Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană Note de curs şi tehnici de laborator

3.4. OBŢINERE de SONDE de ACIZI NUCLEICI 1. Principiile hibridizării acizilor nucleici

Hibridizarea acizilor nucleici reprezintă procesul prin care 2 monocatene ADN sau ARN din surse biologice diferite reformează configuraţia dublu catenară (Fig.3.44.). Din punct de vedere chimic, procesul de hibridizare se bazează pe :

- principiul complementarităţii dintre cele 2 catene ale unui duplex ADN sau ARN - eventuala omologie de secvenţă dintre cele 2 surse ADN

Pe aceleaşi principii se pot forma hibrizi ADN : ADN, hibrizi ARN : ARN sau hibrizi ADN : ARN. In majoritatea cazurilor, scopul tehnicilor de hibridizare este identificarea sau localizarea

anumitor fragmente de acizi nucleici.

D E N A T U R A R E

H I B R I D I Z A R E

ADN sursa 1 ADN sursa 2

Fig.3.42. Principiul hibridizării acizilor nucleici

In procesele de hibridizare a acizilor nucleici se definesc noţiunile : molecula ŢINTĂ = fragmentul de ADN, ARN sau de proteină de identificat sau de localizat; molecula SONDĂ = fragmentul de ADN,ARN sau de proteină cu ajutorul căruia, prin hibridizare,

este identificată sau localizată ŢINTA

In foarte multe variante tehnice, hibridizarea acizilor nucleici se realizează pe suport solid (presupunând transferul moleculelor de acizi nucleici pe suportul solid), purtând denumirea de BLOTTING. Exista 3 categorii principale de blotting : SOUTHERN BLOTTING (dupa numele autorului – Southern, 1975) – tehnică moleculară ce identifică fragmente de ADN folosind sonde ADN sau ARN NORTHERN BLOTTING - tehnică moleculară ce identifică fragmente ARN folosind sonde ARN sau ADN WESTERN BLOTTING - tehnică moleculară ce identifică fragmente proteice folosind anticorpi specifici

1

Cap. 3-4Sinteză de sonde oligonucleotidice

2. Caracteristicile generale ale sondelor O sondă moleculară de acizi nucleici reprezintă o secvenţă de nucleotide, scurtă, monocatenară, alcătuită din ADN sau din ARN, ce se va lega specific de o secvenţă ţintă; cu ajutorul sondei va fi identificată sau localizată molecula ţintă. Gradul de omologie de secvenţă dintre sondă şi ţintă va determina stabilitatea hibridului. Sondele moleculare de acizi nucleici se construiesc astfel încât să prezinte următoarele caracterisitici: a) să prezinte un marcaj chimic care să permită vizualizarea hibridului molecular sondă:ţintă b) să aibă dimensiune cuprinsă între 10 şi 10.000 nucleotide; de regulă însă, se folosesc sonde de

14 – 40 nucleotide. Sondele prea scurte hibridizează foarte rapid (în câteva minute), dar prezintă şi hibridizări nespecifice şi sunt şi mai greu de marcat; sondele prea lungi hibridizează foarte încet (în câteva ore), dar hibrizii sunt mai stabili şi mai specifici

c) specificitatea de reacţie a sondei este dată de secvenţa acesteia; sonda nu trebuie să hibridizeze cu ea însăşi, deci să nu conţină complementaritate intracatenară; totodată, sonda trebuie să nu hibridizeze cu non-ţinte

