Studiul la nivel de singură moleculă a complexului metal - peptidă amiloidică,

de provenienţă umană şi murină

RESEARCHALEXANDRU IOAN CUZA OF IAŞI

Drd. ACS Irina SCHIOPU

- Statiunea de Cercetari Biologice Potoci-Bicaz -- 10 iulie 2013 -

Studierea influenţei ionilor metalelor tranziţionale (Cu2+, Fe3+, Zn2+) asupra modului deîmpachetare a peptidelor amilodice Ab(1-16)human şi Ab(1-16)rat . Desluşirea importanţeirolului jucat de aminoacidul His suplimentar, prezent în secvenţa primară a peptideiAb(1-16)human, asupra modificării conformaţiei, prin legăturile coordonative create întreionii metalelor şi azotul din componenţa inelului imidiazol al acestui aminoacid.

SCOPUL STUDIULUI

Aβ(1-16)_human:Asp - Ala - Glu - Phe - Arg - His - Asp - Ser - Gly - Tyr - Glu - Val - His - His - Gln – Lys

Aβ(1-16)_rat:Asp - Ala - Glu - Phe - Gly - His - Asp - Ser - Gly - Phe - Glu - Val - Arg - His - Gln - Lys

timp

Cu2+Zn2+ Fe2+

Alzheimer’s Disease

Tehnica “Montal – Muller” de realizare a bistraturilor lipidice planare. Înregistrări electrofiziologice la nivel de singură moleculă

L. Ma and S.L. Cockroft, 2010, ChemBioChem 11, 25-34

2 M KCl 2 M KCl

ΔV = - 50 mV

timp (ms)

cure

nt(p

A)

- 89

0 τOFF

τON

α-hemolizina - proteinătransmembranară heptamerică,toxina secretată de bacteriaStaphylococcus aureus

6 nm

BLM

trans cis

6 nm

trans cis

- 89

cure

nt(p

A)

timp (ms)

0Cl-

K+

Cl-

K+

Înregistrări reprezentative de curent ionic ce reflectă interacţiunile dintre peptida amiloidică Aβ1-16 de proveninenţă umanăşi porul de α-hemolizină (panel a) şi în prezenţa a diferitelor concentraţii de ioni de cupru adăugaţi în partea trans, aceeaşiparte în care a fost adăugată şi peptida (panel b, c şi d).* - linia de bază, corespunzătoare porului liber# - evenimente ce reflectă interacţiunea dintre peptida liberă şi porul de α-HL.$ - evenimente ce reflectă interacţiunea dintre peptida complexată cu cupru şi porul de α-HL.& - evenimente de „bumping” corespunzătoare interacţiunii peptidei complexate cu gura porului de α-HL.

Studiul la nivel de singură moleculă a influenţei ionilor de cupru asupra conformaţiei peptidei amyloidice Ab(1-16)human

- 100 mV

Studiul la nivel de singură – moleculă a influenţei ionilor de cupru asupra conformaţiei peptidei amyloidice Ab(1-16)human

Reversibilitatea procesului de complexare

Înregistrări reprezentative ale curentului ionic ce arată efectul adiţiei a 100 μM Cu2+ asupra fluctuaţiilor de curent ionic,corespunzătoare evenimentelor de interacţiune dintre peptida (complexată şi necomplexată cu cupru) şi porul proteic.Adiţia în partea trans a unei concentraţii duble de EDTA (200 μM) induce restabilirea flucturaţiilor de curent ionic iniţiale,indicând reversibilitatea procesului de complexare.

Aβ(1-16) human

Cu2+

Cu2+ - Aβ(1-16) human Aβ(1-16) human

- 100 mV Cu2+ - EDTA

Studiul la nivel de singură – moleculă a influenţei ionilor de cupru asupra conformaţiei peptidei amyloidice Ab(1-16)rat

Înregistrări reprezentative de curent ionic ce reflectă interacţiunile dintre peptida amiloidică Aβ1-16 de proveninenţă murinăşi porul de α-hemolizină (panel a) şi în prezenţa a diferitelor concentraţii de ioni de cupru adăugaţi în partea trans, aceeaşiparte în care a fost adăugată şi peptida (panel b şi c).

