Stabilitatea si stabilizarea proteinelor

In ultimul deceniu, cercetarea ştiinţifica la nivel mondial şi-a concentrat atenţia şi şi-a mobilizat forţele spre obţinerea de bioproduse cu performanţe biologice şi biochimice deosebite. Rezultate remarcabile în acest domeniu s-au realizat cu ajutorul tehnicilor ingineriei genetice de modificare direcţionată a structurii primare a bioproduşilor, ceea ce a condus atât la obţinerea unor proprietăţi adecvate pentru diferite domenii de aplicabilitate, cât şi la tehnologii cu randament ridicat de producere, adecvate procesării la scară industrială.

In acest context, asigurarea calitatii bioproduselor prin stabilizarea şi standardizarea proprietatilor utile ale compuşilor bioactivi la valoare optimă se impune din ce în ce mai mult ca o direcţie prioritară de cercetare, de ale cărei progrese ştiinţifice şi tehnice depinde finalizarea multor cercetări şi, în ultimă instanţă, gradul de competitivitate din punct de vedere comercial al noilor produse biotehnologice.

Realizarea practică a acestui deziderat este condiţionată de elaborarea şi experimentarea unor noi tehnici şi procedee de conditionare compatibile cu produsele bioactive din punct de vedere al structurii biochimice (ex. mentinerea nealterata a retelei complexe alcatuite atat din legaturi de hidrogen şi electrostatice, cat şi din interactii hidrofobe), dar şi adecvate din punct de vedere tehnologic (ex. viscozitate, presiune, solventi organici, temperatura, etc.).

Stabilitatea enzimelor şi a proteinelor in vitro reprezintă un punct critic în dezvoltarea unei biotehnologii. Atât conservarea, cât şi stabilitatea operaţională afectează gradul de utilizare al produşilor comerciali obţinuţi cu ajutorul enzimelor.

Stabilitatea în condiţii de păstrare (shelf life) se referă la menţinerea capacităţii catalitice a enzimei pe perioada dintre obţinere şi momentul utilizării.

Modele de inactivare a activităţii enzimelorUn model comun de inactivare pentru o proteină unicatenară sau a unei

enzime, implică deplierea sau denaturarea structurii terţiare a proteinei native (N). Proteina depliată (U) se poate replia în conformaţia nativă sau poate suferi unele modificări ce conduc la inactivarea permanentă (I).

N U IStabilitatea conformaţională descrie echilibrul N U , dar în ele mai multe procese biotehnologice este deosebit de interesantă viteza de inactivare, descrisă

de echilibrul N I, cum ar fi menţinerea activităţii biologice şi biochimice în condiţii de interes practic. De multe ori, inactivarea N I respectă o ecuaţie de ordinul I, exponenţială:

At/A0 = exp (-kt) unde At, A0 reprezintă activitatea enzimei la momentul t, respectiv 0;

K este constanta vitezei de ordinul IÎntr-un proces de ordinul I, se poate calcula timpul de înjumătăţire t1/2

(0,693 k) ca un indicator al stabilităţii. Multe procese de inactivare a proteinelor nu sunt, totuşi, de ordinul I şi sunt necesare modele mai complexe (ce implică mai mulţi termeni) pentru a explica procesele de inactivare.

Pentru a simplifica modelele în aceste cazuri, s-a propus un model şimplu triparametric pentru a descrie inactivarea enzimelor, independent de mecanisme. Acest model se bazează pe observaţia conform căreia expreşiile matematice ce descriu diferite mecanisme de inactivare pot fi reduse la o funcţie mai şimplă, biexponenţială prin corelarea vitezelor individuale :

At/A0 = A exp (-t) + (1-A) exp (-t) unde şi sunt expreşiile constantelor individuale .

În cele mai multe cazuri, termenul A este, de asemenea, o funcţie complexă a constantelor vitezelor individuale, dar când A=0, atunci se ajunge la o ecuaţie de ordinul I. Când =0, enzima îşi păstrează o activitate reziduală după evenimentele de inactivare.

