează: CO = DO Medie R3 + 0.100 Probele cu o DO mai mică decât CO sunt considerate a fi negative conform Syphilis Total Ab. Rezultatele aflate imediat sub valoarea limită (CO -10% < DO < CO) ar trebui, însă, să fie interpretate cu atenție. Este recomandată retestarea, în dublu exemplar, a probelor corespunzătoare atunci când sistemele și procedurile de laborator o permit. Eșantioanele cu o DO mai mare sau egală cu CO sunt considerate a fi pozitive conform Syphilis Total Ab și ar trebui retestate în dublu exemplar înainte de interpretarea finală. Eșantioanele retestate ce depășesc CO în cel puțin unul dintre cele două duplicate sunt considerate pozitive și ar trebui supuse unor investigații suplimentare. Probele care sunt mai mici decât CO în ambele duplicate sunt considerate a fi negative.

9 [RO]

În cazul unei densități optice foarte scăzute corespunzătoare probelor negative testate (DO negativă) și atunci când prezența eșantioanelor și a reactivului este controlată, rezultatele pot fi interpretate ca negative. Este recomandată confirmarea eșantioanelor pozitive respectând algoritmii și recomandările naționale curente.

7.7. Verificarea spectrofotometrică a pipetării probei și a a conjugatului (opțional) Probe și controale Prezența probelor și a controalelor în godeu poate fi verificată prin citire automată la 450/620 nm. Un godeu cu o proba adăugata va avea o DO cuprinsă între 0.050 și 1.100. Conjugat Conjugatul are culoarea roșie. Prezența conjugatului în godeuri poate fi controlată prin citire automată la 450/620 nm. Un godeu cu proba și conjugat va avea o DO ≥ 1.200. Verificarea pipetării soluției de developare Este posibilă verificarea prezenței în godeu a soluției de developare roz prin citire automată 492 nm. Un godeu cu soluție de developare trebuie să aibă o densitate optică mai mare decât 0,100 (o DO mai mică indică o distribuire necorespunzătoare a soluției de developare)

8. LIMITĂRILE TESTULUI La fel ca în cazul tuturor testelor serologice pentru sifilis, interpretarea rezultatelor obținute cu testul Syphilis Total Ab EIA trebuie să fie realizată coroborat cu simptomele clinice ale pacientului, cu istoricul medical al acestuia și cu alte rezultate ale analizelor de laborator pentru obținerea unui diagnostic clinic de ansamblu. Nu există un anumit test sau un standard de referință decisiv petru fiecare stadiu al bolii. Astfel, diagnosticarea sifilisului se bazează în special pe testarea serologică și necesită rezultate obținute atât prin metoda non-treponemică, cât și prin metoda treponemică. Niciun test de diagnosticare nu oferă o asigurare absolută că o anumita proba nu conține niveluri scăzute de anticorpi anti- T. Pallidum, cum este cazul celor prezente într-un stadiu foarte timpuriu al infecției. În consecință, un rezultat negativ, în orice moment ar fi obținut, nu exclude posibilitatea expunerii la infecția cu sifilis. Orice tehnică ELISA poate produce reacții fals pozitive. Se recomandă verificarea specificității reacției oricărei probe care s-a dovedit a fi repetat pozitiva, conform criteriilor de interpretare ale kitului Syphilis Total Ab, cu ajutorul unei metode adecvate: testul Treponema pallidum Hemagglutination. Toate rezultatele testelor treponemice tind să rămână reactive în urma infecției treponemice, prin urmare nu ar trebui să fie folosite pentru a evalua răspunsul la terapie. Ca urmare a menținerii reactivității, în general pentru restul vieții pacientului, testele treponemice nu au valoare în ceea ce privește determinarea recidivei sau reinfectării în cazul unui pacient cu un rezultat reactiv. În acest caz se recomandă utilizarea altor testări: Syphilis IgM EIA, RPR și TPHA. Metoda spectrofotometrică pentru verificarea pipetarii probei, a conjugatului, si soluției de developare nu permite verificarea preciziei distribuirii volumului de probe și de conjugat. Această metodă evidențiază numai prezența probei și a conjugatului. Rata de eroare a acestei metode este strâns legată de precizia sistemului utilizat (un coeficient de variație cumulat de peste 10% pentru distribuire și citire va scădea în mod semnificativ calitatea acestei etape).