3. Modalităţi de sinteză a sondelor moleculare de acizi nucleici Sondele moleculare de acizi nucleici pot fi marcate uniform (prin nick-translation, primeri randomizaţi, ADNc total, transcriere in vitro) sau doar la capete. 3.1. Sinteza de sonde prin nick-translation In această tehnică se porneşte de la o moleculă de ADN d.c., de obicei o copie a moleculei ţintă : a) în prima etapă, această moleculă este supusă unei digestii cu DNaza I, care este o endonuclează

situs-nespecifică, ce în prezenţa ionilor de Mg++ produce ruperi monocatenare randomizate (denumite “nicks”);

b) în a 2-a etapă, acţionează ADN polimeraza I de E.coli, care prin activitatea sa exonucleazică 5’-3’ lărgeşte ruperile monocatenare;

c) această activitate are loc aproape simultan cu activitatea de polimerizare a ADN polimerazei I (în direcţie 5’-3’) folosind molecule dNTP marcate. Ceea ce se obţine este o deplasare a ruperii monocatenare, de unde şi denumirea de “nick-translation” ;

d) ultima etapă este reprezentată de denaturarea termică a moleculelor, pentru obţinerea unor monocatene marcate uniform.

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’ 3’

3’

3’

3’

Incubare in prezenta Dnazei I (endonucleaza care, in prezenta de Mg induce formarea de ruperi mono-catenare - nick’uri)

2+

ADN pol I(functie exonucleazica5’-3’)

ADN pol I (functie polimerazica 5’-3’)dNTP marcati

catena marcata

pozitia finala a nick-ului

Denaturare - obtinere de sonde marcate

ADN d.c.

Fig.3.43. Sinteza de sonde prin ‘nick-translation’

2

Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană Note de curs şi tehnici de laborator

3.2. Sinteza de sonde marcate uniform folosind primeri randomizaţi In această variantă tehnică se folosesc ca primeri oligonucleotide cu secvenţă heterogenă, astfel încât ei vor hibridiza în multe poziţii ale matriţei. Asemenea primeri poartă denumirea de primeri randomizaţi şi pot fi fie cumpăraţi, fie obţinuţi astfel: a) prin digestia ADN din spermă de somon sau din timus de viţel cu DNaza I, astfel încât se obţine o

populaţie mare de fragmente de ADN m.c., cu dimensiuni între 6 şi 12 nucleotide; b) prin sinteză cu ajutorul unui sintetizator automat de oligonucleotide (octameri ce conţin toate cele

4 baze azotate în toate poziţiile); In ceea ce priveşte enzimele utilizate, în această tehnică se folosesc o ADN polimerază ADN-dependentă (revers-transcriptază) şi Klenow-ADN pol I (care nu are activitate exonucleazică 5’-3’). Pentru a obţine sonde marcate se recomandă utilizarea, în amestecul de dNTP, a unui nucleotid marcat şi 3 nemarcaţi.

Matrita

denaturare

atasare de primerirandomizati

adaugare - ADN polI (fragment Klenow) - dNTP (unul marcat)amplificare

Denaturare - obtinere de sonde marcate

Fig.3.44. Sinteza de sonde marcate uniform folosind primeri randomizaţi 3.3. Sinteza de sonde ADNc total Pentru obţinerea unei populaţii de molecule de ADNc (complementar cu o populaţie de ARN m.c.) se pot folosi următoarele tehnici: a) într-o primă variantă tehnică, se izolează ARNm total din celule şi se desfac structurile secundare

ale acestor molecule prin încălzire 5 min la 70oC. Se ataşează apoi primeri randomizaţi (de ex. octameri sintetici). Pornind de la aceştia va fi iniţiată reacţie de polimerizare a dNTP-urilor introduse în reacţie cu ajutorul unei revers-transcriptaze (rTth sau revers-transcriptaze din MLV

3

Cap. 3-4Sinteză de sonde oligonucleotidice

(Murine Leukaemia Virus) sau din AMV (Avian Mieloblastosis Virus). Intr-o etapă următoare, pentru a obţine denaturarea moleculelor hibride, amestecul de reacţie se tratează cu NaOH la peste 70oC, iar rezultatul final este reprezentat de o populaţie de molecule scurte de ADNc “parţiale”.

b) într-o a doua variantă tehnică, după izolarea ARNm total şi desfacerea structurilor secundare, se folosesc primeri oligo (dT) care se ataşează la cozile poli(A) de la capătul 3’ al majorităţii moleculelor ARNm mamaliene. Şi în această situaţie se foloseşte tot o revers-transcriptază, urmată de tratament cu NaOH la 70oC. Spre deosebire de prima variantă tehnică, aici rezultatul este reprezentat de o populaţie de molecule ADNc întregi.