Descrierea cu acurateţe a procesului de inactivare a biocatalizatorului nu oferă, totuşi, o imagine completă a performanţelor acestuia într-un bioproces. S-a propus o schemă pentru măsurători simultane a activităţii şi stabilităţii in situ a biocatalizatorului folosind o tehnică dinamică. Astfel, într-un reactor,o enzimă poate reacţiona cu substratul său la temperaturi coborâte, de ex. la 200C, iar activitatea sa specifică se măsoară presupunând că nu există inactivare enzimatică. După un anumit timp, temperatura este continuu crescută spre valori mai ridicate. În aceste condiţii, viteza observată de formare a produsului, P, sau de consum a substratului, S, este o funcţie atât de activitatea enzimatică, cât şi de inactivarea termică a biocatalizatorului.

Bazele teoretice ale studiilor de stabilizare a proteinelor si a enzimelorEnzimele prezinta caracteristici excelente (activitate, selectivitate,

specificitate) pentru realizarea unor procese de sinteza a unor produsi foarte complecsi, in conditii foarte blinde si pastrind un mediu prietenos. Totusi, enzimele au fost optimizate, via evolutie, pentru a indeplini functiile lor biologice: catalizarea reactiilor pe cai metabolice foarte complexe supuse multor nivele de reglare.

Aplicabilitatea catalizatorilor naturali, respective enzimele, in procesele industriale este adeseori limitata sau este chiar imposibila datorita faptului ca enzimele sunt, in primul rind, adaptate la conditiile naturale si nu la cele industriale.

Astfel, enzimele sunt catalizatori solubili, destul de instabili si sunt inhibati de concentratii mari de substrat sau produs. Mai mult, selectivitatea si activitatea pot sa nu fie adecvate atunci cind catalizeaza procese non-naturale (ex. transesterificare in loc de hidroliza), sau substrate non-naturale in conditii neconventionale.

De aceea, folosirea cu succes a unei enzime avind proprietati imbunatatite este adeseori precedata de eforturi in domeniul ingineriei enzimatice care sunt indreptate spre modificarea proprietatilor specifice ale enzimei.

Multe enzime nu sunt suficient de stabile in conditii de proces industrial, ceea ce face ca stabilitatea sa fie una dintre cele mai des studiate proprietati ale enzimelor in vederea optimizarii.

Studiile mutationale referitoare la denaturarea termica reversibila a proteinelor mici au condus la stabilirea citorva strategii importante pentru stabilizarea proteinelor , cum ar fi introducerea puntilor disulfurice si “stabilizarea entropica” (Gly→Xxx; Xxx→Pro).

In plus, exista numeroase incercari de a stabili “reguli” referitoare la stabilizarea proteinelor pornind de la compararea secventelor ce apar in mod natural la proteine omoloage cu diferite stabilitati. Asemenea reguli statistici nu au intotdeauna explicatii teoretice, iar exemple de aplicare cu succes a acestor reguli sunt rare.

In ciuda existentei unor reguli experimentale verificate, imbunatatirea directionata a stabilitatii unei enzime in conditii industriale este dificila. O problema majora referitoare la inactivarea proteinelor (prin temperatura sau alti factori denaturanti) este rezultatul unor procese ireversibile, dar nedefinite, guvernate de denaturari locale.

Daca aceasta ipoteza se adevereste atunci principala problema a ingineriei proteinelor este gasirea “punctelor slabe” din structura proteinelor care sunt implicate in procesul de denaturare local si care determina viteza procesului ireversibil (de obicei, agregarea sau proteoliza).

In mod traditional, studiile biochimice referitoare la proprietatile macromoleculelor purificate s-au realizat in solutii diluate, datorita problemelor legate de agregare ce apar, ades, la concentratii marite.

In interiorul unei celule exista, insa, o concentratie mare de diferite molecule, proteine si acizi nucleici, ocupind o fractie importanta din volumul total al celulei (30-40% din citoplasma celulelor de E. coli).