Aβ(1-16) rat Cu2+ - Aβ(1-16) rat

- 100 mV

(a) (b) (c)

Studiu comparativ la nivel de singură-moleculă între interacţiunea peptidelor amiloidice Ab(1-16)human şi Ab(1-16)rat cu porul

de α-HL la diferite concentraţii de ioni de cupru

Ab(1-16)human Ab(1-16)rat

- 100 mV

Studiu comparativ la nivel de singură-moleculă între interacţiunea peptidelor amiloidice Ab(1-16)human şi Ab(1-16)rat cu porulde α-HL

hidrofil

Capătul C-terminal al peptidei Ab(1-16)rat este mai hidrofil decât capătulC-terminal al peptidei Ab(1-16)human, astfel că interacţiunea dintre primapeptidă, de provienienţă murină şi nanoporul de α-HL este facilitată.Interiorul porului fiind preponderent hidrofil.

mai hidrofil

- 100 mV

low-pass filter:fc = 20 kHz

low-pass filter:fc = 10 kHz

Concluzii

Ab(1-16)human şi cupru: Prin experimentele de electrofiziologie la nivel de singură moleculă am pus în

evidenţă faptul că ionii de cupru induc schimbări conformaţionale asuprapeptidei, vizibile şi cuantificabile prin această tehnică.

Procesul de complexare a peptidei cu cupru este unul reversibil.

Ab(1-16)rat şi cupru: Adiţia ionilor de cupru duce la o creştere a afinităţii peptidei pentru porul proteic,

ceea ce se datorează expunerii aminoacizilor hidrofili spre solvent în urmaschimbării conformaţiei peptide, astfel încât costul energetic necesar inserţieipeptide în lumenul porului este diminuat, favorizând astfel interacţiunea întreporul de α-HL şi peptide Aβrat cu Cu2+.

Afinitatea peptidei Ab(1-16)rat pentru porul de α-HL este mult mai mare decât al peptideiAb(1-16)human deoarece aceasta din urmă prezintă o hidrofobicitate mai mare la capătul C –terminal, ceea ce determină o interacţiunea mai nefavorabilă energetic cu interiorul maihidrofil al lumenului porului de α-HL.

Ab(1-16)human vs. Ab(1-16)rat

Ab1: DAEW RHDSGYEV HHQKpI = 8.7, Q = -1.7 la pH=7, Mw = 1994.1 g/mol, H = -0.39 (Eisenberg)Asp - Ala - Glu - Trp - Arg - His - Asp - Ser - Gly - Tyr - Glu - Val - His - His - Gln – Lys

Ab2: (dD)AEW RHDSGYEV HHQKpI = 8.7, Q = -1.7 la pH=7, Mw = 1994.1 g/mol, H = -0.39 (Eisenberg)(D-Asp) - Ala - Glu - Trp - Arg - His - Asp - Ser - Gly - Tyr - Glu - Val - His - His - Gln – Lys

Ab3: D(dA)EW RHDSGYEV HHQKpI = 8.7, Q = -1.7 la pH=7, Mw = 1994.1 g/mol, H = -0.39 (Eisenberg)Asp - (D-Ala) - Glu - Trp - Arg - His - Asp - Ser - Gly - Tyr - Glu - Val –His - His - Gln – Lys

Ab4: DAEW RHDSGYEV (dH)HQKpI = 8.7, Q = -1.8 la pH=7, Mw = 1994.1 g/mol, H = -0.39 (Eisenberg)Asp - Ala - Glu - Trp - Arg - His - Asp - Ser - Gly - Tyr - Glu - Val - (D-His13) - His - Gln – Lys

Ab5: DAEW R(dH)DSGYEV HHQKpI = 8.7, Q = -1.8 la pH=7, Mw = 1994.1 g/mol, H = -0.39 (Eisenberg)Asp - Ala - Glu - Trp - Arg - (D-His6) - Asp - Ser - Gly - Tyr - Glu - Val - His - His - Gln – Lys

Perspective

Ab(1-16)_human: DAEF RHDSGYEV HHQK(pI = 8.7), Q = -1.7 la pH=7, Mw = 1994.1 g/mol, H = -0.38 (Eisenberg)

Asp - Ala - Glu - Phe - Arg - His - Asp - Ser - Gly - Tyr - Glu - Val - His - His - Gln – Lys

Vă mulţumesc pentru atenţie!

Acknowledgements:

Sprijinul financiar a fost acordat de Departamentul de Cercetare Interdisciplinar - Domeniul Stiinte şi de Laboratorului de Biofizică şi Fizică Medicală, prin contractele de cercetare:PN-II-ID-PCCE-2011-2-0027, PN-II-PT-PCCA-2011-3.1-0595 and PN-II-PT-PCCA-2011-3.1-0402.