3.4. Sinteza de sonde ARN prin transcriere in vitro Pentru sinteza de sonde ARN prin transcriere in vitro este recomandabil ca ADN heterolog să fie în prealabil clonat într-un vector plasmidial sau într-un fagimid, care să conţină promotori puternici, aşa cum sunt promotorii din fagii T3 şi, respectiv, T7. Aceşti promotori au fost aleşi pentru că sunt recunoscuţi extrem de specific de ARN polimeraza din fagii respectivi. Astfel, enzima are o specificitate distinctă pentru promotorul cognat şi nu foloseşte promotorii recunoscuţi de alte ARN polimeraze (aceste două ARN polimeraze nu recunosc nici promotori bacterieni cromozomali sau plasmidiali şi nici promotori de la eucariote). Principalele etape ale acestei tehnici sunt (Fig.3.45.): a) vectorul recombinat (ce conţine şi ADN heterolog) este linearizat cu ajutorul unor endonucleaze

de restricţie ce produc capete netede şi care taie în afara celor 2 promotori (de T3 şi T7); de ex., în cazul clonării unei secvenţe de ADN în vectorul pBluescript SK+, întreaga casetă se scoate prin digestie cu endonucleaza de restricţie BssH II;

b) fragmentul ADN linear ce conţine ADN heterolog mărginit de cei 2 promotori se introduce în amestec cu ARN polimerază de fag T3 sau de fag T7 (funcţie de catena ce urmează a fi transcrisă), spermidină sau albumina serică bovină (ce activează transcrierea de 2 – 2.5 ori) şi rNTP (dintre care unul marcat radioactiv sau neradioactiv); întreg amestecul de reacţie se ţine 1 – 2 h la 37oC, timp în care are loc un proces de transcriere in vitro, ce conduce la acumularea de molecule ARN marcate;

c) în ultima etapă, moleculele ADN folosite ca matriţă sunt transformate în fragmente foarte mici prin tratatment cu DNaza I, după care moleculele de ARN sunt precipitate cu etanol 100% în prezenţă de acetat de amoniu 2.5 M.

4

Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană Note de curs şi tehnici de laborator

3’

3’

vector plasmidialsau phagemid

ADN heterolog clonat in MCS

linearizare cu enzimede restrictie care produccapete drepte

T3

T3

T7

T7 3’

3’ 5’5’

adaugare:- rNTP (unul marcat)- spermidina sau BSA* (amplifica transcrierea de 2-2,5 ori)- ARN polimeraza fagica (T3 sau T7)

transcript ARN

T3 T75’5’3’

3’

Tratare cu DNazaI

molecule ARN

Fig.3.45. Sinteza de sonde prin transcriere in vitro

5

Cap. 3-4Sinteză de sonde oligonucleotidice

Marcarea capetelor 3’ şi 5’ ale ADN a) Marcarea capetelor 3’ ale ADN d.c. Pentru a realiza marcarea radioactivă a unor molecule de ADN d.c., într-o primă etapă se folosesc endonucleaze de restricţie, fie ce produc capete coezive, fie ce produc capete netede:

- în cazul digestiei ADN cu enzime de restricţie ce produc capete coezive, ADN-ul restrictat se amestecă apoi cu un dNTP marcat (funcţie de enzima cu care a fost în prealabil digerat ADN) şi cu Klenow-ADN polimerază I de E.coli (această enzimă va adăuga dNTP-ul introdus in reacţie pe bază de complementaritate); de ex., în cazul digestiei ADN cu EcoR I, se adaugă [32P]-dATP, iar Klenow-ADN polimeraza I va adăuga resturi de adenine marcate complementare cu cele 2 resturi de timine (Fig.3.46.);

CTTAA P5’ CTTAA P5’