De aceea, se poate ridica problema veridicitatii rezultatelor obtinute din studierea biomoleculelor in solutii diluate deoarece se pune intrebarea daca interactiile nespecifice dintre moleculele invecinate pot influenta reactiile vitale si procese ce definesc celula vie.

Modelele statistic-termodinamice prezic ca efectele volumului de excludere au consecinte masurabile asupra structurii, functiilor si interactiilor moleculelor individuale in conditii fiziologice. O abordare conform acestui model s-a aplicat in cazul stabilitatii proteinelor fata de denaturarea prin caldura si in prezenta de uree in medii concentrate.

O predictie pertinenta a acestor modele este aceea ca proteinele vor tinde sa favorizeze conformatiile globulare compacte odata cu cresterea concentratiei, respectiv a constringerilor spatiale.

Din aceste predictii se pot deduce doua corolare; Naturarea initiala a polipeptidelor nascinde “in vivo” este

promovata de mediul “aglomerat” in care se sintetizeaza; Stabilitatea proteinei mature, ex abilitatea de a mentine o stare

native globulara, este mai mare “in vivo” decit valoarea masurata in solutii diluate.

O metoda experimentala viabila pentru determinarea marimii si importantei efectelor volumului de excludere asupra structurii macromoleculelor este greu de realizat.

Strategii de stabilizare operaţională a biocatalizatorilorBiocatalizatorii au concurat şi concurează în continuare cu catalizatorii

chimici clasici convenţionali. Potenţialele avantaje ale biocatalizatorilor sunt: marea specificitate; activitatea în condiţii blânde de reacţii ; numărul mare de turnover; natura lor biodegradabilă.

În condiţiile unui bioproces, biocatalizatorii trebuie, însă, să acţioneze într-un mediu diferit în mare măsură de mediul obişnuit.

Apa, cel mai des întâlnit mediu de reacţie pentru procesele biotehnologice, acţionează ca un reactant în reacţiile de inactivare şi, totodată, ca un lubrifiant în modificările asociate cu denaturarea proteinelor.

Diferiţi factori de reacţie, cum ar fi temperatura şi prezenţa unor reactivi chimici, pot contribui la inactivarea enzimelor. Inactivarea datorată reactivilor chimici poate fi ades evitată prin înlocuirea acelora care au efect denaturant cu alţi reactivi . Temperatura, totuşi, produce efecte opuse asupra

activităţii enzimatice şi a stabilităţii acesteia şi de aceea este o veritabilă cheie în orice proces biocatalitic.

Stabilitatea biocatalizatorilor, ex. capacitatea de a-şi menţine activitatea în timp, este fără îndoială un factor limitativ în cele mai multe bioprocese, stabilitatea biocatalizatorului fiind un punct central al biotehnologiilor, care determină în mare măsură viabilitatea procesului.

În vederea creşterii stabilităţii operaţionale a biocatalizatorilor s-au propus diferite strategii care implică diverse tehnici de lucru, printre care pot fi menţionate:

folosirea aditivilor de stabilizare este o practică curentă în tehnologia enzimatică de obţinere a produşilor. Astfel, o varietate de aditivi cu mase moleculare mici exercită efecte de stabilizare asupra proteinelor prin inducerea unei hidratări preferenţiale, situaţie explicată prin faptul că aditivii au tendinţa de a fi excluşi din imediata vecinătate a moleculei proteice. Interacţiile dintre aditivii protectori şi scheletul polipeptidic sunt nefavorabile, iar hidratarea preferenţială este determinată, de obicei, de creşterea tensiunii superficiale a solventului apos. Pierderea din compactizarea proteinei va avea ca efect mărirea interfeţei apă-proteină. În schimb, interacţiile termodinamic nefavorabile dintre aditivi şi molecula de proteină vor fi în creştere. Rezultatul este stabilizarea proteinei prin intermediul aditivilor. Dintre poliolii cu masă moleculară mică ce au fost folosiţi în acest scop, se numără manitolul , sorbitolul, inozitolul şi xilitolul. Polimerii pot avea şi ei efect de stabilizare a proteinelor, astfel polietilenimina (PEI) care este un polimer cationic.