10 [RO]

9. CARACTERISTICI DE PERFORMANȚĂ

9.1. Măsurarea preciziei Repetabilitatea și precizia intermediară au fost determinate prin utilizarea de probe cu diferite concentrații de anticorpi anti- sifilis. Probele au fost testate de 30 de ori în timpul aceleiasi serii de testări pentru a fi determinată repetabilitatea. De asemenea, probele au fost testate în duplicat timp de 20 de zile, câte 2 teste pe zi. Au fost calculate valoarea medie, deviațiile standard și Coeficienții de Variație (CV). 9.1.1. Repetabilitate:

Eșantioane N Medie Deviatie standard CV %

Slab pozitive 30 0.14 0.014 9.5%

Puternic negative 30 0.68 0.051 7.5%

Slab pozitive Syphilis ab 30 1.90 0.070 3.7%

Pozitive Syphilis ab 30 3.76 0.130 3.5%

Coeficienții de variație obținuți pe eșantioanele pozitive sunt mai puțin de 10%.

9.1.2 Precizie intermediară

Eșantioane N Medie Intra testare

Inter testare / operator

Inter zile Reproductibilitate

totală

SD CV % SD CV % SD CV % SD CV %

Slab negative 80 0.15 0.035 22.5% 0.023 14.7% 0.017 10.9% 0.045 29.0%

Puternic negative 80 0.74 0.038 5.1% 0.074 10.0% 0.006 0.8% 0.084 11.2%

Slab pozitive Syphilis ab 80 2.30 0.112 4.9% 0.312 13.5% 0.099 4.3% 0.346 15.0%

Pozitive Syphilis ab 80 4.13 0.180 4.3% 0.543 13.1% 0.195 4.7% 0.604 14.6%

Coeficienții de variație obținuți pe eșantioanele pozitive sunt mai puțin decât sau egal cu 15%.

9.2. Performanțe clinice Performanțele clinice ale testului Syphilis Total Ab au fost determinate prin testarea probelor provenite din studii prospective și retrospective: Studiu prospectiv: - 5195 eșantioane de la donatori de sânge aleatori; - 460 eșantioane de la pacienți suspecți de sifilis. Studiu retrospectiv: - 350 pozitive de la pacienți BTS. Studiile au fost realizate în două locații de donatori, în cadrul unui centru BTS (Boli cu Transmitere Sexuală) și într-o locație Bio-Rad. 9.2.1. Specificitatea Diagnostica Studiul a fost realizat pe probe de ser și plasmă prelevata pe EDTA de la două bănci de sânge, de la donatori aleatori, în Franța. De asemenea, a fost realizat un studiu de specificitate pe probele provenite de la pacienți. Toate rezultatele au fost comparate cu cele obținute prin alte teste pentru sifilis marcate CE.

11 [RO]

Tabelul 1: Testul de specificitate (IR = Inițial Reactiv; RR= Repetat Reactiv)

Populație Locație Tip proba Nr. total de

probe Inițial

Reactiv (IR) Repetat

Reactiv (RR)

RR Specificitate

(%)

95% CI (%)

Donatori de sânge

#1 + #2

Serum SST 3127 2 2* 3125/3125

Plasma EDTA K2

2068 2 2* 2066/2066

Total 5195 4 4* 100%

5191/5191 99.93% -

100%

Pacienți #3 Ser 351 1 1 99.72% 350/351

98.42 - 100%

* Eșantioanele Repetat Reactive care au fost pozitive cu alte teste EIA Sifilis marcate CE au fost excluse

din calculația de specificitate a diagnosticului.

9.2.2. Sensibilitatea Diagnostica

Studiu retrospectiv:

Studiul a fost realizat pe 350 probe congelate, dintre care 2 probe au fost declarate negative, iar 348 au

fost confirmate pozitive cu testele pentru Sifilis marcat CE.

Dintre aceste 348 de probe pozitive, 7 probe au provenit de la pacienți aflați într-un stadiu timpuriu al

infecției. Toate cele 348 probe au fost pozitive cu testul Bio-Rad Syphilis Total Ab.

Studiu prospectiv:

A fost evaluat un număr total de 460 de probe proaspete cu testul Bio-Rad Syphilis Total Ab și au fost

comparate cu testele pentru sifilis marcate CE.

348 au fost negative atât cu testele Bio-Rad, cât și cu testele de referință (două probe au fost fals

pozitive cu testul de referință EIA)

109 au fost pozitive cu ambele tipuri de testări.