EcoRI

+ PdATP32

+Klenow ADN polimeraza

Fig.3.46. Marcarea capetelor 3’ ale ADN prin ‘umplerea’ capetelor coezive

- în cazul digestiei ADN cu enzime de restricţie ce produc capete netede, acestea pot fi marcate prin înlocuirea nucleotidei de la capul 3’OH– în amestecul de reacţie se introduce nucleotida de înlocuit ca [32P]-dNTP;

- în cazul marcării capetelor 3’ monocatenare, se foloseşte enzima terminal-deoxinucleotidil transferaza din timus de viţel; această enzimă este o ADN polimerază “neobişnuită”, găsită numai în prelimfocite şi în stadii timpurii ale diferenţierii limfoide; în prezenţa unui cation divalent, enzima produce adiţia de dNTP-uri la capetele 3’OH, preferabil monocatenare: în prezenţă de Mg++, se adiţionează o purină, iar în prezenţă de Co++, se adiţionează o pirimidină (Fig.3.47.)

CGC OH3’

CGC OH3’G

CGC OH3’T

CGC OH3’A

CGC OH3’C

Terminaltransferaza

+Mg ++

+Co ++

dGTP

dATP

dTTP

dCTP

Fig.3.47. Marcarea capetelor 3’ monocatenare Sisteme de marcare a sondelor moleculare 1. Marcare radioactivă In marea majoritate a cazurilor, în marcarea radioactivă a moleculelor de acizi nucleici se folosesc [32P] sau [35S]. Avantajul marcării radioactive a acizilor nucleici îl reprezintă faptul că au o sensibilitate foarte mare, putând detecta cantităţi foarte mici de acizi nucleici. Principalele deazavantaje ale marcării radioactive sunt reprezentate de riscul manipulării unor materiale radioactive, de instabilitatea isotopilor, precum şi de timpii lungi de expunere. 2. Marcare neradioactiva In marcarea neradioactivă se folosesc molecule reporter ce sunt detectabile direct sau indirect. 2.a. metode directe de marcare neradioactivă : molecula reporter este detectabilă direct şi se leagă direct de sondă, astfel că hibrizii pot fi vizualizaţi direct; în asemenea situaţii, moleculele reporter sunt de obicei reprezentate de fluorocromi.

6

Genetica microorganismelor şi inginerie genetică microbiană Note de curs şi tehnici de laborator

7

In cazul marcării fluorescente a sondelor de acizi nucleici se folosesc analogi ai nucleotidelor cuplaţi cu fluoresceină (de ex. fluorescein-dUTP), ce se incorporează în acizii nucleici prin tehnici enzimatice standard (de ex. prin reacţie PCR). Marcajul cu fluoresceină poate fi folosit şi ca metodă indirectă, caz în care fluoresceina este folosită ca haptenă. 2.b. metode indirecte de marcare radioactivă: sonda conţine o moleculă reporter introdusă chimic sau enzimatic, care va deveni detectabilă prin citochimie de afinitate; în aceste situaţii, se foloseşte, fie biotina cuplată cu avidină sau cu streptavidină, fie digoxigenina cuplată cu anticorpi-antidigoxigenină. Biotina (sau vitamina H) poate fi incorporată în acizii nucleici ca biotin-dUTP (Fig.) prin tehnici enzimatice standard (de ex. PCR). După folosirea sondei biotinilate într-o reacţie de hibridizare moleculară, hibrizii de acizi nucleici sunt detectaţi prin cuplarea biotinei cu avidina din complexul avidină-fosfatază alcalină (sau avidină-peroxidază din hrean).