Stabilizarea prin modificare chimică a moleculei de proteină este atractivă, dar nu i s-a acordat atenţie . Mărirea stabilităţii s-a obţinut prin introducerea de grupări hidrofile pe suprafaţa moleculei de enzimă ce reduce contactul dintre grupările hidrofobe şi apă, ceea ce previne renaturarea incorectă după denaturare.

Derivatizarea cu polimeri este din ce în ce mai des propusă pentru stabilizarea enzimelor solubile. Modificarea proteazelor cu polimeri carbohidraţi, cum ar fi polimeri ai sucrozei şi ai dextranului, s-a dovedit a stabiliza enzimele faţă de inactivarea indusă de temperatură şi agenţii chaotropici.

Imobilizarea pe suporturi solide este poate cea mai folosită strategie de a îmbunătăţii stabilitatea biocatalizatorilor, putând fi obţinute şi alte avantaje, cum ar fi controlul operaţiilor, flexibilitatea design-ului reactorului, recuperarea mărită a produsului în lipsa contaminării cu catalizator. Stabilitatea termică după imobilizare este rezultatul rigidităţii moleculare şi al creării unui micromediu de protecţie. Printre metodele de imobilizare disponibile, legarea covalentă multiplă este cea mai eficientă în termeni de stabilizare termică, dar a fost semnalată şi în cazul gel-entrapării enzimei. Totodată, a fost observată

creşterea stabilităţii termice şi în cazul imobilizării pe matrici de chitină activate cu glutaraldehidă, caz în care se formează multiple legături de tip bază Schiff între grupările NH2 libere ale aminoacizilor din structura proteinei şi grupările aldehidice ale glutaraldehidei.

Cristalele de enzimă reticulată (CLEC-crosslinked enzyme crystals) sunt tipuri noi de biocatalizatori foarte stabili. Aceştia sunt produşi prin cristalizare şi reticulare moleculară pentru a conserva structura cristalină. Cristalele cu mărime uniformă pot fi obţinute în domeniul 1-100 m. CLEC sunt foarte stabile, nu numai faţă de temperatură, dar şi faţă de acţiunea altor agenţi de inactivare, cum ar fi solvenţii organici. În cazul CLEC, moleculele de enzimă au o structură compactă , aproape de limita teoretică, stabilizarea fiind o consecinţă a intenselor interacţii polare şi hidrofobe. Din nou, rigiditatea moleculară este responsabilă de stabilitatea termică. În plus, CLEC sunt foarte rezistente la proteoliză, proteazele fiind excluse din matricea foarte compactă de cristal. Activitatea specifică este mult mai mare în cazul CLEC decât în cazul enzimelor imobilizate, deşi activitatea poate fi sever limitată de flexibilitatea moleculară redusă a enzimei şi de excluderea dimensională a substratului. Stabilitatea CLEC în solvenţi organici hidrofobi şi în cosolvenţi miscibili cu apa este remarcabil de mare şi de aceea numeroase aplicaţii ale CLEC s-au direcţionat în conexiune cu sinteza enzimelor în medii organice.

O abordare total diferită a stabilităţii biocatalizatorilor este reprezentată de ingineria mediului de reacţie. Deoarece apa este implicată în inactivarea enzimelor, substituţia parţială sau totală a apei poate fi benefică pentru stabilizarea biocatalizatorului.În fapt, au fost semnalate numeroase cazuri când s-a obţinut o stabilitate remarcabilă în asemenea medii. Până recent, folosirea enzimelor în medii neapoase părea nefezabilă datorită activităţii foarte mici care se obţinea. Totuşi, potenţialul tehnologic reprezintă un impuls pentru cercetările în domeniul biocatalizei. Solvenţii organici, teoretic incompatibili cu activitatea enzimatică, au şi excepţii notabile cum ar fi poliglicolii, recent elaborându-se ghiduri pentru selecţia adecvată a solvenţilor.