3 probe au prezentat rezultate dscrepante (după retestarea cu testul Bio-Rad):

• 1 proba pozitiva cu testul Bio-Rad Assay și puternic negativ cu testele de referință. Aceasta proba cu

o rată de sifilis scăzută s-a aflat la limita cut-off în cazul ambelor teste EIA:

• 1 proba pozitiva cu testele de referință, negativa cu testul Bio-Rad (provenit de la 1 pacient fara

semne)

• 1 proba pozitiva cu testele de referință, negativ IR și pozitiva la retestarea cu testul Bio-Rad.

Studii retrospective și prospective:

Sensibilitatea de diagnostic globală este egală cu 99.56% (457/459) cu un interval de încredere de 95%

intre [98.44% - 99.95%].

Sensibilitate clinică:

De asemenea, sensibilitatea clinică a fost studiată pe 3 paneluri comerciale și 1 panel de seroconversie.

Testul Bio-Rad Syphilis Total Ab a fost comparat cu un test pentru sifilis marcat CE. Detectarea fiecărei

probe din cadrul panelurilor este echivalentă la testul Bio-Rad și la testul de referință pentru sifilis.

9.3. Sensibilitate analitică Sensibilitatea analitică a fost evaluată pe 2 Standarde NIBSC și calculată la valoarea cut-off utilizând o

regresie:

1. Limita de detectie a IgG / IgM a fost evaluată pe 3 loturi de teste Syphilis Total Ab și estimată la 0.53

mIU/ml cu CI 95% [0.10 mIU/ml – 1.30 mIU/ml] utilizând WHO Standard IgM/ IgG (NIBSC cod: 05/132).

2. Limita de detectie a IgG a fost evaluată pe 1 lot de teste Syphilis Total Ab și estimată la 0.11 mIU/ml

cu CI 95% [0.02 mIU/ml – 0.27 mIU/ml] utilizând WHO Standard IgG (NIBSC cod: 05/122).

12 [RO]

9.4. Specificitate analitică/Studiu de reactivitate încrucișată Un număr total de 125 probe potential interferente ce conțineau anticorpi împotriva agenților patogeni ce

ar putea determina boli infecțioase (Lyme, toxoplasmoza, EBV, Leptospiroza, LES (lupus), anticorpi

împotriva hepatitei A, anticorpi împotriva hepatitei B, anticorpi împotriva hepatitei C, HTLV I/II și HIV),

probe din grupul de risc (femei însărcinate și femei multipare) sau probe provenind de la pacienți cu

tulburări de sistem imunitar (factori reumatoizi) au fost testate cu testul Syphilis Total Ab.

Dintre cele 125 probe testate, 1 probă a fost repetat pozitivă cu testul Syphilis Total Ab; aceasta proba a

fost confirmat ca fiind pozitiva cu alte teste CE Syphilis EIA și teste de confirmare. Specificitatea

observată pe această populație țintă este egală cu 100% (124/124) cu un interval de încredere de 95%

[97.1% - 100.0%].

9.5. Efectul Hook Existența unui posibil efect cârlig a fost studiată prin testarea a 6 probe sifilis cu titruri ridicate la diluții diferite. Echivalența rezultatelor observate între probele nediluate și probele diluate indică absența

efectului cârlig pe probele testate.

10. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE 1. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference. J.

Clin. Immunoassay 15: 108-115,1992.

2. Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural,

functional and immunological role. Microbiological Reviews, Setpt. 1993 Vol 57.

3. Larsen SA, Steiner BM, and Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for

syphilis. Clin Microbiol Rev. 1995 Jan; 8(1):1–21.

4. Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for

screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbol. 1995 Mar;

33(3):525–7.

5. Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some

biologic features. Clin Microbiol Rev. 1999 Apr; 12(2):187–209.

6. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab

Med. 2009. 47:596-606.

7. International Journal of STD & AIDS 2009; 20: 300–309.

8. Screening donated Blood for Transfusion-Transmissible infections. World Health Organization. 2009

9. M. J. Loeffelholz, and M. J. Binnicker, 'It Is Time to Use Treponema-Specific Antibody Screening

Tests for Diagnosis of Syphilis', J Clin Microbiol, 50 (2012), 2-6.

13 [RO]

14 [RO]

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 2014/11 www.bio-rad.com 883679

15 [RO]

16 [RO]

17 [RO]

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 2014/11 www.bio-rad.com 883679