Avidina este o glicoproteină din albuşul de ou, care are 4 subunităţi, fiecare conţinând un situs de legare cu biotina (în utlimii ani, în loc de avidină se foloseşte streptavidină, care nu conţine reziduuri glicozilate ce dau un fond ridicat al reacţiilor nespecifice, reducând contrastul de culoare)

Enzima va degrada un compus cromogen, obţinându-se în final o reacţie de culoare. Astfel, fosfataza alcalină va degrada substratul cromogen NBT (nitro-blue-tetrazolium) sau BCIP (5-Br-4-Cl-3-indolilfosfat), obţinându-se un precipitat de culoare albastră. In locul fosfatazei alcaline se poate folosi peroxidaza din hrean (HPOX), care va degrada substratul cromogen DAB (3,3’-diaminobenzidină tertahidroclorid), obţinându-se un precipitat roşu-brun. O altă variantă de marcare din acelaşi sistem, foloseşte digoxigenina în loc de biotină. In acest caz, în sondă este incorporat enzimatic, fie digoxigenină-dUTP, fie digoxigenină-dTTP. După realizarea reacţiei de hibridizare moleculară, se adaugă anticorpi-anti-digoxigenină cuplaţi cu fosfatază alcalină şi apoi substratul cromogen (NBT sau BCIP), iar hibrizii sunt detectaţi ca spot/bandă albastră. Principalele etape ale unui proces de hibridizare moleculară pe suport solid 1. Sinteza sondei marcate Funcţie de molecula de ADN ţintă, de lungimea sondei dorite, precum şi de tipul de marcare, se sintetizează (prin tehnicile prezentate mai sus) o specie moleculară de sondă ADN sau ARN complementară cu molecula ţintă. 2. Procesarea ADN ţintă Moleculele de ADN sursă în care se găseşte şi secvenţa de ADN ţintă, trebuie izolate şi purificate. Ulterior, ADN sursă se digera cu o endonuclează de restricţie, astfel încât secvenţa de ADN ţintă să fie obţinută ca moleculă d.c. lineară. Amestecul de digestie se supune unei electroforeze în gel de agaroză, în care se separă diversele fragmente obţinute în reacţia de restricţie. 3. Denaturarea ADN ţintă Gelul de agaroză în care se află şi moleculele de ADN se introduce în soluţii de NaOH, în care va avea loc denaturarea acestora, rezultând molecule monocatenare. 4. Transferul ADN ţintă pe suport solid Fragmentele de ADN d.c. lineare separate în gelul de electroforeză se transferă pe un suport solid (hârtie de nitroceluloză sau membrană de nylon), după ce în prealabil se realizează o denaturare a moleculelor de ADN prin imersarea gelului în NaOH 0.5N. Transferul poate fi realizat prin 3 variante tehnice:

- transfer prin capilaritate, în sistem sandwich: fragmentele de ADN sunt transportate din gel de către un lichid (de obicei, tampon SSC) şi depozitate pe suportul solid; mişcarea lichidului se realizează prin capilaritate şi se datorează unui teanc de hârtie prosop aşezat în sistem sandwich; rata transferului depinde de dimensiunea fragmentelor şi de concentraţia agarozei.

- transfer electroforetic: se foloseşte numai pe membrane de nylon încărcate electric şi reprezintă o metodă eficientă chiar pentru transferul unor fragmente mici: 56 bp.

- transfer prin vacuum: este mult mai eficient şi mai rapid decât celelalte 2 variante tehnice; în acest caz, gelul de agaroză se găseşte în contact direct cu suportul solid (nitroceluloza sau membrana de nylon), amândouă aşezate pe un suport poros deasupra unei camere de vacuum; tamponul este aşezat în camera superioară a dispozitivului şi este tras prin vacuum, eluând acizii nucleici din gel şi depozitându-i pe suportul solid. Suportul solid cu acizii nucleici depozitaţi pe el este apoi expus la radiaţii UV, ceea ce creează o serie de legături de tip cross-links între moleculele de acizi nucleici şi structura suportului; astfel, fragmentele de acizi nucleici (inclusiv ADN ţintă) sunt fixate de suportul solid. 5. Hibridizarea moleculară In această etapă, suportul solid pe care se află fixată ţinta se imersează în tampon 5xSSC care conţine şi sonda marcată, şi se lasă în agitare uşoară 14-16h. După hibridizare, sonda nehibridizată se îndepărtează prin spălări succesive cu tampon SSC.